Селективная питательная среда для выделения псевдомонад, сухая
Владельцы патента RU 2530549:
Федеральное бюджетное учреждение науки Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии (ФБУН ГНЦ ПМБ) (RU)
Изобретение относится к санитарной и клинической микробиологии. Питательная среда содержит панкреатический гидролизат казеина, пептон мясной, дрожжевой экстракт, натрий хлористый, калий фосфорнокислый двузамещенный, калий фосфорнокислый однозамещенный, магний сернокислый, цетримид, агар бактериологический, натрий углекислый, налидиксовую кислоту, глицерин и дистиллированную воду в заданном соотношении компонентов. Изобретение позволяет упростить идентификацию псевдомонад и повысить эффективность диагностики при проведении клинических и санитарно-микробиологических исследований. 2 табл., 3 пр.
Изобретение относится к санитарной и клинической микробиологии и может быть использовано для выделения Pseudomonas aeruginosa из клинического материала, объектов внешней среды, пищевых продуктов и др.
Ведущими зарубежными фирмами выпускаются питательные среды агары с цетримидом на основе желатина, мясного пептона и лактозы, а также содержащие калий сернокислый, магний хлористый, цетримид, агар, налидиксовую кислоту и глицерин. Cetrimide Agar (Pseudomonas Selectice Agar Base) фирмы Fluka (Scientific research 2003/2004, стр.361), ООО «ГЕМ» (Среды бактериологические. Каталог 2012,). Cetrimide Agar Base HiMedia (HiMedia Laboratories Pvt. Limited (Индия), http://www.himedialabs.com). Селективный агар для псевдомонад, основа Merck «Микробиология, 2004/2005, стр.236.
Наиболее близкой по назначению к предлагаемой среде является Cetrimide Agar (Pseudomonas Selectice Agar Base) фирмы Fluka, состоящий из следующих компонентов, г/л:
| Пептон из желатина | 20.0 |
| Калий сернокислый | 10.0 |
| Магний хлористый | 1.4 |
| Цетримид | 0.3 |
| Агар | 15,0 |
| Глицерин | 10,0 мл |
В связи с отсутствием отечественной коммерческой среды с цетримидом для выделения Pseudomonas aeruginosa из различных объектов, контроль пищевых продуктов проводят на агаре с цетримидом, лабораторного приготовления ГОСТ 54755-2011 «Продукты пищевые. Методы выявления и определения количества бактерий вида Pseudomonas aeruginosa». М.: Стандартинформ 2012 г., XII Государственная Фармакопея Российской Федерации. - М.: 2007.
Компонентное содержание Агара с цетримидом различных производителей в г/л представлено в таблице 1.
| Таблица 1 | ||||||
| Компонентный состав Агара с цетримидом различных производителей, г/л | ||||||
| № п/п | Компонентный состав | Fluka | ООО «ГЕМ» |
Merck | HiMedia | ГОСТ 54755-2011 «Продукты пищевые |
| 1. | Пептон из желатина | 20.0 | 20,0 | 20,0 | 20,0 | 20,0 |
| 2. | Пептон мясной | - | 10,0 | - | - | - |
| 3. | Калий сернокислый | 10.0 | 10,0 | 10,0 | 10,0 | 10,0 |
| 4. | Магний хлористый | 1.4 | 1,4 | 1,4 | 1,4 | 1,4 |
| 5. | Цетримид | 0.3 | 0,3 | 0,3 | 0,3 | 0,3 |
| 6. | Агар | 15 | 13,6 | 13,0 | 15,0 | 15,0 |
| 7. | Налидиксовая кислота | 0,15 мкг | ||||
| Глицерин | 10,0 мл | |||||
| рН | 7,2±0,2 |
Техническим результатом изобретения является создание отечественной сухой питательной среды для выделения псевдомонад, сухой (Цетримидный агар), обеспечивающей стабильность результатов по ростовым, дифференцирующим и ингибирующим свойствам.
Технический результат достигается сбалансированностью компонентного состава среды, которая содержит панкреатический гидролизат казеина производства НПО ПС, пептон мясной, дрожжевой экстракт, натрий хлористый, магний сернокислый, цетримид, агар микробиологический, натрий углекислый, буферную смесь, состоящую из калия фосфорнокислого двузамещенного и калия фосфорнокислого однозамещенного, а также дополнительно налидиксовую кислоту при следующем соотношении компонентов, г/л:
| Панкреатический гидролизат казеина | 10,0 |
| Пептон мясной | 10,0 |
| Дрожжевой экстракт | 2,0 |
| Натрий хлористый | 5,0 |
| Калий фосфорнокислый двузамещенный | 1,0 |
| Калий фосфорнокислый однозамещенный | 1,0 |
| Магний сернокислый | 1,5 |
| Цетримид (гексадецилтриметиламмоний бромид) | 0,3 |
| Агар бактериологический | 10,0 |
| Натрий углекислый | 0,3 |
| Налидиксовая кислота | 0,01 |
| Глицерин | 10,0 мл |
Отличием предлагаемой среды от прототипа является
- замена магния хлористого на магний сернокислый, что в присутствии фосфатов калия приводит к усилению образования пигмента пиоцианина;
- замена калия сернокислого на одно- и двузамещенные фосфаты калия, что улучшает дифференцирующие свойства за счет поддержания буферной емкости среды;
- доказана возможность замены пептонов из желатина на панкреатический гидролизат казеина, выпускаемый в НПО ПС, с сохранением всех биологических свойств питательной среды;
- в состав питательной среды дополнительно внесен дрожжевой экстракт, содержащий витамины группы В, что стимулирует оптимальные условия роста псевдомонад;
- в состав питательной среды дополнительно внесена налидиксовая кислота для усиления ингибирующего эффекта в отношении сопутствующей микрофлоры;
- в состав питательной среды для сохранения молярного баланса ионов введен хлористый натрий.
Питательную среду готовят следующим образом:
Пример 1: Для приготовления питательной среды берут следующие навески компонентов
| Панкреатический гидролизат казеина | 10,0±2,0 |
| Пептон мясной | 10,0±2,0 |
| Дрожжевой экстракт | 2,0±0,5 |
| Натрий хлористый | 5,0±1,0 |
| Калий фосфорнокислый двузамещенный | 1,0±0,1 |
| Калий фосфорнокислый однозамещенный | 1,0±0,1 |
| Магний сернокислый | 1,5±0,1 |
| Цетримид (гексадецилтриметиламмоний бромид) | 0,3±0,05 |
| Агар бактериологический | 10,0±3,0 |
| Натрий углекислый | 0,3±0,1 |
| Налидиксовая кислота | 0,01±0,002 |
| Глицерин | 10,0±2,0 мл |
Навески тщательно размешивают в 1000 мл дистиллированной воды, нагревают до расплавления агара и добавляют 10 мл глицерина, кипятят 2 мин до полного расплавления агара, фильтруют через ватно-марлевый фильтр. Автоклавируют 15 минут при температуре 121°С. Среду охлаждают до температуры 45-50°С, разливают в стерильные чашки Петри. После застывания среды чашки подсушивают.
Для биологического контроля предлагаемой питательной среды используют культуры музейных штаммов: P. aeruginosa 453, P. aeruginosa 27/99, P. aeruginosa 10145, P. aeruginosa 27853 из разведения 10~6 S. typhimurium 79, Е. coli 055.К59 3912/41, P. mirabilis 3177 из разведения 10-3, S. aureus 209-Р из разведения 10-6. Все посевы инкубируют аэробно при температуре 37±1°С в течение 44-48 ч. При учете результатов учитывают наличие и характер роста колоний. Результаты биологического контроля представлены в таблице 2.
Селективная питательная среда для выделения псевдомонад, сухая (Цетримидный агар), приготовленная в соответствии с предложенной рецептурой, обеспечивает рост P. aeruginosa в виде колоний желто-зеленого цвета. Рост сопутствующих грамположительных и грамотрицательных бактерий в значительной степени ингибируется. Разработанная среда соответствует требованиям, предъявляемым к Цетримидному агару по селективности и дифференцирующим свойствам в отношении P. aeruginosa.
Результаты биологического контроля представлены в таблице 2.
Пример 2. Среду готовят в соответствии с примером 1.
| Панкреатический гидролизат казеина | 8,0 |
| Пептон мясной | 8,0 |
| Дрожжевой экстракт | 1,5 |
| Натрий хлористый | 4,0 |
| Калий фосфорнокислый двузамещенный | 0,9 |
| Калий фосфорнокислый однозамещенный | 0,9 |
| Магний сернокислый | 1,4 |
| Цетримид (гексадецилтриметиламмоний бромид) | 0,25 |
| Агар бактериологический | 7,0 |
| Натрий углекислый | 0,2 |
| Налидиксовая кислота | 0,008 |
| Глицерин | 8,0 мл |
Результаты биологического контроля представлены в таблице 2 и аналогичны результатам проверки по примеру 1.
| Панкреатический гидролизат казеина | 10,0 |
| Пептон мясной | 10,0 |
| Дрожжевой экстракт | 2,0 |
| Натрий хлористый | 5,0 |
| Калий фосфорнокислый двузамещенный | 1,0 |
| Калий фосфорнокислый однозамещенный | 1,0 |
| Магний сернокислый | 1,5 |
| Цетримид (гексадецилтриметиламмоний бромид) | 0,3 |
| Агар бактериологический | 10,0 |
| Натрий углекислый | 0,3 |
| Налидиксовая кислота | 0,01 |
| Глицерин | 10,0 мл |
Результаты биологического контроля представлены в таблице 2 и аналогичны результатам проверки по примеру 1.
Пример 3. Среду готовят в соответствии с примером 1.
| Панкреатический гидролизат казеина | 12,0 |
| Пептон мясной | 12,0 |
| Дрожжевой экстракт | 2,5 |
| Натрий хлористый | 6,0 |
| Калий фосфорнокислый двузамещенный | 1,1 |
| Калий фосфорнокислый однозамещенный | 1,1 |
| Магний сернокислый | 1,6 |
| Цетримид (Hexadecyltrimethylammonium bromide) | 0,35 |
| Агар бактериологический | 13,0 |
| Натрий углекислый | 0,4 |
| Налидиксовая кислота | 0,012 |
| Глицерин | 12,0 мл |
Результаты биологического контроля представлены в таблице 2.
Из таблицы видно, что предлагаемая питательная среда, приготовленная в соответствии с примерами 1, 2, 3, обладает хорошими ростовыми свойствами в отношении P. aeruginosa, подавляет рост сальмонелл, протеев и стафилококков.
Изменение количественного соотношения компонентов среды ведет к нарушению биологических показателей качества предложенной среды.
Таким образом, предлагаемая питательная среда обеспечивает стабильность результатов по ростовым, дифференцирующим и ингибирующим свойствам. Использование предлагаемой среды упрощает идентификацию возбудителя из объектов с высокой степенью контаминации P. aeruginosa с возможностью прямого посева на цетримидный агар, что повышает эффективность диагностики при проведении клинических и санитарно-микробиологических исследований.
| Таблица 2 | ||||
| Результаты биологического контроля Цетримидного агара | ||||
| № п/п | Тест-штаммы | Биологические показатели (диаметр (мм), морфология колоний) | ||
| Разведение | Селективный агар для псевдомонад (Цетримидный агар) | Cetrimide Agar (Pseudomonas Se-lectice Agar Base) Fluka | ||
| 1. | P. aeruginosa 453 | 10-6 | 3,0-4,0 колонии желто-зеленые | 3,0-4,0 колонии желто-зеленые |
| 2. | P. aeruginosa 27/99 | 10-6 | 3,0-4,0 колонии желто-зеленые | 3,0-4,0 колонии желто-зеленые |
| 3. | P. aeruginosa 10145 | 10-6 | 4,0 колонии желто-зеленые |
4,0 колонии желто-зеленые |
| 4. | P. aeruginosa 27853 | 10-6 | 4,5-5,0 колонии желто-зеленые | 4,5-5,0 колонии желто-зеленые |
| 5. | S. typhimurium 79 | 10-3 | рост отсутствует | рост отсутствует |
| 6. | Е. coli 055.К59 3912/41 | 10-3 | рост отсутствует | рост отсутствует |
| 7. | P. mirabilis 3177 | 10-3 | рост отсутствует | рост отсутствует |
| 8. | S. aureus 209-Р | 10-1 | рост отсутствует | рост отсутствует |
Селективная питательная среда для выделения псевдомонад, сухая, содержащая питательную основу, соли калия и магния, цетримид и глицерин, отличающаяся тем, что в качестве питательной основы она содержит панкреатический гидролизат казеина и дополнительно экстракт пекарных дрожжей, калий фосфорнокислый двузамещенный, калий фосфорнокислый однозамещенный, магний сернокислый, натрий хлористый, натрий углекислый, налидиксовую кислоту при следующем соотношении компонентов, г/л:
| Панкреатический гидролизат казеина | 10,0±2,0 |
| Пептон мясной | 10,0±2,0 |
| Дрожжевой экстракт | 2,0±0,5 |
| Натрий хлористый | 5,0±1,0 |
| Калий фосфорнокислый двузамещенный | 1,0±0,1 |
| Калий фосфорнокислый однозамещенный | 1,0±0,1 |
| Магний сернокислый | 1,5±0,1 |
| Цетримид (Hexadecyltrimethylammonium bromide) | 0,3±0,05 |
| Агар бактериологический | 10,0±3,0 |
| Натрий углекислый | 0,3±0,1 |
| Налидиксовая кислота | 0,01±0,002 |
| Глицерин Дистиллированная вода |
10,0±2,0 мл до 1 л |
