Слитый белок dlk1-fc и его применение для ингибирования метастазов рака, полинуклеотид, кодирующий белок, вектор, клетка-хозяин, способ получения слитого белка, композиция и способ ингибирования метастазов рака



Слитый белок dlk1-fc и его применение для ингибирования метастазов рака, полинуклеотид, кодирующий белок, вектор, клетка-хозяин, способ получения слитого белка, композиция и способ ингибирования метастазов рака
Слитый белок dlk1-fc и его применение для ингибирования метастазов рака, полинуклеотид, кодирующий белок, вектор, клетка-хозяин, способ получения слитого белка, композиция и способ ингибирования метастазов рака
Слитый белок dlk1-fc и его применение для ингибирования метастазов рака, полинуклеотид, кодирующий белок, вектор, клетка-хозяин, способ получения слитого белка, композиция и способ ингибирования метастазов рака
Слитый белок dlk1-fc и его применение для ингибирования метастазов рака, полинуклеотид, кодирующий белок, вектор, клетка-хозяин, способ получения слитого белка, композиция и способ ингибирования метастазов рака
Слитый белок dlk1-fc и его применение для ингибирования метастазов рака, полинуклеотид, кодирующий белок, вектор, клетка-хозяин, способ получения слитого белка, композиция и способ ингибирования метастазов рака
Слитый белок dlk1-fc и его применение для ингибирования метастазов рака, полинуклеотид, кодирующий белок, вектор, клетка-хозяин, способ получения слитого белка, композиция и способ ингибирования метастазов рака
Слитый белок dlk1-fc и его применение для ингибирования метастазов рака, полинуклеотид, кодирующий белок, вектор, клетка-хозяин, способ получения слитого белка, композиция и способ ингибирования метастазов рака
Слитый белок dlk1-fc и его применение для ингибирования метастазов рака, полинуклеотид, кодирующий белок, вектор, клетка-хозяин, способ получения слитого белка, композиция и способ ингибирования метастазов рака
Слитый белок dlk1-fc и его применение для ингибирования метастазов рака, полинуклеотид, кодирующий белок, вектор, клетка-хозяин, способ получения слитого белка, композиция и способ ингибирования метастазов рака
Слитый белок dlk1-fc и его применение для ингибирования метастазов рака, полинуклеотид, кодирующий белок, вектор, клетка-хозяин, способ получения слитого белка, композиция и способ ингибирования метастазов рака
Слитый белок dlk1-fc и его применение для ингибирования метастазов рака, полинуклеотид, кодирующий белок, вектор, клетка-хозяин, способ получения слитого белка, композиция и способ ингибирования метастазов рака
Слитый белок dlk1-fc и его применение для ингибирования метастазов рака, полинуклеотид, кодирующий белок, вектор, клетка-хозяин, способ получения слитого белка, композиция и способ ингибирования метастазов рака
Слитый белок dlk1-fc и его применение для ингибирования метастазов рака, полинуклеотид, кодирующий белок, вектор, клетка-хозяин, способ получения слитого белка, композиция и способ ингибирования метастазов рака
Слитый белок dlk1-fc и его применение для ингибирования метастазов рака, полинуклеотид, кодирующий белок, вектор, клетка-хозяин, способ получения слитого белка, композиция и способ ингибирования метастазов рака
Слитый белок dlk1-fc и его применение для ингибирования метастазов рака, полинуклеотид, кодирующий белок, вектор, клетка-хозяин, способ получения слитого белка, композиция и способ ингибирования метастазов рака
Слитый белок dlk1-fc и его применение для ингибирования метастазов рака, полинуклеотид, кодирующий белок, вектор, клетка-хозяин, способ получения слитого белка, композиция и способ ингибирования метастазов рака
Слитый белок dlk1-fc и его применение для ингибирования метастазов рака, полинуклеотид, кодирующий белок, вектор, клетка-хозяин, способ получения слитого белка, композиция и способ ингибирования метастазов рака
Слитый белок dlk1-fc и его применение для ингибирования метастазов рака, полинуклеотид, кодирующий белок, вектор, клетка-хозяин, способ получения слитого белка, композиция и способ ингибирования метастазов рака
Слитый белок dlk1-fc и его применение для ингибирования метастазов рака, полинуклеотид, кодирующий белок, вектор, клетка-хозяин, способ получения слитого белка, композиция и способ ингибирования метастазов рака
Слитый белок dlk1-fc и его применение для ингибирования метастазов рака, полинуклеотид, кодирующий белок, вектор, клетка-хозяин, способ получения слитого белка, композиция и способ ингибирования метастазов рака
Слитый белок dlk1-fc и его применение для ингибирования метастазов рака, полинуклеотид, кодирующий белок, вектор, клетка-хозяин, способ получения слитого белка, композиция и способ ингибирования метастазов рака
Слитый белок dlk1-fc и его применение для ингибирования метастазов рака, полинуклеотид, кодирующий белок, вектор, клетка-хозяин, способ получения слитого белка, композиция и способ ингибирования метастазов рака
Слитый белок dlk1-fc и его применение для ингибирования метастазов рака, полинуклеотид, кодирующий белок, вектор, клетка-хозяин, способ получения слитого белка, композиция и способ ингибирования метастазов рака
Слитый белок dlk1-fc и его применение для ингибирования метастазов рака, полинуклеотид, кодирующий белок, вектор, клетка-хозяин, способ получения слитого белка, композиция и способ ингибирования метастазов рака
Слитый белок dlk1-fc и его применение для ингибирования метастазов рака, полинуклеотид, кодирующий белок, вектор, клетка-хозяин, способ получения слитого белка, композиция и способ ингибирования метастазов рака
Слитый белок dlk1-fc и его применение для ингибирования метастазов рака, полинуклеотид, кодирующий белок, вектор, клетка-хозяин, способ получения слитого белка, композиция и способ ингибирования метастазов рака
Слитый белок dlk1-fc и его применение для ингибирования метастазов рака, полинуклеотид, кодирующий белок, вектор, клетка-хозяин, способ получения слитого белка, композиция и способ ингибирования метастазов рака
Слитый белок dlk1-fc и его применение для ингибирования метастазов рака, полинуклеотид, кодирующий белок, вектор, клетка-хозяин, способ получения слитого белка, композиция и способ ингибирования метастазов рака
Слитый белок dlk1-fc и его применение для ингибирования метастазов рака, полинуклеотид, кодирующий белок, вектор, клетка-хозяин, способ получения слитого белка, композиция и способ ингибирования метастазов рака
Слитый белок dlk1-fc и его применение для ингибирования метастазов рака, полинуклеотид, кодирующий белок, вектор, клетка-хозяин, способ получения слитого белка, композиция и способ ингибирования метастазов рака
Слитый белок dlk1-fc и его применение для ингибирования метастазов рака, полинуклеотид, кодирующий белок, вектор, клетка-хозяин, способ получения слитого белка, композиция и способ ингибирования метастазов рака
Слитый белок dlk1-fc и его применение для ингибирования метастазов рака, полинуклеотид, кодирующий белок, вектор, клетка-хозяин, способ получения слитого белка, композиция и способ ингибирования метастазов рака
Слитый белок dlk1-fc и его применение для ингибирования метастазов рака, полинуклеотид, кодирующий белок, вектор, клетка-хозяин, способ получения слитого белка, композиция и способ ингибирования метастазов рака
Слитый белок dlk1-fc и его применение для ингибирования метастазов рака, полинуклеотид, кодирующий белок, вектор, клетка-хозяин, способ получения слитого белка, композиция и способ ингибирования метастазов рака
Слитый белок dlk1-fc и его применение для ингибирования метастазов рака, полинуклеотид, кодирующий белок, вектор, клетка-хозяин, способ получения слитого белка, композиция и способ ингибирования метастазов рака
Слитый белок dlk1-fc и его применение для ингибирования метастазов рака, полинуклеотид, кодирующий белок, вектор, клетка-хозяин, способ получения слитого белка, композиция и способ ингибирования метастазов рака
Слитый белок dlk1-fc и его применение для ингибирования метастазов рака, полинуклеотид, кодирующий белок, вектор, клетка-хозяин, способ получения слитого белка, композиция и способ ингибирования метастазов рака
Слитый белок dlk1-fc и его применение для ингибирования метастазов рака, полинуклеотид, кодирующий белок, вектор, клетка-хозяин, способ получения слитого белка, композиция и способ ингибирования метастазов рака
Слитый белок dlk1-fc и его применение для ингибирования метастазов рака, полинуклеотид, кодирующий белок, вектор, клетка-хозяин, способ получения слитого белка, композиция и способ ингибирования метастазов рака

 


Владельцы патента RU 2531756:

КОРЕЯ РИСЕРЧ ИНСТИТЬЮТ ОФ БАЙОСАЙЕНС ЭНД БАЙОТЕКНОЛОДЖИ (KR)

Представленная группа изобретений относится к области биотехнологии и касается слитого белка DLK1-Fc и его применения для ингибирования метастазов рака, полинуклеотида, кодирующего такой белок, экспрессионного вектора, содержащего полинуклеотид, клетки-хозяина, продуцирующей указанный слитый белок, способа получения слитого белка путем культивирования указанной клетки-хозяина, композиции, содержащей указанный слитый белок, и способа ингибирования метастазов рака. Охарактеризованный слитый белок содержит внеклеточный растворимый домен DLK1, состоящий из аминокислотной последовательности SEQ ID NO:4 и Fc-домена человеческого антитела. Представленная группа изобретений может быть использована для получения лекарственного средства для снижения миграции раковых клеток и ингибирования метастазов рака. 8 н. и 3 з.п. ф-лы, 36 ил., 3 пр.

 

Область, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение относится к композиции для лечения метастазов рака, содержащей слитой белок DLK1-Fc, который обладает способностью ингибировать метастазы рака.

Предшествующий уровень техники

Рак является одним из самых серьезных заболеваний, представляющих угрозу жизни человека. В Южной Корее, рак является причиной № 1 смертности людей за последние несколько лет. В США, по причине смертности, рак занимает второе место после сердечно-сосудистых заболеваний. Несмотря на огромное число исследований, которые проводились ранее и проводятся в настоящее время, раковые заболевания, по сравнению с заболеваниями, которыми когда-либо страдало человечество, достигли катастрофических масштабов, и каждый год уносят миллионы жизней, причем затраты на их лечение исчисляются астрономическими суммами.

Рак можно рассматривать как генетическое заболевание на клеточном уровне, и считается, что развитие этого заболевания происходит из-за возникновения мутаций генов, таких как онкогены и гены-суппрессоры опухоли. Применяемые в настоящее время методы лечения рака включают хирургические операции, химиотерапию, лучевую терапию и иммунотерапию, однако пока еще не существует эффективного решения проблем, связанных с ингибированием роста злокачественной опухоли и ее рецидивов.

Одна из наиболее важных биологических особенностей рака заключается в том, что раковые опухоли могут мигрировать, что является самым главным препятствием при разработке средств для лечения рака. Действительно, при диагностике первичной опухоли, примерно у 60% всех пациентов с солидными опухолями обнаруживается небольшая, но клинически обнаружимая миграция опухоли, и широко известно, что самой главной причиной смерти большинства раковых больных являются метастазы. Процесс метастазирования заключается в проникновении опухолей в локальную ткань с образованием новых сосудов (то есть ангиогенезом), в котором участвует опухолевый ангиогенный фактор (TAF). Новые сосуды, образуемые опухолью, имеют много дефектов, которые позволяют раковым клеткам легко проникать в ткань. Для проникновения клеток раковой опухоли в ткань и ее метастазирования требуется присутствие множества рецепторов на поверхности раковой клетки, таких как ламининовый рецептор, необходимый для адгезии к матриксу и к базальной мембране ткани; различных ферментов, необходимых для растворения стромы нормальных тканей, таких как коллагеназа типа IV, активатор плазминогена и катепсин D; фактора роста, аутокринного фактора миграции опухоли (AMF); а также осуществление экспрессии онкогенов.

Большие надежды возлагаются на разработку веществ, обладающих ингибирующим действием на метастазы, так как в настоящее время почти не существует средств, способных ингибировать метастазы. Уже сообщалось, что вещества, включающие сульфированный полисахарид, N-диазоацетиловое производное глицина, фермент нейраминидазу и фибронектины (FN), обладают ингибирующим действием на метастазы. Но, как известно, ни одно из этих средств не поступало в промышленное производство, и пока нет данных, указывающих на то, что ингибирующие действия на метастазы оказывают сами эти вещества. Если будет разработан эффективный метод ингибирования миграции опухолей, то лечение, которое будет спасать человека от летального исхода, вызываемого метастазами, станет реальностью.

В этих целях был исследован дельта-подобный 1 гомолог (DLK1), являющийся членом семейства рецепторов notch/delta/serrate, который представляет собой трансмембранный гликопротеин, кодируемый геном dlk1, локализованным в положении 14q32, и состоит из 280 внеклеточных областей, содержащих 383 аминокислоты, 24 трансмембранных сегментов и 56 цитоплазматических доменов. Среди доменов во внеклеточной области присутствуют 6 повторяющихся доменов, подобных эпидермальному фактору роста (EGF) и имеющих 3 сайта N-гликозилирования и 7 сайтов О-гликозилирования. Как объяснялось ранее, DLK1 представляет собой трансмембранный белок, причем известно также, что он представляет собой внеклеточную часть белка, которая слущивается с клеточной мембраны под действием фермента, конвертирующего фактор некроза опухоли альфа (TACE), и обладает независимой функцией (Yuhui Wang and Hei Sook Sul, Molecular and cellular biology. 26(14): 5421-5435, 2006).

Было обнаружено, что DLK1 имеет различные формы, размер которых при гликозилировании на клеточной мембране составляет 50~60 кДа (Smas C.M. and Sul H.S., Cell. 73:725-34, 1993), и 4 варианта сплайсинга при альтернативном сплайсинге (Smas C.M. et al., Biochemistry. 33:9257-65, 1994). Из них, два самых больших варианта имеют сайты расщепления протеолитическими ферментами, которые разрезаются ферментом ТАСЕ с образованием двух растворимых форм размером 50 кДа и 25 кДа (Yuhui Wang et al., Journal of Nutrition. 136:2953-2956, 2006) (см. фиг.1).

DLK1 широко известен как фетальный антиген 1 (FA1) (Jensen C.H. et al., European Journal of Biochemistry. 225:83-92, 1994), поскольку он экспрессируется, главным образом, на стадии развития организма в эмбриональной ткани (Smas C.M. et al., Cell. 73:725-34, 1993; Kaneta M. et al., Journal of Immunology. 164:256-64, 2000) и в плаценте, а в частности он экспрессируется в высоких концентрациях в материнской сыворотке. Имеются некоторые сообщения об экспрессии DLK1 в железистых клетках поджелудочной железы (Kaneta M. et al., Journal of Immunology. 164:256-64, 2000), в клетках яичника или в скелетных мышечных трубочках (Floridon C. et al., Differentiation. 66:49-59, 2000). Экспрессия DLK1 в большинстве тканей прекращается после рождения и наблюдается в ограниченном ряде клеток, таких как преадипоциты (Smas C.M. et al., Cell. 73:725-34, 1993), клетки панкреатических островков (Carlsson C et al., Endocrinology. 138:3940-8, 1997), стромальные клетки тимуса (Kaneta M. et al., Journal of Immunology. 164:256-64, 2000) или клетки коры надпочечника (Halder S.K. et al., Endocrinology. 139:3316-28, 1998). Экспрессия DLK1 также известна как моноаллельная экспрессия по отцовской линии, вызываемая метилированием (Schmidt J.V. et al., Genes and Development. 14:1997-2002, 2000; Takada S. et al., Current Biology 10:1135-8, 2000; Wylic A.A. et al, Genome Research. 10:1711-8, 2000).

DLK1 широко известен как преадипоцитарный фактор-1 (Pref-1), который играет определенную роль в ингибировании дифференцировки адипоцитов и который в большинстве случаев исследовался именно с этой точки зрения (Smas C.M. et al., Cell. 73:725-34; Villena J.A. et al., Hormone and Metabolic Research. 34:664-70, 2002). Кроме того, известно, что DLK1, помимо ингибирования дифференцировки адипоцитов, также ингибирует дифференцировку гемопоэтических стволовых клеток (Sakajiri S. et al., Leukemia. 19:1404-10, 2005; Li L et al., Oncogene. 24:4472-6, 2005), регулирует дифференцировку лимфоидных клеток-предшественников (Bauer S.R. et al., Molecular and Cellular Biology. 18:5247-55, 1998; Kaneta M et al., Journal of Immunology. 164:256-64, 2000) и участвует в процессах заживления ран (Samulewicz S.J. et al., Wound Repair and Regeneration. 10:215-21, 2002). Однако до сих пор почти не проводились исследования по влиянию DLK1 на раковые клетки.

Недавно проводились исследования по взаимосвязи между DLK1 и несколькими типами раковых опухолей, сверхэкспрессирующих DLK1 в глиомных клетках, и было обнаружено, что кДНК DLK1, если он экспрессируется в глиомных клетках, способствует увеличению уровня пролиферации глиомных клеток и тем самым увеличению степени миграции этих клеток (Yin D. et al., Oncogene. 25:1852-61, 2006). В литературе также сообщалось, что экспрессия DLK1 в раковых клетках печени выше, чем в нормальных клетках печени, и что, при снижении уровня экспрессии DLK1 опухоль значительно уменьшается, на что указывал тест, проводимый с использованием киРНК (Huang J. et al., Carcinogenesis. 28(5):1094-1103, 2007). Недавно сообщалось, что цитоплазматический домен DLK1 играет важную роль в онкогенезе (Yuri K. et al., Cancer Research. 69(24):OF1-10, 2009). До настоящего времени исследования растворимого DLK1, который представляет собой внеклеточную часть, слущиваемую с клеточной мембраны под действием ТАСЕ, были сосредоточены, главным образом, на функции ингибирования дифференцировки адипоцитов. Однако пока еще не проводились исследования по взаимосвязи между внеклеточным растворимым доменом DLK1 и раковым заболеванием.

Поэтому авторами было разработано настоящее изобретение, в основу которого были положены: получение ими рекомбинантного экспрессионного вектора, содержащего ген растворимого домена во внеклеточной области DLK1 вместе с генами Fc-домена антигена IgG; экспрессия и очистка слитого белка DLK1-Fc из клеток 293Е; и подтверждение, путем измерения фармакокинетических (ФК) параметров, заметного снижения степени миграции раковых клеток под действием слитого белка DLK1-Fc и его эффективности как лекарственного средства, ингибирующего метастазы, что дает основание утверждать, что слитый белок DLK1-Fc может быть с успехом использован в качестве эффективного ингредиента в композициях для ингибирования метастазов опухоли.

Описание

Техническая проблема

Целью настоящего изобретения является получение слитого белка DLK1-Fc и композиции против метастазов рака, содержащей DLK1-Fc в качестве эффективного ингредиента.

Техническое решение

Для достижения вышеуказанной цели было разработано настоящее изобретение, которое относится к растворимому внеклеточному домену DLK1 (дельта-подобному гомологу 1).

Кроме того, настоящее изобретение относится к полинуклеотиду, кодирующему внеклеточный растворимый домен DLK1, к рекомбинантному вектору, содержащему указанный полинуклеотид, и к штамму трансфицированной рекомбинантной клетки, где указанный рекомбинантный вектор трансфицируют в клетку-хозяина.

Кроме того, настоящее изобретение относится к внеклеточному растворимому домену DLK1 и к слитому белку DLK1-Fc, в который входит Fc-домен человеческого антитела.

Кроме того, настоящее изобретение относится к полинуклеотиду, кодирующему слитый белок DLK1-Fc, к рекомбинантному вектору, содержащему указанный полинуклеотид, и к штамму трансфицированной рекомбинантной клетки, где указанный рекомбинантный вектор трансфицируют в клетку-хозяина.

Кроме того, настоящее изобретение относится к способу получения слитого белка DLK1-Fc, включающему стадии:

1) культивирования рекомбинантного клеточного штамма; и

2) выделения слитого белка DLK1-Fc из среды для культивирования клеточного штамма.

Кроме того, настоящее изобретение относится к композиции для ингибирования метастазов рака, содержащей растворимый внеклеточный домен DLK1, полученный как описано выше, или слитый белок DLK1-Fc, используемый в качестве эффективного ингредиента.

Кроме того, настоящее изобретение относится к способу ингибирования метастазов рака, включающему стадию введения фармацевтически эффективного количества внеклеточного растворимого домена DLK1 или слитого белка DLK1-Fc, полученного как описано выше, индивидууму с метастазами опухоли.

Кроме того, настоящее изобретение относится к применению внеклеточного растворимого домена DLK1 или слитого белка DLK1-Fc для получения композиции для ингибирования метастазов рака.

Преимущественные эффекты

Слитый белок DLK1-Fc согласно изобретению, по сравнению с не слитым белком, имеет высокую стабильность, значительно снижает степень миграции клеток различных клеточных линий рака и оказывает превосходное действие, направленное на ингибирование метастазов рака даже при низких концентрациях, а поэтому он может быть использован в качестве эффективного ингредиента в композиции для ингибирования метастазов рака.

Краткое описание чертежей

На фиг.1 проиллюстрирована структура белка DLK1, где

S: сигнальный пептид

1-6: повторяющиеся домены, подобные эпидермальному фактору роста (EGF)

JM: юкстамембранный домен

Tm: трансмембранный домен

Cy: внутриклеточный домен

На фиг.2 проиллюстрирована степень экспрессии гена DLK1 в ткани пациента, страдающего раком.

На фиг.3 проиллюстрирована степень экспрессии гена DLK1 в раковых клетках.

На фиг.4 представлена праймерная последовательность (SEQ ID NO. 2: 5'-CAGGGGGCCGTGGGGGCCGAATGCTTCCCGGCCTGCAA-3'; и SEQ ID NO. 3: 5'-TAGCGGCCGACGCGGCCGCCCTCGGTGAGGAGAGGGG-3'), используемые в целях конструирования экспрессионного вектора для экспрессии слитого белка DLK1-Fc.

На фиг.5 представлена структура вектора pYK602-His-DLK1, который представляет собой экспрессионный вектор для экспрессии слитого белка DLK1-Fc.

На фиг.6 представлена последовательность нуклеиновой кислоты (SEQ ID NO. 1) клонированного DLK1.

На фиг.7 представлена аминокислотная последовательность (SEQ ID NO. 4) клонированного DLK1.

На фиг.8 проиллюстрирована экспрессия слитого белка DLK1-Fc, полученного из среды для культивирования клеток и выделенного после индуцирования экспрессии слитого белка DLK1-Fc в клетках 293Е.

На фиг.9 представлены результаты электрофореза в ДСН-полиакриламидном геле для подтверждения присутствия очищенного слитого белка DLK1-Fc.

На фиг.10 проиллюстрировано ингибирование миграции клеточной линии рака толстой кишки (SW620) под действием среды для культивирования клеток, содержащей слитый белок DLK1-Fc.

На фиг.11 проиллюстрировано ингибирование миграции клеточной линии меланомы кожи (MDA-MB-435) под действием среды для культивирования клеток, содержащей слитый белок DLK1-Fc.

На фиг.12 проиллюстрировано ингибирование миграции клеточной линии меланомы кожи (MDA-MB-435) под действием среды для культивирования клеток, содержащей внеклеточный растворимый домен DLK1 и растворимый слитый белок DLK1-Fc, где

sDLK1, sDLK1-Fc и Fc используются в концентрации 10 мкг/мл соответственно.

На фиг.13 представлен график, иллюстрирующий ингибирование миграции клеточной линии меланомы кожи (MDA-MB-435) под действием среды для культивирования клеток, содержащей внеклеточный растворимый домен DLK1 и растворимый слитый белок DLK1-Fc, где

sDLK1, sDLK1-Fc и Fc используются в концентрации 10 мкг/мл соответственно.

На фиг.14 проиллюстрировано ингибирование миграции клеточной линии рака молочной железы (Hs578T) под действием среды для культивирования клеток, содержащей растворимый слитый белок DLK1-Fc.

На фиг.15 проиллюстрировано ингибирование миграции клеточной линии рака молочной железы (MCF-7) под действием среды для культивирования клеток, содержащей растворимый слитый белок DLK1-Fc.

На фиг.16 проиллюстрировано ингибирование миграции клеточной линии рака матки (HeLa) под действием среды для культивирования клеток, содержащей растворимый слитый белок DLK1-Fc.

На фиг.17 проиллюстрировано ингибирование миграции клеточной линии рака толстой кишки (SW480) под действием среды для культивирования клеток, содержащей растворимый слитый белок DLK1-Fc.

На фиг.18 проиллюстрировано ингибирование миграции клеточной линии рака толстой кишки (HT29) под действием среды для культивирования клеток, содержащей растворимый слитый белок DLK1-Fc.

На фиг.19 проиллюстрировано ингибирование миграции клеточной линии рака почек (786-О) под действием среды для культивирования клеток, содержащей растворимый слитый белок DLK1-Fc.

На фиг.20 проиллюстрировано ингибирование миграции клеточной линии рака почек (UO-31) под действием среды для культивирования клеток, содержащей растворимый слитый белок DLK1-Fc.

На фиг.21 проиллюстрировано ингибирование миграции клеточной линии рака печени (HepG2) под действием среды для культивирования клеток, содержащей растворимый слитый белок DLK1-Fc.

На фиг.22 проиллюстрировано ингибирование миграции клеточной линии рака печени (SNU449) под действием среды для культивирования клеток, содержащей растворимый слитый белок DLK1-Fc.

На фиг.23 проиллюстрировано ингибирование миграции клеточной линии рака печени (SNU398) под действием среды для культивирования клеток, содержащей растворимый слитый белок DLK1-Fc.

На фиг.24 проиллюстрировано ингибирование миграции клеточной линии рака легких (A549) под действием среды для культивирования клеток, содержащей растворимый слитый белок DLK1-Fc.

На фиг.25 проиллюстрировано ингибирование миграции клеточной линии рака легких (NCIH23) под действием среды для культивирования клеток, содержащей растворимый слитый белок DLK1-Fc.

На фиг.26 проиллюстрировано ингибирование миграции клеточной линии рака легких (NCIH460) под действием среды для культивирования клеток, содержащей растворимый слитый белок DLK1-Fc.

На фиг.27 проиллюстрировано ингибирование миграции клеточной линии рака яичника (MDAH2774) под действием среды для культивирования клеток, содержащей растворимый слитый белок DLK1-Fc.

На фиг.28 проиллюстрировано ингибирование миграции клеточной линии рака яичника (IGROV-1) под действием среды для культивирования клеток, содержащей растворимый слитый белок DLK1-Fc.

На фиг.29 проиллюстрировано ингибирование миграции клеточной линии рака поджелудочной железы (Aspc-1) под действием среды для культивирования клеток, содержащей растворимый слитый белок DLK1-Fc.

На фиг.30 проиллюстрировано ингибирование миграции клеточной линии рака поджелудочной железы (HPAC) под действием среды для культивирования клеток, содержащей растворимый слитый белок DLK1-Fc.

На фиг.31 проиллюстрировано ингибирование миграции клеточной линии рака поджелудочной железы (MIA paca-2) под действием среды для культивирования клеток, содержащей растворимый слитый белок DLK1-Fc.

На фиг.32 проиллюстрировано ингибирование миграции клеточной линии рака желудка (SNU638) под действием среды для культивирования клеток, содержащей растворимый слитый белок DLK1-Fc.

На фиг.33 проиллюстрировано ингибирование миграции клеточной линии рака желудка (AGS) под действием среды для культивирования клеток, содержащей растворимый слитый белок DLK1-Fc.

На фиг.34 показаны число клеток в каждой клеточной линии, состав хемоаттрактанта и время инкубирования, используемые в тесте на подтверждение действия растворимого слитого белка DLK1-Fc, направленного на ингибирование миграции раковых клеток.

На фиг.35 представлен результат проведения теста на фармакокинетическое действие растворимого слитого белка DLK1-Fc.

На фиг.36 представлены фармакокинетические параметры sDLK1.

Наилучший вариант осуществления изобретения

Настоящее изобретение более подробно описано ниже.

Настоящее изобретение относится к растворимому домену внеклеточной части DLK1 (дельта-подобного гомолога 1), к полинуклеотиду, кодирующему внеклеточный растворимый домен DLK1, к рекомбинантному вектору, содержащему указанный полинуклеотид, и к рекомбинантному клеточному штамму, где указанный рекомбинантный вектор трансфицируют в клетку-хозяина.

Внеклеточный растворимый домен DLK1, предпочтительно, может иметь, но не ограничивается ею, аминокислотную последовательность SEQ ID NO. 4.

Полинуклеотид, кодирующий указанный внеклеточный растворимый домен DLK1, предпочтительно может иметь, но не ограничивается ею, генную последовательность SEQ ID NO. 1.

Кроме того, настоящее изобретение относится к внеклеточному растворимому домену DLK1 и к слитому белку DLK1-Fc, с которым объединен Fc-домен человеческого IgG.

Термин «слитый белок DLK1-Fc» означает рекомбинантную молекулу, содержащую фрагмент, происходящий от константного домена тяжелой цепи антитела. Fc-содержащий слитый белок может включать Fc-домен антитела, произвольно выбранного из Ig пяти классов (например, IgA, IgD, IgE, IgG и IgM), то есть включать весь константный домен СН2 и СН3 или его часть. Так, например, слитый белок DLK1-Fc может быть получен в форме, содержащей весь константный домен или часть константного домена тяжелой цепи на карбокси- и амино-концах внеклеточного растворимого домена DLK1. В другом примере, Fc-слитый белок может иметь форму, содержащую часть константного домена из двух или более тяжелых цепей антитела, а в описании настоящей заявки две тяжелые цепи Fc могут быть связаны дисульфидной связью или ковалентной связью. В другом примере, DLK1-часть слитого белка DLK1-Fc может иметь форму, содержащую два или более внеклеточных растворимых домена DLK1.

Кроме того, настоящее изобретение относится к полинуклеотиду, кодирующему слитый белок DLK1-Fc, к рекомбинантному клеточному штамму, содержащему указанный полинуклеотид, и к трансфицированному рекомбинантному вектору, где указанный рекомбинантный вектор трансфицируют в клетку-хозяина.

Кроме того, настоящее изобретение относится к способу получения слитого белка DLK1-Fc, включающему стадии:

1) культивирования рекомбинантного клеточного штамма; и

2) выделения слитого белка DLK1-Fc из среды для культивирования клеточного штамма.

Экспрессионным вектором, содержащим указанный ген, предпочтительно, является, но не ограничиваются им, вектор pYK602-His. При этом может быть использован любой вектор при условии, что он включает промотор экспрессии и Fc-домен млекопитающего.

Предпочтительной клеткой млекопитающего является, но не ограничивается ею, клетка 293Е. При этом может быть использован любой клеточный штамм млекопитающего, в котором данный промотор является функциональным.

В отличие от результатов предшествующих исследований, результаты, полученные авторами настоящего изобретения в ранее проведенных исследованиях с использованием микромассивов, показали, что уровень экспрессии DLK1 (см. фиг. 2) был значительно снижен, и такой феномен наблюдался, в частности, в тканях раковой опухоли молочной железы, поджелудочной железы и яичника (фиг. 2). Кроме того, за исключением лишь некоторых клеточных штаммов, экспрессия DLK1 в 67 раковых клеточных штаммах была очень низкой (см. фиг. 3). Исходя из вышеописанного характера экспрессии, можно сделать предположение, что DLK1 может функционировать как ген-суппрессор опухоли, а также как онкоген. В этом исследовании, в частности, использовался только растворимый домен, который представляет собой внешнюю часть клеточной мембраны, слущенной с клеточной мембраны под действием фермента, конвертирующего фактор некроза опухоли альфа (ТАСЕ), а поэтому он обладает как паракринным, так и аутокринным действием.

Растворимый Fc-слитый белок широко используется в in vitro экспериментах и в in vivo экспериментах и, по сравнению с не слитым белком, имеет много преимуществ, например он обладает более высокой стабильностью, в частности, в экспериментах на животных (Meg L et al., Methods in Molecular Biology 378:33-52, 2007). В настоящее время, растворимый Fc-слитый белок имеет широкое применение, поскольку он сохраняет антигенную специфичность лекарственных препаратов, содержащих человеческое антитело, что позволяет избежать вырабатывания множества иммунологических реакций. Репрезентативным лекарственным препаратом на основе человеческого антитела, содержащим растворимый Fc-слитый белок, является этанерцепт (Etanercept), то есть лекарственный препарат для лечения артрита, который выпускается фирмой Amgen и который получают путем объединения растворимого домена рецептора TNF2 с Fc человеческого IgG1 (патент США № 5447851).

В конкретном примере настоящего изобретения, для клонирования DLK1 в вектор pYK602-His осуществляли полимеразную цепную реакцию (ПЦР) с использованием смеси библиотек ДНК (почек, плаценты, поджелудочной железы и печени) в качестве матрицы, а также праймеров SEQ ID NO. 2 (5'-CAGGGGGCCGTGGGGGCCGAATGCTTCCCGGCCTGCAA-3') и SEQ ID NO. 3 (5'-TAGCGGCCGACGCGGCCGCCCTCGGTGAGGAGAGGGG-3') для селективной амплификации внеклеточного растворимого домена белка DLK1, после чего ПЦР-продукт подвергали ферментативной реакции с ферментом рестрикции SfiI, и получали рекомбинантный вектор pYK602-His-DLK1 путем объединения вектора pYK602-His и DLK1 (фиг. 4 и 5).

После этого ДНК pYK602-His-DLK1 переносили в клетки 293Е, восстанавливали на среде, и экспрессию слитого белка DLK1-Fc оценивали с помощью вестерн-блот-анализа (фиг. 8). Очистку проводили на колонке с белком А на среде с подтвержденной экспрессией, рН очищенного белка DLK1-Fc нейтрализовали, затем проводили диализ с использованием физиологического раствора, забуференного фосфатом калия (PBS), и осуществляли количественную оценку с помощью ВСА-анализа, после чего завершение очистки и количественной оценки подтверждали с помощью электрофореза в ДСН-ПААГ (фиг. 9). Затем бактериальный эндотоксин удаляли из очищенного слитого белка DLK1-Fc на колонке с EndoTrap Red. В результате получали слитый белок DLK1-Fc.

Кроме того, настоящее изобретение относится к композиции для ингибирования метастазов рака, содержащей внеклеточный растворимый домен DLK1, полученный, как описано выше, или слитый белок DLK1-Fc в качестве эффективного ингредиента.

Раковым заболеванием может быть по меньшей мере одно заболевание, выбранное из группы, состоящей из рака кожи, рака печени, рака желудка, рака молочной железы, рака толстой кишки, рака кости, рака поджелудочной железы, рака головы и шеи, рака матки, рака толстой кишки, рака легких, рака яичника, рака прямой кишки, рака пищевода, рака тонкого кишечника, рака заднего прохода, рака толстой кишки, рака фаллопиевых труб, карциномы эндометрия, карциномы шейки матки, карциномы влагалища, рака вульвы, болезни Ходжкина, рака предстательной железы, рака мочевого пузыря, рака почек, рака уретры, почечно-клеточной карциномы, карциномы почечной лоханки и опухолей центральной нервной системы, а более предпочтительно заболевание, выбранное из группы, состоящей, но не ограничивающейся ими, из рака кожи, рака молочной железы, рака матки, рака толстой кишки, рака почек, рака печени, рака легких, рака яичника, рака желудка и рака поджелудочной железы.

В конкретном примере настоящего изобретения было проанализировано влияние полученного слитого белка DLK1-Fc на раковую клеточную линию. То есть был проведен анализ на миграцию раковой клеточной линии с применением метода Chen H.C., Methods in molecular biology. 294:15-22, 2005, который вводится в настоящее описание посредством ссылки. Кроме того, в результате исследования влияния очищенного слитого белка DLK1-Fc на метастазы различных раковых клеток было подтверждено, что слитый белок DLK1-Fc может ингибировать метастазы рака кожи (фиг. 11), рака молочной железы (фиг. 14 и 15), рака матки (фиг. 16), рака толстой кишки (фиг. 17 и 18), рака почек (фиг. 19 и 20), рака печени (фиг. 21-23), рака легких (фиг. 24-26), рака яичника (фиг. 27 и 28), рака поджелудочной железы (фиг. 29-31) и рака желудка (фиг. 32 и 33).

Кроме того, полученный внеклеточный растворимый домен DLK1 селективно экспрессировали и очищали, а затем использовали для обработки злокачественной меланомы кожи. В результате сравнения было подтверждено, что внеклеточный растворимый домен DLK1 может также заметно снижать степень миграции раковых клеток (фиг. 12 и 13).

Кроме того, для исследования эффективности указанного соединения в качестве лекарственного средства для ингибирования метастазов рака, на мышах был проведен эксперимент по определению фармакокинетических параметров. Принимая во внимание тот факт, что в этом эксперименте было инъецировано 5 мг/кг препарата (то есть 100 мкг/мышь в расчете на фактическую массу мыши) и что общий объем крови мыши составляет приблизительно 2 мл, максимальная концентрация, которая может быть введена путем внутривенной инъекции, составляет 50 мкг/мл. В соответствии с этим, значение 38,96 мкг/мл (Cmax), которое было получено в эксперименте с перитониальной инъекцией, можно считать высоким. Максимальная концентрация наблюдалась через 4 часа после инъекции (Tmax). Время полужизни, означающее время сохранения стабильности лекарственного средства in vivo, составляет приблизительно 20 часов, что указывает на то, что это лекарственное средство является достаточно стабильным in vivo (см. фиг. 36). Поскольку концентрация 10 мкг/мл является очень эффективной для ингибирования метастазов, если исходить из того факта, что концентрация приблизительно 10 мкг/мл сохраняется в течение 48 часов, то очевидно, что такое лекарственное средство, которое представляет собой новое лекарственное средство, является достаточно безопасным и эффективным для ингибирования метастазов рака (фиг. 35).

В соответствии с этим, растворимый домен во внеклеточном домене DLK1 или слитый белок DLK1-Fc, полученные, как описано выше, могут быть с успехом использованы в качестве эффективного ингредиента в композиции для ингибирования метастазов рака.

Композиция согласно изобретению может дополнительно включать эффективный ингредиент одного или нескольких типов с одинаковыми или аналогичными функциями. Композиция, предназначенная для введения, может дополнительно включать фармацевтически приемлемый носитель одного или нескольких типов. Композиция согласно изобретению включает 0,0001-10 масс.% или, предпочтительно, 0,001-1 масс.% белка в расчете на общую массу композиции. Фармацевтически приемлемый носитель может включать физиологический раствор, дистиллированную воду, раствор Рингера, забуференный физиологический раствор, раствор декстрозы, раствор мальтодекстрина, глицерин, этанол и смесь одного или нескольких вышеперечисленных компонентов, а при необходимости, он может включать и другие стандартные добавки, такие как антиоксидант, буферный раствор, бактериостат или т.п. Композиция может быть также получена в виде лекарственной формы для инъекции, такой как водный раствор, суспензия или эмульсия, таблетка, капсула, порошок или драже, приготовленные путем дополнительного включения разбавителей, диспергирующего вещества, поверхностно-активного вещества, связующего вещества и замасливателя. Кроме того, указанная композиция может быть приготовлена в любой нужной форме в зависимости от заболевания, подвергаемого лечению, или от ингредиентов, входящих в состав данной композиции, с применением метода, описанного в публикации Remington's Pharmaceutical Science (Mack Publishing Company, Easton PA, 18th, 1990).

Композиция для ингибирования метастазов рака согласно изобретению может быть введена парентерально (например, внутривенно, внутримышечно, внутрибрюшинно, подкожно или местно) или перорально в дозе, которая может варьироваться в широких пределах в зависимости от массы тела, возраста, пола и состояния здоровья индивидуума, а также от режима питания, времени введения, способа введения, скорости экскреции и тяжести заболевания пациента. Для взрослых мужчин массой 60 кг количество вводимого белка составляет в пределах 0,738 мкг~7,38 г (в соответствии со стандартом, утвержденным Управлением по контролю качества пищевых продуктов, медикаментов и косметических средств (FDA), США), а предпочтительно в пределах 7,38 мкг~0,738 г (максимально допустимая доза 12,3 мкг), причем указанное количество белка желательно вводить один раз через день, однако схема введения может быть определена в соответствии с потребностями пациента.

Кроме того, настоящее изобретение относится к способу ингибирования метастазов рака, включающему стадию введения фармацевтически эффективного количества внеклеточного растворимого домена DLK1 или слитого белка DLK1-Fc, полученного как описанного выше, индивидууму с метастазирующей опухолью.

Внеклеточный растворимый домен DLK1 может предпочтительно иметь, но не ограничиваются ею, аминокислотную последовательность SEQ ID NO. 4.

Термин «слитый белок DLK1-Fc» означает рекомбинантную молекулу, содержащую фракцию, происходящую от константного домена тяжелой цепи. Fc-содержащий слитый белок может включать полноразмерные константные домены СН2 и СН3 или их часть, такую как Fc-домен антитела, произвольно выбранного из Ig пяти классов (например, IgA, IgD, IgE, IgG и IgM). Так, например, слитый белок DLK1-Fc может быть получен в форме, содержащей весь константный домен или часть константного домена тяжелой цепи на карбокси- или амино-концах указанного внеклеточного растворимого домена. В другом примере, Fc-содержащий слитый белок может также иметь форму, включающую константные домены из двух или более тяжелых цепей антитела, где две тяжелые цепи могут быть соединены дисульфидной связью или ковалентной связью. В другом примере, DLK1-часть Fc-содержащего слитого белка может также иметь форму, включающую два или более внеклеточных растворимых домена DLK1.

Раковым заболеванием может быть заболевание, выбранное из группы, состоящей из рака кожи, рака печени, рака желудка, рака молочной железы, рака толстой кишки, рака кости, рака поджелудочной железы, рака головы и шеи, рака матки, рака толстой кишки, рака легких, рака яичника, рака прямой кишки, рака пищевода, рака тонкого кишечника, рака заднего прохода, рака толстой кишки, рака фаллопиевых труб, карциномы эндометрия, карциномы шейки матки, рака влагалища, рака вульвы, болезни Ходжкина, рака предстательной железы, рака мочевого пузыря, рака почек, рака уретры, почечно-клеточной карциномы, карциномы почечной лоханки и опухолей центральной нервной системы, а более предпочтительно заболевание, выбранное из группы, состоящей, но не ограничивающейся ими, из рака кожи, рака молочной железы, рака матки, рака толстой кишки, рака почек, рака печени, рака легких, рака яичника, рака желудка и рака поджелудочной железы.

В зависимости от цели применения способ ингибирования метастазов рака согласно изобретению может включать парентеральное введение (например, внутривенное, внутримышечное, внутрибрюшинное, подкожное или местное введение) в дозе, которая может варьироваться в широких пределах в зависимости от массы тела, возраста, пола и состояния здоровья индивидуума, а также от режима питания, времени введения, способа введения, скорости экскреции и от тяжести заболевания у пациента. В соответствии с настоящим изобретением, белок может быть введен, например, взрослым мужчинам массой в 60 кг (в соответствии со стандартом, утвержденным Управлением по контролю качества пищевых продуктов, медикаментов и косметических средств (FDA), США), в количестве, составляющем в пределах 0,738 мкг~7,38 г, а предпочтительно 7,38 мкг~0,738 г (максимально допустимая доза 12,3 мкг), причем указанное количество белка желательно вводить один раз через день, однако способ введения может варьироваться в зависимости от потребностей пациента.

В соответствии с настоящим изобретением был сконструирован рекомбинантный экспрессионный вектор, содержащий ген внеклеточного растворимого домена DLK1 вместе с геном Fc-домена антитела IgG, и был экспрессирован и очищен слитый белок DLK1-Fc из клеток 293Е, после чего было подтверждено заметное снижение степени миграции клеток под действием слитого белка DLK1-Fc, а также была подтверждена его эффективность как лекарственного средства для ингибирования метастазов рака путем вычисления фармакокинетических параметров. Это результат показал, что введение внеклеточного растворимого домена DLK1 или слитого белка DLK1-Fc индивидууму с метастазами опухоли может быть с успехом применено в способе ингибирования метастазов рака.

Кроме того, настоящее изобретение относится к применению внеклеточного растворимого домена DLK1 или слитого белка DLK1-Fc, полученного, как описанного выше, для получения композиции для ингибирования метастазов рака.

Внеклеточный растворимый домен DLK1 может предпочтительно иметь, но не ограничиваются ею, аминокислотную последовательность SEQ ID NO. 4.

Термин «слитый белок DLK1-Fc» означает рекомбинантную молекулу, содержащую фракцию, происходящую от константного домена тяжелой цепи. Fc-содержащий слитый белок может включать полноразмерные константные домены СН2 и СН3 или их часть, такие как Fc-домен антитела, произвольно выбранного из Ig пяти классов (например, IgA, IgD, IgE, IgG и IgM). Так, например, слитый белок DLK1-Fc может быть получен в форме, содержащей весь константный домен или часть константного домена тяжелой цепи антитела на карбокси- или амино-концах указанного внеклеточного растворимого домена. В другом примере, Fc-содержащий слитый белок может также иметь форму, включающую константные домены из двух или более тяжелых цепей антитела, где две тяжелые цепи могут быть соединены дисульфидной связью или ковалентной связью. В другом примере, DLK1-часть Fc-содержащего слитого белка может также иметь форму, включающую два или более внеклеточных растворимых домена DLK1.

Раковым заболеванием может быть заболевание, выбранное из группы, состоящей из рака кожи, рака печени, рака желудка, рака молочной железы, рака толстой кишки, рака кости, рака поджелудочной железы, рака головы и шеи, рака матки, рака толстой кишки, рака легких, рака яичника, рака прямой кишки, рака пищевода, рака тонкого кишечника, рака заднего прохода, рака толстой кишки, рака фаллопиевых труб, карциномы эндометрия, карциномы шейки матки, рака влагалища, рака вульвы, болезни Ходжкина, рака предстательной железы, рака мочевого пузыря, рака почек, рака уретры, почечно-клеточной карциномы, карциномы почечной лоханки и опухолей центральной нервной системы, а более предпочтительно заболевание, выбранное из группы, состоящей, но не ограничивающейся ими, из рака кожи, рака молочной железы, рака матки, рака толстой кишки, рака почек, рака печени, рака легких, рака яичника, рака желудка и рака поджелудочной железы.

В соответствии с настоящим изобретением был сконструирован рекомбинантный экспрессионный вектор, содержащий ген внеклеточного растворимого домена DLK1 вместе с геном Fc-домена антитела IgG, и был экспрессирован и очищен слитый белок DLK1-Fc из клеток 293Е, после чего было подтверждено заметное снижение степени миграции клеток под действием слитого белка DLK1-Fc, а также была подтверждена его эффективность как лекарственного средства для ингибирования метастазов рака путем вычисления фармакокинетических параметров. Это результат показал, что введение внеклеточного растворимого домена DLK1 или слитого белка DLK1-Fc индивидууму с метастазами опухоли может быть с успехом применено в способе ингибирования метастазов рака.

Композиция согласно изобретению может дополнительно включать эффективный ингредиент одного или нескольких типов с одинаковыми или аналогичными функциями. Композиция, предназначенная для введения, может дополнительно включать фармацевтически приемлемый носитель одного или нескольких типов. Композиция согласно изобретению включает 0,0001-10 масс.% или предпочтительно 0,001-1 масс.% белка в расчете на общую массу композиции. Фармацевтически приемлемый носитель может включать физиологический раствор, дистиллированную воду, раствор Рингера, забуференный физиологический раствор, раствор декстрозы, раствор мальтодекстрина, глицерин, этанол и смесь одного или нескольких вышеперечисленных компонентов, а при необходимости он может включать и другие стандартные добавки, такие как антиоксидант, буферный раствор, бактериостат или т.п. Композиция может быть также получена в виде лекарственной формы для инъекции, такой как водный раствор, суспензия или эмульсия, таблетка, капсула, порошок или драже, приготовленные путем дополнительного включения разбавителей, диспергирующего вещества, поверхностно-активного вещества, связующего вещества и замасливателя. Кроме того, указанная композиция может быть приготовлена в любой нужной форме в зависимости от заболевания, подвергаемого лечению, или ингредиентов, входящих в состав данной композиции, с применением метода, описанного в публикации Remington's Pharmaceutical Science (Mack Publishing Company, Easton PA, 18th, 1990).

Композиция для ингибирования метастазов рака согласно изобретению может быть введена парентерально (например, внутривенно, внутримышечно, внутрибрюшинно, подкожно или местно) или перорально в дозе, которая может варьироваться в широких пределах в зависимости от массы тела, возраста, пола и состояния здоровья индивидуума, а также режима питания, времени введения, способа введения, скорости экскреции и тяжести заболевания у пациента. Для взрослых мужчин массой 60 кг количество вводимого белка составляет в пределах 0,738 мкг~7,38 г (в соответствии со стандартом, утвержденным Управлением по контролю качества пищевых продуктов, медикаментов и косметических средств (FDA), США), а предпочтительно 7,38 мкг~0,738 г (максимально допустимая доза 12,3 мкг), причем указанное количество белка желательно вводить один раз через день, но оно может быть определено в соответствии с потребностями пациента.

Некоторые варианты, экспериментальные примеры и примеры получения препаратов согласно изобретению более подробно описаны ниже.

Однако следует отметить, что описанные здесь варианты, экспериментальные примеры и примеры получения препаратов приводятся лишь в иллюстративных целях, а поэтому не должны рассматриваться как ограничение объема изобретения.

Пример 1

Получение экспрессионного вектора pYK602-His-DLK1

Для индуцирования экспрессии DLK1-Fc в векторе pYK602-His получали пару праймеров, представленных как SEQ ID NO. 2 (5'-CAGGGGGCCGTGGGGGCCGAATGCTTCCCGGCCTGCAA-3') и SEQ ID NO. 3 (5'-TAGCGGCCGACGCGGCCGCCCTCGGTGAGGAGAGGGG-3') соответственно, а затем осуществляли полимеразную цепную реакцию (ПЦР). Комбинацию специфических реакций осуществляли следующим образом: добавляли 100 нг смеси библиотек ДНК (почек, плаценты, поджелудочной железы и печени), используемой в качестве матрицы, и 10 пмоль 2,5 б.о.е. каждого праймера, после чего их оставляли для реакции в объеме 50 мкл. Реакцию проводили в следующих условиях, 1 цикл - 94°C, 2 минуты, 30 циклов - 94°C, 30 секунд, 55°C, 30 секунд, 72°C, 1 минута, и 1 цикл - 72°C, 10 минут, а затем реакцию завершали. Поскольку ПЦР-продукт включает сайт расщепления ферментом рестрикции SfiI, то ферментативную реакцию проводили с использованием фермента рестрикции SfiI, и полученный продукт встраивали в вектор pYK602-His с получением рекомбинантного вектора pYK602-His-DLK1 (фиг.5).

Клонированный DLK1 представляет собой внеклеточный растворимый домен DLK1, который соответствует области аминокислот 25-302 в полноразмерной последовательности из 383 аминокислот, из которой были удалены сигнальный пептид, трансмембранная область и цитоплазматический домен. Последовательность нуклеиновой кислоты и аминокислотная последовательность клонированного DLK1 представлены на фиг.6 (SEQ ID NO. 1) и на фиг.7 (SEQ ID NO. 4) соответственно.

Пример 2

Экспрессия и очистка слитого белка DLK1-Fc

Для экспрессии DLK1-Fc, клонированного, как описано в примере 1, использовали клетки 293Е. Конкретный метод экспрессии проводили следующим образом. В 100 мм планшете, содержащем приблизительно 70% клеток, смешивали 10 мкг ДНК и 20 мкг ПЭИ (#23966, Polysciences, USA), а затем подвергали реакции в течение 20 минут при комнатной температуре с получением смеси, и указанные клетки обрабатывали этой смесью. Через 16~10 часов бессывороточную культуральную среду DMEM заменяли, и эту процедуру проводили через день, а затем культуральную среду удаляли и заменяли новой культуральной средой. Экспрессию выделенной культуральной среды подтверждали с помощью вестерн-блот-анализа (фиг.8). Культуральную среду с подтвержденной экспрессией центрифугировали для удаления возможно оставшихся клеток и фильтровали на 0,22 мкм фильтре (#PR02890 Millipore, USA). После этого проводили очистку на колонке с белком А. То есть в 10-миллилитровую колонку загружали 500 мкл сфер с белком А (#17-1279-03 GE, Sweden), после чего колонку промывали PBS, и культуральную среду с экспрессированным DLK1-Fc элюировали. В этом способе использовали перистальтический насос, который устанавливали так, чтобы он подавал жидкость со скоростью 0,5 мл в минуту. При завершении прохождения культуральной среды через колонку, культуральную среду промывали PBS, и выделяли белок DLK1-Fc, очищенный с использованием 0,1 M глицина-HCl (#G7126, Sigma, USA). рН выделенного белка нейтрализовали с использованием 1M триса, pH 9,0 (#T-1503, Sigma, USA), а затем с использованием PBS, после чего проводили диализ. Количественную оценку очищенного белка проводили с помощью BCA-анализа, а затем, для подтверждения очистки, осуществляли электрофорез в ДСН-ПААГ (фиг. 9), в результате чего получали очищенный слитый белок DLK1-Fc.

Экспериментальный пример 1

Измерение и удаление эндотоксина из очищенного DLK1-Fc

Для оценки количества бактериального эндотоксина в очищенном DLK1-Fc использовали реагент Chromo-LAL(cat# C0031, CAPE COD). Для оценки специфичности, 1 э.ед./мл CSE (контрольного стандартного эндотоксина; cat# E0005, CAPE COD), используемого в качестве стандартного белкового вещества, двукратно разводили до концентрации 0,03125 э.ед./мл. Затем добавляли LRW (реагент LAL с водой; cat# WP1001, CAPE COD) (100 мкл+100 мкл LAL), используемый в качестве негативного контроля, и стандарт (100 мкл+100 мкл LAL), используемый в качестве позитивного контроля в концентрации 0,125 э.ед./мл. Для проведения анализа приготавливали 100 мкл + 100 мкл LAL разведенного образца LRW в предварительно определенной концентрации (50 мкг/мл). Кроме того, для оценки степени интерференции образцов, вышеупомянутый разведенный образец (50 мкл+0,125 э.ед./мл) и стандарт (50 мкл+100 мкл LAL) также приготавливали в целях проведения эксперимента с продуктом позитивного контроля. Кроме того, для измерения на микропланшете-ридере VersaMax (Molecular devices) использовали файл (Chromo LAL setting.pda), в котором имеются запротоколированные данные заданных значений. Перед проведением эксперимента планшет предварительно нагревали при 37°C в течение приблизительно 10 минут. LAL обрабатывали и одновременно измеряли оптическую плотность, исходя из данных, представленных в файле с заданными значениями. Была построена стандартная кривая, где по оси Х отложен Log э.ед./мл, а по оси Y отложен Log времени c начала реакции, и оптическую плотность эндотоксина в образце измеряли автоматически с помощью компьютерной программы и выражали в э.ед./мл. Измерения считались достоверными, если R2 стандартной кривой превышало 0,98. После проведения LAL-теста белка DLK1-Fc была получена величина 150,24 э.ед./мл эндотоксина. Затем эндотоксин удаляли из образца на колонке EndoTrap Red (cat# 83-009U, Lonza). Колонку два раза промывали 3 мл свежего буфера, а затем два раза промывали тем же количеством буфера для стабилизации. Затем наносили образец и одновременно получали фракцию (со скоростью ~ 0,5-1 мл/мин). Образец, оставшийся внутри колонки, собирали путем подачи 1 мл буфера для стабилизации. После удаления эндотоксина, LAL-тест проводили способом, описанным выше, в результате чего получали величину 7,53 э.ед./мл эндотоксина, которая была аналогична величине негативного контроля. В соответствии с этим было подтверждено, что бактериальный эндотоксин был удален из очищенного белка DLK1-Fc.

Экспериментальный пример 2

Подтверждение ингибирующего действия слитого белка DLK1-Fc, направленного против миграции раковой клеточной линии

Анализ на миграцию раковой клеточной линии проводили методом Chen H.C. (Methods in molecular biology. 294:15-22, 2005) в целях исследования эффекта белка DLK1-Fc, полученного и очищенного, как описано в примере 2.

Для оценки специфичности, раковые клеточные линии [клеточную линию рака кожи (MDA-MB-435; ATCC HTB-129), клеточную линию рака молочной железы (Hs578T; ECACC 86082104 и MCF-7; ATCC HTB-22), клеточную линию рака матки (HeLa; ATCC CCL-2), клеточную линию рака толстой кишки (SW480; ATCC CCL-228, SW620; ATCC CCL-227 и HT29; ATCC HTB-38), клеточную линию рака почек (786-O; ATCC CRL-1932 и UO-31; DTP), клеточную линию рака печени (HepG2; ATCC HB-8065, SNU398; KCLB 00398 и SNU449; KCLB 00449), клеточную линию рака легких (A549; ATCC CCL-185, NCIH23; KCLB 90023 и NCIH460; KCLB 30177), клеточную линию рака яичника (MDAH2774; ATCC CRL-10303 и IGROV-1; DTP), клеточную линию рака поджелудочной железы (Aspc-1; KCLB 21682, HPAC; ATCC CRL-2119 и MIA paca-2; KCLB 21420) и клеточную линию рака желудка (SNU638; KCLB 00638 и AGS; KCLB 21739)] культивировали, и, когда уровень клеток составлял приблизительно 50%, среду заменяли бессывороточной средой, а через 24 часа клетки удаляли с использованием трипсина, и подсчитывали число клеток. Клетки, бессывороточную среду и соответствующие белки, предназначенные для обработки, смешивали вместе с получением 100 мкл смеси и инкубировали при 37°C в течение 1 часа. 1 мл хемоаттрактанта помещали в 24-луночный планшет Transwell (Corning #3422) с размером пор 8,0 мкм, и в этот планшет помещали 100 мкл предварительно культивированной смеси клеток, а затем клетки и белок инкубировали при 37°C в культуральной среде с двуокисью углерода в течение 24-48 часов. На фиг.21 указаны число клеток, состав хемоаттрактанта и время культивирования соответствующих клеточных линий.

После культивирования, среду в планшете Transwell удаляли и фиксировали в течение 15 минут в 100% метаноле, после чего два раза промывали дистиллированной водой и подвергали реакции в течение 5 минут в растворе кристаллического фиолетового. После прохождения реакции, смесь три раза промывали дистиллированной водой, и клетки, которые оставались в планшете Transwell, были полностью удалены с помощью ватного тампона. После полной осушки планшета Transwell, клетки, прошедшие реакцию в планшете Transwell, наблюдали визуально и фотографировали с увеличением х100. Для количественного анализа, после фотографирования, в планшет Transwell вводили 10% уксусную кислоту, а затем экстрагировали и измеряли оптическую плотность на длине волны 560 нм.

В результате наблюдалось заметное увеличение ингибирования миграции клеточных линий рака толстой кишки (SW620) и меланомы кожи (MDA-МВ-435), обработанных клеточной средой, содержащей растворимый слитый белок DLK1-Fc, под действием растворимого слитого белка DLK1-Fc, в отличие от группы клеток, обработанных контрольным растворимым Fc-белком, и группы необработанных клеток (фиг. 10 и 11). Кроме того, растворимую область DLK1 селективно экспрессировали и очищали для подтверждения того, что такая миграция была обусловлена влиянием связывания Fc с DLK1, в результате чего было обнаружено заметное увеличение уровня ингибирования раковой клеточной линии, как и в случае растворимого слитого белка DLK1-Fc (фиг. 12 и 13). Было также исследовано влияние очищенного растворимого слитого белка DLK1-Fc на метастазы различных раковых клеточных линий, и в результате был подтвержден эффект ингибирования миграции клеток рака молочной железы (фиг. 14 и 15), рака матки (фиг. 16), рака толстой кишки (фиг. 17 и 19), рака почек (фиг. 19 и 20), рака печени (фиг. 21-23), рака легких (фиг. 24-26), рака яичника (фиг. 27 и 28), рака поджелудочной железы (фиг. 29-31) и рака желудка (фиг. 32 и 33).

Экспериментальный пример 3

Подтверждение фармакокинетического параметра слитого белка DLK1-Fc

Был проведен фармакокинетический тест для исследования возможности применения слитого белка DLK1-Fc, полученного и очищенного, как описано в примере 2, в качестве ингибитора метастазов рака.

Для оценки специфичности, 5 мг/кг этого белка один раз вводили тридцати (30) 6-недельным самкам мышей Balb/c (Orient Bio) путем внутрибрюшинной инъекции, а затем через 0, 0,5, 2, 4, 6, 24, 30, 48 часов брали кровь из глазного венозного сплетения, после чего выделяли сыворотку, которую использовали в данном тесте.

Измерение концентрации DLK1-Fc в крови проводили с помощью твердофазного иммуноферментного анализа с использованием пробы сыворотки. Для оценки специфичности, антитело против DLK1 (#MAB1144, R&D) в концентрации 1 мкг/мл наносили на ELISA-планшет (#439454, NUNC) при 4°C. Блокирование проводили в течение 1 часа с использованием 4% сепарированного молока/буфера PBS (физиологического раствора, забуференного фосфатом калия), и планшет промывали буфером PBST (физиологическим раствором, забуференным фосфатом калия, 0,05% твин 20). Для построения стандартной кривой, очищенный DLK1-Fc двукратно разводили начиная с концентрации 100 нМ. В качестве негативного контроля использовали hIgG (человеческий IgG). Пробу сыворотки в данном тесте 250-кратно, 500-кратно и 1000-кратно разводили соответственно, а затем оставляли на 2 часа для прохождения реакции при комнатной температуре. Планшет промывали буфером РВТ, и ПХ-конъюгированное анти-Fc антитело (#31413, Pierce) разводили в концентрации 1:4000, а затем оставляли на 2 часа для прохождения реакции при комнатной температуре. Планшет промывали буфером PBST и приготавливали раствор OPD (дигидрохлорида o-фенилендиамина). Соответствующие лунки обрабатывали 100 мкл раствора OPD. Раствор OPD получали путем добавления к буферу РС, рН 5,0, воды, насыщенной кислородом, и OPD (Р9187, Sigma). После прохождения реакции в темном помещении в течение 10 минут, лунки обрабатывали 50 мкл 2,5 М серной кислоты. В соответствии с этим, цветовую реакцию завершали и измеряли оптическую плотность (OD) на 492 нм. Была отобрана область, в которой R2 превышает 0,99, и этот результат использовали для построения стандартной кривой.

В результате, учитывая то, что было инъецировано 5 мг/кг (100 мкг/мышь в расчете на фактическую массу мыши) и что общий объем крови мыши составляет приблизительно 2 мл, можно сказать, что максимальная концентрация, которая может быть оценена, составляет 50 мкг/мл, и результат теста, проводимого путем внутрибрюшинной инъекции, указывал на достаточно высокую концентрацию Cmax, то есть v = 38,96 мкг/мл. В соответствии с этим, максимальная концентрация наблюдалась через 4 часа после инъекции (Tmax). Время полужизни, означающее время сохранения стабильности лекарственного средства in vivo, составляло приблизительно 20 часов, что указывает на то, что это лекарственное средство является достаточно стабильным in vivo (см. фиг.36). Поскольку концентрация 10 мкг/мл является очень эффективной для ингибирования метастазов, если исходить из того факта, что концентрация приблизительно в 10 мкг/мл сохраняется в течение 48 часов, то очевидно, что такое новое лекарственное средство является достаточно безопасным и эффективным для ингибирования метастазов рака (фиг.35).

В соответствии с этим, принимая во внимание, что слитый белок DLK1-Fc может ингибировать миграцию различных опухолей, а также учитывая фармакокинетические параметры, можно сказать, что слитый белок DLK1-Fc может быть с успехом использован в качестве композиции для ингибирования метастазов рака.

Примеры получения композиции согласно изобретению приводятся ниже.

Пример получения композиции 1

Получение фармацевтического препарата

1. Получение порошков

Слитый белок DLK1-Fc 2 г
Лактоза 1 г

Вышеуказанные ингредиенты смешивали, и этой смесью заполняли воздухонепроницаемое саше для порошков.

2. Получение таблеток

Слитый белок DLK1-Fc 100 мг
Кукурузный крахмал 100 мг
Лактоза 100 мг
Стеарат магния 2 мг

Вышеуказанные ингредиенты смешивали и формовали в таблетки в соответствии с общим стандартным методом таблетирования.

3. Получение капсул

Слитый белок DLK1-Fc 100 мг
Кукурузный крахмал 100 мг
Лактоза 100 мг
Стеарат магния 2 мг

Вышеуказанные ингредиенты смешивали, и этой смесью заполняли желатиновые капсулы в соответствии с общим стандартным методом инкапсулирования.

5. Получение препарата для инъекций

Слитый белок DLK1-Fc 10 мкг/мл
Соляная кислота BP до рН 7,6
Хлорид натрия BP для инъекции максимум 1 мл

Слитый белок DLK1-Fc растворяли в соответствующем растворе нитрида натрия ВР для инъекции, рН полученного раствора доводили до 7,6 с использованием соляной кислоты ВР, а его содержание регулировали с использованием нитрида натрия ВР для инъекции, после чего раствор тщательно перемешивали. Этим раствором заполняли 5-миллилитровую ампулу из прозрачного стекла типа I, затем стекло оплавляли, и раствор герметизировали под давлением газа. Ампулу помещали в автоклав более чем на 15 минут при 120°C и получали препарат для инъекций.

6. Получение драже

Слитый белок DLK1-Fc 1 г
Лактоза 1,5 г
Глицерин 1 г
Ксилит 0,5 г

Вышеуказанные ингредиенты смешивали, и получали драже массой в 4 г в соответствии с общим стандартным методом.

7. Получение гранул

Слитый белок DLK1-Fc 150 мг
Соевый экстракт 50 мг
Глюкоза 200 мг
Крахмал 600 мг

Вышеуказанные ингредиенты смешивали и добавляли 100 мг 30% этанола, а затем сушили при 60°C с получением гранул, которые упаковывали в саше.

Промышленное применение

Слитый белок DLK1-Fc, по сравнению с не слитым белком, обладает более высокой стабильностью, значительно снижает степень миграции клеток различных клеточных линий рака и значительно повышает степень ингибирования миграции раковых клеток даже при низкой концентрации. В соответствии с этим, слитый белок DLK1-Fc может быть с успехом использован в качестве композиции для ингибирования метастазов рака и для предупреждения и лечения рака, а также в качестве диетического пищевого продукта для предупреждения рака и улучшения состояния ракового больного. Кроме того, при промышленном изготовлении слитого белка DLK1-Fc в комбинации с антиангиогенной композицией, которая в настоящее время используется для лечения рака, этот слитый белок может быть с успехом использован в качестве композиции для ингибирования метастазов и лечения рака, которая будет обладать значительно более высокой противораковой активностью.

1. Слитый белок DLK1-Fc для ингибирования метастазов рака, содержащий внеклеточный растворимый домен DLK1, состоящий из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 4 и Fc-домена человеческого антитела.

2. Полинуклеотид, кодирующий слитый белок DLK1-Fc по п.1.

3. Рекомбинантный экспрессионный вектор, содержащий полинуклеотид по п.2.

4. Клетка-хозяин, продуцирующая слитый белок DLK1-Fc по п.1, в которую рекомбинантный вектор по п.3 трансфицирован.

5. Способ получения слитого белка DLK1-Fc по п.1, включающий:
1) культивирование клетки-хозяина по п.4; и
2) выделение слитого белка DLK1-Fc из клеточной культуры.

6. Композиция для ингибирования метастазов рака, содержащая внеклеточный растворимый домен DLK1, состоящий из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 4, или слитый белок DLK1-Fc по п.1 в эффективном количестве и фармацевтически приемлемый носитель.

7. Композиция по п.6, где указанным раковым заболеванием является рак, выбранный из группы, состоящей из рака кожи, рака молочной железы, рака матки, рака толстой кишки, рака почек, рака печени, рака легких, рака яичника, рака поджелудочной железы и рака желудка.

8. Способ ингибирования метастазов рака, включающий стадию введения фармацевтически эффективного количества растворимого внеклеточного домена DLK1, состоящего из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 4, или слитого белка DLK1-Fc по п.1 индивидууму с метастазами раковой опухоли.

9. Способ по п.8, где указанным раковым заболеванием является рак, выбранный из группы, состоящей из рака кожи, рака молочной железы, рака матки, рака толстой кишки, рака почек, рака печени, рака легких, рака яичника, рака поджелудочной железы и рака желудка.

10. Применение внеклеточного растворимого домена DLK1, состоящего из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 4, или слитого белка DLK1-Fc по п.1 для получения композиции для ингибирования метастазов рака.

11. Применение по п.10, где указанным раковым заболеванием является рак, выбранный из группы, состоящей из рака кожи, рака молочной железы, рака матки, рака толстой кишки, рака почек, рака печени, рака легких, рака яичника, рака поджелудочной железы и рака желудка.



 

Похожие патенты:

Изобретение относится к области молекулярной биологии, биохимии и генной инженерии. Предложены нуклеиновая кислота, характеризующаяся нуклеотидной последовательностью, кодирующей белок, который состоит из аминокислотной последовательности с делецией, заменой или добавлением одной или более аминокислот в аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 2 или SEQ ID NO: 7 и обладает активностью фосфатазы фосфатидной кислоты, соответствующий белок, рекомбинантный вектор, клетка для экспрессии белка и способ получения композиции жирной кислоты.

Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к модифицированному фактору Виллебранда (VWF), и может быть использовано в медицине. Рекомбинантным путем получают модифицированный VWF, слитый в С-концевой части своего первичного продукта трансляции с N-концевой частью альбумина посредством линкера SSGGSGGSGGSGGSGGSGGSGGSGGSGGSGS.

Настоящее изобретение относится к области иммунологии. Предложено антитело, специфически связывающееся с эпитопом на CD43 и CEA и имеющее модификации в константной области тяжелой и/или легкой цепи.

Настоящее изобретение относится к области иммунологии. Предложено выделенное моноклональное антитело к интегрину α5β1 человека.

Изобретение относится к области биотехнологии, вирусологии и медицины. Предложена комбинация флавивирусных частиц.

Изобретение относится к области биотехнологии и иммунологии. Предложено изолированное моноклональное антитело или его иммунореактивный фрагмент, которое связывается с эпитопом G-белка штамма А2 респираторно-синцитиального вируса (RSV).

Изобретение относится к области иммунологии, медицины и биотехнологии. Предложены варианты анти-EPHA2 антител.

Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к средству для лечения ишемических поражений тканей, представляющему собой смесь с соотношением 1÷0,5-3 из двух культур мезенхимальных стволовых клеток, одна из которых модифицирована генетической конструкцией на основе вирусного вектора, обеспечивающего гиперпродукцию фактора роста эндотелия сосудов, а другая модифицирована генетической конструкцией на основе вирусного вектора, обеспечивающего гиперпродукцию ангиопоэтина, а также способу лечения ишемических поражений тканей посредством обкалывания ишемезированной ткани, и может быть использовано в медицине.

Изобретения относятся к области иммунологии. Представлены одноцепочечное антитело, специфичное к раково-эмбриональному антигену, химерный мононуклеарный Т-клеточный рецептор, вектор, клетка-хозяин и способ диагностики или лечения заболеваний, характеризующихся наличием антигенов, способных связываться с химерным рецептором.

Изобретение относится к химико-фармацевтической промышленности и представляет собой средство для вовлечения мезенхимальной стволовой клетки костного мозга в периферическую кровь из костного мозга, которое вводят в кровеносный сосуд или мышцу и которое содержит любой из компонентов: (a) белок HMGB1; (b) клетка, которая секретирует белок HMGB1; (c) вектор, в который встроена ДНК, кодирующая белок HMGB1; (d) белок HMGB2; (e) клетка, которая секретирует белок HMGB2; (f) вектор, в который встроена ДНК, кодирующая белок HMGB2; (g) белок HMGB3; (h) клетка, которая секретирует белок HMGB3; и (i) вектор, в который встроена ДНК, кодирующая белок HMGB3.

Изобретение относится к области биотехнологии. Представлена рекомбинантная плазмида рСНВН для экспрессии в Pichia pastoris последовательности, кодирующей прокарбоксипептидазу Б, имеющая размер 10466 т.п.о и состоящая из XhoI/EcoRI - фрагмента ДНК вектора рР1С9К размером 9246 т.п.о.

Изобретение относится к области биохимии, в частности к рекомбинантному фактору VIII, содержащему одну или более мутаций, приводящих к увеличению стабильности как фактора VIII, так и фактора VIIIa, а также к фармацевтической композиции для лечения гемофилии ее содержащей.

Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к модифицированному фактору Виллебранда (VWF), и может быть использовано в медицине. Рекомбинантным путем получают модифицированный VWF, слитый в С-концевой части своего первичного продукта трансляции с N-концевой частью альбумина посредством линкера SSGGSGGSGGSGGSGGSGGSGGSGGSGGSGS.

Изобретение относится к области биохимии, в частности к выделенному полипептиду, который является биологической мишенью для ингибирования клетки-метанопродуцента, а также к выделенному полинуклеотиду, который кодирует этот полипептид.

Настоящее изобретение относится к области иммунологии. Предложено антитело, специфически связывающееся с эпитопом на CD43 и CEA и имеющее модификации в константной области тяжелой и/или легкой цепи.

Настоящее изобретение относится к области иммунологии. Предложено выделенное моноклональное антитело к интегрину α5β1 человека.

Группа изобретений относится к биотехнологии. Предложены варианты рекомбинантных штаммов бактерий Escherichia coli, являющихся продуцентами янтарной кислоты и содержащих ген, кодирующий пируваткарбоксилазу.

Изобретение относится к области биотехнологии и нанотехнологии. Способ предусматривает трансформацию клеток архей рекомбинантной плазмидой, выращивание клеток, выделение жгутиков и модификацию поверхности жгутиков.

Изобретение относится к области генной инженерии и может быть использовано для регулирования проницаемости метан-продуцирующей клетки. Получают полипептид, который способен проникать в метан-продуцирующую клетку и повышать ее проницаемость, характеризующийся аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:117, 118 или 119 или по меньшей мере 90% идентичностью к указанной последовательности или по меньшей мере 15 последовательно расположенными аминокислотами указанной последовательности.

Изобретение относится к области биохимии, в частности к растению, обладающему повышенной устойчивостью к AHAS-ингибирующему гербициду, включающему, по крайней мере, одну Shiloh-8 IMI нуклеиновую кислоту, его части, растительной клетке и семени.

Изобретение относится к области молекулярной биологии и генетической инженерии. Предложен способ селекции эукариотической клетки-хозяина, экспрессирующей желаемый уровень интересующего полипептида, включающий трансфекцию клеток гетерологичной нуклеиновой кислотой, содержащей по меньшей мере одну кассету, содержащую по меньшей мере первый полинуклеотид, кодирующий интересующий полипептид, стоп-кодон, расположенный по направлению экспрессии относительно первого полинуклеотида, второй полинуклеотид, расположенный по направлению экспрессии относительно стоп-кодона, кодирующий иммуноглобулиновый трансмембранный якорный домен, культивирование клеток-хозяев для экспрессии интересующего полипептида так, чтобы по меньшей мере часть рассматриваемого полипептида экспрессировалась в виде слитого полипептида, содержащего иммуноглобулиновый трансмембранный якорный домен, причем такой слитый полипептид экспонируется на поверхности указанной клетки-хозяине, селекцию клетки по наличию или количеству слитого полипептида, экспонируемого на клеточной поверхности.
Наверх