Холодоадаптированный штамм вируса гриппа в-в/виктория/2/63/87, предназначенный в качестве штамма-донора аттенуации для получения реассортантов холодоадаптированных штаммов для живой гриппозной вакцины


 


Владельцы патента RU 2529772:

Федеральное государственное бюджетное учреждение "Научно-исследовательский институт вакцин и сыворотк им. И.И. Мечникова" (ФГБУ "НИИВС им. И.И. Мечникова" РАМН) (RU)

Изобретение относится к медицинской вирусологии и может быть использовано при производстве живой холодоадаптированной аттенуированной вакцины против гриппа. Холодоадаптированный штамм вируса гриппа В/Виктория/2/63/87 обладает уникальными мутациями в генах, кодирующих белки PB2, PB1, PA, NP, M1, NS1, и предназначен для получения холодоадаптированных реассортантных штаммов-кандидатов для получения живой гриппозной сезонной вакцины. 2 табл., 5 пр.

 

Изобретение относится к медицинской вирусологии и может быть использовано при производстве живой холодоадаптированной аттенуированной вакцины против гриппа.

Известно, что живая вакцина против гриппа производится из аттенуированных штаммов вируса, безвредных для людей и обладающих способностью стимулировать противогриппозный иммунитет.

В связи с тем, что антигенная специфичность вирусов гриппа весьма изменчива, вакцинные штаммы этого вируса для гриппозных вакцин приходится заменять на новые почти каждый год в соответствии с рекомендациями Всемирной Организации Здравоохранения. При получении таких новых вакцинных штаммов для живой холодоадаптированной аттенуированной гриппозной вакцины и для получения новых реассортантных холодоадаптированных вакцинных штаммов в России используют холодоадаптированные штаммы - доноры аттенуации В/СССР/60/69 и В/Ленинград/14/55, также полученные путем пассажей при пониженной температуре (RU 2084525, 1997; RU 2068271, 1996).

Однако эти штаммы обладают серьезным недостатком - авторы не имеют данных о том, какие мутации в определенных участках генов этого вируса имеются у данных ха штаммов, что не позволяет определить, какие гены вируса могут иметь отношение к аттенуации штамма, что дает возможность характеризовать генетическую однородность штаммов, а также определить их генетическую стабильность при размножении в организме вакцинированных людей. Оба штаммы были клонированы методом предельных разведении в куриных эмбрионах, что оставляет генетическую однородность этих штаммов под большим сомнением.

В США для приготовления живой холодоадаптированной гриппозной вакцины используют в качестве штамма-донора аттенуации штамм В/Анн Арбор/1/66, полученный путем пассажей при пониженной температуре (Maassab H, De Borde B. Development and characterization of cold-adapted virus for use as live virus vaccines. Vaccine, 1983й вакцины. Вопросы вирусологии, 2005, №2: 43-46).

Этот штамм имеет восемь кодирующих мутаций в трех вирусных белках (PA, NP и M1) (см. таблицу 2).

Наиболее близким к заявленному изобретению является аттенуированный холодоадаптированный штамм вируса гриппа В/Ленинград/14/17/55 для получения штаммов живой гриппозной вакцины (RU 2068271, 1996).

Задачей исследования является получение ха генетически однородного штамма-донора аттенуации вируса гриппа B, обладающего уникальными мутациями в генах, кодирующих белки PB2, PB1, PA, NP, M1, NS1 и предназначенного для получения холодоадаптированных реассортантных штаммов-кандидатов живой гриппозной сезонной вакцины.

Техническим результатом заявленного изобретения является создание аттенуированного холодоадаптированного штамма - донора вируса гриппа, обладающего генетической однородностью, охарактеризованного по количеству и распределению мутаций аминокислот в каждом из внутренних белков вируса, и способного размножаться при пониженной температуре и температуре 34°C как на куриных эмбрионах, так и в культуре клеток, в частности в линии клеток MDCK, одобренной в России для производства вирусных вакцин для людей (4, 5).

Сущность изобретения: холодоадаптированный штамм вируса гриппа В/Виктория/2/63/87 получен методом серийных пассажей в куриных эмбрионах и клетках MDCK при постепенно снижающейся температуре инкубации. Полученный штамм прошел в сумме 63 пассажа при пониженной температуре (из них 29 пассажей на куриных эмбрионах и 34 пассажа на клетках MDCK), с последующим трехкратным клонированием методом бляшек на культуре клеток MDCK. Последнее обеспечивает полную генетическую гомогенность ха штамма. Полученный штамм обладает хорошей репродуктивной активностью в куриных эмбрионах и на клетках MDCK при пониженной температуре (26°C) и не размножается при повышенных температурах (38° и 40°C). Полученный ха штамм вируса гриппа В имеет во всех внутренних генах 8 мутаций, отличающих его от родительского дикого штамма, причем 6 из 8 мутаций кодируют замену аминокислоты в белках PB2, PB1, PA, NP, M1, NS1. 5 из 6 кодирующих мутаций являются уникальными для данного штамма по сравнению со всеми эпидемическими штаммами вируса гриппа В, отсеквенированными на данный момент.

Штамм В/Виктория/2/63/87 вируса гриппа В зарегистрирован в Государственной коллекции депозитария НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского под номером 2615 от 13.12.2010.

Штамм В/Виктория/ 2/63/87 полностью генетически охарактеризован и трижды клонирован в культуре MDCK методом бляшек. Методом секвенирования отдельных РНК-сегментов его генома доказана его генетическая однородность.

Примеры получения холодоадаптированного (ха) варианта вируса гриппа В/Виктория/2/63/87.

Пример 1. Получение холодоадаптированного варианта. Эпидемический родительский штамм вируса гриппа В/Виктория/2/87 хорошо размножался при повышенной температуре 38,5°C (ts38 + признак) и не размножался при пониженной температуре 26°C (ca26 - признак). Этот штамм вируса прошел в куриных эмбрионах 2 пассажа при 30°C, затем 3 пассажа при 28°C, далее 6 пассажей при 26°C, затем 34 пассажа при 26°C в культуре клеток MDCK и далее 18 пассажей при 26°C в куриных эмбрионах.

Полученный ха вариант вируса, в отличие от родительского эпидемического штамма, хорошо размножался при 26°C (ca26 + признак), а также хорошо размножался при 34°C, но не размножался при 38,5°C (ts38 - признак).

Для получения генетически гомогенного ха штамма вируса полученный вариант был трижды клонирован методом бляшек на линии клеток MDCK при 34°C и был выбран один клон, который хорошо размножался при 26°C (ca26 + признак) и не размножался при 38,5°C (ts38,5 - признак). Ряд пассажей полученного ха варианта на куриных эмбрионах при 34°C не изменили его са26+ и ts38.5 - признаки, что свидетельствовало о генетической однородности клонированного ха варианта этого вируса.

Пример 2. Размножение холодоадаптированного варианта в куриных эмбрионах.

При размножении в куриных эмбрионах при 34°C родительского штамма титры вируса составили 128 ГАЕ/мл и 108.0 ЭИД50/0,1 мл, при 38,5°C - 256 ГАЕ/мл и 108.5 ЭИД50/0,1 мл, а при 26°C вирус не размножался, т.е. обладал ts38.5+ и ca26 - признаками. При заражении куриных эмбрионов ха вариантом вируса титры при 26°C составляли 64 ГАЕ/мл и 106.0 ЭИД50/0,1 мл, при 34°C - 256 ГАЕ /мл и 108.5 ЭИД50/0,1 мл, а при 38,5°C этот вариант не размножался, т.е. обладал ca26+ и ts38 - признаками.

Пример 3. Размножение ха варианта в линии клеток MDCK.

Ха вариант вируса В/Виктория/2/63/87 хорошо размножался в линии клеток MDCK при 33° (титры составили 128-256 ГАЕ/мл и 108.0 ЭИД50/0.1 мл) и не размножался при 26°C.

Пример 4. Размножение ха варианта и родительского штамма вируса при заражении мышей.

При интраназальном заражении самок мышей линии Balb/c (18,0-20,0 г) родительским штаммом вируса (50 мкл в две ноздри) в дозе 107.5 ЭИД50/0,2 мл на 3-й день после заражения титры вируса в носоглотке составляли 104.5 ЭИД50/0,2 мл, а в легких 103.9 ЭИД50/0.2 мл.

При интраназальном заражении мышей той же дозой ха варианта титры вируса на 3-й день после заражения титры вируса в носоглотке составляла 102.0 ЭИД05/0,2 мл, а в легких <101.0 ЭИД50/0,2 мл. Эти данные свидетельствуют о хорошей аттенуации ха варианта, потерявшего способность размножаться при заражении мышей.

Пример 5. Анализ мутаций в геноме ха варианта.

Сравнительный анализ последовательности нуклеотидов в генах родительского штамма и ха варианта вируса В/Виктория/2/63/87 выявило 8 мутаций в 6 генах, кодирующих внутренние белки PB2, PB1, PA, NP, M1, NS1, из которых 6 мутаций привели к замене аминокислот в соответствующих белках (см. таблицу 1). В РНК-сегменте 1, кодирующем белок PB2, в позиции 555 наблюдалась нуклеотидная замена G-A, которая сопровождалась аминокислотной заменой Arg-Lys в позиции 185 белка PB2. Нуклеотидная замена A-G в РНК-сегменте 2 в позиции 366 сопровождалась аминокислотной заменой Asp-Gly в позиции 120 белка PB1. В РНК-сегменте 3 наблюдались 2 мутации, из которых одна в позиции 972 (А-Т) оказалась некодирующей, а вторая в позиции 1885 (G-A) приводила к аминокислотной замене Val-Ile в позиции 625 белка PA. Уникальная нуклеотидная замена C-T в позиции 156 в РНК-сегменте 5, кодирующем белок NP, имела следствием аминокислотную замену Pro-Ser в позиции 40 белка NP. В РНК-сегменте 7 ха варианта наблюдались 2 нуклеотидные замены. Первая замена (G-A) в позиции 70 сопровождалась аминокислотной заменой Glu-Lys в позиции 23 белка M1. Вторая нуклеотидная замена C-T в позиции 387 этого РНК-сегмента оказалась некодирующей. Последняя нуклеотидная замена G-A в позиции 62 РНК-сегмента 8 приводила к аминокислотной замене Gly-Ser в белке NS1.

Сравнение мутаций, обнаруженных в геноме ха варианта штамма В/Виктория/2/63/87 и мутаций в геноме американского ха варианта вируса В/Анн Арбор/1/60 (см. таблицу 2), показало, что мутации, выявленные нами в геноме ха варианта В/Виктория/2/63/87, являются уникальными и отличаются от мутаций, обнаруженных в ха штамме В/Анн Арбор/1/60 (5).

На основе полученного штамма-донора получены реассортанты с актуальными эпидемическими штаммами вируса гриппа В.

ЛИТЕРАТУРА

1. Патент №2084525 "Аттенуированный холодоадаптированный штамм вируса гриппа В/СССР (69) Е для получения живой интраназальной гриппозной вакцины." от 20.07.1997.

2. Патент №2068271. Аттенуированный холоадаптированный штамм вируса гриппа В/Ленинград/14/55 для получения штаммов живой гриппозной вакцины от 27.10.1996.

3. Maassab H, De Borde В. Development and characterization of cold-adapted virus for use as live virus vaccines. Vaccine, 1983й вакцины. Вопросы вирусологии, 2005, N2: 43-46.

4. Радаева И.Ф., Колокольцева Т.Д., Нечаева Е.Д. и др. "Создание и аттестация банков перевиваемой культуры клеток MDCK для производства гриппозной вакцины." Вопросы вирусологии, 2005, №2: 43-46.

5. Выписки из протокола №6 Комитета медицинских иммунобиологических препаратов Министерства Здравоохранения Российской Федерации от 26.06.2003 г.

6. Hoffmann E., Mahmood K., Chen Z. et al. Multiple gene segments control the temperature sensitivity and attenuation phenotypes of ca B/Ann Arbor/ 1/66. J. Virol. 2005. 79: 11014-11021.

Таблица 1
Мутации во внутренних генах холодоадаптированных вариантов штамма В/Виктория/2/63/87
Сегмент РНК Длина (нт) Мутации в нуклеотидной последовательности Белок Длина (ак) Аминокислотные замены
Позиция Уникальность* Вик (Дт) Вик (ха) Позиция Вик (дт) Вик (ха)
1 2396 555 Да AGG AAG PB2 770 185 Arg Lys
2 2386 366 Да GAC GGC PB1 752 120 Asp Gly
3 2304 972 Нет АСА ACT PA 726 - - -
1885 Нет GTA АТА 625 Val Ile
5 1841 156 Да ССА ТСА NP 560 40 Pro Ser
7 1191 70 Да GAA ААА M1 248 23 Glu Lys
387 Нет СТС СТТ - - -
- - - - BM2 109 - - -
8 1096 62 Да GGT AGT NS1 281 13 Gly Ser
NS2 122
* Уникальность по сравнению с вирусами гриппа B из базы данных GenBank
Таблица 2
Аминокислотные замены, уникальные для внутренних генов штамма В/Энн Арбор/1/66 по сравнению с дикими штаммами вируса гриппа В по данным Hoffman и др (6)
Сегмент РНК Длина (нт) Нуклеотидная последовательность Белок Аминокислотные замены
Позиция Уникальность* Консенсус (дт) В/Энн Арбор/1/66 (ха) Позиция Консенсус (дт) В/Энн Арбор/1/66 (ха)
1 2396 1913 Нет*1 AGC AGA PB2 770 630 Ser Arg
2 2386 PB1 752
3 2304 1320 Да GTG A PA 726 431 Val Met
1518 Да TAT CAT 497 Tyr His
5 1841 221 Нет*2 ACC GCC NP 560 55 Thr Ala
399 Да GTG GCG 114 Val Ala
1287 Да CCT CAT 410 Pro His
1583 Да GCT ACT 509 Ala Thr
7 1191 501 Нет*2 CAT САА M1 248 759 His Gin
571 Да ATC GTG 183 Met Val
- - - - BM2 109 - - -
8 1096 NS1 281
NS2 122
* Уникальность по сравнению с дикими штаммами вируса гриппа B из базы данных GenBank, в том числе с диким штаммом-предком ХА вируса В/Энн Арбор/1/66
*1 Мутация присутствовала лишь в одном диком штамме вируса гриппа B из всех исследованных (B/Harbin/7/94 (AAF89735))
*2 Эти мутации присутствовали в диком штамма В/Энн Арбор/1/66 (wt5).

Холодоадаптированный штамм вируса гриппа В/Виктория/2/63/87, депонированный в Государственной коллекции вирусов ФГБУ НИИ вирусологии им. Д.И.Ивановского Минздравсоцразвития России под номером 2615, обладающий уникальными мутациями в генах, кодирующих белки PB2, PB1, PA, NP, M1, NS1, и предназначенный для получения холодоадаптированных реассортантных штаммов-кандидатов для получения живой гриппозной сезонной вакцины.



 

Похожие патенты:
Изобретение относится к области ветеринарной вирусологии и биотехнологии. От племенной нетели выделен штамм вируса блютанга 14 серотипа, депонированный в коллекции микроорганизмов ГНУ ВНИИВВиМ Россельхозакадемии под №3032.

Изобретение относится к области ветеринарной вирусологии и биотехнологии и касается вакцины против ящура типа А. Вакцина содержит авирулентный и очищенный антигенный материал из штамма вируса Aphtae epizooticae, сем.
Изобретение относится к медицинской вирусологии и микробиологии. Способ оценки противооспенной активности лечебно-профилактических препаратов включает введение в организм модельных животных контрольной и испытуемой групп по заданной схеме суспензии исследуемого противовирусного препарата.
Изобретение относится к области медицины. Способ предусматривает отделение подвижных сперматозоидов от спермоплазмы и сопутствующих клеток путем центрифугирования и последующей инкубации в специальных средах с целью забора супернатанта, содержащего «отмытые» сперматозоиды для проведения оплодотворения.

Изобретение касается набора олигонуклеотидных праймеров и флуоресцентномеченого зонда для видоспецифичной экспресс-идентификации РНК вируса Хунин методом полимеразной цепной реакции в реальном времени.

Изобретение касается набора олигонуклеотидных праймеров и флуоресцентномеченного зонда для видоспецифичной экспресс-идентификации РНК вируса Мачупо методом полимеразной цепной реакции в реальном времени.
Представленный способ получения бактериофага включает: засев бактериальной культуры штамма-хозяина в титре 108-109 КОЕ/мл в сосуд для культивирования на скошенную плотную питательную среду с толщиной слоя от 10 мм до 25 мм, культивирование в течение 3-3,5 часов при оптимальной температуре для роста культуры штамма-хозяина, затем на полученный газон культуры штамма-хозяина засевают маточный бактериофаг в титре 105-106 БОЕ/мл и культивируют в течение 13-15 часов при оптимальной температуре и толщине слоя воздуха над поверхностью плотной питательной среды от 25 мм до 40 мм.

Изобретение относится к области биотехнологии, вирусологии и медицины. Предложен реассортантный вирус гриппа для производства вакцин.

Изобретение относится к области биотехнологии и касается синтетических олигонуклеотидов-праймеров. Представленные праймеры фланкируют участки генов PB2, PB1, PA, NP, MP, NS низкопатогенных вирусов гриппа птиц и не дают перекрестных реакций с родственными видам.
Изобретение относится к области вирусологии и касается штамма вируса гриппа H10N7-cyбтипа. Охарактеризованный штамм вируса гриппа A/pochard/Siberia/249/08-МА H10N7-субтипа выделен из клоакального смыва красноголового нырка и адаптирован к линии BALB/c мышей.

Изобретение относится к области молекулярной биологии, вирусологии, генной инженерии, биотехнологии и ветеринарии. Предложена рекомбинантная вакцина, содержащая рекомбинантный вирус и фармацевтически приемлемые носитель, адъювант или эксципиент, где рекомбинантный вирус является инактивированным и содержится в вакцине в виде вирусного вектора, имеющего введенную экзогенную нуклеотидную последовательность, которая кодирует антиген заболевания, где инактивацию вируса проводят физическими или химическими методами, и вакцина является эффективной против, по меньшей мере, указанного заболевания, связанного с указанным антигеном.

Изобретение относится к области биотехнологии и касается рекомбинантных векторов, используемых для производства противогриппозных вакцин. Охарактеризованы рекомбинантная псевдоаденовирусная частица на основе генома аденовируса человека 5 серотипа и способ ее использования.

Изобретение относится к области биотехнологии, вирусологии и медицины. Предложен реассортантный вирус гриппа для производства вакцин.

Изобретение относится к области биотехнологии и вирусологии. Представлены выделенные штаммы вируса гриппа, которые способны инфицировать собачьих и вызывать респираторное заболевание в собачьих.

Изобретение относится к области медицинской биотехнологии и касается штаммов вируса гриппа. Представлен штамм вируса гриппа A/Гонконг/1/68/162/35 (H3N2), депонированный в Государственную коллекцию вирусов научно-исследовательского института вирусологии им.

Изобретение относится к области биотехнологии и касается рекомбинантных векторов, используемых для производства противогриппозных вакцин. Охарактеризованы рекомбинантная псевдоаденовирусная частица на основе генома аденовируса человека 5 серотипа и способ ее использования.

Изобретение относится к области биотехнологии и касается рекомбинантных векторов, которые могут быть использованы для противогриппозных вакцин. Охарактеризованы рекомбинантная псевдоаденовирусная частица на основе генома аденовируса человека 5 серотипа и способ ее использования в качестве компонента для создания вакцины против вируса гриппа А субтипа H1N1.
Изобретение относится к области медицинской вирусологии. Предложен вакцинный штамм вируса гриппа A/17/mallard/Нидерланды/00/95(H7N3), характеризующийся температурочувствительностью и высокой степенью холодоадаптированности.

Группа изобретений относится к области биотехнологии. Предложены способы очистки инактивированного вируса или фрагментированного вируса (варианты).
Изобретение относится к области микробиологии и касается штамма вируса гриппа H16N3-субтипа. Описан штамм вируса гриппа птиц A/common gull/Altai/804/2011/H16N3-субтипа, депонирован в Государственной Коллекции вирусных инфекций и риккетсиозов Федерального бюджетного учреждения науки «Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии «Вектор» под регистрационным номером V-583.

Изобретение относится к области биотехнологии и медицины и касается вакцины против гриппа, вызываемого известными штаммами вирусов гриппа А и В, а также возможными реассортантами. Предложенная поливалентная вакцина против гриппа получена на основе гибридного белка, включающего фрагменты белков Н1, Н3 и Н5 вируса гриппа А, фрагмент гемагглютинина вируса гриппа В и компоненты флагеллина - FliC1 и FliC2 (SEQ ID NO:1), соединенные гибкими мостиками. Кодирующая белок нуклеотидная последовательность (SEQ ID NO:2) оптимизирована для высокоэффективной экспрессии в клетках Escherichia coli. Использование охарактеризованной вакцины позволит обеспечить универсальную защиту от гриппа. 2 з.п. ф-лы, 4 ил., 1 табл., 13 пр.
Наверх