Способ оценки жизнеспособности клеток в микробиореакторе с помощью оптического световода
Владельцы патента RU 2532839:
Общество с ограниченной ответственностью Научно-технический центр "БиоКлиникум" (ООО НТЦ "Биоклиникум) (RU)
Изобретение относится к области биохимии. Предложен способ оценки жизнеспособности клеток в микробиореакторе с помощью оптического световода. Способ включает помещение клеток в мембранную ячейку сменного клеточного блока микробиореактора, приготовление рабочего раствора витального красителя, внесение красителя в ячейку микробиореактора. После внесения осуществляют инкубацию клеток в растворе витального красителя и удаление несвязавшегося с клетками раствора витального красителя. Удаление осуществляют путем замены раствора инкубации на ростовую среду, не содержащую краситель. При этом оптический световод, соединенный со спектрометром, приводят в контакт с оптически прозрачным материалом сменного клеточного блока под мембранной ячейкой микробиореактора. Далее измеряют опорный спектр флуоресцентного сигнала как интеграл интенсивности флуоресценции на мембранной ячейке микробиореактора, в которой отсутствуют исследуемые клетки. Также измеряют спектр флуоресцентного сигнала как интеграл интенсивности флуоресценции на мембранной ячейке микробиореактора с исследуемыми клетками. После из полученного спектра флуоресцентного сигнала для мембранной ячейки с исследуемыми клетками вычитают опорный спектр флуоресцентного сигнала для мембранной ячейки микробиореактора без исследуемых клеток. Вычисляют количество жизнеспособных клеток в мембранной ячейке микробиореактора на основании полученной величины интенсивности сигнала флуоресценции. Изобретение позволяет быстро определить жизнеспособность клеток под влиянием воздействующих факторов в режиме реального времени в микробиореакторе. 5 з.п. ф-лы, 3 ил., 5 табл., 5 пр.
Изобретение относится к способам исследования или анализа материалов с помощью оптических средств, в частности с использованием флуоресценции, в том числе в устройствах для работы с клетками тканей человека, животных или растений и (или) культурами вирусов.
Известен способ оценки жизнеспособности клеток в клеточном микрочипе (микробиореакторе), включающий инкубацию клеток, введение электрода в виде пипетки с Ag/AgCl в камеру с клетками, измерение электрохимического сигнала (потока ионов) с помощью клетки Фарадея, обработку электрического сигнала (1) (Pathak et al, 2011). Недостатком известного способа является необходимость применения дополнительных технических мер для заземления и устранения шумовых помех, неточность измерения. Недостатком известного способа является также низкая специфичность, связанная с определением электрохимического сигнала, дающего только опосредованную информацию о жизнеспособности клеток.
Известен способ оценки жизнеспособности клеток, включающий помещение клеток в ячейки микробиореактора, внесение в культуральную среду политетрафторэтилена, оценку диссипации митохондриального трансмембранного потенциала (ΔΨm) как маркера жизнеспособности клеток, в реальном времени (2) (Wlodkowic et al, 2009). Недостатком известного способа является его применимость в ограниченном числе устройств с определенной конфигурацией (микробиореактор на основе культурального планшета), а также длительная пробоподготовка с использованием большого числа химических реагентов, исключающих возможность проведения дальнейших экспериментов с данным биологическим материалом.
Известен способ оценки жизнеспособности клеток в микробиореакторе, включающий размещение клеток в ячейках микробиореактора, окрашивание их с помощью витального красителя (трипанового синего), определение числа живых клеток путем исключения окрашенных трипановым синим мертвых клеток с помощью инверсионного светового микроскопа (3) (Yang et al, 2008). Недостатком известного способа является непрямая оценка жизнеспособности и невозможность использования способа для микробиореакторов сложной конструкции, включающей сменные клеточные блоки.
Известен способ оценки жизнеспособности клеток в микробиореакторе, включающий размещение клеток в ячейках микробиореактора, окрашивание их с помощью красителя трипанового синего, измерение жизнеспособности клеток по интенсивности окраски клеток в красном свете, излучаемом полупроводниковыми фотодиодами (4) (Naoghare et al, 2007). Недостатком известного способа является то, что краситель трипановый синий окрашивает преимущественно мертвые клетки, что позволяет лишь косвенно определять жизнеспособность клеток. Кроме того, трипановый синий окрашивает не только нежизнеспособные клетки, но и ядра жизнеспособных клеток, что снижает точность оценки.
Наиболее близким к заявленному является способ оценки жизнеспособности клеток в микробиореакторе, включающий помещение нормальных или опухолевых клеток в ячейки микробиореактора с культуральной средой, приготовление рабочего раствора витального красителя, пригодного для использования в качестве флуоресцентного маркера жизнеспособных клеток; внесение его в ячейку для культивирования клеток микробиореактора; инкубацию клеток с раствором витального красителя; удаление несвязавшегося с клетками раствора витального красителя путем замены раствора инкубации на ростовую среду, не содержащую витального красителя; оценку количества жизнеспособных клеток с помощью флуоресцентного микроскопа. В качестве витального красителя используют изотиоцианат флуоресцеина (5) (Meng et al, 2011). Недостатком известного способа является необходимость перемещения ячейки микробиореактора в поле наблюдения под флуоресцентным микроскопом, что требует прерывания эксперимента, замедляет процедуру оценки жизнеспособности клеток, не позволяет проводить ее в режиме реального времени. Другим недостатком прототипа является то, что в поле флуоресцентного микроскопа невозможно оценивать жизнеспособность клеток в ячейках микробиореактора сложной конструкции, т.к. в нем ячейки, снабженные мембранными вставками для культивирования клеток (далее - мебранные ячейки), являются неотъемлемой составной частью сменного клеточного блока, в состав которого входят также камера микронасоса, клапаны микронасоса, резервуар для среды и другие структурные элементы, а над мембранными ячейками расположены заглушки, которые обеспечивают постоянное давление для осуществления тока среды по каналам и не могут быть убраны во время эксперимента. Поэтому непосредственное наблюдение клеток в мембранных ячейках сменного клеточного блока сверху под микроскопом без нарушения хода эксперимента невозможно. Третьим недостатком способа по прототипу является то, что используемый витальный краситель изотиоцианат флуоресцеина жестко связывается с клетками и не отмывается с клеток при последующем культивировании, что делает его непригодным для продолжительного мониторинга жизнеспособности клеток.
Задачей, на решение которой направлено изобретение, является быстрое определение жизнеспособности клеток под влиянием воздействующих факторов в режиме реального времени в микробиореакторе сложной конструкции, включающем сменные клеточные блоки.
Решение поставленной задачи достигается тем, что клетки помещают в мембранную ячейку сменного клеточного блока микробиореактора; оптический световод, соединенный со спектрометром, приводят в контакт с оптически прозрачным материалом сменного клеточного блока непосредственно под мембранной ячейкой сменного клеточного блока микробиореактора, после чего измеряют опорный спектр флуоресцентного сигнала как интеграл интенсивности флуоресценции в соответствующем витальному красителю диапазоне длин волн на мембранной ячейке сменного клеточного блока микробиореактора, в которой отсутствуют исследуемые клетки, а также измеряют спектр флуоресцентного сигнала как интеграл интенсивности флуоресценции в соответствующем витальному красителю диапазоне длин волн на мембранной ячейке сменного клеточного блока микробиореактора с исследуемыми клетками; из полученного спектра флуоресцентного сигнала для мембранной ячейки сменного клеточного блока микробиореактора с исследуемыми клетками вычитают опорный спектр флуоресцентного сигнала для мембранной ячейки сменного клеточного блока микробиореактора без исследуемых клеток; вычисляют количество жизнеспособных клеток в мембранной ячейке сменного клеточного блока микробиореактора на основании полученной величины интенсивности флуоресценции; рабочий раствор витального красителя готовят путем разведения витального красителя в диметилсульфоксиде до концентрации 10 ммоль/л; в полученный раствор добавляют культуральную среду, не содержащую сыворотки, до достижения концентрации витального красителя 1-5 мкмоль/л; в качестве витального красителя используют CellTracker™ Green или CellTracker™ Red; при этом детектирование флуоресцентного сигнала осуществляют в диапазоне длин волн 500 нм-540 нм и 600 нм-640 нм соответственно.
Указанный технический результат позволяет быстро оценить жизнеспособность клеток в микробиореакторе без изъятия из системы и с проведением минимальных необходимых манипуляций.
Раскрытие изобретения
Способ оценки жизнеспособности клеток в микробиореакторе осуществляют следующим образом. Помещают клетки в мембранную ячейку сменного клеточного блока (СКБ) микробиореактора. Готовят рабочий раствор с витальным красителем, пригодный для использования в качестве флуоресцентного маркера жизнеспособных клеток. Вносят его в мембранную ячейку сменного клеточного блока микробиореактора. Инкубируют клетки с рабочим раствором витального красителя, удаляют несвязавшийся с клетками раствор витального красителя путем замены раствора инкубации на ростовую среду, не содержащую краситель. Оптический световод приводят в контакт с оптически прозрачным материалом СКБ непосредственно под мембранной ячейкой, затем измеряют опорный спектр флуоресцентного сигнала как интеграл интенсивности сигнала флуоресценции в соответствующем витальному красителю диапазоне длин волн на мембранной ячейке сменного клеточного блока микробиореактора, в которой отсутствуют исследуемые клетки, а также измеряют спектр флуоресцентного сигнала как интеграл интенсивности сигнала флуоресценции в соответствующем витальному красителю диапазоне длин волн на мембранной ячейке сменного клеточного блока микробиореактора с исследуемыми клетками. После этого из полученного спектра флуоресцентного сигнала для мембранной ячейки сменного клеточного блока микробиореактора с исследуемыми клетками вычитают опорный спектр флуоресцентного сигнала для мембранной ячейки сменного клеточного блока микробиореактора без исследуемых клеток. На основании полученной величины интенсивности сигнала флуоресценции определяют количество жизнеспособных клеток в мембранной ячейке сменного клеточного блока микробиореактора.
Для осуществления способа используют культуру клеток различных органов и тканей, например клетки кожи, кишечника.
В качестве витального красителя используют CellTracker™ Green или CellTracker™ Red, которые не влияют на жизнеспособность клеток и позволяют неоднократно проверять ее на протяжении длительного культивирования клеток. При использовании витального красителя CellTracker™ Green детектирование флуоресцентного сигнала осуществляют в диапазоне длин волн 500 нм-540 нм. При использовании витального красителя CellTracker™ Red детектирование флуоресцентного сигнала осуществляют в диапазоне длин волн 600 нм-640 нм.
Рабочий раствор витального красителя готовят по стандартной процедуре в соответствии с протоколом производителя (6). Рекомендуемая производителем концентрация 1 мкмоль/л является минимально возможной для гарантированного получения результатов при минимальном воздействии красителя на клетки и расходе реагента, но для осуществления заявленного способа возможно использование концентрации в диапазоне 1-5 мкмоль/л.
Стандартную процедуру подготовки рабочего раствора витального красителя в соответствии с протоколом производителя (6) осуществляют следующим образом. Лиофилизированный витальный краситель растворяют в диметилсульфоксиде (ДМСО) до концентрации 10 ммоль/л; на его основе готовят рабочий раствор витального красителя заданной концентрации в культуральной среде, не содержащей сыворотки.
Окрашивание исследуемых клеток производят в мембранной ячейке сменного клеточного блока микробиореактора с исследуемыми клетками, вторую мембранную ячейку сменного клеточного блока, не содержащую исследуемых клеток, используют для контроля. Из мембранной ячейки СКБ, содержащей исследуемые клетки, удаляют культуральную среду. Клетки промывают раствором Хэнкса (HBBS) трижды. Вносят рабочий раствор с витальным красителем в мембранную ячейку для культивирования клеток СКБ. Объем добавляемого красителя в стандартной процедуре окрашивания выбирают на основании геометрических параметров ячейки СКБ микробиореактора таким образом, чтобы все клетки были покрыты рабочим раствором с красителем в течение рекомендованного времени инкубации. Например, при диаметре мембранной ячейки СКБ 4,26 мм и площади поверхности для культивирования клеток 0,143 см2 достаточно введения 50 мкл рабочего раствора с красителем.
Инкубацию клеток в растворе витального красителя осуществляют согласно протоколу производителя красителя (6) в течение 15-30 минут при 37°C. Удаляют несвязавшийся с клетками раствор витального красителя путем замены раствора инкубации на ростовую среду, не содержащую краситель; оптимально замену производят дважды.
Количество клеток в мембранной ячейке сменного клеточного блока вычисляют на основании величины интенсивности сигнала флуоресценции с помощью калибровочной кривой, построенной общепринятым способом по образцам с известным числом жизнеспособных клеток, полученным с помощью кратных разбавлений клеточной суспензии, например, согласно методике, изложенной в (7). Для построения калибровочных кривых используют окрашенные витальным красителем клетки, размещенные в 96-луночном планшете или в ячейках сменного клеточного блока микробиореактора так, чтобы количество клеток в каждой последующей ячейке было в два раза меньше, чем в предыдущей (заполняют 7 ячеек в одном повторе). Измеряют величину интенсивности сигнала флуоресценции в каждой ячейке согласно заявленному способу. Производят подсчет клеток в каждой ячейке при помощи камеры Горяева. Строят калибровочную кривую, откладывая по оси абсцисс количество жизнеспособных клеток, определенных с помощью камеры Горяева, а по оси ординат - соответствующую величину интенсивности сигнала флуоресценции. Калибровочную кривую строят для каждого конкретного типа клеток, вида красителя, концентрации и количества рабочего раствора с витальным красителем, вводимого в мембранную ячейку СКБ, и используют затем всякий раз при реализации заявленного способа при соответствующих данной калибровочной кривой условиях (тип клеток, вид красителя, концентрация и объем вводимого в ячейку рабочего раствора красителя). При реализации заявленного способа количество жизнеспособных клеток в ячейке определяют с помощью калибровочной кривой посредством сопоставления величины интенсивности сигнала флуоресценции в ячейке с соответствующим ему значением количества жизнеспособных клеток на калибровочной кривой.
Для измерения интенсивности сигнала флуоресценции, проходящего через оптически прозрачный материал микробиореактора (в частности, полидиметилсилоксан), оптический световод приводят в контакт с оптически прозрачным материалом сменного клеточного блока непосредственно под ячейкой с клетками. При постоянной работе с одним микробиореактором оптический световод может быть необратимо вмонтирован в состав микробиореактора. Для высокопроизводительного анализа жизнеспособности клеток в различных условиях, когда используют большое количество сменных клеточных блоков микробиореактора, оптический световод фиксируют таким образом, чтобы на него можно было поставить сменный клеточный блок микробиореактора, затем снять и поставить следующий.
Для осуществления способа может быть использован микробиореактор с проточным (Фиг.1) или замкнутым (Фиг.2) контуром тока среды.
Сменный клеточный блок в составе микробиореактора представляет собой систему для культивирования клеток в режиме постоянного тока среды в условиях, максимально приближенных к физиологическим по температуре, составу культуральной и газовой среды и т.д. Сложная конструкция микробиореактора, обеспечивает возможность длительного культивирования клеток с минимальным внешним воздействием (симуляция живого организма).
На Фиг.1 представлена схема сменного клеточного блока микробиореактора с проточным контуром тока среды (культуральной или иной среды). Сменный клеточный блок микробиореактора представляет собой держатель с мембранными ячейками для клеток 1, в которые по каналам поступает культуральная или иная среда из резервуара 2 для ввода среды; камеры микронасоса 3, обеспечивающего через его клапаны 4 продвижение среды по каналам к мембранным ячейкам для клеток 5 и в порт слива среды 6, клапаны для управления током среды 7, 8, 9.
На Фиг.2. представлена схема сменного клеточного блока микробиореактора с замкнутым контуром тока среды, включающего держатель с мембранными ячейками для клеток 1, в который по каналам поступает культуральная или иная среда из резервуара для ввода среды 2; камеру микронасоса 3, обеспечивающего через его клапаны 4 продвижение среды по мембранным ячейкам для клеток 1.
На Фиг.3 изображена схема оптической системы для измерений, проводимых с помощью оптического световода. Оптическая система содержит источник излучения 10, излучающий свет длины волны λ1, поступающий через соединитель 11 по оптическому световоду 12 в мембранную ячейку для клеток 1, излучающую свет длины волны λ2 благодаря окраске исследуемых клеток витальным красителем; оптический световод 13 соединен одним концом с мембранной ячейкой для клеток 1 сменного клеточного блока микробиореактора с проточным контуром тока среды или сменного клеточного блока микробиореактора с замкнутым контуром тока среды. Другим концом оптический световод 13 подключен через соединитель 14 к спектрометру 15. Для осуществления способа может быть использован, например, спектрометр CCS100 CCD-spectrometer (Thorlabs, Newton, NJ, USA).
Перечень фигур, чертежей и иных материалов
Фиг.1. Схема сменного клеточного блока микробиореактора с проточным контуром среды.
Фиг.2. Схема сменного клеточного блока микробиореактора с замкнутым контуром среды.
Фиг.3. Функциональная схема измерений с помощью оптического световода.
Осуществление изобретения
Пример 1. Оценка жизнеспособности клеточной модели кожи.
Ключевые параметры:
Клеточная модель кожи
Витальный краситель CellTracker™ Green CMFDA
Концентрация и количество вводимого в ячейку рабочего раствора витального красителя: 1 мкмоль/л, 50 мкл
Длительность культивирования с витальным красителем: 15 мин
Микробиореактор с замкнутым контуром тока среды
Клеточную модель кожи, полученную с использованием первичных фибробластов и клеточной линии кератиноцитов НаСаТ, культивировали в мембранной ячейке для культивирования клеток СКБ микробиореактора с замкнутым током среды (фиг.1) в культуральной среде DMEM, содержащей 5% эмбриональной бычьей сыворотки (Gibco), 200 мМ L-глутамина и 0,1% антибиотиков пенициллин/стрептомицин (Penicillin Streptomycin, Gibco).
Для построения калибровочной кривой использовали клеточную модель кожи и витальный краситель CellTracker™ Green CMFDA в концентрации 1 мкмоль/л в объеме 50 мкл, длительность культивирования 15 мин.
Оценку жизнеспособности клеток проводили согласно заявленному способу. Использовали рабочий раствор витального красителя CellTrackerTM Green CMFDA в концентрации 1 мкмоль/л и объеме 50 мкл на одну мембранную ячейку для культивирования клеток СКБ. Культивирование клеток с рабочим раствором витального красителя осуществляли при 37°C в течение 15 мин. Величину интенсивности флуоресценции рассчитывали в диапазоне длин волн в пределах от 500 нм до 540 нм. Оценку жизнеспособности клеток проводили на 1-й и 14-й дни культивирования клеток кожи. Для осуществления способа использовали спектрометр CCS100 CCD-spectrometer (Thorlabs, Newton, NJ, USA). Результаты приведены в таблице 1.
| Таблица 1 | |||
| Оценка жизнеспособности клеток кожи на 1-й и 14-й дни культивирования | |||
| Тип клеток | День культивирования клеток | Интенсивность сигнала флуоресценции | Количество жизнеспособных клеток, тыс. |
| Клетки кожи | 1 | 198±7 | 11,4±0,6 |
| 14 | 172±11 | 9,7±0,4 |
Таким образом, анализ жизнеспособности клеток кожи по заявленному способу с помощью оптического световода показал, что через 14 дней культивирования в микробиореакторе с замкнутым контуром среды жизнеспособность клеток снижается на 15%.
Пример 2. Оценка жизнеспособности клеточной модели кожи.
Ключевые параметры:
Клеточная модель кожи
Витальный краситель CellTracker™ Red
Концентрация и количество вводимого в ячейку рабочего раствора витального красителя: 1 мкмоль/л, 50 мкл
Длительность культивирования с витальным красителем: 15 мин
Микробиореактор с замкнутым контуром тока среды
Клеточную модель кожи, полученную с использованием первичных фибробластов и клеточной линии кератиноцитов НаСаТ, культивировали в мембранной ячейке для культивирования клеток СКБ микробиореактора с замкнутым током среды (фиг.1) в культуральной среде DMEM, содержащей 5% эмбриональной бычьей сыворотки (Gibco), 200 мМ L-глутамина и 0,1% антибиотиков пенициллин/стрептомицин (Penicillin Streptomycin, Gibco).
Для построения калибровочной кривой использовали клеточную модель кожи и витальный краситель CellTracker™ Red в концентрации 1 мкмоль/л в объеме 50 мкл, длительность культивирования 15 мин.
Оценку жизнеспособности клеток проводили согласно заявленному способу. Использовали рабочий раствор витального красителя CellTracker™ Red в концентрации 1 мкмоль/л и объеме 50 мкл на одну мембранную ячейку для культивирования клеток СКБ. Культивирование клеток с рабочим раствором витального красителя осуществляли при 37°C в течение 15 мин. Величину интенсивности флуоресценции рассчитывали в диапазоне длин волн в пределах от 600 нм до 640 нм. Оценку жизнеспособности клеток проводили на 1-й и 14-й дни культивирования клеток кожи. Для осуществления способа использовали спектрометр CCS100 CCD-spectrometer (Thorlabs, Newton, NJ, USA). Результаты приведены в таблице 2.
| Таблица 2 | |||
| Оценка жизнеспособности клеток кожи на 1-й и 14-й дни культивирования | |||
| Тип клеток | День культивирования клеток | Интенсивность сигнала флуоресценции | Количество жизнеспособных клеток, тыс. |
| Клетки кожи | 1 | 221±10 | 10,7±0,5 |
| 14 | 188±12 | 9,1±0,6 |
Таким образом, анализ жизнеспособности клеток кожи по заявленному способу с помощью оптического световода показал, что через 14 дней культивирования в микробиореакторе с замкнутым контуром среды жизнеспособность клеток снижается на 15%.
Пример 3. Оценка жизнеспособности клеточной линии кишечника.
Ключевые параметры:
Клеточная линия кишечника
Витальный краситель CellTracker™ Red
Концентрация и количество вводимого в ячейку рабочего раствора витального красителя: 1 мкмоль/л, 50 мкл
Длительность культивирования с витальным красителем: 15 мин
Микробиореактор с замкнутым контуром тока среды
Клеточную модель кишечника на основе клеток линии Сасо-2 культивировали в микробиореакторе с замкнутым контуром среды в течение 14 дней в среде MEM, содержащей 20% эмбриональной бычьей сыворотки, 2 мМ глутамина, 1% заменимых аминокислот, 1 мМ пирувата, 0,1% антибиотика.
Для построения калибровочной кривой использовали клеточную линию кишечника и витальный краситель CellTracker™ Red в концентрации 1 мкмоль/л в объеме 50 мкл, длительность культивирования 15 мин.
Оценку жизнеспособности клеток проводили согласно заявленному способу. Использовали рабочий раствор витального красителя CellTracker™ Red в концентрации 1 мкмоль/л и объеме 50 мкл на одну мембранную ячейку для культивирования клеток СКБ. Культивирование клеток с рабочим раствором витального красителя осуществляли при 37°C в течение 15 мин. Величину интенсивности флуоресценции рассчитывали в диапазоне длин волн в пределах от 600 нм до 640 нм. Оценку жизнеспособности клеток проводили на 1-й и 14-й дни культивирования клеток кожи. Для осуществления способа использовали спектрометр CCS100 CCD-spectrometer (Thorlabs, Newton, NJ, USA). Результаты приведены в таблице 3. Как видно из таблицы 3, оценка жизнеспособности кишечника линии Сасо-2 по заявленному способу с помощью оптического световода показала, что через 14 дней культивирования в микробиореакторе с замкнутым контуром среды жизнеспособность клеток снижается на 10%.
| Таблица 3 | |||
| Оценка жизнеспособности клеточной линии кишечника Сасо-2 | |||
| Тип клеток | День культивирования клеток | Интенсивность сигнала флуоресценции | Количество жизнеспособных клеток, тыс. |
| Клетки кишечника | 1 | 205±10 | 11,8±0,6 |
| 14 | 180±7 | 10,4±0,6 |
Пример 4. Оценка жизнеспособности клеточной линии кишечника.
Ключевые параметры:
Клеточная линия кишечника
Витальный краситель CellTracker™ Red
Концентрация и количество вводимого в ячейку рабочего раствора витального красителя: 5 мкмоль/л, 50 мкл
Длительность культивирования с витальным красителем: 15 мин
Микробиореактор с замкнутым контуром среды
Клеточную модель кишечника на основе клеток линии Сасо-2 культивировали в микробиореакторе с замкнутым контуром среды в течение 14 дней в среде MEM, содержащей 20% эмбриональной бычьей сыворотки, 2 мМ глутамина, 1% заменимых аминокислот, 1 мМ пирувата, 0,1% антибиотика.
Для построения калибровочной кривой использовали клеточную линию кишечника и витальный краситель CellTracker™ Red в концентрации 5 мкмоль/л в объеме 50 мкл, длительность культивирования 15 мин.
Оценку жизнеспособности клеток проводили согласно заявленному способу. Использовали рабочий раствор витального красителя CellTracker™ Red в концентрации 5 мкмоль/л и объеме 50 мкл на одну мембранную ячейку для культивирования клеток СКБ. Культивирование клеток с рабочим раствором витального красителя осуществляли при 37°C в течение 15 мин. Величину интенсивности флуоресценции рассчитывали в диапазоне длин волн в пределах от 600 нм до 640 нм. Оценку жизнеспособности клеток проводили на 1-й и 14-й дни культивирования клеток кожи. Для осуществления способа использовали спектрометр CCS100 CCD-spectrometer (Thorlabs, Newton, NJ, USA). Результаты приведены в таблице 4.
| Таблица 4 | |||
| Оценка жизнеспособности клеточной линии кишечника Сасо-2 | |||
| Тип клеток | День культивирования клеток | Интенсивность сигнала флуоресценции | Количество жизнеспособных клеток, тыс. |
| Клетки кишечника | 1 | 263±13 | 12,5±0,6 |
| 14 | 238±17 | 11,3±0,8 |
Как видно из таблицы 4, оценка жизнеспособности кишечника линии Сасо-2 по заявленному способу с помощью оптического световода показала, что через 14 дней культивирования в микробиореакторе с замкнутым контуром среды жизнеспособность клеток снижается на 10%.
Пример 5. Оценка жизнеспособности клеточной модели кожи.
Ключевые параметры:
Клеточная модель кожи
Витальный краситель CellTracker™ Green CMFDA
Концентрация и количество вводимого в ячейку рабочего раствора витального красителя: 1 мкмоль/л, 50 мкл
Длительность культивирования с витальным красителем: 30 мин
Микробиореактор с проточным контуром среды
Клеточную модель кожи, полученную с использованием первичных фибробластов и клеточной линии кератиноцитов НаСаТ, культивировали в мембранной ячейке для культивирования клеток СКБ микробиореактора с проточным контуром среды (фиг.2) в культуральной среде DMEM, содержащей 5% эмбриональной бычьей сыворотки (Gibco), 200 мМ L-глутамина и 0,1% антибиотиков пенициллин/стрептомицин (Penicillin Streptomycin, Gibco).
Для построения калибровочной кривой использовали клеточную модель кожи и витальный краситель CellTracker™ Green CMFDA в концентрации 1 мкмоль/л в объеме 50 мкл, длительность культивирования 30 мин.
Оценку жизнеспособности клеток проводили согласно заявленному способу. Использовали рабочий раствор витального красителя CellTrackerTM Green CMFDA в концентрации 1 мкмоль/л и объеме 50 мкл на одну мембранную ячейку для культивирования клеток СКБ. Культивирование клеток с рабочим раствором витального красителя осуществляли при 37°C в течение 30 мин. Величину интенсивности флуоресценции рассчитывали в диапазоне длин волн в пределах от 500 нм до 540 нм. Оценку жизнеспособности клеток проводили на 1-й и 14-й дни культивирования клеток кожи. Для осуществления способа использовали спектрометр CCS100 CCD-spectrometer (Thorlabs, Newton, NJ, USA). Результаты приведены в таблице 5. Таким образом, анализ жизнеспособности клеток кожи по заявленному способу с помощью оптического световода показал, что через 14 дней культивирования в микробиореакторе с проточным контуром среды жизнеспособность клеток снижается на 15%.
| Таблица 5 | |||
| Оценка жизнеспособности клеток кожи на 1-й и 14-й дни культивирования | |||
| Тип клеток | День культивирования клеток | Интенсивность сигнала флуоресценции | Количество жизнеспособных клеток, тыс. |
| Клетки кожи | 1 | 201±11 | 10,9±0,6 |
| 14 | 177±9 | 9,3±0,5 |
Источники информации
1. Pathak Р, Zhao Н, Gong Z, Nie F, Zhang T, Cui К, Wang Z, Wong ST, Que L. Real-time monitoring of cell viability using direct electrical measurement with a patch-clamp microchip // Biomed Microdevices. 2011 Oct;13(5):949-53.
2. Wlodkowic D, Falev S, Skommer J, McGuinness D, Cooper JM. Biological implications of polymeric microdevices for live cell assays // Anal Chem. 2009 Dec 1;81(23):9828-33.
3. Yang ST, Zhang X, Wen Y. Microbioreactors for high-throughput cytotoxicity assays // Curr Opin Drug Discov Devel. 2008 Jan; 11(1):111-27.
4. Naoghare PK, Kwon HT, Song JM. An automated method for in vitro anticancer drug efficacy monitoring based on cell viability measurement using a portable photodiode array chip // Lab Chip. 2007 Sep;7(9):1202-5.
5. Meng Q, He Z, Zhang L, Zhao L, Li E, Zhang O, Zhang X, Yang D. Zou L, Gao Z, Wang Q Development of a double-layer microfluidic chip with flow medium for chemotherapy resistance analysis of lung cancer // Electrophoresis. 2011 Nov;32(23):3446-53.
6. ER-Tracker™ Dyes for Live-Cell Endoplasmatic Reticulum Labeling. Product Information
http://tools.lifetechnologies.com/content/sfs/manuals/mp12353.pdf).
7. Blaheta R.A., Franz M., Auth M.K.H., Wenisch H.J.C., Markus B.H. A rapid non-radioactive fluorescence assay for the measurement of both cell number and proliferation //J. Immunol. Methods, 1991. 142. P.199-206.
1. Способ оценки жизнеспособности клеток в микробиореакторе с помощью оптического световода, включающий помещение клеток в ячейку для культивирования клеток микробиореактора, приготовление рабочего раствора витального красителя, пригодного для использования в качестве флуоресцентного маркера жизнеспособных клеток; внесение его в ячейку для культивирования клеток микробиореактора; инкубацию клеток в растворе витального красителя; удаление несвязавшегося с клетками раствора витального красителя путем замены раствора инкубации на ростовую среду, не содержащую краситель, отличающийся тем, что клетки помещают в мембранную ячейку сменного клеточного блока микробиореактора; оптический световод, соединенный со спектрометром, приводят в контакт с оптически прозрачным материалом сменного клеточного блока непосредственно под мембранной ячейкой сменного клеточного блока микробиореактора, после чего измеряют опорный спектр флуоресцентного сигнала как интеграл интенсивности флуоресценции в соответствующем витальному красителю диапазоне длин волн на мембранной ячейке сменного клеточного блока микробиореактора, в которой отсутствуют исследуемые клетки, а также измеряют спектр флуоресцентного сигнала как интеграл интенсивности флуоресценции в соответствующем витальному красителю диапазоне длин волн на мембранной ячейке сменного клеточного блока микробиореактора с исследуемыми клетками, после чего из полученного спектра флуоресцентного сигнала для мембранной ячейки сменного клеточного блока микробиореактора с исследуемыми клетками вычитают опорный спектр флуоресцентного сигнала для мембранной ячейки сменного клеточного блока микробиореактора без исследуемых клеток; вычисляют количество жизнеспособных клеток в мембранной ячейке сменного клеточного блока микробиореактора на основании полученной величины интенсивности сигнала флуоресценции.
2. Способ по п.1, отличающийся тем, что рабочий раствор витального красителя готовят путем разведения витального красителя в диметилсульфоксиде до концентрации 10 ммоль/л; в полученный раствор добавляют культуральную среду, не содержащую сыворотки, до достижения концентрации витального красителя 1-5 мкм/л.
3. Способ по п.1, отличающийся тем, что в качестве витального красителя используют CellTracker™ Green.
4. Способ по п.1, отличающийся тем, что в качестве витального красителя используют CellTracker™ Red.
5. Способ по п.3, отличающийся тем, что при использовании витального красителя CellTracker™ Green детектирование флуоресцентного сигнала осуществляют в диапазоне длин волн 500 нм-540 нм.
6. Способ по п.4, отличающийся тем, что при использовании витального красителя CellTracker™ Red детектирование флуоресцентного сигнала осуществляют в диапазоне длин волн 600 нм-640 нм.
