Способ и устройство для определения анализируемого вещества
Изобретение относится к аналитической химии, в частности к аспектам, относящимся к способам неферментативного определения присутствия или количества углеводов в образце, и описывает способ, устройство и набор для анализа образца для определения присутствия или количества анализируемого вещества, в частности углеводорода, более конкретно сахара, в образце при использовании ткани. Способ включает нанесение образца на синтетическую ткань; химическую модификацию указанного углевода, присутствующего в образце, окисляющим средством с достаточным окисляющим потенциалом, чтобы расщепить углевод между двумя гидроксильными группами; инактивацию указанного окисляющего средства, которое препятствовал бы определению химически модифицированного углевода; определение присутствия или количества указанного химически модифицированного углевода при помощи медьсодержащего соединения для получения видимого изменения цвета. Изобретение может использоваться для определения присутствия углевода на поверхности для индикации загрязнения поверхности, в частности загрязнения веществом, способствующим микробному росту. 6 н. и 14 з.п. ф-лы, 2 ил., 7 табл.,4 пр.
ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ, К КОТОРОЙ ОТНОСИТСЯ ИЗОБРЕТЕНИЕ
Настоящее изобретение относится к способу, устройству и набору для анализа образца при использовании ткани для определения присутствия или количества в образце анализируемого вещества, в частности углевода, более конкретно, сахара.
УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Санитарному состоянию внешней среды уделяется растущее внимание в лабораториях, приемных медицинских учреждений, дома, в местах общего пользования и на предприятиях промышленного производства. Тенденция состоит в развитии способов, при помощи которых пользователь, использующий или очищающий пространство, может легко убедиться в его гигиеническом состоянии. Такие способы должны быть чрезвычайно простыми, удобными для пользования, быстрыми и недорогими.
Убедиться в гигиеническом состоянии можно по определению присутствия микроорганизмов, например концентрации бактерий или веществ, стимулирующих бактериальный рост, на поверхностях. Анализ микроорганизмов с поверхностей при использовании принятых в настоящее время способов медленный и требует профессиональной экспертизы. Анализ веществ, например сахаров и белков, облегчающих рост микроорганизмов, например бактерий и грибов, определяет чистоту поверхностей с практически сравнимой достоверностью.
Существуют быстрые и чувствительные тесты, пригодные для определения присутствия белка, которые основываются на бромкрезола зеленого с белками. Такие тесты были описаны, например, в заявке на патент WO 2006/122733, в которой подробно обсуждаются существующие форматы тестов на основе использования различных мембран. В заявке также подробно обсуждаются различные способы применения реагентов на мембране в виде дупликации рулон-на-рулон или других способов печати.
Наиболее известные способы анализа углеводов, таких как сахара, основаны на способах, в которых сахара определяют по изменению окраски. Большинство способов, основанных на изменении окраски, были разработаны для спектрофотометрического анализа сахаров. К настоящему времени не существует недорогих, быстрых и простых тестов, пригодных для определения присутствия сахаров на поверхностях. Проблема сахаров состоит в их стабильной структуре, что означает, что их анализ требует присутствия специфических и по-видимому нестабильных ферментов, инкубацию при сильно повышенных температурах, продолжительного времени реакции и/или химических реагентов, вредных для здоровья или небезопасных для использования.
Существует несколько способов, пригодных для анализа сахаров, которые основаны на изменении цветов. Способы, основанные на восстановлении меди, включают реактивы Фелинга, арсеномолибдатный и BCA (бицинхининовой кислоты) анализ. Другие способы, применимые для определения сахара, включают способы с использованием цианида железа и DNS (динитросалициловой кислоты), способы, основанные на образовании ацеталей, антронный способ, способы индикации, включающие феназиновую группу, реактивы Шиффа и тетразолиевый голубой, а также бороновые сенсоры, основанные на циркулярном дихроизме, фотоабсорбции и флуоресценции. Другие способы, пригодные для определения сахаров, включают ферментативные способы, такие как глюкозоксидазный/пероксидазный и гексокиназный, и люминесцентные способы, включающие биолюминесценцию и хемилюминесценцию.
Такие пригодные способы не представляют собой применимые для использования в формате теста, где сахара определяют, используя способ на ткани. Все способы, основанные на восстановлении меди, требуют нагревания для достаточно быстрого воздействия на реакцию.
В патенте США 6586195 для индикации сахаров используют зеленый янус В. В патенте показано, что восстанавливающие сахара способны к восстановлению зеленого януса B в достаточно высоких концентрациях, порядка 10 г/л, в основных условиях, при этом зеленый янус B изменяет цвет с синего на серый. Изменение цвета не представляет собой оптимальное, поскольку указанная реакция - изменение с синего на серый - делает чрезвычайно сложным определение результата теста с концентрацией, близкой к пределу определения.
Способы, основанные на образовании ацеталя, и антронный способ используют сильные кислоты в высоких концентрациях, что делает указанные способы непригодными в разработке быстрого теста на основе ткани.
Индикационные способы включают простые композиции реагентов, что уменьшает требуемый объем реагентов для отпечатывания на ткани. При достаточно высоких концентрациях сахаров, изменения в окраске индикаторов также можно наблюдать даже при комнатной температуре. Недостаток состоит в том, что можно определять только сахара с высокой восстанавливающей способностью, например фруктозу. Также недостаточно коммерчески доступных индикаторов.
Ферментативные способы и способы на основе люминесценции представляют собой чувствительные и быстрые. Недостатки, связанные с некоторыми ферментами, включают их стоимость и их нестабильные характеристики. Более того, специфическое действие ферментов, например, они действуют исключительно в отношении определенных сахаров, мешает их использованию в быстрых тестах, которые должны быть способны определять общую концентрацию всех или практически всех углеводов. Способы на основе люминесценции пригодны только в сочетании с модифицирующими сахара ферментами и, таким образом, разделяют те же проблемы, что и ферментативные способы.
Хорошо известные способы, знакомые специалистам в данной области, и реагенты, которые они применяют, не пригодны для быстрых диагностических способов. Например, способ цианида железа не применим для быстрого анализа сахаров, поскольку в кислых условиях выделяется цианид в виде цианистого водорода, высоко токсичного вещества. Некоторые способы могут не работать при комнатной температуре (например, способ DNS или зеленый янус В), или они обладают плохой стабильностью (например, способы, требующие ферментов, реактивы Шиффа и образующие ацеталь реагенты). Несколько способов также требуют сильно кислотные или щелочные условия.
Таким образом, существует необходимость для быстрого и чувствительного теста для определения углеводов на поверхностях. В особенности существует необходимость в тесте, который можно осуществлять без повышения температуры.
СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Настоящее изобретение обеспечивает способ определения присутствия или количества определяемого при анализе вещества в образце, указанный способ, включающий:
нанесение образца на ткань;
химическую модификацию указанного определяемого вещества, если оно присутствует в образце;
определение присутствия или количества указанного химически модифицированного анализируемого вещества.
В одном из вариантов осуществления средства для химической модификации анализируемого вещества, например реактив(ы), присутствуют в ткани до того, как образец наносится на ткань. Предпочтительно, реактивы отпечатаны или другим образом нанесены, абсорбированы или прикреплены к ткани.
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения способ дополнительно включает инактивацию агента, который препятствует определению химически модифицированного анализируемого вещества. Предпочтительно, химическую модификацию и инактивацию препятствующего агента проводят до определения химически модифицированного анализируемого вещества. Согласно данному варианту осуществления любой образец или препятствующий продукт, например агент, реактив, композиция или субстанция, присутствующие в образце, реактив для анализа, нанесенный на ткань или образованный в ходе анализа, могут подвергаться инактивации, например, нейтрализацией или предотвращением его движения осаждением. В одном варианте осуществления средства инактивации препятствующего агента присутствуют на ткани до нанесения образца на ткань. Указанные средства предпочтительно отпечатаны, другим образом нанесены, абсорбированы или прикреплены к ткани. В одном из вариантов осуществления средства для химической модификации анализируемого вещества и средства для инактивации препятствующего агента присутствуют на ткани до нанесения образца на ткань.
Настоящее изобретение также обеспечивает устройство для теста, пригодное для проведения способа, указанное устройство включает ткань, несущую средства для химической модификации анализируемого вещества, средства для определения химически модифицированного анализируемого агента и необязательно средства для инактивации препятствующего агента. Согласно одному из вариантов осуществления указанные средства нанесены или отпечатаны периодически, например, в виде областей, зон или участков, предпочтительно так, чтобы при использовании устройства образец мог проходить через области в определенном порядке.
Настоящее изобретение дополнительно обеспечивает набор для определения присутствия или количества анализируемого вещества в образце, включающий:
материал ткани; и
средства для модификации анализируемого вещества при использовании химически модифицирующих агентов; и
средства для инактивации препятствующих агентов; и
средства для определения химически модифицированного анализируемого вещества.
Дополнительно, настоящее изобретение относится к способу дупликации рулон-на-рулон, где реагенты и указанные средства последовательно отпечатывают на определенных участках ткани.
В одном из вариантов осуществления анализируемое вещество представляет собой углеводород. В одном из вариантов осуществления анализируемое вещество представляет собой сахар. Предпочтительно, сахар включает фруктозу, декстрин, лактозу, мальтозу и/или сахарозу.
Настоящее изобретение обеспечивает способ определения сахара в образце, включающий неферментативный способ, проводимый при комнатной температуре путем нанесения указанного образца на ткань.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ
Фигура 1. Структурный принцип способа абсорбирующей влагу ткани.
Фигура 2. Конкретный пример ткани, пригодной для теста на сахар, показывающий реагенты в различных участках ткани.
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Настоящее изобретение относится к способу, устройству и набору для анализа образца таким образом, что анализируемое вещество в образце может быть химически изменено или модифицировано и, необязательно, препятствующие реакционные агенты, или агенты, и/или продукты, полученные в ходе анализа, могут быть инактивированы в ходе анализа.
Способ широко применим для измерения анализируемого вещества, которое представляет собой стабильное или иным образом сложное для измерения в той форме, в которой оно находится в образце. Способ по настоящему изобретению в особенности пригоден для определения присутствия углеводов, в особенности сахаров, в образце.
Изобретение относится к способу определения сахаров в образце при использовании способа абсорбирующей влагу ткани. Способ можно проводить без увеличения температуры реакции. Настоящее изобретение также относится к устройству, содержащему ткань, для использования в настоящем способе. При производстве устройства химические вещества, используемые при анализе, могут переноситься на ткань при использовании традиционных способов печати. Пригодный способ производства описан в деталях в WO 2006/122733, включенном здесь в качестве ссылки. Ламинирование ткани между пластиковыми мембранами позволяет жидкости быстрее двигаться вдоль ткани. Однако процедура производства отличается от процедуры, описанной в WO 2006/122733 тем, что представляет собой более сложную и трудную, из-за различных областей, на которые наносят изменяющий(е) агент(ы), инактивирующий(ие) агент(ы) и типичные реагенты анализа. Способ и устройство по настоящему изобретению применимы для быстрого теста. Основные требования для быстрого теста представляют собой простоту, чувствительность, специфичность, безопасность, легкость использования, пригодность для удаления отходов и пригодность для промышленного производства печатными способами.
Несмотря на то, что тест по настоящему изобретению можно использовать для любого пригодного анализируемого вещества, для удобства последующее описание будет обсуждать в деталях вариант осуществления, в котором анализируемое вещество представляет собой углевод. Тест по настоящему изобретению можно использовать для определения углеводородов, в особенности сахаров, таких как фруктоза (фруктовый сахар), декстрин, лактоза (молочный сахар), мальтоза (солодовый сахар) и сахароза (гранулированный сахар), предпочтительно при использовании видимого изменения цвета. При использовании традиционных способов фруктоза представляет собой наиболее просто определяемый сахар, тогда как наиболее сложно определяемыми являются сахароза и крахмал. Сахароза и крахмал представляют собой наиболее сложно определяемые, поскольку они имеют значительно более низкую восстанавливающую способность, по сравнению с упомянутыми выше сахарами. Настоящее изобретение способно определять присутствие 150 мкг сахаров, включая присутствие нейтральных сахаров, таких как сахароза.
Для оценки санитарного состояния тесты главным образом представляют собой количественные, показывая присутствие сахара в образце в заданном пределе чувствительности. Настоящее изобретение способно определять присутствие углеводов, в частности сахаров, с чувствительностью, так что предел определения составляет 1 г/л. Это соответствует способности определять 500 мкг сахаров в образце 500 мкл, отобранном с поверхности 10×10 см2. Предел определения сахаров (при использовании тех же единиц) предпочтительно составляет 0,5 г/л (250 мкг), более предпочтительно, 0,2 г/л (100 мкг), 0,1 г/л (50 мкг), 0,05 г/л (25 мкг), 0,02 г/л (10 мкг) или 0,01 г/л (5 мкг).
Настоящее изобретение предоставляет простое и недорогое устройство для определения санитарного состояния в, например, больницах, кабинетах врача, лабораториях, пищевой промышленности, молочных заводах, пекарнях, пивоваренных заводах и в производстве напитков.
«Углевод» представляет собой химическое соединение, которое содержит углерод, кислород и водород. Предпочтительно, он представляет собой сахар.
«Сахар» представляет собой водорастворимый моносахарид, олигосахарид или полисахарид.
Серийная реакция на ткани может быть использована для осуществления способа по изобретению. Кратко, образец вводят в реакцию на ткани для реакции с желаемыми химическими веществами в конкретным образом определенном порядке.
Образец обычно вводят в ткань, протирая тканью исследуемые поверхности. Также предусмотрены другие варианты осуществления изобретения. Например, ткань можно помещать на исследуемую поверхность или образец жидкости можно отбирать из исследуемой области и вводить в ткань при использовании, например, пипетки сходных устройств для переноса. Поверхность и/или ткань можно обрабатывать перед введением в контакт. Например, одну из них (предпочтительно, поверхность) можно увлажнять водным раствором для облегчения обеспечения жидкого образца. Водный раствор можно наносить в виде, например, спрея или раствора. Это представляет собой в особенности желательное, если исследуемая поверхность сухая или обычно сама по себе не несет воды или раствора, включающего вещества, благоприятные для проведения анализа, например буферы.
Буфер не должен содержать соединения, которые взаимодействуют с химическими веществами, используемыми для модификации анализируемого вещества или для определения анализируемого вещества. Например, если анализируемое вещество представляет собой углевод, химическая модификация обычно представляет собой окисление, и стадия определения обычно включает использование металлических комплексов, цвет которых представляет собой видимую индикацию положительного результата. В данном варианте осуществления препятствующие агенты, которые предпочтительно должны отсутствовать в водном растворе, включают, но не ограничиваются перечисленным, иодаты и фосфаты, которые образуют комплексы с медью, и борную кислоту и бораты, которые образуют комплексы с углеводами, препятствуя окислению. Буферные растворы могут содержать первичные, вторичные и третичные спирты, хотя ди-, три- и полиспирты не представляют собой предпочтительные. Водный раствор может также содержать иод и стабилизаторы, такие как KI, для определения крахмала и других полисахаридов, продвижение которых в тестовом устройстве может быть более ограниченным из-за хроматографического разделения.
Пригодные водные растворы представляют собой буферы, которые приготовлены согласно ASC или качества для анализа. Водный раствор должен также иметь низкое содержание примесей металлических ионов. Предпочтительно, он содержит не более чем 0,002% или не более чем 0,001% Fe. Предпочтительно, он содержит не более чем 10 ч/млн или не более чем 5 ч/млн Pb. Более предпочтительно, содержание примесей металлических катионов в водном растворе должно быть настолько низким, насколько это возможно.
После того как образец жидкости вводится в ткань, обычно первая стадия представляет собой химическую модификацию углевода. Если углевод представляет собой сахар, его обычно изменяют или модифицируют таким образом, который позволяет определение при комнатной температуре. В одном из вариантов осуществления сахара делают более реакционно-активными за счет открытия простой эфирной связи в кольцевой структуре сахара и между мономерами с последующим способом окисления, где число альдегидных групп увеличивается. Средства для химической модификации углевода могут представлять собой реакционный агент, например периодную кислоту или соль периодной кислоты, такую как периодат натрия, или другой тип химического вещества, такой как соль церия (IV). Такие средства химической модификации предпочтительно представляют собой окисляющий агент с достаточным окислительным потенциалом для расщепления углеводной цепи между двумя гидроксильными группами и предпочтительно представляет собой бесцветный.
Другие реакции, рассмотренные для модификации углеводорода в более легко определяемую форму и которые могут быть использованы на основе способа и устройства определения по настоящему изобретению, включают, но не ограничиваются перечисленным:
- мультиротацию, где -ОН группу подвергают мультиротации из α- в β-форму при использовании слабой кислоты.
- катализируемое кислотой образование кислородного мостика (простой эфир) между сахар-ОН и спиртом.
- образование карбоновой кислоты, например, глюконовой кислоты, в присутствии слабого окислителя, например Cu2+.
- образование дикарбоновой кислоты, например глюкуроновой кислоты, при повышенных температурах с сильной кислотой.
- восстановление при использовании NaBH4 до сахарных спиртов (разрыв эфирного цикла и образование гидроксильной конечной группы).
- образование ацетатов, при наличии Na-ацетата и уксусного ангидрида.
- образование альдегидов в присутствии, например, оксида серебра и метилиодида.
Считается, что способ химической модификации анализируемого вещества перед определением химически модифицированного анализируемого вещества представляет собой процедуру, не известную ранее для ткани. В способе по настоящему изобретению образец и средства модификации или изменения должны встретиться, предпочтительно, препятствующие агенты должны быть инактивированы и только заданные композиции или вещества должны далее продвигаться по материалу ткани.
«Интерферирующий агент» представляет собой вещество, которое, если присутствует при определении химически модифицированного анализируемого вещества, будет препятствовать определению химически модифицированного вещества. Препятствующий агент может присутствовать в образце изначально, может представлять собой избыточный реагент из химической модификации анализируемого вещества или может существовать в результате реакции химической модификации анализируемого вещества, т.е. может представлять собой побочный продукт реакции.
Если анализируемое вещество представляет собой углевод, примеры препятствующих агентов включают иодаты и фосфаты, которые образуют комплексы с медью, а также борную кислоту и бораты, которые склонны образовывать комплексы с углеводородами, препятствуя окислению углеводов. Также восстанавливающие агенты, такие как катионы металлов, способны восстанавливать медь, таким образом, приводя к окрашенной реакции без присутствия сахара.
Интерферирующие агенты могут быть инактивированы или в том же участке ткани, где имеет место химическая модификация, или в последующем участке ткани, через который проходит образец, включающий химически модифицированное анализируемое вещество. Предпочтительно, инактивацию проводят в последующем участке. Инактивация проходит до определения химически модифицированного анализируемого вещества.
Затем определяют химически модифицированное анализируемое вещество. Если анализируемое вещество представляет собой углеводород, определение предпочтительно проводят при использовании BCA анализа. В способе BCA Cu2+ в кипящей щелочи. Винную кислоту используют в качестве комплексообразователя для Cu2+, препятствующего образованию осадка гидроксида меди. В ходе указанного способа Cu2+ восстанавливают до Cu+, который реагирует с бицинхониновой кислотой и образует окрашенный комплекс, образование которого связывают с присутствием сахара.
Несмотря на то, что BCA способ использует инкубацию, даже небольшие количества восстановленной меди определяются в виде BCA комплекса и используемые реакционные агенты можно оставлять отвердевать в стабильные соединения на ткани.
Ткань предпочтительно представляет собой синтетическую ткань, поскольку ткань на основе, например, природной целлюлозы и вискозы имеет склонность приводить к ложно положительным результатам при использовании для определения углеводов. Синтетические ткани, которые могут использоваться, включают, но не ограничиваются перечисленным, не содержащие целлюлозы и вискозы ткани, полиэфирные ткани, полиэтановые, полиамидные ткани, полипропиленовые ткани, поливинилхлоридные ткани и их комбинации. В одном варианте осуществления ткань представляет собой полиэфирную ткань.
Термин «ткань» используют в настоящем описании и определяют как включающий любой материал, способный абсорбировать образец жидкости и транспортировать или переносить указанный образец посредством капиллярного действия. Обычно используют термин «матрица», который представляет собой материал с соответствующими свойствами.
Термин «модифицировать» используют и определяют в значении также изменять.
Термин «участок» используют и определяют в значении «зона», «фаза», «область», «сегмент», например, в мультистадийном тесте.
Термин «вытирание» используют и определяют для обозначения также «протирания». В ходе вытирания ткань абсорбирует жидкость с поверхности.
Термин «продукт» используют и определяют для обозначения любого агента, реакционного агента, композиции или вещества.
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения ВСА способ используют для функционирования на ткани. При получении пригодного устройства химическое вещество в жидкой форме отпечатывают на ткани, где оно высыхает. В твердой форме химическое вещество ни передвигается по ткани, ни разбавляется от испарения и его стабильность улучшается по сравнению со стабильностью в жидкой форме. Быстрый диагностический тест по настоящему изобретению позволяет определять сахара на поверхностях на основе реакции, вызывающей изменение цвета, в котором устранены проблемы, связанные с упомянутыми выше тестами. Тестовое устройство по настоящему изобретению представляет собой одноразовое и может быть изготовлено при использовании способа печати рулон-на-рулон, который сохраняет низкую стоимость. Проведение теста является простым и не требует специальной квалификации. Более того, включаемые химические вещества представляют собой безопасные для ежедневного использования.
Существуют несколько способов для определения и индикации сахаров; указанные тесты обсуждались во введении выше. Способы, обнаруженные в литературе, включают BCA и различные индикаторы. Указанные способы удовлетворяют одно из предпочтительных требований успешного теста, т.е. они вызывают изменение цвета при комнатной температуре. Недостаток состоит в том, что они требуют высоких концентраций сахара, несмотря на то, что небольшие количества могут быть определены термическим катализом. Однако свойства, обсуждаемые в литературе, недостаточны для способов, чтобы непосредственно использовать на ткани. Настоящее изобретение устраняет указанные проблемы и необходимость в нагревании, хотя тесты представляют собой достаточно чувствительные для определения даже низких концентраций сахара. Настоящее изобретение дает возможность создания на ткани условий способа в пробирке, что приводит к тому, что образец, перенесенный с увлажненной поверхности, претерпевал изменения цвета, если образец содержит сахар.
Согласно изобретению реакционные агенты, использованные в исследованных способах, переносили на ткань путем печати, что дополнительно к экономичному производству тестового устройства также обеспечивает гомогенную концентрацию реакционного агента по всей области печати. Наиболее обычные способы печати рулон-на-рулон включают рельефную печать, глубокую печать, офсетную печать и шелкографию, а также струйную печать в некоторых применениях.
Глубокая печать представляет собой предпочтительную в качестве способа печати по настоящему изобретению. Однако специалистам в данной области будет понятно, что также могут применяться другие способы печати, использованные с небольшими модификациями. Глубокая печать представляет собой предпочтительную из-за простой механики переноса чернил, что позволяет использовать чернила с в значительной степени различными реологическими свойствами, и хорошего химического переноса и свойств химической устойчивости способа. В примерах печать осуществляли при использовании настольной тестовой печатной машины.
Все способы тестировали по отношению к следующим сахарам: фруктозе, декстрину, лактозе, мальтозе и сахарозе, из которых сахароза была более нейтральной по сравнению с восстанавливающим сахаром.
Пример 1
Одновременно испытывали биологические и искусственные ткани. На ранней стадии было отмечено, что биологические ткани, содержащие целлюлозу и вискозу и, таким образом, сахароподобные группы, оказались непригодными для использования, поскольку сахароподобные функциональные группы вызывали изменение цвета даже в тесте нулевого образца. Ввиду этого, синтетические целлюлозо- и вискозоподобные ткани также испытывали и не наблюдали изменения цвета. Из испытанных тканей было обнаружено, что полиэфирные ткани представляют собой предпочтительные по сравнению с полипропановыми из-за их в меньшей степени гидрофобной природы.
Протоколы Waffenschmidt или Smith использовали в ходе экспериментов для определения сахаров следующим образом (Smith et al., Measurement of Protein Using Bicinchoninic Acid, 1985, 150, 76-85; Waffenschmidt ef al., Anal. Biochem. 1987, 165, 337-340).
Протокол для определения восстанавливающих сахаров при помощи ВСА способа:
Композиции растворов
Раствор А
- BCA 971 мг
- Na2CO3×H2O 31,75 г
- NaHCO3 12,1 г
- H2O до 500 мл
Раствор В
- CuSO2×5H2O 624 мг
- L-серин 631 мг
- H2O до 500 мл
Растворы смешивали 1:1 ежедневно.
Образец сахара смешивали с 1 мл смеси растворов А и В. Указанную содержащую сахар смесь выдерживали в течение 15 минут в нагревающем до 100ºС блоке. После охлаждения до комнатной температуры, примерно 20 минут, измеряли абсорбцию при 560 нм.
Предел определения для восстанавливающих моносахаридов составляет примерно 5 нмоль. Для глюкозы 5 нмоль составляет примерно 0,9 мг.
Композиции растворов, использованных в ходе протокола Smith et al. для определения белка способом ВСА, показаны в Таблице 3.1.
| Таблица 3.1 Композиции растворов в ВСА смеси |
|||
| Раствор А | Раствор В | ||
| Химическое вещество | Количество | Химическое вещество | Количество |
| Натриевая соль в ВСА | 1 г | CuSO2×5H2O | 4 г |
| Na2CO3×H2O | 2 г | H2O | До 100 мл |
| Динатрий тартрат | 0,16 г | - | - |
| NaOH | 0,4 г | - | - |
| NaHCO3 | 0,95 г | - | - |
| H2O | До 100 мл | - | - |
| pH установлен, 10М NaOH до 11,25 | - |
Растворы А и В смешивали в пропорции 50:1 ежедневно.
Образец раствора и смесь растворов А и В смешивали в пропорции 1:20, соответственно. Смесь инкубировали, если имелся ограниченный предел времени для определения или сохранялось только небольшое количество белка.
Поглощающую способность измеряли при использовании спектрофотометра. Сходные показания оптической плотности достигали при использовании различного времени инкубации. Эти результаты представлены в таблице 3.2.
| Таблица 3.2 Достижение поглощающей способности 0,2 при различном содержании белка и параметрах инкубации |
|||
| Поглощающая способность | Количество протеина | Температура инкубации | Время инкубации в минутах |
| ~0,2 | 20 мкг | Комнатная температура | ~5 |
| ~0,2 | 20 мкг | 37°С | ~2,5 |
| ~0,2 | 5 мкг | 60°С | ~3 |
Несмотря на то, что протокол Smiths предназначен для анализа белков, он может быть использован для определения восстанавливающих сахаров. Это показано в Таблице 3.3, где представлено препятствующее действие восстанавливающего сахара (глюкозы).
| Таблица 3.3 Препятствующее действие восстанавливающего сахара в протоколе Smiths |
||
| 100 мкл образца, состоящего из 50 мкг BSA* и | Тест BCA** (BSA* обнаружен) при использовании контрольной поправки воды | Тест BCA** (BSA* обнаружен) при использовании препятствующей поправки |
| 900 мкг глюкозы | 245 мкг | 57,1 мкг |
| 450 мкг глюкозы | 144 мкг | 47,7 мкг |
| 90 мкг глюкозы | 70 мкг | 49,1 мкг |
| *Бычий сывороточный альбумин (белок) **Протокол описан выше с инкубацией при 37°С в течение 30 минут |
При использовании «контрольной поправки воды» все реакционные агенты присутствуют в контроле + таком же количестве воды, что и в образце, для поддержания одинакового объема образца и контроля. Абсорбцию контроля регистрировали и абсорбированное количество вычитали из абсорбции образца для коррекции абсорбции, вызванной загрязнением, реакционными агентами, лабораторным оборудованием и т.д.
«Препятствующая поправка» сходна с «контрольной поправкой воды», но контроль также включает такое же количество препятствующего(их) агента(ов), что и в образце. Таким образом, абсорбция, вызванная препятствующим агентом, загрязнением, реакционными агентами, лабораторным оборудованием и т.д., может быть вычтена из образца.
Композиции BCA реагентов, использованных в экспериментах согласно Smiths протокол, представлены в Таблице 3.1. В способах в пробирке реакционные агенты смешивали в соотношении 50А:1В, после чего образец инкубировали.
Химические вещества, использованные в ВСА способе, переносили на чистую, промытую другим буфером ткань при использовании настольной тестовой печатной машины. Испытывали диапазон различных тканей, значений рН и комбинаций ВСА химических веществ, создавая основу для дальнейших разработок. Наблюдения при испытаниях и их объяснения представлены в Таблице 3.4
| Таблица 3.4 Наблюдения при испытаниях и их объяснения |
|
| Наблюдения | Объяснения |
| Интенсивность нулевой реакции увеличивалась при более высоких значениях рН. | В тесте использовали биологическую ткань, таким образом достигалась более интенсивная реакция при достижении оптимальных условий ВСА способа. Оптимальная величина рН для сахара при использовании способа ВСА составляет 10,2. |
| Биологическая ткань вызывает нулевую реакцию, и нулевые реакции не наблюдаются с синтетическими тканями. | Нулевая реакция, наблюдаемая с биологическими тканями, была вызвана реакцией меди с восстанавливающим веществом, присутствующем в биологической ткани в форме вискозы и целлюлозы. Отсутствие нулевой реакции с синтетическими тканями подтверждает гипотезу. |
| При высоких рН использовали фосфатные буферы, нулевая реакция имела цвет, хотя цвет постепенно исчезал. | При использовании фосфатных буферов, наблюдалась цветная реакция, но цвет постепенно исчезал. Это происходило из-за реакции меди с фосфатами. |
| Самый низкий предел определения достигали при буфере ацетата натрия с величиной рН 4,7. | Ацетатный буфер с величиной рН 4,7 был наиболее чувствительным, поскольку тест проводили при использовании буфера и субстрата, которые не препятствовали способу ВСА. |
Способ ВСА дополнительно развивали с целью создания оптимальных условий пробирочного теста на ткани. Поскольку было показано, что биологическая ткань непригодна из-за положительного результата при отрицательной контрольной реакции, в качестве субстрата была выбрана полиэфирная ткань, поскольку она не содержит восстанавливающих групп, которые вызывают ложную контрольную реакцию.
Для исследования влияния буфера и рН ткань промывали 0,1 М карбонатным буфером, рН 10,2 и результаты сравнивали с ацетатным буфером, рН 4,7. Растворы реакционного агента ВСА отпечатывали на ткани, промытой карбонатным буфером в соотношении А=½ В, т.е. раствор В разбавляли до половинной силы водой перед печатью. Сначала отпечатывали раствор А, после высыхания отпечатка добавляли раствор ½ В. В Таблице 3.1 представлены растворы композиций перед разбавлением.
В предыдущих тестах предел определения для фруктозы на ткани, промытой буфером ацетата натрия, рН 4,7, составлял 5 г/л. Другие определяемые сахара не вызывали изменения цвета. Карбонатный буфер с рН 10,2 понижал предел определения фруктозы до 1 г/л, при этом другие сахара все еще не вызывали изменения цвета.
Поскольку способ анализа в пробирке включал инкубацию образца, влияние тепла на тканевый способ проверяли при помещении ткани, смоченной сахарами, в печь при 80°С на 30 минут. Термический эффект также был очевиден при использовании ткани, предел определения для фруктозы составил 0,05 г/л, но реакцию изменения цвета не наблюдали с сахарами.
Поскольку медный комплексообразующий агент представляет собой элемент способа, различные комплексообразующие агенты испытывали в попытке улучшения производительности теста. В предыдущих тестах использовали натриевую винную кислоту в качестве комплексообразующего агента Cu2+, но на этот раз его замещали на L-серин, поскольку было показано Waffenschmidt, что L-серин представляет собой более эффективный комплексообразующий агент для серебра по сравнению с натриевой винной кислотой.
Последующий тест был основан на композиции реакционных агентов по Waffenschmidt (Waffenschmidt et al., выше). Ткань обрабатывали тем же карбонатным буфером и химические вещества отпечатывали на ткани таким же образом, как и в предыдущих тестах. При печати использовали два различных соотношения, А+В и А+ ½ В. В таблице 3,5 показаны композиции растворов А и В.
| Таблица 3.5 Композиция ВСА растворов по Waffenschmidt |
|||
| Раствор А | Раствор В | ||
| Химическое вещество | Количество | Химическое вещество | Количество |
| BCA | 0,194 г | CuSO4×5H2O | 0,194 г |
| NaCO3×H2O | 6,35 г | L-серин | 0,126 г |
| NaHCO3 | 2,42 г | H2O | До 100 мл |
| H2O | До 100 мл | - | - |
При испытании сахаров на ткани нулевая реакция с водой была интенсивной, и ткань самопроизвольно окрашивалась в лиловый цвет в течение двух недель. Полагается, что L-серин образовывал комплекс с Cu2+ и постепенно восстанавливал его до Cu2, за чем следовало образование сильно окрашенного комплекса ВСА медь. Таким образом, протокол Smith кажется более предпочтительным по сравнению с протоколом Waffenschmidt для использования в дальнейшей работе по развитию.
На основе описанных выше тестов было осознано, что правильная величина рН, раствор буфера и комплесообразующий агент не предоставляют способ достаточной степени чувствительности. Пригодный катализатор для улучшения определения сахаров способом ВСА не мог быть идентифицирован на основании литературы.
Окисляющая сила меди играет роль в ВСА способе. Таким образом, и основываясь на результатах и выводах, представленных выше, была сделана попытка найти более сильный окисляющий агент, чем медь. Согласно изобретению будет возможным определять восстановление окисляющего агента при использовании пригодного изменяющего цвет индикатора.
Однако выбор более сильного окисляющего агента поднимает несколько проблем. Поскольку окисляющая сила вещества увеличивается, увеличиваются его токсичность и реакционная способность по отношению к другим веществам. Реакционная активность вызывает разрушение или немедленное восстановление нескольких веществ, понижение стабильности и функциональности теста.
Заявители затем обнаружили, что можно модифицировать или изменять сами сахара таким образом, чтобы сделать их более легко обнаруживаемыми при использовании способов, основанных на изменении цвета. Таким образом, заявители сделали попытку окисления сахаров с целью увеличения числа альдегидных групп, которые они содержат, поскольку в частности именно альдегидные группы реагируют с медью в способах, основанных на восстановлении меди.
На основе литературы были определены три химических вещества, пригодных для окисления сахаров: периодная кислота, периодат натрия и периодат Десс-Мартина, которые окисляют сахара таким образом, что увеличивается количество альдегидных групп. Как описано ниже, заявители обнаружили, что увеличение числа альдегидных групп понижает предел определения способа и делает возможным определять сахара с низкой восстанавливающей способностью и нейтральные сахара.
Пример 2
В способе в пробирке сахар, периодат натрия и ВСА реакционные агенты, перечисленные в Таблице 3.1, добавляли в тестовую пробирку в указанном порядке. Содержащие сахар тестовые пробирки изменяли цвет при комнатной температуре в течение пяти минут, но нулевая реакция (отрицательный контроль) происходила на пять минут позднее. Тест демонстрировал значительный прогресс, поскольку способ ВСА был функциональным при комнатной температуре и даже нейтральные сахара вызывали изменение цвета. Нулевую реакцию объясняли тартратом натрия, содержащимся в реакционном агенте ВСА.
Действие тартрата натрия исследовали путем получения раствора А в ВСА смеси, показанной в таблице 3.1 без тартрата натрия. В тестовом способе в пробирке все сахара не изменяли цвета. Это может быть объяснено окисляющим действием периодата натрия, в случае чего медь восстанавливается сахарами, но вновь окисляется периодатом натрия (Cu2+→Cu2+).
Было решено провести испытание периодата натрия как части ВСА способа с тканями. Реакционные агенты ВСА отпечатывали на тканях таким же образом, как и в предыдущем тесте, и последним добавляли периодат натрия. Цель состояла в установлении точного предела времени между отрицательным контрольным образцом и образцом, содержащим сахар.
На основе результатов было заключено, что периодат натрия может быть использован для улучшения чувствительности теста, но периодат натрия также препятствует способу, так что изменение цвета, обусловленное сахаром, может наблюдаться на ткани только после 30-40 минут. Таким образом, были необходимы способы нейтрализации и/или инактивации периодата натрия после изменения или модификации сахара.
Пример 3
Предварительные результаты заявителей и их изобретательское решение проблемы привело авторов изобретения к принятию многостадийного способа, включающего химические вещества, которые реагируют как в серии, т.е. мультирегионный или мультизонный тест. Капиллярное действие заставляет образец раствора втекать в ткань, где он реагирует с отпечатанными химическими веществами в определенных зонах ткани.
В концепции теста примеси сахара на исследованной поверхности переносили через абсорбирующую влагу ткань, содержащую необходимые химические вещества. В ткани сахара в образце жидкости реагируют с химическими веществами в заданном порядке. Таким образом, даже реакционно-активные химические вещества, которые обычно будут ингибировать реакцию или вызывать нулевую реакцию, такие как описанные в примере 2, могут быть использованы в качестве реакционных агентов, поскольку они могут быть инактивированы до индикационной области ВСА-анализируемого вещества. Таким образом, реакционные агенты, используемые в указанном способе в пробирке, могут быть использованы на материале ткани в быстром многостадийном тесте, если используют изменение и инактивацию по настоящему изобретению.
В предшествующем способе в пробирке было обнаружено, что периодат натрия облегчает проведение ВСА способа при комнатной температуре. Проблема состояла в возникновении положительного результата теста при отрицательном образце через несколько минут и в трудности перевода способа для функционирования на ткани. Заявители обнаружили, что способ может быть усовершенствован за счет использования дополнительных стадий.
Известно, что кольцевые структуры сахаров и связи между мономерами включают простые эфирные связи. Открытие указанной связи ускоряет реакцию сахара с периодатом натрия и далее с медью. Галогеновые кислоты, иодид водорода и бромид водорода могут быть использованы для расщепления простых эфирных связей (Clayden et. al., Organic Chemistry, OUP 201, p. 434). Галиды водорода не могут быть использованы непосредственно, поскольку они не могут быть фиксированы на ткани в твердой форме.
Простые эфирные связи сахаров разрывали в кислых условиях, что достигали в тестах в пробирке при использовании серной кислоты. Далее сахара окисляли периодатом натрия и нейтрализовали избыток периодата натрия тиосульфатом натрия. Раствор нейтрализовали гидроксидом натрия перед добавлением ВСА реагентов. Использовали стехиометрические соотношения как исходную точку оптимистических химических концентраций, в результате получая концентрации, показанные в Таблице 4.1
| Таблица 4.1 Концентрации реакционных агентов в способе периодата натрия/тиосульфата натрия |
|
| Реакционный агент | Объем |
| Раствор сахара 1 г/л | 200 мкл |
| Серная кислота 0,1 М | 100 мкл |
| Периодат натрия 11,3 г/л | 100 мкл |
| Тиосульфат натрия × 5Н2О 11,6 г/л | 120 мкл |
| NaOH 0,1 М | 200 мкл |
| ВСА раствор В, разбавленный до 5% | 100 мкл |
| ВСА раствор А, содержащий винную кислоту | 500 мл |
Описанный выше способ вызывал изменение цвета с сахарозой и нулевой образец (отрицательный контроль) изменял цвет через 24 минуты после способа теста в пробирке.
Согласно изобретательскому пониманию изобретателей реакционную способность сахаров можно увеличить в многостадийном способе и реакционные агенты, препятствующие определению, можно инактивировать до индикации анализируемого вещества в образце.
В ходе разработки теста на ткани химические вещества отпечатывали на тканях, которые были разрезаны на полосы. Полосы располагали одна рядом с другой, образуя структуру, напоминающую непрерывную ткань, и ламинировали между пластиковыми мембранами. Изначальный выбор был целлюлозным ацетатным пластиком, однако его гидрофильная природа заставляла жидкость двигаться по границе пластик-ткань. Проблема была разрешена путем использования гидрофобного пластика, который оставлял образец жидкости в ткани. На фигуре 1 изображен пример структуры способа абсорбирующей влагу ткани. Могут существовать различные участки ткани, содержащие различные реагенты. Различные цвета на Фигуре 1 изображают потенциальные зоны реакционных агентов.
Таким образом, обеспечивается тестовое устройство, которое включает материал ткани, где ткань включает или набор отдельных полос, комбинированных вместе в серию для образования непрерывной ткани, или одну единую ткань. Каждая из отдельных полос ткани включала по крайней мере один реакционный агент, предпочтительно только один агент, тогда как одна единая ткань включала более чем один реакционный агент, обеспечивая на ткани предварительно определенный и последовательный порядок. Указанный материал ткани ламинировали двумя непроницаемыми слоями, один из непроницаемых слоев имел по крайней мере одно отверстие, предпочтительно, множество отверстий. Форма отверстий может быть формированной в виде округлой, треугольной, квадратной или любой подобной. Размер отверстий может варьировать от перфорации от 0,01 мм до более 2 см, где размер одного отверстия может превышать 2 см. Обычно, для облегчения капиллярного транспорта жидкости в материале ткани непроницаемая мембрана как правило изготовлена из гидрофобного материала. Пригодные материалы включают нетканый полипропиленовый материал.
Устройство также может обеспечивать формат, включающий по крайней мере одно отверстие для образца, с последующим протоком, включающим серии реакционных зон, ламинированных указанным непроницаемым прозрачным или непрозрачным слоем, который заканчивается по крайней мере одним не ламинированным отверстием или прозрачным ламинирующим слоем, включающим индикационную область теста.
Очевидно, протирающее или абсорбирующее тестовое устройство может иметь любую форму, которая способна эксплуатировать принцип изобретения, например, модифицировать тестируемый образец и инактивировать препятствующие агенты. Например, различные форматы, имеющие индикационную область теста на любой стороне устройства, например, возможно на той же или противоположной стороне по отношению к области протирания образца или абсорбции.
Как описано, изобретение относится, предпочтительно, к одному слою ткани, например тестовому формату бокового потока, включающему реакционные агенты, применяемые последовательно в различных зонах. Для специалиста в данной области будет очевидно, что такие тесты латерального потока могут включать различное устройство и технические и методологические подходы.
Необязательно, устройство может также включать слой материала ткани, который позволяет образцу проходить насквозь, при этом ограничивая обратный поток реагентов или образца. Указанный слой часто также называют полупроницаемым слоем. Например, полупроницаемый слой может быть изготовлен из гидрофобного материала. Пригодный гидрофобный материал представляет собой нетканый полипропиленовый материал.
Способ периодата натрия-тиосульфата натрия, использованный в тестовом способе в пробирке, переносили на ткань путем отпечатывания каждого реакционного агента на различной ткани при использовании настольной тестовой печатной машины. Цель мультистадийного теста состоит в разрыве сахарных циклов в кислых условиях и окислении сахарной цепи периодатом натрия до более коротких углеродных цепей, содержащих восстанавливающие альдегидные группы. Избыток периодата натрия, который взаимодействует со способом ВСА, нейтрализуют тиосульфатом натрия до индикации и полученные углеродные цепи, содержащие альдегидные группы, восстанавливали медь и образовали сильно гигроскопический комплекс.
Использованная ткань представляла собой полиэфирную ткань, которую предварительно обрабатывали 0,1 М карбонатным буфером с рН 10,2. Реакционные агенты ВСА отпечатывали на указанной предварительно обработанной ткани в соотношении А=½ В. Другие реакционные агенты отпечатывали на необработанной ткани.
Предпочтительно не использовать способ, включающий тиосульфат натрия, который нейтрализует периодат натрия, на ткани, поскольку небольшие количества избытка тиосульфата натрия в ходе теста могут вызывать нулевую реакцию. Дополнительно, предел определения в указанном способе является высоким, растворы сахара с концентрациями ниже 1 г/л не вызывали различимого изменения цвета. Предпочтительно использовать сульфат двухвалентного железа вместо тиосульфата натрия. Сульфат двухвалентного железа восстанавливает периодат до иодата, одновременно окисляя ион железа до трехвалентного состояния.
Сульфат железа (II) (FeSO4×7H2O) с концентрацией 72 г/л. Периодат натрия с концентрацией 11,3 г/л, серную кислоту с концентрацией 0,1 М и реакционные агенты ВСА А+½ В отпечатывали на различных тканях. Их ламинировали в единую структуру таким образом, что серная кислота была первой, затем периодат натрия и наконец сульфат железа. За этим следовала чистая полоса ткани как область реакции и затем реакционные агенты ВСА. По мере продвижения образца вдоль ткани ожидается прохождение серий реакций, представленных ниже (Waffenschmidt et al., Supra; Clayden et al., Organic Chemistry, OLIP 2001, 146, 344, 1369; Caldwell et al., J. Biol. Chem. 1938, 123, 595-606).
Окисляют альдегид и восстанавливают медь. Cu+ образует сильно окрашенный комплекс с бицинхининовой кислотой.
Предполагаемая серия реакций на ткани
В первой фазе серной кислотой открываются циклические структуры. В следующей фазе периодат расщепляет диолы и окисляет сахара до альдегидов. Периодат нейтрализуют сульфатом железа и в конечной фазе медь восстанавливают формированными альдегидами с последующим образованием комплекса с ВСА.
При продвижении образца по ткани было обнаружено, что сульфид железа переносится до индикационной зоны и вызывает ложную положительную реакцию. Это происходило из-за реакции двухвалентного иона с медью, приводящего к окислению железа и восстановлению меди: Fe2++Cu2+→Fe3++Cu+. Сульфат железа должен присутствовать в правильных количествах для того, чтобы он был полностью окислен периодатом натрия и не вызывал нулевой реакции. Хотя трехвалентное железо более не реагирует с медью, его перенос в индикационную зону тем не менее ослабляет предел определения, поскольку красновато-коричневая окраска может скрывать лиловый цвет образованного комплекса ВСА медь.
Вводили зону карбонатного буфера для предотвращения переноса железа в индикационную зону. Ткань промывали 0,1 М карбонатным буфером, рН 10,2 и сушили в печи при 60 градусах Цельсия. Карбонатный слой помещали после сульфата железа и перед индикационной зоной. Железо реагирует с ионами карбоната и гидроксид ионами в щелочном карбонатном слое, образуя соединения, показанные ниже (Smith et al., выше).
Вместо того, чтобы быть растворимыми, представленные соединения железа осаждаются, что останавливает движение аккумулируемого соединения в ткани.
Полученный тест был функциональным и был получен ответ с содержащими сахар образцами, где отрицательный контрольный образец оставался не окрашенным. Предел обнаружения способа составил 0,5 г/л. Пример концепции функционального теста на ткани представлен на Фигуре 2, включающей: 1. Зона протирания 2. Серная кислота 3. Периодат натрия 4. Сульфат железа 5. карбонатный буфер и 6. ВСА, А=½ В. Следует отметить, что слои периодата натрия и серной кислоты можно заменить периодной кислотой.
Способ, как описано в настоящем изобретении, обычно включает отпечатывание химических веществ, одно за другим, на ткани или отдельно на различных тканях, которые затем ламинируют одну за другой для образования непрерывной структуры ткани. Указанные слои были приемлемыми в ходе развития теста, поскольку набирались из различных полос ткани. Однако предусматривается, что будет использован непрерывный кусок ткани в массовом производства рулон-на-рулон, что сделает сложным на практике промывать часть ткани карбонатным буфером. Таким образом, требуемое количество карбонатного буфера должно переноситься при помощи печати. Одномолярный карбонатный буфер отпечатывали на индикационной зоне. Количество карбонатного буфера на ткани в области, где осаждается железо, увеличивали за счет увеличения молярности раствора карбонатного буфера, например, насыщенного раствора с рН 10,2. Раствор дважды отпечатывали на ткани при использовании печатного цилиндра, способного к переносу 24,9 мл/м. В отпечатанной области железо осаждается в виде карбоната и его движение с образцом жидкости предотвращается, таким образом устраняя необходимость оптимизации количества сульфата железа. Устанавливая молярность раствора буфера и изменяя размер ячейки и глубину чаши печатного цилиндра, можно контролировать количество переносимого реакционного агента.
Как описано ранее, количество химических веществ может быть дополнительно уменьшено при замещении периодата натрия на ортопериодную кислоту H5IO6 (HIO4×2H2O) (Masuda et al., J. Org. Chem. 1994, 59, 5550-5555). Ортопериодная кислота доступна в твердой форме и остается стабильной на ткани. Величина рКА орто-периодной кислоты составляет 1,64, таким образом, она также заменяет слабую серную кислоту для расщепления сахарных циклов.
Для усовершенствования чувствительности теста дополнительно оптимизировали соотношение ВСА реакционных агентов на ткани. В тестовых способах в пробирке А и В смешивали вместе в пропорции 50:1. Значительно более высокие соотношения 1:1 (А+В) и 2:1 (А=½ В) использовали для печати на ткани, в указанном случае голубой цвет меди препятствовал наблюдению лилового ВСА комплекса. Раствор меди разбавляли до 1:10 (1/10 В) водой. Уменьшение количества меди понижало предел определения и можно было определять изменение цвета раствора сахара 0,1 г/л вместо использованного ранее раствора сахара 0,5 г/л.
Пример 4
В одном из вариантов осуществления тестовое устройство для определения сахара при комнатной температуре содержало пять различных зон и пять различных химических веществ и/или жидкостей реакционных агентов, отпечатанных на указанных зонах, В качестве первой зоны присутствует зона протирания или всасывания, которая не содержит никаких химических веществ. После нее образец жидкости продвигается к области, содержащей отпечатанную ортопериодную кислоту, где простые эфирные связи в циклических сахарных структурах и между мономерами разрываются. Дополнительно, в указанной зоне сахара окисляются до альдегидов орто-периодной кислотой. Следующая зона содержит сульфат железа, который восстанавливает периодат до иодата, одновременно окисляя в трехвалентное железо. Ионы двухвалентного и трехвалентного железа осаждаются в виде карбоната и гидроксида железа в последующей зоне, содержащей карбонатный буфер. Последний функциональный слой содержит отпечатанный чистый раствор А и разбавленный 1:10 раствор В ВСА теста, отпечатанные цилиндром, способным к переносу 24,9 мл/м2 красителя. Лиловая окраска появлялась для 300 мкг образцов, содержащих 0,5 г/л сахара, демонстрируя способность определять количество 150 мкг, такого как фруктоза, сахароза, лактоза, мальтоза или декстрин в жидком образце. Однако чувствительность теста уменьшается по порядку сахаров, представленному выше, и, таким образом, меньшие концентрации сахара определяются для первых из упомянутых сахаров.
Ортопериодную кислоту можно заменить слоями отдельной кислоты, например, слабой серной кислоты, и периодата натрия. Вместо сульфата двухвалентного железа, может быть также использован тиосульфат натрия для инактивации периодата, как показано на Фигуре 2.
Указанная выше концепция абсорбирующей влагу ткани также была испытана в тесте в пробирке. При использовании реакционных агентов настоящего теста химические вещества измеряли в тестовой пробирке в порядке, показанном в таблице 5.1. После добавления сульфата двухвалентного железа раствор становился несколько мутным, поскольку в растворе образовались ионы трехвалентного железа. Карбонаты и гидроксиды двухвалентного и трехвалентного железа осаждались на дно пробирки в течение пяти минут после добавления раствора А, включенного в ВСА смесь.
| Таблица 5.1 Функционал ВСА углеводного теста при комнатной температуре |
|
| Реакционный агент | Объем |
| Раствор сахара 1 г/л | 1 мл |
| Периодная кислота 11,3 г/л | 100 мкл |
| Сульфат железа (II) 72 г/л | 30 мкл |
| Смесь ВСА раствор В | 10 мкл |
| Смесь ВСА раствор А | 1 мл |
При концентрации сахара 1 г/л раствор немедленно изменял цвет на лиловый. Цвет продолжал темнеть с течением времени, что можно отнести на счет медленного восстановления меди. При концентрации сахара 0,01 г/л достижение цвета уровня, определимого глазом, занимало семь минут в случае моно- и дисахаридов; достижение было более медленным в случае декстрина и крахмала.
Одно из преимуществ настоящего изобретения и связанного с ним теста состояло в его обрабатываемости способами печати рулон-на-рулон. С этой точки зрения, все химические вещества, использованные в тесте, могут быть перенесены на ткань способами печати. Производство предпочтительного теста включает пять химических веществ, последовательно отпечатанных на ткани. Ткань тянется в ходе печати, что требует высокоточной способности к выравниванию оборудования. Дополнительно, многие реакционные агенты представляют собой бесцветные, что дополнительно осложняет отслеживание качества печати и выравнивание различных зон. Согласно изобретению печать представляет собой наиболее простую при использовании пресса, на котором число отпечатанных единиц соответствует числу использованных реакционных агентов. В указанном случае оборудование делает возможным отпечатать все химические вещества на тканях за одну операцию. Это уменьшает вклад проблемы, связанной с расположением различных химических слоев и растяжением, поскольку растяжение будет влиять одинаково на все отпечатываемые единицы.
Тест, разработанный согласно изобретению, представляет собой первый неферментативный тест для определения сахаров, который работает при комнатной температуре. Способ также способен определять нейтральные сахара, которые невозможно определить во многих тестах. Важное понимание, обеспечиваемое настоящим изобретением, состоит в химической модификации анализируемого вещества, например химической модификации сахаров периодной кислотой, и в инактивации препятствующих реакционных агентов перед стадией индикации и в использовании ткани. Один из вариантов осуществления обеспечивает гибкий тест, основанный на абсорбирующей влагу ткани, который облегчает осаждение препятствующих химических веществ на ткани, таким образом останавливая их дальнейшее движение по ткани.
1. Неферментативный способ определения присутствия или количества определяемого углевода в образце, включающий:
нанесение образца на синтетическую ткань;
химическую модификацию указанного углевода, присутствующего в образце, окисляющим средством с достаточным окисляющим потенциалом, чтобы расщепить углевод между двумя гидроксильными группами;
инактивацию указанного окисляющего средства, которое препятствовал бы определению химически модифицированного углевода,
определение присутствия или количества указанного химически модифицированного углевода при помощи медьсодержащего соединения для получения видимого изменения цвета,
где химическую модификацию и определение проводят при комнатной температуре и на отдельных участках ткани.
2. Способ по п.1, где углевод включает сахар, необязательно сахар включает фруктозу, декстрин, лактозу, мальтозу или сахарозу.
3. Способ по п.1, где химическую модификацию и инактивацию окисляющего средства проводят до определения химически модифицированного углевода.
4. Способ по п.3, где инактивация окисляющего средства происходит на участке ткани, который следует за участком, на котором происходит химическая модификация, и через которую проходят химически модифицированные углеводы.
5. Способ по п.2, где химическая модификация представляет собой реакцию с окисляющим средством для раскрытия эфирной связи в сахарном цикле и/или для получения альдегидной группы.
6. Способ по п.1, где химически модифицирующий агент представляет собой периодную кислоту или соль периодной кислоты.
7. Способ по п.1, где после реакции химической модификации и перед определением химически модифицированного углевода избыток окисляющего средства, которое бы препятствовало определению химически модифицированного углевода, инактивируют.
8. Способ по п.1, где ткань представляет собой полиэфирную ткань.
9. Способ по п.3, где образец проходит через ткань благодаря капиллярному действию и средство химической модификации, средство инактивации окисляющего средства и средство определения расположены в последовательных зонах ткани, через которую проходит образец, необязательно ткань включает периодат натрия или периодную кислоту в качестве окисляющего средства для сахара, и где способ включает нейтрализацию указанного периодата натрия или периодной кислоты тиосульфатом натрия или сульфатом двухвалентного железа.
10. Способ по любому из предшествующих пунктов, где образец наносят на ткань способом, включающим контакт ткани с поверхностью и протирание поверхности или абсорбцию образца с поверхности, необязательно ткань или поверхность приводят в контакт с буферным раствором перед тем, как ткань и поверхность контактируют одна с другой.
11. Тестовое устройство, пригодное для проведения способа по любому из предшествующих пунктов, включающее синтетическую ткань, несущую на различных участках ткани средство для химической модификации углевода при комнатной температуре с окисляющим средством с достаточным окисляющим потенциалом, чтобы расщепить углевод между двумя гидроксильными группами; средство для инактивации указанного окисляющего средства, которое препятствовало бы определению химически модифицированного углевода; средство для определения при комнатной температуре химически модифицированного углевода; где определение химически модифицированного углевода проводят при помощи медь-содержащего соединения для получения видимого изменения цвета.
12. Устройство по п.11, где ткань ламинируют непроницаемым слоем и/или слоем материала, позволяющего одностороннее проникновение образца или реагента, где необязательно:
(i) ламинирующий непроницаемый слой включает по крайней мере одно отверстие; или
(ii) ламинирующий слой дает возможность одностороннего прохождения образца или реакционного агента, ограничивая обратный поток образца или реакционного агента на поверхность образца.
13. Устройство по любому из пп.11 или 12 для неферментативного определения присутствия или количества углевода в образце, включающее слой синтетической ткани, приспособленное для последовательного прохождения образца через слой ткани, включающее
химически модифицирующую зону, включающую средство для химической модификации углевода при комнатной температуре окисляющим средством с достаточным окисляющим потенциалом, чтобы расщепить углевод между двумя гидроксильными группами;
зону инактивации, включающую средство для инактивации окисляющего средства, которое препятствует определению химически модифицированного углевода; и
зону индикации, включающую средство для определения химически модифицированного углевода, где зона химического модифицирования и зона определения находятся на разных участках ткани.
14. Устройство по п.13, где зона инактивации является участком ткани, следующим за зоной химической модификации, и которая адаптирована для прохождения через нее химически модифицированного углевода.
15. Устройство для проведения способа по п.1, включающее слой материала ткани, включающей периодную кислоту или периодат натрия в качестве реакционного средства для химической модификации углевода и дополнительно включающее тиосульфат натрия или сульфат двухвалентного железа для нейтрализации указанного химически модифицирующего средства перед определением химически модифицированного углевода, пригодного для определения при использовании медь-комплексообразующего агента при использовании бицинхининовой кислоты.
16. Способ изготовления тестового устройства по любому из пп.11-15, включающий:
нанесение на материал ткани путем печати средства для химической модификации углевода с окисляющим средством с достаточным окисляющим потенциалом, чтобы расщепить углевод между двумя гидроксильными группами, средство для инактивации указанного окисляющего средства, которое препятствовало бы определению химически модифицированного углевода, и средства для определения химически модифицированного углевода, где определение химически модифицированного углевода проводят при помощи медьсодержащего соединения для получения видимого изменения цвета,
где устройство печати рулон-на-рулон приводят в контакт с материалом ткани, при этом контактирующий рулон вращается, и контактирующий рулон и материал ткани движутся один относительно другого; и
ламинирование материала ткани между двумя непроницаемыми слоями, один из непроницаемых слоев имеет по меньшей мере одно отверстие, расположенное на уровне материала ткани и через которое образец может абсорбироваться в материал ткани с поверхности.
17. Способ по п.16, где указанная печать рулон-на-рулон представляет собой глубокую печать.
18. Набор для неферментативного определения присутствия или количества углевода в образце, включающий тестовое устройство по любому из пп.11-15, включающий
материал синтетической ткани и
средство для модификации указанного углевода при комнатной температуре окисляющим средством с достаточным окисляющим потенциалом, чтобы расщепить углевод между двумя гидроксильными группами, и
средство для инактивации окисляющего средства, и
средство для определения при комнатной температуре химически модифицированного углевода, где определение присутствия или количества химически модифицированного углевода проводят при помощи медьсодержащего соединения для получения видимого изменения цвета.
19. Набор по п.18, дополнительно включающий буферный раствор для смачивания материала ткани или поверхности образца или для создания указанного образца.
20. Применение способа по любому из пп.1-10 для определения присутствия углевода на поверхности для индикации загрязнения поверхности, в частности загрязнения веществом, способствующим микробному росту.
