Штамм enterоcoccus mundtii, продуцирующий субстанцию пептидной природы с антилистериозной активностью

Изобретение относится к области микробиологии и биотехнологии. Предложен штамм Enterococcus mundtii «ГКПМ - Оболенск» B-7424, продуцирующий пептидную субстанцию с антилистериозной активностью. Антимикробная пептидная субстанция Enterococcus mundtii «ГКПМ - Оболенск» B-7424 обладает активностью около 6400 - 12800 АЕ/мл против тестового штамма Listeria monocytogenes 776 и может быть использована для деконтаминации биопродуктов, а также материалов, инфицированных бактериальными патогенами. 2 ил., 4 табл., 6 пр.

 

Изобретение относится к биотехнологии и может быть применено для получения антимикробной пептидной субстанции - бактериоцина, используемого при производстве продовольственных продуктов, с целью профилактики и лечения пищевых заболеваний, вызываемых бактериальными патогенами, особенно листериями.

Проблема антибиотикорезистентности, особенно борьба с возбудителями пищевых инфекций - консервантами, безопасными для человека, - актуальна.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

В последнее десятилетие внимание исследователей привлечено к бактериям из рода Enterococcus как потенциальных пробиотикам и продуцентам антимикробных субстанций пептидной природы, которые имеют высокий потенциал применения в производстве продуктов питания, кормов и биопрезервантов.

Несмотря на большое количество научных работ, выполненных в этом направлении и подтверждающих интерес к исследованиям такого рода, только единичные штаммы-продуценты бактериоцинов были доведены до практического использования (низин, педиоцин). Основные проблемы, с которыми сталкиваются разработчики на пути внедрения новых бактериоцинов, это безопасность штаммов-продуцентов и невысокий выход целевой продукции. Так, использование продуцентов бактериоцинов из рода Enterococcus в качестве пробиотиков вызывает настороженность: среди них встречаются штаммы, вызывающие заболевания человека и животных, а также штаммы носители генов резистентности к ванкомицину. У ряда штаммов этого рода выявлены такие факторы вирулентности, как адгезия к клеточным поверхностям, клеточная агрегация и конъюгация, гидролиз коллагена, гемоглобина, желатина (gelE), активация цитолизина, экспрессия адгезинов клеточной стенки (efaAfm). Эти факторы часто ассоциированы со штаммами вида Е. faecalis (Foulquié-Moreno et al., 2006; Mannu et al., 2003) - y некоторых из них выявили гены geIE, efaAfm, а также обнаружена резистентность к антибиотику ванкомицину (Eaton and Gasson, 2001).

Представители рода Enterососсus, применяемые в качестве продуцентов бактериоцинов типа энтероцинов, имеют хорошую перспективу в борьбе с бактериями, вызывающими порчу пищи и кишечные заболевания. Однако исследователями отмечаются невысокие выходы бактериоцинов, что ограничивает практическое использования представителей этого рода микроорганизмов.

Таким образом, поиск в окружающей среде более безопасных и в то же время более продуктивных штаммов энтерококков продуцентов бактериоцинов, которые способны быть альтернативой антибиотикам и химиопрепаратам, является актуальной задачей биотехнологии.

Известен штамм Enterococcus mundtii ST4SA (Patent US 8444998), который продуцирует пептид - бактериоцин ST4SA (м.в. 3400 Да), обладающий антимикробными свойствами, однако представленные авторами высокие значения бактерицидной активности препарата относятся лишь к чувствительному тестовому штамму лактобактерий - Lactobacillus casei LHS. Активность в отношении листерий оценена только для одного представителя этого рода - непатогенного штамма Listeria innocua LMG 13568.

Наиболее близким к предлагаемому изобретению является штамм Enterococcus faecium 1073, продуцирующий бактериоцин Е-1073 (м.в. 3256 Да), выделенный из кишечника бройлерного цыпленка, идентифицированный и исследованный в ГНЦ ПМБ. Этот штамм в условиях глубинного культивирования продуцировал в культуральную жидкость бактериоцин Е-1073 с активностью против L. monocytogenes на уровне 800-1600 АЕ/мл. Такой невысокий выход целевого продукта потребовал дополнительного использования специфических активаторов биосинтеза - конкурентных бактерий и сигнальных пептидов, что в целом усложняет технологию получения бактериоцинов.

Задачей настоящего изобретения является получение нового продуцента бактерицидной субстанции пептидной природы (бактериоцина) - представителя рода Enterососсus, обладающего более высоким выходом целевого продукта, антилистериозной активностью, не резистентного к ванкомицину и пригодного для снижения микробной обсемененности (деконтаминации) лабильных биопродуктов, а также материалов, инфицированных бактериальными патогенами.

Поставленная задача решается тем, что предложен штамм Enterococcus mundtii PPHS-5-13, продуцирующий субстанцию пептидной природы (бактериоцина) с антилистериозной активностью, не обладающий резистентностью к ванкомицину.

Штамм Enterococcus mundtii PPHS-5-13 депонирован в Государственной коллекции патогенных микроорганизмов и клеточных культур «ГКПМ - Оболенск», регистрационный номер В-7424.

Штамм Enterococcus mundtii PPHS-5-13 выделен из молочного продукта (прогорклого молока).

Штамм Enterococcus mundtii PPHS-5-13 характеризуется следующими признаками:

Культурально - морфологические признаки

Штамм Enterococcus mundtii PPHS-5-13 неподвижен, колонии имеют окраску желтого цвета диаметром 1-1,5 мм, клетки штамма в мазках, окрашенных по Граму, имеют вид грамположительных «яйцевидных» кокков до 2 мкм в диаметре, каталазоотрицателен, растет в присутствии 2,5% хлористого натрия, в диапазоне температур от 10 до 45°С.Штамм негемолитичен, микроаэрофилл.

Биохимические признаки

Биохимические свойства определяли с использованием систем rapid ID API 32 STREP (Bio-Merieux, Франция). Гидролизует аргинин, с помощью глюкозидаз и галактозидаз расщепляют некоторые олигосахариды, но не раффинозу и сорбозу. Ферментирует рибозу, маннит, лактозу, сахарозу, мальтозу, тагатозу, трегалозу. Способен образовывать ацетилметилкарбинол из глюкозы, ферментировать пятиатомный спирт арабит, но не обладает уреазной активностью. Чувствителен к ванкомицину (ПДК - менее 4 мг/мл).

Штамм Enterococcus mundtii PPHS-5-13 продуцирует субстанцию пептидной природы - бактериоцин с антилистериозной активностью.

Исследования по идентификации выделенного нами штамма с использованием масс - спектрометра MALDI - TOF BioTyper (Microflex, Bruker Daltonik GmbH) дали достаточно высокие показатели уровня вероятности определения до уровня вида (2,300-2,500 или+++), которые позволили сделать заключение о его близости к музейному штамму из немецкой коллекции - Enterococcus mundtii 4840 DSM. Уточнение видовой принадлежности штамма на основе генетического типирования ДНК проводилось в ПЦР с праймерами, фланкирующими гены tuf, spacer 16S-13S rDNA, rpoA, gap.Ампликоны синтезированы с двумя парами праймеров: tuf и spacer 16S-13S rDNA. Секвенированная последовательность спейсера и последовательности, исследованные для ДНК изолированных колоний, совпали на протяжении 470 нуклеотидов в направлении от 23S rDNA. Сходство на уровне 97-98% для Е. mundtii АТСС 43186, определенное по программе BLAST, позволило уверенно отнести найденный штамм к виду Enterococcus mundtii.

Таким образом, на основании совокупности проведенных исследований патентуемый штамм отнесен к виду Enterococcus mundtii и депонирован как Enterococcus mundtii PPHS-5-13 (далее по тексту - штамм PPHS-5-13).

Выделенная из среды культивирования пептидная субстанция штамма PPHS-5-13 ингибирует рост 23 патогенных штаммов вида Listeria monocytogenes, а также подавляет в различной степени рост Acinetobacter lwoffii; Pseudomonas aeruginosa 468; Staphylococcus aureus 46; Klebsiella pneumoniae 114; Enterobacter cloacae 190; Salmonella enteritidis 237; Shigella sonne ½ и Campylobacter jejuni (коллекция ГНЦ ПМБ)

Штамм PPHS-5-13 не токсичен для белых мышей при пероральном скармливании каждой особи по 100 мг сухой культуры, иммобилизованной в гранулу коммерческого корма. Штамм сохраняет способность продуцировать бактериоцин в кишечнике и после повторного выделения его из фекальной массы мышей.

Предложен способ выращивания штамма PPHS-5-13 на плотных и жидких питательных средах на основе гидролизатов казеина или рыбной муки производства ГНЦ ПМБ с добавлением глюкозы или сахарозы, дрожжевого экстракта, цитрата, солей натрия, магния в ферментерах объемом до 100 литров при контролируемой температуре, рН и оптической плотности. Разделение клеток и получение бесклеточной жидкости, содержащей бактериоцин, проводится методом сепарирования в поле центробежных сил или мембранной фильтрации. Концентрирование бесклеточной жидкости (супернатанта-пермеата) осуществляется в два этапа: путем примерно 10-кратного упаривания на вакуумном роторном испарителе с последующим удалением водной фазы методом распылительного высушивания.

Извлечение активного начала (фракции бактериоцина) производится методом фазовой сепарации из регидратированного порошка супернатанта с использованием органического растворителя, что позволяет удалить до 96-98% (по массе) балластных компонентов. Наличие пептидной субстанции - бактериоцина в концентрате и оценка его активности и молекулярной массы определяются методом электрофореза в системе трицин-ДСН-полиакриламидный гель.

Пептидная природа субстанции бактериоцина подтверждается присутствием окрашенной Кумасси полоски на пластине геля, ее соответствия молекулярному маркеру и наличию зоны ингибирования листерий в месте расположения полоски. Пептидная природа подтверждается также полной потерей активности после обработки субстанции протеолитическими ферментами-химотрипсином и протеиназой K.

Изобретение иллюстрируется следующими графическими материалами:

Фиг.1 - Колония штамма PPHS-5-13 диаметром 2 мм дает зону 35 мм на газоне L. monocytogenes 776.

Фиг.2 - Биотестирование концентрата супернатанта штамма PPHS-5-13 (1) и активной фракции (2), элюированной из хроматографической колонки HPLS: электрофорез в системе трицин-ДСН-ПААГ, маркеры (М) Page Ruler от 3,4 до 100 кДа, агар инокулирован L. monocytogenes 776.

Пример 1. Штамм PPHS-5-13 выделяют из прогорклого молока коровы по следующей схеме: молоко хранится при температуре 0-5°С в открытой пластиковой емкости в течение 3-4 недель. После появления признаков порчи и запаха прогорклости отбирают пробы молока для выделения выросших культур. Пробу разводят стерильной дистиллированной водой (1:1) и термостатируют при 30±1°С.Через 24 часа аликвот пробы высевают на ГРМ - агар (производство ГНЦ ПМБ) из серии десятикратных разведений, начиная с 5-го и по 8-е разведение. На выросшие на среде в чашке Петри колонии микроорганизмов с числом не более 50 наслаивают расплавленный питательный агар (45±5°С), предварительно инокулированный тестовым штаммом Listeria monocytogenes 776. Чашки с посевами инкубируют в термостате в течение 18-24 часов при температуре (37±0,5)°С.При просмотре чашки отмечают наличие зон ингибирования индикаторного штамма вокруг колоний и наиболее антагонистически активные из них пересевают на свежий питательный агар для последующего получения чистой культуры. На фиг. 1 представлены зоны ингибирования роста тестового штамма Listeria monocytogenes 776, образованные колониями чистой культуры штамма PPHS-5-13.

Колонии, давшие наибольшие размеры зоны ингибирования, отбирают для последующих исследований. После нескольких пересевов чистая культура биохимически идентифицируется на тестовых системах API ID 32 STREP и ID 50 СН (Biomerieux, Франция) в соответствии с инструкциями производителя.

По результатам культуральных и биохимических свойств штамм PPHS-5-13 определяется, как способным к росту в температурном диапазоне 10-45°С, в присутствии 2,5% хлористого натрия, как факультативно анаэробный, негемолитичный, не образующий каталазу и неподвижный микроорганизм, образующий желтый пигмент.

Из 49 углеводов (галактоза, глюкоза, фруктоза, манноза, манит, N-ацетилглюкозамин, амигдалин, арбутин, эскулин, салицин, целлобиоза, мальтоза, лактоза, сахароза, трегалоза, раффиноза, гликоген, гентиобиоза, тураноза, тагатоза и др.) стрип теста API 50 CHL штамм PPHS-5-13 ферментирует большинство (44) из них, за исключением глицерина, сорбитола, α-метил-D-маннозида, мелибиозы и крахмала. В таблице 1 представлены сравнительные данные по биохимическим свойствам штамма PPHS-5-13 и известного штамма E. mundtii ST4SA.

Таблица 1
Сравнение профилей ферментации углеводов патентуемого штамма PPHS-5-13 с известным штаммом Enterococcus mundtii ST4SA
№ теста по API 50**	Наименование углевода	Метаболизм углеводов: да (+) или нет (-)
Enterococcus mundtii PPHS-5-13	Ε. mundtii ST4SA*
1	Glycerol	-	+
19	Sorbitol	-	++
20	α-methyl-D-mannoside	-	++
30	Melibiose	-	++
36	Starch	-	+
	D-tagatose	+	-
(*) US Pat. 8444998, (**) API 50 CHL (Biomerieux, г.Марси-Летуаль, Франция)

Штамм PPHS-5-13, как следует из данных таблицы 1, не ферментирует глицерин, сорбитол, α-methyl-D-mannoside (метилманнозид), мелибиозу, крахмал, но ферментирует тагатозу, что отличает его от E. mundtii ST4SA.

Проведен анализ ДНК в ПЦР с праймерами, фланкирующими гены tuf, spacer 16S-23S rDNA, rpoA, gap.Ампликоны синтезированы с двумя парами праймеров: tuf и spacer 16S-23S rDNA. Последовательность спейсера и последовательности ДНК из изолированных колоний совпали на протяжении 470 нуклеотидов в направлении от 23S rDNA, за исключением одной позиции.

Паспорт сиквенса - KF633469 (Links EMBL, Genbank, DDBJ). Описание: Enterococcus mundtii штамм SCPM-Obolensk: PPHS-5-13, ген 16S рибосомальной РНК, частичный сиквенс; 16S-23S рибосомальный межгенный спейсер РНК, полный сиквенс; и ген 23S рибосомальной РНК, частичный сиквенс. Длина 434 пары, последовательность:

1 GTCCCACCACGAGAGTTTGTAACACCTGAAGTCGGTGAGGTAACCTTTTGGAGCCAGCCG 60

61 CCTAAGGTGGGATAGATGATTGGGGTGAAGTCGTAACAAGGTAGCCGTATCGGAAGGTGC 120

121 GGCTGGATCACCTCCTTTCTAAGGAATATTACGGAGACTACACACGTTTGTCGATACTTT 180

181 GTTCAGTTTTGAGAGGTCTACTCTCAAAATTTTGTTCATTGAAAACTGGATATTGAAGTA 240

241 AAAATGTAAGTAATACAAACCGAGAACACCGCGTTGAATGAGTTTTTTAATAAGTTCAAT 300

301 TGCTTATTTTTCTTGATTGGACTTCTATCGCTAGAAGAAAGATCAAAACCCAACCGCAAG 360

361 GTTGATAAGGTTAAGTGAATAAGGGCGCACGGTGGATGCCTTGGCACTAGGAGCCGATGA 420

421 AGGACGGGACTAAC 434

Сравнение всего представленного фрагмента в BLAST показало, что он сходен с Е. hirae АТСС 9790, а межгенная область - только с Е. mundtii АТСС 43186 (сходство 87-98%). В тоже время сходство с другими представителями того же вида хуже и в области гена и в межгенной области.

На основании выполненных исследований физиолого-биохимических и молекулярно-генетических исследований, а также с учетом образования микроорганизмом желтого пигмента, что не свойственно виду Е. hirae, штамм PPHS-5-13 отнесен к виду Enterococcus mundtii и депонирован как Enterococcus mundtii PPHS-5-13.

Идентифицированную культуру штамма PPHS-5-13 смешивают с лактозополиглюкиновой защитной средой и суспензию с концентрацией микробных клеток - около 12×10⁹ КОЕ/см³ разливают в стеклянные ампулы (3 см³) по 0,5 см³. Далее суспензию в ампулах лиофилизируют на установке Virtis 4К (США), а по завершении процесса ампулы заполняются инертным газом аргоном и асептически запаиваются. Ампулы хранятся при температуре (4-8)°С, с последующей перезакладкой через пять лет. Для регидратации и восстановления культуры используется физиологический раствор.

Пример 2. Условия и режимы культивирования штамма PPHS-5-13

Для определения способности штамма PPHS-5-13 к росту и продукции антимикробной субстанции на жидких питательных средах проводят культивирование в колбах и ферментерах малого (6 л) и большого (60 л) рабочих объемов.

Готовится питательная среда следующего состава (г/л): гидролизат казеина солянокислотный - 5; дрожжевой экстракт - 5; натрий лимоннокислый - 3; сахароза - 20; натрий хлористый - 3; магний сернокислый - 0,05; калий фосфорнокислый 2-зам. - 1. Показатель рН 6,8-7,1 ед. Приготовленную среду разливают по 150 мл в 10 качалочных колб вместимостью 750 мл.

Колбы размещают в качалке 120 об/мин, при 30-37°С, время культивирования до 20 часов. Через каждые 2 часа снимается одна колба для определения общего количества клеток (ОП_{550 нм}) и антимикробной активности культуральной жидкости (супернатанта) в отношении тестового штамма листерий Listeria monocytogenes 776. Предварительно в супернатанте устанавливается показатель рН на уровне 6,0±0,5 (добавка КОН), а возможно, присутствующая там перекись водорода разрушается добавлением фермента каталазы (1 мг/мл). Подготовленные пробы, наносятся (10 мкл) на свежий посеянный газон тестовой культуры.

Выращивание культуры в жидкой среде продолжается до тех пор, пока не будет достигнуто максимальное значение антимикробной активности, как правило, после достижения максимума, обычно к 10-12 часам, активность начинает уменьшаться и это является сигналом для завершения процесса культивирования. Оптимальным показателем является накопление в культуральной жидкости активности на уровне 6400-12800 АЕ/мл против тестового штамма Listeria monocytogenes 776.

Для приготовления представительного количества антимикробной пептидной субстанции - бактериоцина культивирование штамма PPHS-5-13 проводят в лабораторном ферментере объемом 10 л (NBS, США; ЗУ, Россия) с использованием в качестве посевного материала культуры из колб в питательной среде следующего состава (г/л): гидролизат казеина солянокислотный - 5; дрожжевой экстракт - 5; натрий лимоннокислый - 3; сахароза - 20; натрий хлористый - 3; магний сернокислый - 0,05; калий фосфорнокислый 2-зам. - 1. Показатель рН 6,8-7,1 ед.

Питательная среда указанного выше состава, залитая в ферментер, инокулируется посевным материалом штамма PPHS-5-13, содержащий около 109 микробных клеток в мл (по Тарасевичу). Объем посевного материала составляет 5% к объему питательной среды в 10 л ферментере. Основные параметры и условия культивирования штамма PPHS-5-13 в ферментере приведены в таблице 1.

Таблица 1
Параметры культивирования штамма PPHS-5-13 в 10 л ферментере и достигаемые параметры по оптической плотности и антилистериозной активности культуральной жидкости
Время роста, ч	Температура, °С	Поддержка рН*	Мешалка, об/мин	Аэрация, л/мин	Достигаемые выходы**
ПО ОП(550 нм)	По АА КЖ
11,0±1,5	34,0±1,0	6,0±0,5	220-450	3±1	2,8±0,6	12800 АЕ/мл
(*) корректировка введением 20% р-ра КОН. (**) ОП - оптическая плотность культуральной жидкости (КЖ), АА - антимикробная активность в отношении тест-штамма 776 Listeria monocytogenes, измеренная в арбитражных единицах на мл (АЕ/мл).

По завершении процесса выращивания культуральную жидкость (КЖ) освобождают от клеток (центрифуга «Beckmann», 8000 об/мин, 5°С, 45 мин) и упаривают на роторном вакуумном испарителе в 10 раз. Концентрат супернатанта подвергают распылительному высушивания при следующих параметрах: температура входа/выхода -110°С/90°С, подача жидкости - около 17 мл/мин, расход воздуха - 100 м /ч. Полученный сухой порошок с остаточной влажностью до 6% имеет активность от 100 до 400 АЕ/мг и может быть использован для приготовления кормовых добавок, лечебных или деконтаминирующих растворов. Сухой порошок может быть дополнительно очищен от примесей и далее использован для проведения аналитических исследований.

Пример 3. Частичная очистка антимикробной пептидной субстанции бактериоцина Для частичной очистки бактерецидной субстанции из концентрата супернатанта используют метод солевой преципитации с помощью сульфата аммония или метод фазовой сепарации с применением органического растворителя.

Порошок супернатанта, содержащий бактерицидную субстанцию с активностью 100 АЕ/мг, взятый в количестве 10 г, разводят в 100 мл стерильной дистиллированой воды до концентрации 100 мг/мл и тщательно перемешивают до полного суспендирования. Далее в 100 мл суспензии вносят до 60% твердого сульфата аммония, смесь перемешивается и помещается в холодильник на 24 часа (температура 4°С). По истечении этого времени стаканы помещают в центрифугу и седиментируют при 25000 G в течение 20 минут при температуре 0-5°С. Надосадочная жидкость удаляется, а к осадку в стаканах добавляют 50-100 мл дистиллированной воды до полного растворения осадка. Полученный раствор диализуют против дистиллированной воды в течение одних суток. Выход по отношению к суммарному расчетному количеству бактериоцина составил 30%, удельная активность - 10 АЕ/мг против Listeria monocytogenes 776. Затраченное время более 2 суток.

Другим методом частичной очистки субстанции бактериоцина было использование фазовой сепарации с применением низкокипящего, нерастворимого в воде органического растворителя. Порошок супернатанта, содержащий бактерицидную субстанцию в концентрации 100 АЕ/мг, взятый в количестве 10 г, разводят в 100 мл стерильной дистиллированой воды до концентрации 100 мг/мл и тщательно перемешивают до полного суспендирования. Далее к 100 мл суспензии добавляют 120 мл органического растворителя дихлорметана (ДХМ) и смесь гомогенизируют в течение 30 минут на смесителе со скоростью 1000 об/мин для формирования устойчивой эмульсии. Полученная эмульсия в объеме 220 мл разливается в 2 металлических стакана по 110 мл, устанавливается в бакет-роторе центрифуги «Beckmann» и центрифугируется при 5000 об/мин в течение 30 минут для сбора на границе фаз (вода/ДХМ) концентрированной эмульсии в виде интерфазной пленки (ИФП). ИФП отбирается путем слива верхней легкой (водной) и затем нижней тяжелой фазы (ДХМ), которые затем отбрасываются, а ИФП высушивается при 90°С до постоянного веса. В результате фазовой сепарации удаляется более 98% балластной массы, представляющей собой компоненты питательной среды, минеральные соли и метаболиты. Выход активной субстанции составляет до 95% активности от ее исходного уровня, при этом для ее получения затрачивается не более 3 часов. Полученный сухой порошок с удельной активностью 2000-3000 АЕ/мг является грубой фракцией бактериоцина. Дальнейшая очистка для проведения молекулярных исследований может быть при необходимости проведена общепринятыми методами колоночной хроматографии.

Пример 4. Физико-химические и биологические свойства грубой фракции бактериоцина

Пептидная природа фракции бактериоцина подтверждается преципитацией при обработке сульфатом аммония - классическому методу, широко используемому для первичной очистки протеинов. Другими фактами, доказывающими пептидную природу, является деградирующее действие протеолитических ферментов, а также выявление индивидуальной полосы пептида на электрофореограмме в системе Трицин-ДСН-ПААГ.

В таблице 2 представлены результаты влияния на активность бактерицина протеолитических ферментов, показателя рН и действия высоких температур.

Таблица 2
Влияние протеолитических ферментов, рН и высоких температур на активность бактериоцина.
Ферменты*, рН и температура	Активность**
Исходно,без обработки	+
Химотрипсин (рН 6-7)	-
Протеиназа К (рН 6-7)	-
100°С, 30 мин (рН 2-10)	+
121°С, 20 мин (рН 6-7)	+
121°С, 20 мин (рН 10)	-
(*) концентрации ферментов - 10 мг/мл (**) + активность есть, - активности нет

Из представленных в таблице 2 данных следует, что протеолитические ферменты инактивируют активность бактериоцина, сочетание высокой температуры 121°С, 20 мин (рН 10) также инактивирует бактериоцин, что соответствует описанию свойств бактериоцинов, отнесенных к классу 2 по Юаеппаттег T.R. (1988).

Определение молекулярного веса бактериоцина в составе грубой фракции проводили в системе Трицин-ДСН-ПААГ электрофорез с использованием маркеров при постоянном напряжении 200 вольт в течение 2,5 часов. Биотестирование, т.е. антилистериозную активность выявляемых полос проводили на чашке Петри, в которую помещали окрашенный гель и заливали его тестовой агаровой культурой L. monocytogenes 776. Сопоставление пептидных полос с зоной ингибирования и показателями маркеров дает возможность оценить молекулярную массу исследуемого пептида. На снимке фигуры 2 приведены результаты биотестирования фракции бактериоцина Enterococcus mundtii PPHS-5-13: активный пептид виден в виде полоски, соответствующей молекулярному весу чуть менее 5 кДа.

Пример 5. Антимикробные свойства бактериоцина штамма PPHS-5-13 проверяли нанесением грубой пептидной фракции на свежезасеянные газоны штаммов листерий из числа депонированных в коллекции микроорганизмов ГНЦ ПМБ: L. monocytogenes EGDE; 10527; Gim 003; A; EGD; 766; 10357; С644; С-52; 11994; 7973; 4908; 4913; 944; 2; 6; М-5; 12 ИП; 13 ИП; 20 ИП; 46 ИП; 53 ИП; 766 ИП. Рост всех 23 приведенных штаммов был ингибирован при добавлении грубой фракции бактериоцина на свежеприготовленный газон этих культур в концентрации 15 мг/мл. Еще более чувствительными к бактериоцину PPHS-5-13 оказались непатогенные штаммы листерий, относящихся к видам L. ivanovii 4912, L. ivanovii АТСС 19119, L innocua NCTC11288, L. welshimeri, L. seeligeri SLCC5981.

Таким образом, из 23 видов, наиболее часто встречающихся патогенных листерий, все они были чувствительны к пептидной субстанции штамма PPHS-5-13. Антимикробная субстанция штамма PPHS-5-13 была активна в различной степени против других грамположительных и некоторых грамотрицательных патогенных микроорганизмов. Так, при определении минимальной подавляющей концентрации (МПК) грубой фракции бактериоцина, взятой в концентрации 15 мг/мл по сухой массе, но рассчитанного на содержание общего протеина, получены следующие результаты: Acinetobacter Iwoffii 125 - 0,2 мкг/мл; Pseudomonas aeruginosa 468 - 3,45 мкг/мл; Staphylococcus aureus 46 - 0,4 мкг/мл; Klebsiella pneumoniae 114 - 1,7 мкг/мл; Enterobacter cloacae 190 - 0,86 мкг/мл; Salmonella enteritidis 237 - 0,86 мкг/мл; Shigella sonne ½ - 0,2 мкг/мл и Campylobacter jejuni - 0,86 мкг/мл.

Фракция бактериоцина, выделенная из среды культивирования штамма PPHS-5-13, подавляла рост штаммов B. anthracis 34F и B. anthracis 220 - диаметр зоны их ингибирования составлял 7,2 и 6 мм, соответственно.

Пример 6. Деконтаминирующяя активность жидкого препарата пептидной субстанции штамма PPHS-5-13 на образцах нативной кожи бройлеров

Антимикробная активность жидких препаратов бактериоцина была исследована в опытах с нативной кожей тушек коммерческих бройлеров. Алгоритм обработки кожи бройлера заимствован из работы Dickens et. al. (2000) по оценке деконтаминирующих свойств препаратов, используемых в производстве бройлеров в США (2005). Образцы кожи получены от коммерческих бройлеров, хранившихся на холоду после забоя в течение 3 суток. Кожа с помощью стального пробойника нарезалась на кружки площадью по 4,5 см² каждый и инфицировалась смесью листерий и сальмонелл, взятых в концентрации 2,5×10⁸ клеток/мл каждого вида (разведения - по стандарту ГИСК Тарасевича), и нанесенной в количестве 100 мкл на каждый образец кожи. После инкубирования в течение 30 минут при комнатной температуре поверхность образцов кожи орошалась жидким препаратом пептидной субстанции штамма PPHS-5-13, взятым в объеме 100 мкл. Обработанные образцы после 1 мин экспозиции были поставлены вертикально для стекания капель в течение 3 мин, и затем они были перенесены в холодильник (3-5)°С на 45 минут для предотвращения возможного роста бактерий. После завершения этого времени образцы энергично промывались стерильной дистиллированной водой в объеме 3 мл на каждый образец, а собранную воду исследовали на общее содержание аэробов. В таблице 3 представлены результаты изучения деконтаминирующего действия пептидной фракции PPHS-5-13 на кожу бройлера, инфицированной сальмонеллами и листериями.

Таблица 3
Уровень обсемененности инфицированной кожи бройлера после обработки антимикробным препаратом PPHS-5-13
№№ проб	Образцы куриной кожи	Содержание аэробов в смывах, ×103 КОЕ/мл	Уровень обсемененности
1	Кожа нативная (контроль)	349	Нулевой*
2	Кожа, инфицированная сальмонеллами и листериями	2330	100%
3	Кожа, инфицированная сальмонеллами и листериями с последующей обработкой PPHS-5-13	690	29,6%
Примечание. (*) уровень исходной обсемененности кожи в контроле принят за ноль

Из представленных в таблице 3 данных следует, что при орошении кожи бройлера препаратом пептидной субстанции PPHS-5-13 содержание аэробов снизилось на 70,4%, практически до исходного уровня без применения химических реагентов и антибиотиков.

Штамм Enterococcus mundtii PPHS-5/13, продуцирующий субстанцию пептидной природы с антилистериозной активностью, депонированный в Государственной коллекции патогенных микроорганизмов и клеточных культур "ГКПМ - Оболенск", регистрационный номер В-7424.