Штамм азотфиксирующих бактерий pseudomonas sp. для получения биопрепарата против заболеваний пшеницы, вызываемых фитопатогенными грибами, и повышения урожайности

Авторы патента:

 


Владельцы патента RU 2529958:

Закрытое акционерное общество научно-производственное предприятие "Биомедхим" (ЗАО НПП "Биомедхим") (RU)
Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт биологии Уфимского научного центра РАН (ФГБУН ИБ УНЦ РАН) (RU)

Изобретение относится к микробиологии. Штамм бактерий Pseudomonas sp. ИБ-4 обладает высокой продуктивностью, нитрогеназной и ростстимулирующей активностями. Штамм бактерий Pseudomonas sp. депонирован во Всероссийской коллекции микроорганизмов под регистрационным номером ВКМ В-2830D и может быть использован при получении биопрепарата для снижения заболеваемости растений, вызываемой фитопатогенными грибами, и повышения урожайности растений. Изобретение позволяет повысить урожай пшеницы., 6 табл., 5 пр.

 

Изобретение относится к сельскохозяйственной микробиологии и касается штамма, который оказывает антагонистическое действие на возбудителей заболеваний пшеницы твердой головней и корневыми гнилями, обладающего нитрогеназной (способностью к фиксации атмосферного азота) и ростстимулирующей активностью. Новый штамм может быть реализован в микробиологической промышленности для получения биопрепарата для защиты сельскохозяйственных растений от болезней и повышения урожайности.

Известен штамм Pseudomonas sp. ЦМПМ В-348, используемый для получения препарата при защите злаковых от возбудителя обыкновенной корневой гнили Helminthosporium sativum [1]. Однако этот штамм неэффективен для подавления корневой гнили злаков, вызываемой комплексом грибов Fusarium spp. и Helminthosporium sativum.

Известны штаммы Pseudomonas putida, подавляющие рост фитопатогенного гриба Fusarium oxysporum [2] и Pseudomonas putida BKM B-1743 Д, подавляющий рост грибов рода Fusarium [3]. Недостатками известных штаммов является узкий спектр антагонистического действия.

Наиболее близкими к заявляемому является штаммы Pseudomonas aureofaciens ИБ 51 и Pseudomonas putida ИБ 17 [4, 5], обладающие способностью оказывать антагонистическое действие на возбудителей заболеваний пшеницы твердой головней и корневыми гнилями. Недостатком штаммов является их сравнительно невысокая антагонистическая активность и неспособность к фиксации атмосферного азота и синтезу ростстимулирующих веществ, т.е. отсутствие комплексности воздействия на фитопатогены и растения.

Технической задачей изобретения является выделение нового природного штамма с широким спектром антагонистического действия на возбудителей грибных заболеваний пшеницы, в том числе и твердой головни, обладающего нитрогеназной и ростстимулирующей активностью.

Поставленная задача достигается выявлением и использованием штамма Pseudomonas sp. ИБ-4, выделенного из образца пахотной почвы Республики Башкортостан. Штамм депонирован во Всероссийскую коллекцию микроорганизмов с регистрационным номером ВКМ В - 2830D.

1. Культурально-морфологические признаки.

1.1. На агаризованной питательной среде, имеющей состав, г/л: KH2PO4 - 0,3; CaHPO4 - 0,2; MgSO4 - 0,3; K2SO4 - 0,2; NaCl - 0,5; FeCl3 - 0,01; CaCO3 - 5,0; сахароза - 20 г; агар - 1,5%; смесь микроэлементов - 1 мл; дистиллированная вода до 1000 мл, рН 6,8-7,2 культура образует круглые колонии диаметром 3-4 мм, с гладкой блестящей поверхностью, выпуклые, прозрачные, с гладкими краями, мягкой тягучей консистенции. На 24 часу роста клетки - мелкие палочки 0,5×1,5 мкм, подвижные.

1.2. На жидкой питательной среде Федорова с мелассой, имеющей состав, г/л: K2HPO4 - 0,3; CaHPO4 - 0,2; MgSO4 - 0,3; K2SO4 - 0,2; NaCl - 0,5; FeCl3 - 0,01; СаСО3 - 5,0; меласса - 40 г; смесь микроэлементов - 1 мл; рН 6,8-7,0, выращивание при температуре 28°C и режиме аэрации-перемешивания 180 об/мин в течение 48 часов. Круглые колонии диаметром 0,5 см, выпуклые с ровными краями, слизистой консистенции.

1.3. На питательной среде КГА колонии круглые диаметром 6 мм, выпуклые, белого полупрозрачного цвета, консистенция тягучая мягкая. Пигмента не образуют. На 24 часу роста - мелкие подвижные палочки.

2. Физиолого-биохимические признаки.

Штамм является аэробным микроорганизмом, оптимальная температура роста 28°C.

Отношение к источникам углерода: очень хорошо усваивает глюкозу, сахарозу; хорошо усваивает маннит, мальтозу, ксилозу, сорбит, рамнозу, лактозу, декстрин, галактозу, маннозу, глицерин, фруктозу, этанол; слабо усваивает арабинозу, мезоинозитол.

Отношение к источникам азота: растет на безазотистых средах, сохраняя высокую продуктивность не менее 8·1010 кл/мл.

Штамм хранится на косяках со средой Федорова в холодильнике с пересевом на свежие косяки через 2-4 месяца, а также в лиофильновысушенном состоянии.

Штамм идентифицирован по определителю Bergey Manual of Determinative Bacteriology.

Пример 1. Для сравнения продуктивности нового штамма Pseudomonas sp. ИБ-4 с известными штаммами Pseudomonas aureofaciens ИБ 51 и Pseudomonas putida ИБ 17 проводили выращивание в колбах на качалке при температуре 28-30°C в течение 48 ч в условиях аэрации на жидкой питательной среде LB следующего состава, г/л: пептон - 10,0; дрожжевой экстракт - 5,0; натрий хлористый - 10,0; вода водопроводная до 1 л. Результаты приведены в табл. 1 и свидетельствуют о более высокой продуктивности предлагаемого штамма, чем у штаммов по прототипу. Высокое значение продуктивности предлагаемого штамма отмечено и при культивировании на других питательных средах (табл. 2).

Пример 2. Изучение антагонистической активности нового штамма Pseudomonas sp. ИБ-4.

На чашки Петри с агаризованной средой КГА (картофель тертый 200 г; глюкоза 20 г; агар 20 г; вода водопроводная 1 л) высевают сплошным газоном суспензию спор грибного фитопатогена. Затем в эти же чашки уколом сажают бактерии штамма Pseudomonas sp. ИБ-4. Чашки инкубируют при 28°C в течение 3 суток. Учет проводят по зонам отсутствия или подавления роста гриба вокруг колонии штамма. Результаты приведены в табл. 3 и свидетельствуют о широком спектре и высокой величине антагонистического действия нового штамма.

Пример 3. Антагонистическое действие нового штамма против комплекса возбудителей корневых гнилей пшеницы испытывают в лабораторных условиях на пшенице сорта "Жница" с естественным уровнем заражения посевного материала, полученного в условиях опытного поля Института биологии УНЦ РАН. Посевной материал дополнительно инфицируют спорами фитопатогенных грибов Fusarium oxysporum и Bipolaris sorokiniana (титр споровой суспензии обоих патогенов составил 5·104 КОЕ/мл). Семена пшеницы обрабатывают суспензией штамма (с титром 109 КОЕ/мл) из расчета 1 мл суспензии на 1 кг семян. Семена переносят на увлажненную до полной влагоемкости полоску фильтровальной бумаги, поверх которой накладывают полоску полиэтилена, сворачивают в рулон, помещают вертикально в лабораторный стакан и оставляют при комнатной температуре. В контрольных опытах обработку семян осуществляют водопроводной водой. Эксперимент выполняют в четырехкратной повторности. Обработку результатов проводят через 7 дней. Эффективность штамма определяют при сопоставлении степени проявления корневых гнилей проростков пшеницы в опыте и контроле. Результаты приведены в табл.4.

Пример 4. Антагонистическое действие штамма против возбудителя твердой головни пшеницы испытывали на пшенице сорта "Жница", искусственно зараженной Tilletia caries, в условиях закрытого грунта в теплице. Заспорение спорами твердой головни осуществляли из расчета 1-2 г спор на 1 кг зерна. Семена пшеницы обрабатывали суспензией штамма (с титром 109 КОЕ/мл) из расчета 1 мл суспензии на 50 г семян и высаживали в вегетационные сосуды по 60 штук с учетом всхожести данного сорта пшеницы. В контрольных экспериментах обработку семян осуществляли водопроводной водой. Эксперименты выполняли в трехкратной повторности.

Эффективность штамма определяли при сопоставлении степени проявления заболевания растений твердой головней в опыте и контроле в период молочно-восковой спелости зерна. Результаты приведены в табл.5.

Как свидетельствуют результаты эксперимента, биологическая эффективность подавления твердой головни на пшенице у штамма Pseudomonas sp. ИБ-4 составляет 60,0%, при 52,7% у выбранного аналога.

Пример 5. Определение ростстимулирующей активности заявляемого штамма.

Некоторые микроорганизмы, обитающие в ризосфере растений, способны синтезировать цитокинины. Цитокинины представляют собой природные соединения, участвующие в гормональной регуляции онтогенеза растений, характеризующиеся способностью индуцировать деление растительных клеток и являющиеся наиболее активными среди открытых рострегулирующих веществ. Наличие цитокининов в культуральной жидкости обуславливает наличие ростстимулирующей активности микроорганизма. Образование заявляемым штаммом цитокининов с концентрацией 300 нг/мл культуральной жидкости обнаружено методом непрямого конкурентного иммуноферментного анализа [6].

Пример 6. Штамм Pseudomonas sp. ИБ-4 обладает нитрогеназной активностью (определяли ацетиленовым методом), сопоставимой по величине с активностями азотфиксирующих микроорганизмов рода Azotobacter (табл. 6), предлагаемых для использования под различные сельскохозяйственные культуры [7-10].

Таким образом, выделен новый штамм Pseudomonas sp. ИБ-4 с широким спектром и величиной антагонистического действия на возбудителей грибных заболеваний пшеницы, в том числе против возбудителя твердой головни Tilletia caries, обладающий высокой продуктивностью, нитрогеназной и ростстимулирующей активностью, что в целом позволяет увеличить урожай в 1,84 раза.

Таблица 1
Продуктивность штамма Pseudomonas sp. ИБ-4 на среде LB
Штамм Время ферментации, ч Число жизнеспособных клеток (КОЕ), млрд/мл
Pseudomonas sp. ИБ-4 48 10
ИБ 51 (по прототипу) 48 1
ИБ 17 (по прототипу) 48 1
Таблица 2
Титр микроорганизмов Pseudomonas sp. ИБ-4 при культивировании на различных питательных средах (КОЕ), млрд/мл
Питательная среда Время ферментации, ч
24 36 48
КГА 0,1 2,2 21
Федорова 0,4 2,8 33
С-40 0,4 5,5 95
Таблица 3
Антагонистическое действие штаммов Pseudomonas sp. ИБ-4 и штаммов по прототипу на грибные фитопатогены
Вид фитопатогенных грибов Диаметр зоны подавления роста гриба, мм
Штаммы
Pseudomonas sp. ИБ-4 ИБ 51 ИБ 17
Fusarium culmorum 29 9 14
Fusarium gibbosum 28 35 12
Fusarium graminesrum 28 7 26
Fusarium nivale 33 31 12
Fusarium semitectum 32 9 26
Fusarium solani 18 9 12
Bipolaris sorokiniana 49 55 22
Penicillium funiculosum 33 31 14
Fusarium oxysporum 32 29 -
Alternaria altemata 48 19 18
Таблица 4
Эффективность нового штамма Pseudomonas sp. ИБ-4 против корневых гнилей пшеницы
Варианты опытов Развитие болезни проростков пшеницы, %
Altemaria + Penicillium Bipolaris sorokiniana Fusarium oxysporum
Контроль 28,0 6,3 2,2
ИБ 51 (Прототип) 16,0 4,3 0,0
ИБ 17 (Прототип) 16,0 4,8 0,7
Paenibacillus sp. ИБ-1 12,0 4,0 0,0
Таблица 5
Эффективность нового штамма Pseudomonas sp. ИБ-4 против твердой головни пшеницы
Варианты опытов Пораженность твердой головней, % Биологическая эффективность подавления болезни, % Вес валового урожая по отношению к контролю, %
Контроль 55,0 - 100,00
ИБ 51 (Прототип) 26,0 52,7 173,5
Paenibacillus sp. ИБ-1 22,0 60,0 184,0
Таблица 6
Нитрогеназная активность предлагаемого штамма Pseudomonas sp. ИБ-4 и свободноживущих азотфиксаторов
Культура Нитрогеназная активность, мкг N2/мл/час
Pseudomonas sp. ИБ-4 0,68
Azotobacter chroococcum В 35 [8] 0,26
Azotobacter chroococcum Ш 25 [9] 0,45
Azotobacter chroococcum Ц 40 [10] 0,11
Azotobacter chroococcum Б 1 [11] 0,22

Список литературы

1. Авторское свидетельство СССР 1464468, кл. A01N 63/00, 1988.

2. Патент США 4714614, кл. 424-93, 1987.

3. Патент RU 1805849, кл. A01N 63/00, 1993.

4. Патент RU №2203945, кл. C12N 1/20, 2003.

5. Патент RU №2213774, кл. C12N 1/20, 2003.

6. Кудоярова Г.Р., Веселов С.Ю., Каравайко Н.Н., Гюли-заде В.З., Чередова Е.П., Мустафина А.Р., Мошков И.Е., Кунаева О.Н. Иммуноферментная система для определения цитокининов // Физиология растений. - 1990. - Т.37, вып.1. - С.193-199.

7. Патент RU №2074159, кл. C05F 11/08, 1997.

8. Патент RU №2074158, кл. C05F 11/08, 1997.

9. Патент RU №2074157, кл. C05F 11/08, 1997.

10. Патент RU №2076088, кл. C05F 11/08, 1997.

Штамм бактерий Pseudomonas sp., депонированный во Всероссийской коллекции микроорганизмов под регистрационным номером ВКМ В-2830D, для получения препарата против заболеваний пшеницы, вызываемых фитопатогенными грибами, и повышения урожайности.



 

Похожие патенты:

Группа изобретений относится к биотехнологии. Предложен способ обогащения пробиотических микроорганизмов, выбранных из дрожжей и бактерий, органическим селеном.

Изобретение относится к области микробиологии. Предложен штамм бактерий Pseudomonas stutzeri ВКПМ B-11230 - деструктор нефтяных алифатических и ароматических углеводородов, стимулятор роста растений в ассоциации с растениями.
Изобретение относится к биотехнологии, в частности к ветеринарной микробиологии. Определяют чувствительность бактерий, вызывающих кишечные инфекции, к комплексным антибактериальным препаратам.
Изобретение относится к биотехнологии, а именно к получению питательных сред, которые создают оптимальные условия для выделения и выращивания бруцеллезного микроба.
Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано в микробиологии. Питательная среда содержит дигидрофосфат калия, гидрофосфат калия, сульфат магния гептагидрат, хлорид натрия, сульфат кальция дигидрат, молибдат натрия, сульфат железа(II), сахарозу, фосфорит и дистиллированную воду в заданном соотношении компонентов.
Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано в микробиологии. Питательная среда содержит дигидрофосфат калия, гидрофосфат калия, сульфат магния гептагидрат, хлорид натрия, сульфат кальция дигидрат, молибдат натрия, сульфат железа (II), сахарозу, вермикулит и воду в заданном соотношении компонентов.

Группа изобретений относится к биотехнологии. Предложен штамм Lactobacillus fermentum ВКМ В-2793D, обладающий антагонистической активностью по отношению к патогенным и условно-патогенным микроорганизмам.

Группа изобретений относится к биотехнологии. Предложены штамм Enterococcus faecium 8G-1 (NRRL В-50173), штамм Enterococcus faecium 8G-73 (NRRL B-50172) и штамм Bacillus pumilus 8G-134 (NRRL B-50174), обеспечивающие улучшение состояния здоровья жвачных животных.

Изобретение относится к биотехнологии. Предложен способ получения миллерита путем помещения чистой культуры сульфатредуцирующих бактерий, устойчивых к ионам меди и других металлов, в синтетическую среду, содержащую соли металлов, с добавлением двухвалентного никеля и питательных веществ, включающих в себя растворы витаминов, солей калия, аммония, натрия, кальция, кофакторов, лактата, сульфида натрия.
Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано в микробиологии и сельском хозяйстве. Питательная среда содержит дигидрофосфат калия, гидрофосфат калия, сульфат магния гептагидрат, хлорид натрия, сульфат кальция дигидрат, молибдат натрия, сульфат железа (II), сахарозу, сапропель и воду в заданном соотношении компонентов.
Изобретение относится к области сельского хозяйства и мелиорации. Способ включает подготовку почвы, внесение в почвенный слой природного кремнийсодержащего минерального сорбента-мелиоранта, посев или посадку семян, уход за посевами и уборку урожая.

Изобретение относится к сельскому хозяйству. Гуминовое производное для применения в качестве регулятора роста растений содержит силанольные группы, характеризуется водорастворимостью в щелочной среде, и способностью к необратимой сорбции на твердой подложке, содержащей на поверхности -ОН группы.
Изобретения относятся к биохимии. Предложен штамм бактерий Bacillus amyloliquefaciens ВКПМ В-11475, обладающий фунгицидным и бактерицидным действием.

Группа изобретений, включающая штамм одноклеточных зеленых водорослей Parachlorella nurekis и его применение для уничтожения цианобактерий, относится к биотехнологии. Штамм Parachlorella nurekis 1904 KIEG депонирован в Коллекции Культур Водорослей и Протозоа (Culture Collection of Algae and Protozoa, CCAP), Морской институт Шотландии, Данбег, ОБАН, Аргайл, РАЗУ 1QA, Шотландия, Соединенное Королевство (Scottish Marine Institute, Dunbeg, OBAN, Argyll, PA37 1QA, Scotland, UK) под регистрационным номером CCAP №259/1 и может быть применен для уничтожения цианобактерий.
Изобретение относится к области сельского хозяйства, а именно к виноградарству. Способ включает исходно-однократный высев через ряд кустов винограда по 3-годичным агротехнологическим циклам в незасеянное в предыдущем цикле междурядье озимого тритикале чередующихся в циклах сортов селекции КНИИСХ им.
Изобретение относится к сельскому хозяйству и может быть использовано для истребления крыс и мышей. Родентицидный состав включает действующее вещество - яд острого действия, гелеобразующее вещество, краситель.
Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано при получении симбиотических бактерий рода Xenorhabdus, выделенных из нематод вида Steinernema feltiae protense. Способ предусматривает выращивание на питательной среде симбиотических бактерий рода Xenorhabdus, выделенных из нематод вида Steinernema feltiae protense.
Изобретение относится к сельскому хозяйству. Родентицидный состав включает действующее вещество - антикоагулянт, гелеобразующее вещество, стабилизатор, краситель и воду.

Изобретение относится к биотехнологии и сельскому хозяйству Предложена антидотная композиция, состоящая из биомассы Bacillus megaterium, Pseudomonas aureofaciens либо других непатогенных бактерий, содержащих биополимер поли-бета-гидроксимасляную кислоту в количестве не менее 0,4 мас.% в расчете на финальную композицию, гидролизованной с помощью микромицетов рода Cephaliophora при температуре 50-60°С, а также определенного набора макро- и микроэлементов: азот (валовый N) 3,6-15,4 мас.%, фосфор (валовое содержание в пересчете на P2O5) 6,0-10,2 мас.%, калий (валовое содержание в пересчете на K2O) 2,1-8,0 мас.%, магний (валовое содержание в пересчете на MgO) 0,5-4,8 мас.%, сера (валовое содержание в пересчете на SO4 2-) 2,5-6,7 мас.%.
Изобретение относится к сельскому хозяйству. Композиция адъюванта содержит в расчете на 100 частей масс.: (a) от 25 ч.

Изобретение относится к области сельского хозяйства, в частности к виноградарству. Способ включает исходно-однократный высев через ряд кустов винограда по 3-годичным агротехнологическим циклам в незасеянное в предыдущем цикле междурядье озимого тритикале чередующихся в циклах сортов. Ежегодно в циклах подкашивают зеленую массу при выходе растения тритикале в трубку весной, летом заделывают в почву междурядий созревшую растительную биомассу тритикале с колосьями зерна. Совместно с созревшей биомассой и колосьями зерна тритикале в почву заделывают 2-годичный компост из равнодолевой смеси мезги и измельченной лозы обрезки виноградных кустов с их соотношением 1/1 по массе с расходом 500 кг/га, обогащенный в процессе приготовления раствором агробиологического стимулятора эффективных микроорганизмов «Байкал ЭМ-1» на основе питательной среды «ЭМ-патока» нормой расхода 200 л/т компостной смеси мезги и измельченной лозы. Способ увеличивает естественное плодородие почвы, продуктивность виноградников, повышает качество винограда и пищевую безопасность виноградовинодельческих продуктов за счет сокращения в них пестицидных остатков, обеспечивает увеличение и стабилизацию оптимального экологического потенциала и санитарно-токсикологического состояния агроугодий виноградных насаждений. 1 табл.
Наверх