Способ прогнозирования рецидивирования сарком мягких тканей


 


Владельцы патента RU 2532332:

Федеральное государственное бюджетное учреждение "Ростовский научно-исследовательский онкологический институт" Министерства здравоохранения Российской Федерации (RU)

Изобретение относится к медицине, а именно к онкологии, и может быть использовано при лечении сарком мягких тканей для прогнозирования возникновения рецидива. Сущностью изобретения является то, что определяют наличие клеток, экспрессирующих EGFR, CD 34, bcl 6, bcl 2, и при выявлении клеток с гиперэкспрессией EGFR, CD 34, bcl 6, bcl 2 прогнозируют появление рецидива в короткие сроки, а при наличии клеток со слабой экспрессией EGFR, CD 34, bcl 6, bcl 26 прогнозируют благоприятный исход. Разработанный способ обеспечивает повышение точности и информативности прогнозирования рецидивирования сарком мягких тканей. 2 пр., 1 табл.

 

Изобретение относится к медицине, а именно к онкологии, и может быть использовано при лечении сарком мягких тканей для прогнозирования возникновения рецидива.

Из литературных источников известен способ прогнозирования метастазов у больных раком желудка, в котором в качестве одного из маркеров метастазирования используется фактор ингибитора апоптоза bcl-2 (RU 2445632 C1, опубл. 20.03.2012 г., Бюл. №8, G01N /33). Способ включает в себя определение маркера пролиферативной активности Ki-67 и маркера апоптоза p53, отличающийся тем, что у больных раком желудка различного морфологического строения проводят иммуногистохимическое исследование (ИГХ), дополнительно определяют маркер апоптоза bcl-2 и устанавливают, что при абсолютных значениях при перстневидно-клеточном раке: p53 - 10%, bcl-2 - 10%, Ki-67 - 12%; при недифференцированном раке: p53 - 13%, bcl-2 - 11%, Ki-67 - 9%; при аденокарциноме: p53 - 10%, bcl-2 - 9%, Ki-67 - 12% прогнозируют возникновение метастазов в лимфоузлах, а при p53 - 6%, bcl-2 - 5%, Ki-67 - 10% прогнозируют отсутствие метастатического поражения лимфоузлов.

Известен способ прогнозирования метастазирования увеальной меланомы на основе маркеров апоптоза Bax и Bcl-2 (см. RU 2242766 C1, G01N 33/68, опубл. 20.12.2004). Способ включает иммуногистохимическое определение в удаленной опухоли наличия клеток, экспрессирующих Bax, и отличается тем, что дополнительно определяют наличие клеток, экспрессирующих Bcl-2, и если первые выявляют, а вторые не выявляют, то прогнозируют высокую вероятность метастазирования. Однако приведенные известные исследования в совокупности факторов, выявляемых при иммуногистохимическом исследовании не обеспечивают прогнозирование неблагоприятного течения сарком мягких тканей.

Известен способ прогнозирования рецидива заболевания, в котором до и после операции по удалению саркомы мягких тканей у мужчин и женщин проводят биохимическое определение уровня креатинкиназы в крови больного и при показателях фермента до и после операции в пределах нормы прогнозируют длительный безрецидивный период, а при уровне фермента, значительно превышающем норму после операции, прогнозируют появление рецидива в ближайшие месяцы после операции (RU 2471191 C2, опубл. 27.12.2012, Бюл. №36).

Однако на наш взгляд предлагаемый авторами способ прогнозирования рецидива опухолевого образования по уровню креатинкиназы не совсем специфичен для сарком мягких тканей.

Техническим результатом предлагаемого нами изобретения является повышение точности и информативности способа прогнозирования рецидивирования сарком мягких тканей.

Технический результат достигают тем, что дополнительно определяют наличие клеток, экспрессирующих EGFR, CD 34, bcl 6, bcl 2, и при выявлении клеток с гиперэкспрессией EGFR, CD 34, bcl 6, bcl 2 прогнозируют появление рецидива в короткие сроки, а при наличии клеток со слабой экспрессией EGFR, CD 34, bcl 6, bcl 26 прогнозируют благоприятный исход.

Выбор в качестве маркеров метастазирования сарком мягких тканей таких белков, как EGFR, CD 34, bcl 6, bcl 2, обусловлен их ролью в развитии рецидивирующего процесса. Так, белок CD34 локализуется в клетках эндотелия новообразованных тонкостенных сосудов и регулирует неоангиогенез. Белок bcl-2 экспрессируется на мембранах клеток опухолей, регулирует процессы апоптоза. Белок EGFR - трансмембранный гликопротеин, запускает внутриклеточный сигнальные каскады, приводящие к повышению пролиферации и росту клеток, ангиогенезу, метастазированию. Белок bcl-6 регулирует степень пролиферации и роста клеток опухоли.

Выбранный нами набор белков позволил оценить биологические потенции мягкотканных сарком, позволяющие дать оценку их прогрессии, рецидивирования, неоангиогенеза.

В таблице 1 представлены результаты ретроспективного исследования иммуногистохимических маркеров EGFR, CD 34, bcl 6, bcl 2 в срезах тканей опухолей у 20 пациентов с рецидивирующей саркомой мягких тканей в анамнезе (1 группа) и у 20 пациентов с благоприятным исходом (без рецидивов) (2 группа). При сравнении результатов исследования между двумя группами пациентов обнаружено, что у пациентов с рецидивирующей саркомой мягких тканей наблюдалась гиперэкспрессия EGFR, CD 34, bcl 6, bcl 2 белков, а у пациентов с саркомой мягких тканей без рецидивов наблюдалась слабая экспрессия белков EGFR, CD 34, bcl 6, bcl 2.

Маркер ИГХ 1 группа пациентов, количество (%) экспрессирующих клеток, n=20 p<0,05 2 группа пациентов, количество (%) экспрессирующих клеток, n=20 p<0,05
EGFR 70% 10%
CD 34 100% 7%
Bcl 6 73% 20%
Bcl 2 65% 10%

Подобных иммуногистохимических исследований при изучении прогнозирования сарком мягких тканей в доступной нам научно-медицинской и патентной литературе не встречалось.

Сравнительный анализ известных способов прогнозирования течения заболевания и предлагаемого нами способа позволяет выявить его новизну и отличия от известных.

Новизна способа прогнозирования рецидивирования сарком мягких тканей заключается в использовании дополнительных маркеров, отвечающих за пролиферацию и рост клеток (EGFR, bcl 6), апоптоз (bcl 2) и за ангиогенез (CD 34) с целью повышения точности прогноза рецидивирования заболевания после оперативного удаления опухоли.

Предлагаемый нами способ прогнозирования осуществляют следующим образом.

1. После удаления опухоли мягких тканей готовили из стандартного блока с опухолью 2 парафиновых среза толщиной 3-5 микрон по стандартной методике, депарафинировали в ксилоле и регидратировали в батарее спиртов. Четыре среза использовали для проведения иммуногистохимической реакции с маркерами EGFR, CD 34, bcl 6, bcl 2. Последовательность этапов проведения реакции с каждым из маркеров совпадала.

2. Иммуногистохимическое исследование по оценке экспрессии EGFR, CD 34, Вс12, Вс16 проводили по стандартной методике. Для открытия антигенных детерминант проводили обработку срезов в цитратном буфере [pH 6,0] в течение 30 минут при 95°C на водяной бане.

3. Инкубацию с первичными антителами проводили в течение ночи при 4°C. В качестве первичных антител при оценке экспрессии EGFR, CD 34, Вс12, Вс16 использовали мышиные моноклональные антитела к данным маркерам (разведение EGFR - 1:70, CD 34-1:150, bcl 6 - RTU, bcl-2 - 1:100, фирма производитель DAKO Corp).

4. Для визуализации реакции антиген-антитело использовали стрептавидин-биотиновую тест-систему [DAKO Corp] согласно инструкции. В качестве хромогена использовали ДАБ+[DAKO Corp].

5. Затем срезы докрашивали гематоксилином и заключали в бальзам.

6. Реакцию оценивали с применением светового микроскопа (увеличение ×40) по следующим критериям. Количество положительных клеток оценивали в зонах, содержащих их максимальное количество. В качестве негативного контроля использовали иммуногистохимическую реакцию без добавления первичных антител.

При наличии клеток с гиперэкспрессией EGFR, CD 34, bcl 6, bcl 2 оценивали прогноз для пациента как неблагоприятный (развитие рецидивов в короткие сроки), а при наличии клеток со слабой экспрессией EGFR, CD 34, bcl 6, bcl 2 прогноз расценивался как благоприятный (без рецидивов).

Приводим клинический пример использования способа

Пример 1

Больной А, 49 лет. История болезни №23425/ц.

Образование мягких тканей правого бедра заметил в августе 2007 года. Самостоятельно обратился в РНИОИ.

Отлечен комплексным методом лечения.

21.11.2007 года выполнена операция - удаление опухоли мягких тканей правого бедра.

Гистологическое заключение №982276-282/07 - злокачественная фиброзная гистиоцитома, гигантоклеточный вариант, обширные очаги некроза, степень дифференцировки G2 (умереннодифференцированная).

Данные иммуногистохимического исследования парафинового среза опухоли: выявлено EGFR - позитивных клеток 70%, CD 34 - позитивных клеток 100%, bcl 6 - позитивных клеток 73%, bcl 2 - позитивных клеток 65%. Больного отнесли в группу высокого риска развития метастазов и сократили интервалы между визитами к врачу.

С 20.12.2007 г. по 30.12.2007 г. прошел лучевое лечение в СОД 50 Гр на послеоперационный рубец и пути лимфооттока.

С 17.01.2008 г. по 22.01.2008 г. прошел 2 курса адъювантной химиотерапии:

Доксорубицин 100 мг, Циклофосфан 1600 мг, Цисплатин 100 мг.

В марте 2009 года обнаружено образование в послеоперационном рубце. Диагностирован рецидив опухоли.

30.03.2009 г. выполнена операция: широкое иссечение рецидива опухоли мягких тканей правого бедра.

Пример 2

Больная Б, 74 года. История болезни №2251/ф.

В сентябре 2004 г. заметила опухоль в левой пахово-подвздошной области, обратилась к врачу по месту жительства, направлена в РНИОИ.

Отлечена комплексным методом лечения.

02.03.2005 года выполнена операция: удаление саркомы мягких тканей левой паховой области.

Гистологическое заключение №95234-235/05 - злокачественная фиброзная гистиоцитома, гигантоклеточный вариант, обширные очаги некроза, степень дифференцировки G3.

По данным иммуногистохимического исследования парафинового среза опухоли выявлено EGFR - позитивных клеток 10%, CD 34 - позитивных клеток 7%, bcl 6 - позитивных клеток 24%, bcl 2 - позитивных клеток 10%, что расценено нами как благоприятный прогноз.

Прошла курс в СОД 40 Гр после операции на послеоперационный рубец и пути лимфооттока.

С 7.05.2005 г. по 15.05.2005 г. - прошла 3 курса адъювантной химиотерапии по схеме:

Винкристин 2 мг, доксорубицин 100 мг, циклофосфан 1200 мг

Больная планово проходила диспансерное наблюдение в РНИОИ, данных за рецидив в послеоперационном рубце, метастазирование нет.

Последняя явка 14.12.2012 г. - состояние больной удовлетворительное, жалоб не предъявляет. Послеоперационный рубец без признаков рецидивирования.

Таким способом был рассчитан прогноз 20 больным.

Разработанный способ прогнозирования рецидивирования сарком мягких тканей является промышленно применимым. С помощью этих прогностических факторов можно прогнозировать исход заболевания и планировать лечебные мероприятия.

Способ прогнозирования рецидивирования сарком мягких тканей, включающий иммуногистохимическое исследование ткани удаленной опухоли, отличающийся тем, что определяют наличие клеток, экспрессирующих белки EGFR, CD 34, bcl 6, bcl 2, при выявлении клеток с гиперэкспрессией белков EGFR, CD 34, bcl 6, bcl 2 прогнозируют появление рецидива в короткие сроки, при выявлении клеток со слабой экспрессией EGFR, CD 34, bcl 6, bcl 2 прогнозируют благоприятный исход.



 

Похожие патенты:

Изобретение относится к медицине, а именно к кардиологии, и может быть использовано для прогнозирования риска сердечно-сосудистой летальности у пациентов с постинфарктной хронической сердечной недостаточностью, сочетающейся с сахарным диабетом 2 типа.

Изобретение относится к медицине, а именно к урологии, и может быть использовано для интермиттирующей терапии у пациентов с доброкачественной гиперплазией предстательной железы (ДГПЖ).

Предлагаемое изобретение относится к области медицины, а именно к исследованию физических и химических свойств биологических жидкостей, и может быть использовано для прогнозирования хронического течения вирусного гепатита В у детей с пищевой аллергией в острый период заболевания.
Изобретение относится к медицине, а именно к внутренним болезням, и может быть использовано в терапии для дифференциальной диагностики алкогольной болезни печени (АБП).
Изобретение относится к медицине, в частности к кардиологии, и описывает способ прогнозирования развития осложнений при остром коронарном синдроме в остром периоде, включающий одномоментный забор и определение в 1-3 сутки госпитализации концентрации интерлейкина-6 в крови и слюне, при этом производят расчет коэффициента распределения (КР) интерлейкина-6 (ИЛ-6) как отношение его количества в крови к его количеству в слюне и при значении КРИЛ-6 менее 1,0 прогнозируют развитие кардиоваскулярных осложнений в течение острого периода.
Способ относится к области медицины, а именно к способам лабораторной диагностики в ревматологии, используется для диагностики тяжести остеоартроза коленного сустава.
Изобретение относится к области медицины, а именно к лабораторной диагностике, и может быть использовано для прогнозирования реализации гестационных осложнений с ранних сроков беременности.
Изобретение относится к области медицины и представляет собой способ определения риска развития сердечно-сосудистых осложнений у женщин с гипертонической болезнью путем забора крови у больных, определения в крови уровня интерлейкина-1α, рецепторного антагониста интерлейкина-1 иммуноферментным методом, отличающийся тем, что определяют показатель, равный отношению рецепторного антагониста интерлейкина-1 к интерлейкину-1α, фактор ингибирования лейкозных клеток в крови и количество CD34 клеток с последующим диагностированием развития сердечно-сосудистых осложнений в течение 5 лет, при этом устанавливают высокий, средний или низкий риски развития осложнений.
Изобретение относится к медицине, а именно к пульмонологии и аллергологии, и может быть использовано для прогнозирования эффективности терапии тяжелой бронхиальной астмы.
Изобретение относится к области медицины, а именно к способу прогнозирования общей выживаемости у больных с метастазами колоректального рака в печени после ее резекции, включающий определение клинико-патологических (морфологических), гистологических и молекулярных факторов прогноза, отличающийся тем, что с помощью иммуногистохимического метода проводят исследование молекулярных характеристик микроокружения опухоли, а именно наличие и количество сосудов с гладкомышечным актином в их стенке для стромы метастаза печени в трех полях зрения микроскопа, при этом поля зрения выбирают по максимальной выраженной иммуногистохимической реакции с каждого среза биоптата печени с метастатической опухолью и при наличии в каждом из трех полей зрения сосудов с наличием гладкомышечного актина в их стенке, пациента определяют в группу благоприятного прогноза (дожитие после резекции печени три года и более), при отсутствии сосудов с наличием в стенке гладкой мускулатуры во всех трех полях зрения, пациента включают в группу неблагоприятного прогноза (с продолжительностью жизни меньше двух лет).
Изобретение относится к медицине, а именно к гинекологии, и может быть использовано для прогнозирования рецидива рака вульвы. Для этого перед началом лечения определяют содержание в крови больших гранулярных лимфоцитов (БГЛ) и уровень циркулирующих иммунных комплексов (ЦИК). При содержании БГЛ выше 11,8% и уровня ЦИК ниже 33,3 у.е. прогнозируют безрецидивный период в течение 5 и более лет. При содержании БГЛ ниже 9,8% и ЦИК выше 42,7 у.е. прогнозируют развитие рецидива в ближайшие 2 года. Использование данного способа позволяет проводить наиболее эффективные лечебные мероприятия у больных с неблагоприятным прогнозом, а также указывает на необходимость регулярного тщательного динамического наблюдения с проведением дополнительных клинико-лабораторных обследований. 4 пр.

Изобретение относится к медицине. Способ включает последовательность этапов количественного определения содержания фактора дифференцировки клеток HLDF у пациента, страдающего заболеванием сердечно-сосудистой системы. Такая последовательность обеспечивает получение валидной специфичной и воспроизводимой иммуноферментной тест-системы, позволяющей детектировать биомаркер состояния сосудистой системы в сыворотке крови как здоровых, так и больных сосудистыми заболеваниями людей. 2 пр., 2 ил.
Изобретение относится к области медицины и представляет собой способ прогнозирования риска развития врожденных инфекций путем определения количества специфических антител классов Ig М и Ig G в биологическом материале, отличающееся тем, что в качестве биологического материала используют мазок со слизистой оболочки цервикального канала при первичном обследовании в сроке до 12-й недели гестации, одновременно в мазках определяют количество антител Ig М и Ig G к вирусу краснухи, цитомегаловирусу, парвовирусу B19V, токсоплазмам, вирусу простого герпеса 1 и 2 типов и величины авидности специфических Ig G к этим возбудителям, дополнительно в том же мазке определяют уровень секреторного неспецифического Ig A методом РИФ к антигенам цитомегаловируса, хламидий, микоплазм, и генетического материала этих микроорганизмов методом ПЦР и в зависимости от полученных результатов прогнозируют группы высокого, умеренного или низкого риска развития врожденных инфекций. Изобретение обеспечивает повышение точности прогноза риска наиболее актуальных врожденных инфекций за счет комплексной оценки совокупности клинико-анамнестических данных и количественных параметров результатов лабораторных исследований при первичном обследовании беременных. 3 пр.

Изобретение относится к области медицины, а именно к способу выделения ДНК Mycoplasma hominis (М. hominis) для дальнейшего применения в диагностическом алгоритме. Изобретение представляет способ выделения ДНК Mycoplasma hominis из крови путем ее разделения центрифугированием на супернатант и осадок, последующее обогащение исследуемого материала, выделение ДНК методом аффинной сорбции с добавлением сорбента и лизирующего буфера, инкубацию, трехкратную отмывку сорбентного осадка центрифугированием и удаление надосадочной жидкости, высушиванием сорбентного осадка, добавление раствора для элюции ДНК и детекцию ПЦР-методом. Способ отличается тем, что в качестве исследуемого материала используют осадок цельной крови, а его обогащение производят в процессе выделения ДНК путем удвоения числа пробирок на один образец со 100 мкл осадка цельной крови и 20 мкл сорбента в каждой, в которые перед третьей отмывкой добавляют по 375 мкл отмывочного раствора, а их содержимое соединяют в одну пробирку и к сорбентному осадку добавляют раствор для элюции ДНК в количестве 40 мкл. Изобретение обеспечивает повышение точности диагностики M. Hominis. 1 табл.
Изобретение относится к области медицины, а именно к способу качественной дифференциальной диагностики доброкачественных и злокачественных новообразований слизистой оболочки дна полости рта. Способ осуществляют путем определения содержания биомаркеров - матриксной металлопротеиназы 2 / matrix metalloproteinase 2 (ММП 2 / ММР 2) и тканевого ингибитора металлопротеиназы 1 / tissue inhibitor of metalloproteinase 1 (ТИМП 1 / TIMP 1) в ротовой жидкости пациента, забранной до или не ранее чем через 30 минут после приема пищи пациентом. На основании полученных значений диагностируют папиллому или рак слизистой оболочки дна полости рта пациента. Применение изобретения обеспечивает достижение значительного повышения точности дифференциальной диагностики доброкачественных и злокачественных новообразований слизистой оболочки дна полости рта в день обращения пациента, значительное повышение чувствительности дифференциальной экспресс-диагностики, достижение высокой вероятности выявления процессов доброкачественных и злокачественных новообразований в организме пациента как на ранних стадиях заболевания, так и на более поздних, а также значительное упрощение подготовки пациента в определенных временных рамках для забора и хранения диагностического материала. 2 з.п. ф-лы, 5 пр.
Изобретение относится к медицине, а именно к оториноларингологии и иммунологии, и может быть использовано для патогенетического лечения хронического тонзиллита и/или гипертрофии небных миндалин у детей дошкольного возраста с лимфопролиферативным синдромом. Для этого осуществляют санацию небных миндалин. В смывах с небных миндалин определяют уровень интерлейкина-1β(ИЛ-1β). При его значениях менее 5,8 пг/мл осуществляют локальное введение рекомбинантного интерлейкина-1β (ИЛ-1β) с помощью фонофореза аппаратом «Тонзиллор-ММ». Проводят два курса по 10 процедур с 14-дневным перерывом. Эффективность терапии оценивают на основании положительной динамики уровня ИЛ-1β, определяемого в смывах с небных миндалин через 17 и 41 день от начала иммуномодулирующей терапии. Способ обеспечивает повышение эффективности лечения за счёт диффернцированного отбора детей для проведения иммуномодулирующей терапии, снижение частоты инфекционных поражений нёбных миндалин у заявленной группы больных за счёт патогенетически обоснованного применения рекомбинантного ИЛ-1β. 2 з.п. ф-лы, 2 табл., 1 пр.

Изобретение относится к области медицины, в частности к нейрохирургии, и касается способа диагностики опухоли мозга у пациентов. Сущность способа: в забранной крови определяют процентное количество CD25-лимфоцитов. При его значении 13,7 устанавливают отсутствие опухоли мозга, а при его значении меньше 13,7 диагностируют наличие опухоли мозга у пациента. Изобретение обеспечивает нулевой уровень ошибок, что свидетельствует о высокой вероятности правильного распределения испытуемых по группам здоровых и больных с опухолью головного мозга, что позволяет реально использовать данный метод в дополнительной диагностике церебральной патологии. Способ прост для практического применения. 2 табл., 1 ил.
Изобретение относится к медицине, а именно к патологической анатомии, и позволяет проводить морфологическую дифференциальную диагностику трофобластической, эндометриальной и смешанной формы первичной плацентарной недостаточности при самопроизвольном прерывании беременности в первом триместре. Способ заключается в том, что при иммуногистохимическом исследовании ворсинчатого хориона и децидуальных клеток гравидарного эндометрия оценивают индекс экспрессии сосудисто-эндотелиального (СЭФР) и трансформирующего (ТФР-β2) факторов роста. При индексе экспрессии в ворсинчатом хорионе СЭФР, равном или менее 1,5 у.е., а ТФР-β2, равном или менее 1,4 у.е., диагностируют трофобластическую форму первичной плацентарной недостаточности. При индексе экспрессии в децидуальных клетках СЭФР, равном или менее 1,6 у.е., а ТФР-β2, равном или более 2,7 у.е., диагностируют эндометриальную форму первичной плацентарной недостаточности; при одновременном выявлении вышеуказанных критериев диагностируют смешанную форму первичной плацентарной недостаточности. Предлагаемый способ является высокоинформативным, повышает качество гистологического заключения, способствует индивидуальному подходу к дальнейшей диагностике, лечению и реабилитации репродуктивного здоровья женщины в зависимости от патогенетической формы плацентарной недостаточности. 3 пр.

Изобретение относится к области медицины, в частности к неврологии, и может быть использовано для прогноза течения ишемического инсульта у больных сахарным диабетом. Сущность способа: проводят забор анализируемого образца крови, при этом осуществляют в динамике цитофлюориметрический анализ полученного тестируемого образца на наличие маркеров эндотелиальной дисфункции - растворимых молекул адгезии sICAM-1 и sVCAM-1. При значении уровней экспрессии молекул адгезии sICAM-1 591,9 нг/мл и более и sVCAM-1 632 нг/мл и более в первые дни острейшего периода ишемического инсульта с последующим сохранением в динамике данных уровней или их повышением относительно исходных уровней прогнозируют неблагоприятное течение ишемического инсульта у данной категории больных. Применение способа обеспечивает высокую чувствительность, специфичность и точность прогноза в первые дни острейшего периода ишемического инсульта у больных сахарным диабетом. 5 ил 1 табл., 3 пр.

Изобретение относится к области медицины, в частности к лабораторной диагностике, и может быть использовано для оценки угрозы формирования гипоксии у беременных с обострением цитомегаловирусной инфекции в третьем триместре гестации. Сущность способа: определяют титр антител к цитомегаловирусу, оценивают нарушение оксигенации гемоглобина в эритроцитах, гистохимическим методом определяют активность глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы и содержание метгемоглобина в эритроцитах, и при титре антител к цитомегаловирусу 1:1600, снижении активности глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы до 15,0±0,8 усл.ед. и увеличении содержания метгемоглобина в эритроцитах до 1,7±0,09% и снижении оксигемоглобина в периферической крови до 90,0±1,3% оценивают угрозу формирования гемической гипоксии. 2 ил.
Наверх