Способ культивирования сублимированных штаммов микроорганизмов


 

C12N1/00 - Микроорганизмы, например простейшие; их композиции (лекарственные препараты, содержащие материал из микроорганизмов A61K 35/66; приготовление лекарственных составов, содержащих бактериальные антигены или антитела, например бактериальных вакцин A61K 39/00); способы размножения, содержания или консервирования микроорганизмов или их композиций; способы приготовления или выделения композиций, содержащих микроорганизмы; питательные среды

Владельцы патента RU 2532849:

Кальной Сергей Михайлович (RU)
Зыков Андрей Владимирович (RU)
Гаркуша Юлия Юрьевна (RU)
Винокуров Владимир Иванович (RU)

Изобретение относится к микробиологии. Способ культивирования сублимированных штаммов микроорганизмов предусматривает внесение в плотную питательную среду стимулятора роста и источника углерода с последующим посевом клеток микроорганизма, инкубацией посевов и учетом жизнеспособных микробных клеток. В качестве сублимированных штаммов микроорганизмов используют Yersinia pestis EV, Escherichia coli C600, Bacillus anthracis СТИ, Vibrio cholerae NAG 504, Brucella abortus 19BA. В качестве стимулятора роста и источника углерода используют 96% этиловый спирт в количестве 1,0-2,0% от объема среды. При необходимости добавляют генцианвиолет в концентрации 1:100000. Изобретение обеспечивает повышение выхода жизнеспособных клеток штаммов на плотных питательных средах. 1 табл., 5 пр.

 

Изобретение относится к микробиологии и может быть использовано при культивировании сублимированных культур вакцинных и референтных (экспериментальных) штаммов микроорганизмов после длительного хранения или пребывания в неблагоприятных условиях, а также при контроле исходных штаммов в производстве вакцины.

Общепринятые в микробиологии способы культивирования микроорганизмов предусматривают использование элективных питательных сред, содержащих ингибиторы, стабилизаторы, стимуляторы роста, энергообеспечивающие, чаще всего углеродсодержащие вещества, способствующие выделению культур.

Как правило, преследуется цель повышения эффективности выживаемости культур сублимированных штаммов, увеличения выхода бактериальной массы, сокращение времени культивирования.

Известен способ выделения холерных вибрионов, включающий посев и выращивание исследуемого материала из объектов внешней среды на щелочную питательную среду (Хоттингера, Мартена, из сердечной мышцы, рН 7,8-8,0), в которую добавлена сахароза, теллурит калия и фосфомицин [Патент РФ №2039826, C12Q 1/04, C12N 1/00, от 20.07.95, Бюл. №20]. Использование этого способа исключает пересев материала, ускоряет анализ и обеспечивает надежность обнаружения возбудителя холеры в объектах внешней среды.

Известна питательная среда для выращивания холерного вибриона на основе бульона Хоттингера, в которую в качестве стимулятора роста добавляют смесь ганглиозидов из мозгов быка или свиньи [А.с. СССР №1637326, C12N 1/20, C12Q 1/04, 1989]. При использовании этой среды скорость размножения вибрионов увеличивается в 3-3,5 раза. Известна плотная питательная среда для выращивания чумного микроба на основе гидролизата казеина и бульона Хоттингера, которая в качестве стимулятора роста содержит дрожжевой экстракт, в качестве углевода - маннит, а также минеральные соли [А.с. СССР №738998, C12K 1/06, 07.06.81, Бюл. №21].

Использование такой среды обеспечивает получение бактериальной массы с полноценным антигенным составом фракций FI, V и W, необходимых для получения вакцин.

В микробиологической промышленности известно использование ряда эффективных стимуляторов роста микроорганизмов. При использовании в питательной среде ферментативного гидролизата плодов крупного рогатого скота в качестве белковой основы наблюдается значительное повышение выхода биомассы Yersinia pestis EV, Escherichia coli по сравнению с питательной средой на основе бульона Хоттингера культур за счет сбалансированного содержания азота, белка, кальция, магния, железа, фосфора [А.с. СССР №1586180, C12N 1/20, 1989].

Значительно повышается выход биомассы и сокращается время культивирования микроорганизмов бруцеллеза, кишечных инфекций, сибирской язвы и др. при внесении в питательную среду в качестве стимуляторов роста диметилсульфоксида, питуитрина или гифотоцина, последние из которых являются гормональными препаратами [А.с. СССР №1834288, C12N 1/20, 1/38, 1990].

Анализ известных решений и их экспериментальные испытания свидетельствуют о некоторых общих недостатках.

Основным недостатком является то, что не учитывается тот факт, что при хранении культур сублимированных штаммов часть клеток теряет свою жизнеспособность, что снижает их способность к росту, биосинтезу, сохранению специфической морфологической структуры.

Известна среда для регидратации лиофилизированной культуры возбудителя мелиоидоза, содержащая раствор хлорида натрия, агар-агар, гидролизат казеина, желатину и сахарозу [А.с. СССР №1616137, C12N 1/20, 1/04 // (C12N 1/20; C12R 1/38), 1989].

Однако при культивировании штаммов после долгого хранения на такой среде не обеспечивается достаточной степени повышения жизнеспособности клеток.

Известен способ культивирования лиофилизированной культуры возбудителя мелиоидоза, согласно которому культуру высевают на плотную питательную среду на основе мясопептонного бульона и глицерина и обогащенную после ее охлаждения пируватом натрия в количестве 0,3-1,2% от объема среды с последующим инкубированием в желатине в течение 72 часов. Пируват натрия представляет собой соль пировиноградной кислоты. [А.с. СССР №1616138, C12N 1/20 (C12N 1/20, C12R 1/38), 1989].

Недостатком прототипа является недостаточно высокий выход жизнеспособных клеток.

Известно использование этилового спирта в количестве 1,0-1,5% от массы среды в качестве источника углерода в селективной среде для выделения флуоресцирующих псевдомонад, которая также содержит в качестве стимулятора роста и источника азота - диаммоний янтарнокислый и, кроме того, калий фосфорнокислый двузамещенный, сернокислый магний, краситель, агар и воду [А.с. СССР №1299142, C12N 1/20, C12R 1/40, 1985].

Известно использование этилового спирта в количестве 4,0-7,0% от объема среды в качестве стимулятора роста в питательной среде для выращивания белок А продуцирующих бактерий, которая содержит также глюкозу и в качестве питательной основы - ферментативно-кислотные гидролизаты форменных элементов крови сыворотки крупного рогатого скота [А.с. СССР №16303146 C12N 1/20, 1989]. Использование 96° этилового спирта в питательных средах, указанного выше состава, в первом случае обеспечивает углеродный энергетический запас среды при селективном выделении флуоресцирующих псевдомонад, во втором значительное увеличение выхода биомассы белок А продуцирующих бактерий за счет стимуляции их роста по сравнению с выращиванием в бульоне Хоттингера (без спиртовой добавки), однако при культивировании долго хранившихся сублимированных штаммов или исследуемого материала, пребывавшего в неблагоприятных условиях, не обеспечивается контролируемого повышения жизнеспособности клеток.

Наиболее близким к заявляемому способу культивирования сублимированных культур микроорганизмов является описание способов повышения выживаемости микробных клеток в сухих живых вакцинах и пробиотиках (Светлакова Е.В., 2003). Это описание приведено в диссертационных материалах Е.В. Светлаковой, показаны свойства стимулятора роста микроорганизмов (СРМ ТС-1), получаемого на основе «чайного гриба» - Medusomyces Gisevi. В культуральной жидкости «чайного гриба» сохраняются основные компоненты чая (кофеин, танин, витамины Bi, С, Р и др.), а также образуется небольшое количество спирта, углекислого газа, сахара, уксусной кислоты, а также вещества, подавляющие развитие ряда микроорганизмов. Кроме того, в вышеназванной работе показано: «Добавление определенного количества СРМ ТС-1 к основным питательным средам приводит к увеличению накопления общей биологической массы культивируемых микробов на 22-48%, увеличению количества живых микробных клеток на 11-35%, а также обеспечиванию наибольшей выживаемости микробных клеток после лиофильной сушки. При этом не только сохраняются, но и повышаются антигенные и иммуногенные свойства перечисленных микроорганизмов. (Светлакова Е.В. Совершенствование способов повышения выживаемости микробных клеток в сухих живых вакцинах и пробиотиках: диссертация… кандидата биологических наук: 03.00.23. - Ставрополь, 2003. - 164 с.: ил. РГБ ОД, 61-033/1093-3). См. сайт: © 2007-2013 Электронная библиотека диссертаций .

Техническим результатом изобретения является повышение выхода жизнеспособных клеток сублимированных культур вакцинных и референтных штаммов, высеваемых на элективных плотных питательных средах.

Указанный технический результат достигается тем, что способ культивирования сублимированных культур вакцинных и референтных штаммов микроорганизмов: Yersinia pestis EV, Brucella abortus 19 BA, Bacillus anthracis СТИ, Eschericha coli С 600, Vibrio NAG 504, включающий внесение в элективную для каждого вида плотную питательную среду в качестве стимулятора роста и источника углерода 96° этилового спирта в количестве 1,0-2,0% от объема среды для увеличения их выживаемости.

По отношению к прототипу заявляемый способ имеет следующие отличительные признаки.

Введение в питательную среду в качестве стимулятора роста и источника углерода этилового спирта в количестве 1,0-2,0% от объема среды увеличивает выход жизнеспособных клеток на 30-49% по сравнению с культивированием на традиционных элективных питательных средах. Снижение вводимого стимулятора ниже 1,0% не обеспечивает необходимого эффекта, а увеличение более 2,0% приводит к подавлению роста бактерий.

Точные количественные характеристики повышения эффективности роста сублимированных культур вакцинных и референтных штаммов микроорганизмов могут быть получены при последующем посеве материала на элективной плотной питательной среде за счет добавления стимулятора роста - 96% этилового спирта в оптимальной концентрации, определенной опытным путем.

Использование в питательных средах в качестве стимулятора роста и источника углерода этилового спирта в заявляемых количествах - 1,0-2,0% к объему среды - обеспечивает повышение выхода жизнеспособных клеток различных видов микроорганизмов на 30-49% по сравнению с плотными питательными средами на основе агара Хоттингера рН 7,3, рН 7,8, Альбими агара, соответственно, используемых для культивирования возбудителей чумы, сибирской язвы, кишечной палочки, вибрионов бруцелл.

Сравнительные результаты влияния различных количеств этилового спирта на выживаемость некоторых грамотрицательных и грамположительных бактерий приведены в таблице 1. Эти данные получены на основании средних результатов не менее трех раз повторенных опытов.

Возможность практического использования заявляемого способа иллюстрируется примерами его конкретного выполнения.

Пример 1. Плавили агар Хоттингера в объеме 400 мл и в 8 мерных флаконов вносили по 50 мл агара. В каждый из 7 флаконов при температуре 45-47°C дополнительно вносили соответствующие объемы 96° стерильного этилового спирта (0,25, 0,5, 1,0, 1,5, 2,0, 2,5, 3,8 мл). Из каждого флакона готовили по 2 чашки, которые подсушивали. Хранившиеся >10 лет сублимированные культуры чумного вакцинного штамма ресуспендировали в 2 мл физиологического раствора и затем посевные дозы его раститрованной суспензии по 0,5 мл наносили на каждую чашку из разведений 10-6, 10-7, 10-8. Культивировали при 28-30°C. Учет посевов производили через 48±2, 72±3 часов. Подсчитывали среднее число выросших колоний из различных разведений на средах с различным содержанием этилового спирта, определяли увеличение выживаемости клеток чумного вакцинного штамма в процентах по отношению разницы КОЕ/из посевной дозы в опыте и контроле к контролю, данные систематизировали в таблице 1.

Примеры 2 и 3. Не отличаются по методике выполнения от примера 1, за исключением того, что в них испытаны штаммы кишечной палочки и сибиреязвенного вакцинного штамма СТИ, а посевы культивировали при 37°C.

Пример 4. Не отличается по методике выполнения от примера 1, за исключением того, что в нем испытана культура штамма неагглютинирующегося вибриона и использован элективный щелочной агар (рН 7,8), а посевы культивировали при 37°C.

Пример 5. Не отличается по методике выполнения от примера 1, за исключением того, что в нем испытана сублимированная культура бруцеллезного вакцинного штамма и использовали элективную плотную питательную среду Альбими, а посевы культивировали при 37°C.

Таким образом, заявляемый способ практически осуществим и прост в исполнении. Использование предлагаемого способа культивирования сублимированных культур вакцинных и референтных штаммов микроорганизмов в микробиологической практике и экспериментальной работе повысит надежность анализов при культивировании материала после длительного хранения, а также при контроле штаммов и наращивании бактериальной массы в производстве вакцины.

Примечание к таблице 1: выживаемость определяли по отношению разницы КОЕ/из посевной дозы в опыте и контроле к контролю. «-» - нет роста.

Способ культивирования сублимированных штаммов микроорганизмов, включающий внесение в плотную питательную среду стимулятора роста и источника углерода с последующим посевом клеток микроорганизма, инкубацией посевов и учетом жизнеспособных микробных клеток, отличающийся тем, что сублимированными штаммами микроорганизмов являются Yersinia pestis EV, Escherichia coli C600, Bacillus anthracis СТИ, Vibrio cholerae NAG 504, Brucella abortus 19BA, в качестве стимулятора роста и источника углерода используют 96% этиловый спирт в количестве 1,0-2,0% от объема среды, при этом происходит стимуляция роста на плотных питательных средах, при необходимости добавляют генцианвиолет в концентрации 1:100000.



 

Похожие патенты:

Изобретение относится к использованию неочищенного глицерина в качестве источника углерода для роста клеток в культуре и производства белков в таких клеточных культурах.

Изобретение относится к микробиологической промышленности. .

Изобретение относится к микробиологической промышленности и касается нового штамма ацидофильных метилотрофных бактерий продуцента биомассы на основе метанола. .

Изобретение относится к микробиологической промышленности и касается нового штамма дрожжей, используемого для получения белково-витаминных веществ из этанола. .
Изобретение относится к области микробиологии. Готовят две взвеси.

Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к лейколектинам, и может быть использовано в медицине. Получен полипептид лейколектин, характеризующийся SEQ ID NO:1-8.

Изобретение относится к очистке окружающей среды. Для детоксикации загрязненного нефтепродуктами грунта в него вносят природный сорбент с биопрепаратом до достижения заданной концентрации загрязняющего вещества в грунте.

Изобретение относится к области генной инженерии и может быть использовано для регулирования проницаемости метан-продуцирующей клетки. Получают полипептид, который способен проникать в метан-продуцирующую клетку и повышать ее проницаемость, характеризующийся аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:117, 118 или 119 или по меньшей мере 90% идентичностью к указанной последовательности или по меньшей мере 15 последовательно расположенными аминокислотами указанной последовательности.
Изобретение относится к биотехнологии, в частности к способам разведения полезных насекомых. Способ предусматривает приготовление питательной среды, содержащей соевую муку, сахарозу, сухое молоко, масло пальмоядровое, сухую тлю, соль Вессона, сухие пивные дрожжи, токоферол, аскорбиновую кислоту, агар-агар, витамины B1, B6, В12, метабен, инозит и дистиллированную воду в заданном соотношении и выращивание кокцинеллиды Harmonia axyridis Hall.

Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к мутеинам липокалина слезной жидкости человека, и может быть использовано в медицине. Мутеин липокалина слезной жидкости человека (hTLc) имеет обнаруживаемую аффинность связывания с рецепторной тирозинкиназой Met (c-Met) человека, или ее доменом, или фрагментом c-Met человека.

Настоящее изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к новому пептидному аналогу инсулиноподобного фактора роста-1 (IGF-1), содержащему аминокислотную замену метионина в положении 59 на Asn, Leu, Nle, Ile, Arg, A6c, Glu, Trp или Tyr, а также другие дополнительные замены, вставки и делеции.

Изобретение относится к области микробиологии и дезинфектологии. Плотную питательную среду засевают исследуемыми штаммами бактерий.

Изобретение относится к области биотехнологии, фармацевтической промышленности, в частности к оборудованию для культивиротвания фотосинтезирующих микроорганизмов, преимущественно микроводорослей.
Изобретение относится к области микробиологии и биотехнологии. Предварительно отбирают материал, подлежащий исследованию, - чистую культуру палочковидных, грамотрицательных, ферментирующих глюкозу, оксидазоположительных или оксидазоотрицательных бактерий.

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано для получения протективных антигенов на основе секретируемых белоксодержащих соединений Staphylococcus aureus. Способ предусматривает культивирование на жидкой питательной среде вирулентного штамма бактерий Staphylococcus aureus №6 с последующим отделением культуральной среды от бактерий путем фильтрования через фильтр PLASMAFILTER PLASMAFLUX PSu 2S с получением фильтрата. К полученному фильтрату добавляют сульфат аммония до 80% насыщения с получением осадка. Полученный осадок отделяют центрифугированием при 10000 g в течение 30 минут и растворяют в фосфатном буфере с pH 7.4 с последующей микрофильтрацией белоксодержащей фракции через мембрану 0,22 мкм и обессоливанием на колонке PD-10, очисткой и концентрированием путем проведения ион-обменной хроматографии на колонке Q-сефарозы, элюции 0,15 М NaCl и ультрафильтрацией на двух фильтрах 100 и 30 кДа до получения белоксодержащей фракции с молекулярной массой 30-90 кДа и содержанием белка 0,5-1,0 мг/мл. Изобретение позволяет получить препараты на основе протективного секретируемого белоксодержащего соединения. 1 ил., 5 табл., 1 пр.
Наверх