Способ получения концентрата микробных клеток для получения живой туляремийной вакцины

Изобретение относится к технологии производства медицинских иммунобиологических препаратов и может быть использовано в практике производства туляремийной живой вакцины. Изобретение представляет собой способ получения концентрата микробных клеток для получения живой туляремийной вакцины, характеризующийся тем, что туляремийный микроб выращивают при температуре 37°C в течение 20±2 часов на питательной среде, содержащей, г/л: сухой ферментативный гидролизат фибрина, приготовленный из отхода сывороточно-вакцинного производства 50-55, глюкозу 10, пантотенат кальция 0,05, с последующим концентрированием микробной массы путем микрофильтрации культуры туляремийного микроба через мембраны с размером пор 0,2 мкм в режиме тангенциального потока жидкости. Изобретение направлено на получение концентрата микробных клеток туляремийного микроба, пригодного для получения живой туляремийной вакцины. 1 пр.

 

Изобретение относится к технологии производства медицинских иммунобиологических препаратов и может быть использовано в практике производства туляремийной живой вакцины.

В настоящее время иммунизация является самым надежным способом профилактики туляремии. В 2011 году в Российской Федерации против туляремии вакцинировано 317953 человека и ревакцинировано 1294433 человека (О состоянии санитарно-эпидемиологического благополучия населения в Российской Федерации в 2011 году: Государственный доклад. - М.: Федеральный центр гигиены и эпидемиологии Роспотребнадзора, 2012. - 316 с.).

Туляремийная живая сухая вакцина в 2011 году Приказом Министерства здравоохранения и социального развития РФ (№51н от 31 января 2011 г.) включена в Национальный календарь профилактических прививок по эпидемическим показаниям, предусматривающим проведение вакцинации для населения, проживающего на энзоотичных по туляремии территориях, а также прибывших на эти территории лиц, выполняющих ряд работ.

Основным компонентом вакцины туляремийной живой сухой являются клетки туляремийного микроба вакцинного штамма 15 НИИЭГ.

Известен способ получения препарата для активной иммунизации против туляремии (Патент на изобретение №2221591, МПК A61K 39/40, 20.01.2004 г.), в соответствии с которым вирулентные и вакцинные штаммы Francisella tularensis выращивают в жидкой питательной среде, с последующей инактивацией биомассы фенолом в концентрации 0,5-2% и отделением низкомолекулярных примесей. Клетки отделяли путем центрифугирования при 10000 g в течение 30 минут, затем ресуспендировали в стерильном фосфатно-солевом буферном растворе и подвергали обработке на ультразвуковом дезинтеграторе при 0°C. Дезинтеграт клеток центрифугировали при 12000 g в течение 30 минут, полученный супернатант - при 100000 g. После удаления супернатанта осадок препарата для активной иммунизации ресуспендировали в деионизованной воде и трижды переосаждали путем центрифугирования при 100000 g с последующим ресуспендированием в деионизованной воде. Очищенный препарат лиофилизовали. Способ предназначен для получения препарата для активной иммунизации против туляремии. Препарат, полученный по данному способу, обеспечивает защиту высокочувствительных животных при заражении высоковирулентными штаммами F. tularensis как при парентеральном, так и при пероральном способе иммунизации. Однако в связи с тем, что для получения целевого продукта клетки подвергают лизису фенолом и разрушают ультразвуковым воздействием, то описанный способ не пригоден для получения живой туляремийной вакцины.

Известен способ получения биомассы туляремийного микроба (Патент на изобретение №2451743, МПК C12N 1/20, 27.05.2012 г.), согласно которому предварительно подготовленный посевной материал туляремийного микроба культивируют при pH 6,8-7,0, температуре 37°C в течение 18±2 ч на жидкой питательной среде, содержащей, г/л: панкреатический гидролизат рыбокостной муки 20,5, стимулятор роста гемофильных организмов 5, экстракт пекарских дрожжей 2,3, сульфат магния 1,0, сульфит натрия 0,7, дигидрофосфат калия 1, цистеин 0,5. При культивировании туляремийного микроба в среду добавляют глюкозовитаминную добавку в количестве 2 мл на 100 мл среды (1,23 г/л). Затем культуральную жидкость освобождают от клеточной массы центрифугированием при 9000 об/мин в течение 20 мин или на сепараторе АСГ-3М при том же режиме. С полученного концентрата клеток получают антигены гидродинамическим смывом с последующим поэтапным осаждением с постепенным понижением pH (от 7,0 до 4,3) для освобождения от балластных веществ. На последнем этапе переосаждение повторяют 2-3 раза для окончательной очистки препарата. Технология позволяет получать большие объемы (для производственных целей) биомассы туляремийного микроба. Однако этапы отделения клеточной массы (получения клеточного концентрата) направлены на разрушение клеток. Концентрат, полученный по данному способу, пригоден для получения антигенных компонентов при создании диагностических препаратов против возбудителя туляремии и не может использоваться в качестве промежуточного компонента для дальнейшего приготовления живой туляремийной вакцины.

Кроме того, технология получения концентрата микробных клеток, получаемого по данному способу, не предусматривает асептического ведения процесса, что может привести к контаминации посторонней микрофлорой и, следовательно, выбраковке данного полупродукта для получения туляремийной живой вакцины, так как одним из требований является отсутствие посторонней микрофоры в культуре туляремийного микроба на всех технологических этапах приготовления живой вакцины.

Техническим результатом является получение концентрата микробных клеток туляремийного микроба, пригодного для получения живой туляремийной вакцины.

Технический результат достигается тем, что туляремийный микроб выращивают методом глубинного культивирования при температуре 37°C в течение 20±2 часов на жидкой питательной среде pH 7,2, содержащей, г/л: сухой ферментативный гидролизат фибрина, приготовленный из отхода сывороточно-вакцинного производства 50-55, глюкозу 10, пантотенат кальция 0,05, с последующим концентрированием микробной массы путем микрофильтрации культуры туляремийного микроба через мембраны с размером пор 0,2 мкм в режиме тангенциального потока жидкости.

Для достижения технического результата разработана жидкая питательная среда, подобран режим выращивания туляремийного микроба и подобраны характеристики пористых мембран, обеспечивающих процесс концентрирования туляремийного микроба.

Возможность использования микрофильтрационного концентрирования микробных клеток туляремии установлена нами экспериментальным путем и неизвестна из доступных источников информации.

Фильтрация в проточном (тангенциальном) потоке является разделительным методом, в котором поток жидкости направляется вдоль мембраны, омывая ее поверхность. Такой смывающий эффект позволяет постоянно удалять отложения, предотвращая их скапливание и образование слоя на поверхности фильтра, которое известно под названием концентрационной поляризации, уменьшающей скорость фильтрации. Материал, меньше номинального размера пор микрофильтрационной мембраны, проходит через нее в линию фильтрата. Материал, превышающей размера пор микрофильтрационной мембраны, «отбрасывается» мембранной и концентрируется в отдельную емкость. Потери продукта за счет незначительного «мертвого» объема мембраны минимальны и сводятся к нулю путем промывки мембранного модуля жидкостью в количестве, соответствующем «мертвому» объему мембраны.

Неоспоримым преимуществами тангенциальной фильтрации являются:

концентрирование и очистка происходят без изменения агрегатного состояния и фазовых превращений;

перерабатываемый продукт не подвергается тепловым и химическим воздействиям;

механическое и гидродинамическое воздействие на биологический материал незначительно;

легко обеспечивается герметичность и асептические условия;

аппаратурное оформление просто по конструкции, компактно, отсутствуют движущиеся детали;

процесс не обладает высокой энергоемкостью.

Возможность осуществления заявляемого изобретения подтверждается следующим примером.

Пример. Получение концентрата микробных клеток.

Для выращивания туляремийного микроба подготовили питательную среду с основой из ферментативного гидролизата фибрина. Для этих целей бульон варят в реакторе: под вакуумом закачивают воду очищенную (дистиллированную воду) согласно расчета, прибавляя 10% на ее выкипание, добавляют 50-55 г/л сухого ферментативного гидролизата фибрина в количестве, обеспечивающем содержание в среде не менее 0,32% аминного азота. Затем вносят глюкозу до концентрации 1%. Все перемешивают и устанавливают в среде pH (7,2±0,2) при помощи 20% раствора натрия гидроокиси и кипятят в течение 30 мин. Бульон фильтруют через фильтр Сальникова при температуре (75±5)°C под давлением (2,5±0,5) МПа. Жидкую среду из ферментативного гидролизата фибрина стерилизуют в паровом стерилизаторе водяным насыщенным паром при (110+2)°C в течение 30 мин, давлении (0,05+0,02) МПа. Перед внесением инокулята посевной культуры в стерильную среду добавляют стерильный раствор пантотената кальция в концентрации 0,005% (0,05 г/л). Приготовление жидкого ферментативного гидролизата фибрина приведено в патенте RU 2425866. Для получения в сухой форме ферментативный гидролизат фибрина концентрировали в 6-7 раз методом выпаривания на установке вакуум-выпарной УВВ-50 и высушивали конвекционным способом на сушильной установке распылительного типа КЯУЛ 101325.002 в «псевдокипящем слое».

Культуру F. tularensis вакцинного штамма 15 НИИЭГ выращивают методом глубинного культивирования на подготовленной жидкой питательной среде при температуре 37°C в течение 20±2 ч часов. После окончания процесса культивирования нативная культура F. tularensis вакцинного штамма 15 НИИЭГ имеет следующие характеристики: pH 7,0±0,1, концентрация микробных клеток 35±0,5 млрд. кл. мл-1 (по отраслевому стандартному образцу мутности - ОСО мутности 42-28-85-П (10 ME) ФГБУ НЦЭСМП Минздравсоцразвития России, эквивалентной концентрации 5 млрд. кл. мл-1), коэффициент жизнеспособности - 62±0,5%, посторонняя микрофлора отсутствует. Далее полученную микробную суспензию F. tularensis подвергают тангенциальной микрофильтрации на ультра-микрофильтрационной установке «Вива-флоу» через мембраны с размером пор 0,2 мкм до сокращения объема микробного осадка в четыре раза. При необходимости добавляют в концентрат стерильный физиологический раствор до восстановления исходного объема нативной культуры и процесс концентрирования повторяют. Полученный концентрат микробных клеток имел следующие характеристики: pH 7,2±0,1, концентрация микробных клеток 135±1,0 млрд. кл. мл-1 (по отраслевому стандарту мутности ФГБУ НЦЭСМП), коэффициент жизнеспособности - 60±0,1%, посторонняя микрофлора отсутствует. Контроль специфической стерильности фильтрата свидетельствовал об отсутствии в нем туляремийного микроба, что говорит о правильном подборе размера пор мембран.

В полученном концентрате не происходит ухудшения характеристик (в сравнении с нативной культурой F. tularensis вакцинного штамма 15 НИИЭГ после ее глубинного культивирования). В частности, pH и коэффициент жизнеспособности остаются на прежнем уровне и не происходит контаминации посторонней микрофлорой. Основываясь на этом, можно утверждать, что полученный концентрат пригоден для получения живой туляремийной вакцины.

Способ получения концентрата микробных клеток для получения живой туляремийной вакцины, характеризующийся тем, что туляремийный микроб выращивают при температуре 37°C в течение 20±2 часов на питательной среде pH 7,2, содержащей, г/л: сухой ферментативный гидролизат фибрина, приготовленный из отхода сывороточно-вакцинного производства 50-55, глюкозу 10, пантотенат кальция 0,05, с последующим концентрированием микробной массы путем микрофильтрации культуры туляремийного микроба через мембраны с размером пор 0,2 мкм в режиме тангенциального потока жидкости.



 

Похожие патенты:
Изобретение относится к ветеринарии, в частности к профилактике и лечению трихофитии крупного рогатого скота. Инактивированная вакцина для профилактики и лечения трихофитии крупного рогатого скота содержит элементы гриба Trichophyton verrucosum - клетки и фрагменты мицелия, микроконидии, артроспоры, хламидоспоры; формалин и физиологический раствор при следующем соотношении компонентов в 1 мл: элементы гриба Trichophyton verrucosum - фрагменты   мицелия, микроконидии, артроспоры, хламидоспоры 80-120 млн формалин 0,003 мл физиологический раствор до 1 мл Техническим результатом заявленного изобретения является повышение длительности иммунитета до 30 месяцев, повышение стабильности вакцины и срока хранения вакцины до 18 месяцев, возможность полного освобождения хозяйств от возбудителя трихофитии крупного рогатого скота, а также упрощение применения вакцины, снижение себестоимости ее производства и использования, снижение нагрузки на иммунную систему животных.
Изобретение относится к биотехнологии и микробиологии и представляет собой жидкую среду высушивания для стабилизации биомассы вторичного сбора чумного микроба вакцинного штамма EV.
Изобретение относится к медицине, а именно к терапии и кардиологии, и касается коррекции эндотелиальной дисфункции. Для этого вводят активированную - потенцированную форму антител к эндотелиальной синтазе оксида азота в сочетании с активированной - потенцированной формой антител к С-концевому фрагменту AT1 рецептора ангиотензина II.

Изобретение относится к области биотехнологии и медицины. Описана активная иммуностимулирующая вакцина, содержащая по меньшей мере одну РНК, предпочтительно мРНК, кодирующую по меньшей мере два антигена, которые инициируют иммунный ответ у млекопитающего, предназначенная для лечения рака легких, прежде всего немелкоклеточного рака легких (НМРЛ), предпочтительно выбранного из основных трех его подтипов, плоскоклеточной карциномы легких, аденокарциномы и крупноклеточной карциномы легких, или нарушений, связанных с НМРЛ.
Изобретение относится к области ветеринарии. Способ получения антилютеальной крови - АлК, заключается в том, что мерину двукратно с интервалом 14 дней подкожно вводят лютеолизат в дозе по 20 мл, содержащий части желтого тела беременности коров, и через 14 дней после второго введения берут кровь из яремной вены.

Настоящая группа изобретений относится к области медицины, а именно к терапии и фармакологии, и может быть использована для повышения фармакологической активности и терапевтической эффективности лекарственных средств на основе активированных - потенцированных форм сверхразбавленных антител.
Изобретение относится к области медицины и ветеринарии и касается способа получения очищенного антигена Dirofilaria immitis. Представленный способ включает механическую гомогенизацию, центрифугирование гомогената, отбор надосадочной жидкости и использование ее как антигена, при этом для гомогенизации используют головной конец длиной 2 см половозрелой самки Dirofilaria immitis, который помещают в 0,25 М водный раствор сахарозы в соотношении 1:3, замораживают при температуре -18°С, проводят механическую гомогенизацию и экстракцию белков в 0,25 М водном растворе сахарозы при 4°С в течение 12 часов, далее проводят ультразвуковую гомогенизацию супернатанта при 70 кГц 5 раз по 30 секунд с интервалом в 30 секунд в 3 циклах при 0°С, образовавшийся после ультразвуковой гомогенизации супернатант растворяют в охлажденном ацетоне при температуре 0°С в соотношении 1:20 с экспозицией 1 час при температуре 4°С.

Изобретение относится к медицине и касается применения антитела, которое связывается с остатками 1-5 или 3-7 А-бета, для уменьшения сосудистого амилоида у пациента, имеющего церебральную амилоидную ангиопатию, причем антитело вводят внутривенно или подкожно.
Изобретение относится к области ветеринарной микробиологии и биотехнологии. Штамм Moraxella bovoculi обладает антигенными, вирулентными свойствами и иммуногенной активностью.

Группа изобретений относится к области медицины и ветеринарии. Применение RPE (экстракт рибосомного белка) совместно с Th1-активирующим адъювантом для получения лекарственного средства для лечения или профилактики паразитарного заболевания обеспечивает перекрестный иммунитет от различных видов Leishmania.
Изобретение относится к медицине, а именно к онкологии, и может быть использовано для противоопухолевой иммунотерапии. Для этого больному вводят дендритные клетки (ДК), получаемые из кожи, селезенки, костного мозга, тимуса, лимфатических узлов, пуповинной крови или периферической крови больного (аутологичные ДК), при этом ДК больному вводят поэтапно. На первом этапе осуществляют введение зрелых аллогенных ДК, нагруженных опухолеспецифичным антигеном, созревание которых осуществляют ex vivo. На втором этапе не менее чем через 24 часа, но не более чем через 120 часов после первого этапа осуществляют повторное введение зрелых аллогенных ДК одновременно с введением незрелых аутологичных ДК in situ в опухоль, при этом опухоль предварительно или одновременно с введением ДК подвергают воздействию абляции. Использование данного способа позволяет достичь усиления иммунного ответа путем введения двухкомпонентного иммунного агента, состоящего из сенсибилизирующей дозы аллогенных зрелых клеток и терапевтической дозы незрелых ДК, при этом для сенсибилизации достаточно 10% от терапевтической дозы ДК. 1 з.п. ф-лы, 3 пр.

Предложена группа изобретений: фармацевтическая композиция, содержащая иммунологически активный энантиомер компонента катионного липида R-DOTAP или S-DOTAP, способ применения указанного энантиомера для вызова иммуностимулирующего адъювантного эффекта в иммунной системе, способ индукции иммунного ответа у пациента с его использованием и способ лечения или предотвращения заболевания у пациента путем индукции липидом иммуностимулирующего адъювантного эффекта. Технический результат: R-DOTAP и S-DOTAP индуцировали продукцию цитокинов IL-2, IL-8, IL-12, хемокинов CCL-5, CCL-19 и регрессию опухоли у мышей. 4 н. и 19 з.п. ф-лы, 15 ил., 8 пр.

Изобретение относится к иммунологии и биотехнологии и представляет собой способ получения межмолекулярных конъюгатов с коллоидным золотом, используемым в иммунохроматографическом анализе. В иммунохроматографических тест-системах наряду с аналитической зоной, предназначенной для связывания анализируемого соединения, как правило, используется контрольная зона, предназначенная для связывания соединения, конъюгированного с меткой. Нанесение контрольной зоны необходимо для того, чтобы контролировать функциональную активность реагента, конъюгированного с меткой. Если окрашивания контрольной зоны не наблюдается, результат теста признается недействительным. Однако в случае применения иммунохроматографии для определения антител в крови с меткой конъюгируется соединение, предназначенное для связывания антител - далее обозначаемое как ССвАт (соединение, связывающее антитела). При этом концентрация антител в пробе зачастую превышает концентрацию ССвАт, поэтому концентрация свободных молекул ССвАт оказывается очень низкой и исчезновение контрольной зоны в этом случае не свидетельствует о нарушении активности конъюгата. Для решения данной проблемы в настоящем изобретении предлагается добавлять к конъюгату антивидовые антитела против антител, сорбированных в контрольной зоне. В этом случае контрольная зона исчезает только в случае потери активности ССвАт. Антивидовые антитела добавляются в концентрациях значительно ниже связывающей способности конъюгата, чтобы не мешать взаимодействию конъюгата с антителами пробы, вследствие чего не наблюдается значительного снижения чувствительности анализа. 3 ил., 1 пр.

Настоящая группа изобретений относится к медицине, а именно к урологии, и касается лечения заболеваний предстательной железы. Для этого вводят лекарственное средство, содержащее активированную - потенцированную форму антител к простатоспецифическому антигену и в качестве дополнительного усиливающего компонента активированную -потенцированную форму антител к эндотелиальной NO-синтазе. Введение такого комбинированного лекарственного средства обеспечивает эффективное лечение заболеваний предстательной железы за счет синергетического действия входящих в него компонентов, заключающегося в усилении антипролиферативного, противовоспалительного эффектов и улучшении функционального состояния простаты. 3 н. и 7 з.п. ф-лы, 1 пр.

Изобретение относится к области вирусологии, иммунологии, молекулярной биологии и генной инженерии. Предложен слитый (F) протеин респираторного синцитиального вируса (RSV) для вызывания иммунного ответа, где указанный F протеин RSV содержит делецию одной или более аминокислот домена слияния, где указанный домен слияния соответствует аминокислотам 137-154 F протеина RSV дикого типа (SEQ ID NO: 2); и инактивированный первичный сайт расщепления фурина, где первичный сайт расщепления фурина соответствует аминокислотам 131-136 F протеина RSV дикого типа (SEQ ID NO: 2), где инактивация осуществлена посредством мутации; а также кодирующая данный протеин нуклеиновая кислота, клетка, вакцинная композиция, мицелла и вирусоподобная частица. Изобретение может быть использовано для лечения и профилактики инфекции RSV. 9 н. и 16 з.п. ф-лы, 22 ил., 11 пр.

Настоящее изобретение относится к области иммунологии. Предложены варианты олигопептида, выделенные из белка RAB6KIFL (KIFL20A), которые способны индуцировать цитотоксические Т-лимфоциты (CTL) в составе комплекса с молекулой HLA-A*0201. Также рассмотрены: фармацевтическая композиция и способ уничтожения клеток, экспрессирующих RAB6KIFL и HLA-A*0201, экзосома, выделенная антиген-презентирующая клетка и способ ее индукции, фармацевтическая композиция и способ индукции CTL, применения активных ингредиентов по настоящему изобретению для получения фармацевтической композиции для лечения рака, а также полинуклеотид, кодирующий олигопептид по настоящему изобретению. Данное изобретение может найти дальнейшее применение в терапии заболеваний, ассоциированных с RAB6KIFL. 11 н. и 2 з.п. ф-лы, 6 ил., 1 табл.
Настоящая группа изобретений относится к медицине, а именно к терапии и гастроэнтерологии, и касается лечения функциональных нарушений кишечника. Для этого вводят лекарственное средство, содержащее активированные-потенцированные формы антител к гистамину, к фактору некроза опухоли - альфа (ФНО - α) и к мозгоспецифическому белку S-100. Введение такой композиции обеспечивает лечение функциональных нарушений кишечника за счет спазмолитического действия и нормализации моторно-эвакуаторной функции кишечника. 2 н. и 9 з.п. ф-лы, 4 пр., 4 табл.

Настоящая группа изобретений относится к медицине, а именно к психиатрии и наркологии, и касается лечения зависимости от психоактивных веществ, в частности от алкоголизма и табакокурения. Для этого вводят лекарственное средство, содержащее активированную потенцированную форму антител к мозгоспецифическому белку S-100 и активированную потенцированную форму антител к каннабиноидному рецептору человека, предпочтительно к каннабиноидному рецептору человека I типа. Это обеспечивает подавление как физической, так и психологической зависимости от алкоголизма и табакокурения. 2 н. и 9 з.п. ф-лы, 1 пр.

Изобретение относится к биотехнологии. Описано антитело и его функциональный фрагмент, содержащие антиген-связывающие области, специфичные к MST1R. Изобретение также относится к последовательностям нуклеиновой кислоты, кодирующим указанные выше антитела, содержащим их векторам, фармацевтическим композициям и наборам с инструкциями по применению. Изобретение можно использовать для лечения нарушений и состояний, связанных с MST1R. Антитела по изобретению также можно использовать в области диагностики, а также для дальнейшего исследования роли MST1R в прогрессировании нарушений, связанных с опухолями. 18 н. и 34 з.п. ф-лы, 37 ил., 2 табл., 6 пр.
Изобретение относится к области медицины, а именно к фармакологии, и касается создания лекарственных средств, обладающих антиретровирусной активностью. В качестве такого средства предложена фармацевтическая композиция, содержащая активированную потенцированную форму антител к белку или пептиду иммунной системы, который взаимодействует с ВИЧ или содержание и/или функциональная активность которого изменяется в связи с инфицированием ВИЧ. 10 з.п. ф-лы, 2 пр.

Изобретение относится к технологии производства медицинских иммунобиологических препаратов и может быть использовано в практике производства туляремийной живой вакцины. Изобретение представляет собой способ получения концентрата микробных клеток для получения живой туляремийной вакцины, характеризующийся тем, что туляремийный микроб выращивают при температуре 37°C в течение 20±2 часов на питательной среде, содержащей, гл: сухой ферментативный гидролизат фибрина, приготовленный из отхода сывороточно-вакцинного производства 50-55, глюкозу 10, пантотенат кальция 0,05, с последующим концентрированием микробной массы путем микрофильтрации культуры туляремийного микроба через мембраны с размером пор 0,2 мкм в режиме тангенциального потока жидкости. Изобретение направлено на получение концентрата микробных клеток туляремийного микроба, пригодного для получения живой туляремийной вакцины. 1 пр.

Наверх