Способ получения биологического средства для защиты растений от фитопатогенов и нематод на основе штамма гриба рода trichoderma и биологическое средство, полученное способом

Группа изобретений относится к биотехнологии. Способ получения биологического средства для защиты растений от фитопатогенов и нематод на основе штамма гриба рода Trichoderma осуществляют путем приготовления посевного материала штамма гриба, приготовления препарата в жидкой либо сыпучей форме на основе посевного материала, а также перемешивания препарата с минеральным, органическим или бактериальным удобрением. Полученное в результате способа биологическое средство обладает высокой антагонистической активностью по отношению к широкому кругу фитопатогенов и нематод. 2 н. и 4 з.п. ф-лы, 5 пр.

 

Предполагаемое изобретение относится к области микробиологии, а именно к штаммам-продуцентам веществ, оптимизирующих условия роста растений и сохранности урожая. Применимо в сельском и лесном хозяйстве, пищевой промышленности.

Известно, что болезнетворные микроорганизмы наносят ущерб в растениеводстве, например - при возделывании сельскохозяйственных культур, при хранении собранного урожая, в лесном хозяйстве при выращивании посадочного материала в виде сеянцев. Для предотвращения ущерба необходима защита растений и продукции.

Известно, что в растениеводстве ущерб наносят и стрессы, испытываемые растениями. Например - стрессы, вызванные резкими колебаниями температуры, экстремальными температурами, засухой или избытком влажности из-за дождей. Для предотвращения такого ущерба необходимы регуляторы роста растений. При этом применяемые средства должны быть безопасными для окружающей среды. Наиболее полно этим требованиям удовлетворяют биологические средства и технологии их применения.

Известны биологические средства и способы защиты растений, созданные на основе существующих в природе микроорганизмов [1].

Извещен препарат, обеспечивающий защиту растений от болезней различной природы, а также регулирующий рост [2]. Указанный препарат включает по крайней мере два штамма Trichoderma из Trichoderma asperellum, Trichoderma atroviride, и Trichoderma inhamatum.

Известны штаммы мицелиальных грибов Trichoderma lignorum, перемешанные с продуктами своей жизнедеятельности и в совокупности названные препаратом «Триходермин». Препарат применяют на защищенном грунте для борьбы с корневыми гнилями растений [1, с.42].

Также известен штамм ТВД-93 гриба Trichoderma lignorum. Препарат «Триходермин», изготовленный из этого штамма, применяют на защищенном грунте для борьбы с корневой гнилью огурца и фузариоза декоративной культуры - гвоздики [3].

Недостатком известного штамма [3] является то, что он (штамм) обладает сравнительно низкой антагонистической активностью к возбудителям заболеваний растений (фитопатогенам), действует только на весьма ограниченный круг фитопатогенов, не подавляет размножение вредителей, например - нематод. И поэтому только ограниченно применим для защиты зерновых, овощных и декоративных культур, за исключением вышеназванных. Кроме того, у известного штамма отмечены фитотоксические свойства по отношению к некоторым видам зерновых и овощных культур. Исходя из этого, недостатком известного штамма является весьма ограниченная область применения - только для двух культур и двух видов болезней [3]. А перечень болезней растений и вредителей, от которых растения нужно защищать, содержит сотни наименований.

Наиболее близким аналогом является штамм Trichoderma Asperellum R1, известный из заявки на патент №2008108035 RU [4]. В указанной публикации описаны способы приготовления посевного материала из культуры штамма и препаратов на основе культивированного посевного материала. Недостатком указанного решения является ограничение возможностей препарата по удобряемым почвам, так как препарат не включает дополнительных питательных веществ (органических и минеральных) для растений и полезных микроорганизмов Trichoderma Asperellum R1.

Целью изобретения является создание биологического средства с высокой антагонистической активностью по отношению к возможно более широкому кругу вредителей и фитопатогенов, способствующего повышению урожайности и сохранности широкого ассортимента сельскохозяйственных, декоративных культур, сохранности собранного урожая при хранении.

Цель достигается за счет состава средства, которое включает штамм гриба рода Trichoderma, образующий в процессе своей жизнедеятельности антибиотики и/или ферменты, разрушающие клеточную стенку фитопатогенных грибов, и/или гибберелиноподобные вещества, однокомпонентные и/или сложные минеральные удобрения, а также органические удобрения и бактериальные удобрения.

Штаммы гриба Trichoderma характеризуются следующими культурально-морфологическими и физиолого-биохимическим признаками.

Биотехнологическая характеристика

В процессе жизнедеятельности штамм образует метаболиты (всевозможные вещества, образующиеся в организме в процессе обмена веществ - метаболизма). Продукт из структурных элементов грибов (споры, хламидоспоры, мицелий) различной степени зрелости с их продуктами метаболизма является полезным препаратом штамма, который и применяют в растениеводстве. Указанный препарат содержит смесь покоящихся структур, мицелия, ферментов, антибиотиков и регуляторов роста растений - продуктов метаболизма грибов Trichoderma, полученных после культивирования гриба на натуральных жидких, твердых и сыпучих питательных средах - субстратах.

В препарате, например - в его жидкой форме, содержатся:

- антибиотики, например - виридин, виридион, обладающие фунгистатическим действием, выделяемые, например, штаммами Trichoderma Viride, Trichoderma Virens IMI 304061. Trichoderma sp. YMF 1,02647, и другими [5, 6, 7],

- ферменты, например - целлюлазы, хитиназы, протеазы, разрушающие клеточную стенку фитопатогенных грибов, выделяемые, например, штаммами Trichoderma Asperellum Т-203, Trichoderma Virens, Trichoderma harzianum CECT 2413, Trichoderma lignorum HKI 0257 [8, 9, 10, 11, 12, 13, 14],

- гиббереллиноподобные вещества, стимулирующие рост растений, ускоряющие цветение и способствующие возрастанию иммунитета растений, выделяемые, например, Trichoderma harzianum CECT 2413, Trichoderma Asperellum T-203 [15, 16, 9].

Интродукция препарата на основе грибов Trichoderma в почву приводит к снижению инфекционного фона. Интенсивность воздействия зависит от типа почв. Показан наибольший фунгистатический эффект в почве, например - в черноземе (50%) и дерново-подзолистой (40%). Наименьший эффект показан в серых-лесных почвах - 30%. Отмечено возрастание фунгистатического эффекта в почвах при внесении биопрепарата в течении 5 лет подряд.

Регуляция роста растений метаболитами гриба выражается в стимуляции энергии прорастания и всхожести семян, увеличении массы растений и корней, увеличении выхода урожая, снижении пораженности растений и содержания микотоксинов в полученном с использованием штамма урожае.

Показано отсутствие генотоксичности, токсичности к теплокровным животным, пчелам и рыбам.

При этом штаммы грибов Trichoderma характеризуются высокой выживаемостью, например - в почвах, устойчивостью к бактериальному загрязнению, проявлением антагонистической активности к большому разнообразию фитопатогенов и антагонистической активностью к возбудителям заболеваний и вредителей растений.

По предлагаемому изобретению получение биологического средства состоит из этапов приготовления посевного материала штамма гриба рода Trichoderma, приготовления препарата в жидкой или в сыпучей форме на основе посевного материала, перемешивание препарата с минеральным и/или органическим и/или бактериальным удобрением. Препарат для средства получают следующим образом. Культуру штамма Trichoderma поддерживают на агаризованной сусло-среде (содержание солодового сусла 5-6° по Баллингу +2% агара) и хранят в холодильнике температуре от плюс 3°C до плюс 5°C.

Далее получают посевной материал - в 2 этапа.

Первый этап. Получают суспензию спор путем смыва стерильной водой колонии микромицета с поверхности агаризованной сусло-среды.

Второй этап. Получают посевной материал: в колбы Эрленмейера с жидкой картофельно-глюкозной средой вносят суспензию спор из расчета 5%-15% от объема среды. Колбы помещают на качалки с круговым типом перемешивания и культивируют штамм от 24 до 40 часов, при температуре от плюс 19°С до плюс 39°С.

В результате полученный посевной материал содержит мицелий, конидии, хламидоспоры микромицета. Посевной материал используют для получения грибного препарата различных видов, например - в жидком и сыпучем виде.

Для получения жидкой формы препарата с концентрацией от 10⁶ до 10⁹ КОЕ/мл посевной материал штамма переносят в ферментер с питательной средой, указанной ниже (г/л):

Глюкоза - 15-25

NaNO₃ - 1,8-3,0

MgSO₄ - 0,3-0,8

KH₂PO₄ - 0,7-1,3

NACl - 0,2-1,0

Подсолнечное масло - 2,0-4,0

Остальное - вода (доводя г объем до 1 л)

рН - 4.0

Посевной материал штамма в ферментере культивируют в питательной среде и получают биопрепарат. Время культивирования: 18-30 часов при температуре от плюс 19°C до плюс 39°C.

Сыпучую форму препарата получают с использованием зерен или шелухи зерновых культур, например - ржи. Для изготовления субстрата для культивирования штамма берут зерна, увлажняют их мелассно-дрожжевой суспензией, причем мелассы берут в количестве от 0,5% до 2% от объема субстрата, дрожжевой суспензии берут в количестве от 3% до 10% от объема субстрата. Емкость, например - стеклянную бутыль, заполняют субстратом и стерилизуют в автоклаве - 0,5 до 1,5 часа при 0,5 кг/см² избыточного давления. После стерилизации субстрат охлаждают. Затем в субстрат вносят посевной материал штамма в объеме от 5% до 20% от субстрата и инкубируют штамм в течение 5…7 суток при температуре от плюс 19°C до плюс 39°C и экспозиции освещения от 10 до 20 часов в сутки, 2-10 тыс. люкс. Полученный сыпучий препарат сушат с использованием принудительной низкотемпературной сушки, например - при комнатной температуре. При необходимости, по одному из вариантов, сыпучую форму препарата промывают водой, которую собирают, для получения жидкой формы препарата с концентрацией от 10⁶ до 10⁹ КОЕ/мл.

Далее для получения биологического средства препарат в жидкой или сыпучей форме перемешивают с минеральным, органическим либо бактериальным удобрением.

По одному из вариантов препарат в сыпучей форме перемешивают с минеральным удобрением в массовом соотношении от 1/1 до 1/10 (минеральное удобрение/грибной препарат) и фасуют в стерильные пергаментные мешки.

По одному из вариантов препарат в сыпучей форме перемешивают с органическим удобрением в массовом соотношении от 1/1 до 1/50 (грибной препарат/органическое удобрение) и фасуют в стерильные пергаментные мешки.

По одному из вариантов препарат в сыпучей форме перемешивают с бактериальным удобрением в массовом соотношении от 1/1 до 1/5 (грибной препарат/бактериальное удобрение) и фасуют в стерильные пергаментные мешки.

По одному из вариантов препарат в жидкой форме получают в результате смыва водой штамма и продуктов его метаболизма с поверхности сыпучей формы препарата, концентрация препарата от 10⁶ до 10⁹ КОЕ/мл.

По одному из вариантов препараты в жидкой форме далее смешивают с раствором бактериальных удобрений в соотношении от 1/1 до 1/10 (жидкая форма препарата/раствор удобрений), при концентрациях растворов жидкой формы препарата от 10⁶ до 10⁹ КОЕ/мл.

При использовании предлагаемого изобретения происходит следующее.

В результате фунгистатического действия биологического средства на основе штаммов гриба рода Trichoderma (торможения прорастания спор фитопатогенов) летучих и нелетучих продуктов метаболизма штамма происходит ингибирование (замедление или прекращение) роста фитопатогенов, например - Fusarium на 40-50% в зависимости от вида, альтернариоза - на 90%, гельминтоспориоза на - 70%, ботритиоза - на 100% в опытах in vitro. Происходит подавление развития вредителей, например - стеблевых и почвенных нематод. В полевых условиях стабильно наблюдающееся снижение инфекционной нагрузки происходит в зависимости от климатических условий, освещенности, температуры и влажности почвы.

Использование в составе средства минеральных, органических и бактериальных удобрений (на основе фосфатрастворяющих, азотфиксирующих и др. бактерий) корректирует питательные, энергетические функции почвы, что необходимо для роста культур и эффективной реализации технического результата препарата на основе штаммов гриба рода Trichoderma.

Технический результат выражается также в повышении устойчивости сельскохозяйственных культур на защищенном и открытом грунте к фитопатогенам различной видовой принадлежности, снижении инфекционного фона в почве и/или тепличном субстрате, повышении стрессоустойчивости растений, в стимуляции роста и развития почвенных азотфиксирующих и фосфатрастворяющих микроорганизмов. Происходит увеличение содержания гумуса в почве, повышающее качество почвы и улучшающее условия произрастания растений.

Уменьшение заболеваемости растений, обилие почвенных азотфиксирующих и фосфатрастворяющих микроорганизмов и продуктов их жизнедеятельности (в виде необходимых для питания растений природных соединений азота и фосфора) приводит к повышению урожайности растений, улучшению качества урожая за счет снижения микотоксинов. Кроме того, не зараженный фитопатогенами урожай сохраняется существенно лучше зараженного и меньше теряется при хранении. При этом продукты питания, изготовленные из сырья - урожая с уменьшенным содержанием нитратов - имеют повышенную пищевую ценность и являются экологически чистыми, безвредными для потребителей.

Применение штаммов с продуктами метаболизма позволяет уменьшить применение неорганических удобрений, во многих случаях снизить используемое количество либо отказаться от использования химических средств - для защиты растений от болезнетворных микроорганизмов, защиты от стрессов при непредвиденных изменениях окружающей среды, например, температуры, влажности, для регулирования роста растений, повышения урожайности и сохранности урожая.

Показано отсутствие генотоксичности, токсичности штамма и продуктов его жизнедеятельности к человеку, теплокровным животным, пчелам и рыбам. Уменьшение применения химикатов в сельском хозяйстве или отказ от их применения повышает качество вырабатываемых пищевых продуктов питания при уменьшении ущерба окружающей среде.

Пример 1

Штамм Trichoderma asperellum T-310, депонированный во Всероссийской Коллекции Микроорганизмов под номером ВКМ F4340D, используют для защиты зерновых сельскохозяйственных культур от фитопатогенов, например пшеницы от фузариоза, следующим образом. Изготавливают препарат. Жидкое биологическое средство (препарат па основе штамма гриба рода Trichoderma в жидкой форме, смешанный в соотношении 1/1 с раствором препарата РИЗОАГРИН) фильтруют, разбавляют водой в соотношении 1:10 и помещают в протравочную машину, используемую в сельском хозяйстве для предпосадочной обработки семян пестицидами.

Обработку осуществляют аналогично обработке пестицидами [21]. В зерновой бункер машины для протравливания насыпают семенное зерно. Жидкий препарат вводят в массу семенного зерна. Зерно тщательно перемешивают. Перемешанное с препаратом зерно выводят из бункера машины для протравливания и производят посевные работы.

Пример 2

Сыпучую форму биологического средства (сыпучая форма препарата на основе штамма Trichoderma lignorum депонированного в НИИ коллекций культуры клеток Государственного научного центра вирусологии и биотехнологии "Вектор" под номером F5, перемешанная с препаратами Митоз-1 или Изабион в массовом соотношении 1/25 (грибной препарат/органическое удобрение)) используют для дезинфекции почвы путем внесения препарата штамма перед посевом/посадкой растений, и после уборки урожая. Норма внесения - от 200 до 500 г/га препарата, в зависимости от инфекционного фона почвы.

Пример 3

Сыпучую форму биологического средства используют для защиты растений, например картофеля, на открытом и защищенном грунте от фитофтороза (Phythophtora infestans). Для этого сыпучую форму биологического средства (сыпучая форма препарата на основе штамма Trichoderma asperellum T-310, депонированного во Всероссийской Коллекции Микроорганизмов под номером ВКМ F4340D, перемешанного с препаратами Митоз-1 или Изабион в массовом соотношении 1/30 (грибной препарат/органическое удобрение)) вносят в почву в предпосадочный период весной и в августе-сентябре (в зиму) из расчета, например - в количестве or 300 до 1000 г/га.

Пример 4

Сыпучую форму биологического средства используют для защиты от гнилей моркови на открытом грунте. Для этого сыпучую форму биологического средства (сыпучая форма препарата на основе штамма Trichoderma lignorum депонированного в НИИ коллекций культуры клеток Государственного научного центра вирусологии и биотехнологии "Вектор" под номером F5, перемешанная с аммонизированным суперфосфатом в массовом соотношении 1/8 (минеральное удобрение/грибной препарат)) вносят в почву в предпосадочный период весной и в августе-сентябре (в зиму) из расчета двойной дозы препарата на 1 гектар, например - в количестве от 300 до 1000 г/га. В последующем, для защиты растений по вегетации, используют жидкую форму биологического средства (жидкая форма препарата на основе штамма Trichoderma, перемешанная с раствором препарата бактофосфин в соотношении объемов 1/1).

Пример 5

Сыпучую форму биологического средства используют для защиты растений, например огурца, на открытом и защищенном грунте от галловой нематоды путем внесения сыпучей формы биологического средства (форма препарата на основе штамма Trichoderma viride, депонированного во Всероссийской Коллекции Промышленных Микроорганизмов под номером F262, перемешанная с препаратом каинит в массовом соотношении 1/10 (минеральное удобрение/грибной препарат)) в почву в предпосадочный период - из расчета, например, от 400 до 1000 г/га.

ИСПОЛЬЗОВАННЫЕ ИСТОЧНИКИ

1. Твердюков А.П., Никонов П.В., Ющенко Н.П. Биологический метод борьбы с вредителями и болезнями в защищенном грунте: Справочник. - М.: Колос, 1993. - 159 с.

2. Патент US 6890530, дата приоритета 10.05.2005.

3. Список пестицидов и агрохимикатов, разрешенных к применению на территории Российской Федерации. 2003 год: Приложение к журналу «Защита и карантин растений», №4, 2003. - С.143.

4. Заявка на патент №2008108035 RU, опубликовано 27.08.2009.

5. Harman GE, Howell CR, Viterbo A, Chet I, Lorito M (2004), Trichoderma species-opportunistic, avirulent plant symbionts, Nat Rev Microbiol 2:43-56

6. Mukherjee, P.К., Hadar, R., Pardovitz-Kedmi, E., Trushina, N., Horwitz, B.A., Biochemical and Biophysical Research Communications, 2006, 350 (3), pp.716-722

7. Yang, Z.-S., Li, G.-H., Zhao, P.-J., Zheng, X., Luo, S.-L., Li, L., Niu, X.-M., Zhang, K.-Q., World Journal of Microbiology and Biotechnology, 2010, 26 (12), pp.2297-2302

8. Промышленное применение грибов рода Trichoderma / Ф.К. Алимова. - Казань: Казанский государственный университет им. В.И. Ульянова-Ленина, 2006. - 210 с

9. Kolombet, L.V., Zhigletsova, S.K., Kosareva, N.I., Bystrova, E.V., Derbyshev, V.V., Krasnova, S.P., Schisler. D., World Journal of Microbiology and Biotechnology, 2008 24 (1), pp.123-131

10. Djonovic, S., Pozo, M.J., Dangott, L.J., Howell, C.R., Kenerley, C.M., Molecular Plant-Microbe Interactions, 2006, 19 (8), pp.838-853

11. Howell, C.R., Hanson, L.E., Stipanovic, R.D., Puckhaber, L.S., Phytopathology, 2000, 90 (3), pp.248-252

12. Rev, M., Delgado-Jarana, J., Benitez, Т. Applied Microbiology and Biotechnology, 2001, 55 (5), pp.604-608

13. Berg, A., Kemami Wangun, H.V., Nkengfack, A.E., Schlegel, B, Journal of Basic Microbiology, 2004, 44 (4), pp.317-319

14. Krupke, O.A., Castle, A.J., Rinker. D.L., Mycological Research, 2003, 107 (12), pp.1467-1475

15. Benitez, Т., Rincon, A.M., Limon, M.C., Codon, A.C., International Microbiology, 2004, 7 (4), pp.249-260

16. O. Egberongbe Haneefat, A.A. Sobowale, O.A.F. Ilusanya and R.T. Feyisola, American Journal of Experimental Agriculture, 2(3): 516-524, 2012

17. Дудка И.А, Вассер С.П., Элланская И.А. и др. Экспериментальная микология: Справочник. - Киев: Наукова Думка, 1982. - 550 с.

18. Методы почвенной микробиологии и биохимии. Под ред. Д.Г. Звягинцева. - M.: Изд. МГУ, 1991. - 304 с.

19. Семенов C.M. Лабораторные среды для актиномицетов и грибов: Справочник. - M.: Агропромиздат, 1990. - 240 с.

20. Новое в систематике и номенклатуре грибов. Под ред. Ю.Т. Дьякова, Ю.В. Сергеева. - M.: «Национальная академия микологии»; «Медицина для всех», 2003. - 496 с.

21. Гаршина Т.Д., Холявко B.C. Механизация работ и защита растений в декоративном садоводстве. - M.: Агропромиздат, 1990. - С.64.

22. Samuels G.J. Trichoderma - A review of biology and systematics of the genus // Mycol. Res. 1996. Vol.100. P.923-935.

1. Способ получения биологического средства для защиты растений от фитопатогенов и нематод на основе штамма гриба рода Trichoderma, включающий приготовление посевного материала штамма гриба рода Trichoderma, приготовление препарата в жидкой либо сыпучей форме на основе посевного материала, а также перемешивание препарата с минеральным, органическим или бактериальным удобрением, в результате чего получают биологическое средство, причем для приготовления посевного материала штамма гриба рода Trichoderma музейную культуру штамма гриба рода Trichoderma поддерживают на агаризованной сусло-среде с содержанием солодового сусла 5-6° по Баллингу и 2% агара и хранят в холодильнике при температуре от +3°C до +5°C, далее путем смыва колонии микромицета стерильной водой с поверхности агаризованной сусло-среды получают суспензию спор, далее суспензию спор вносят в колбы Эрленмейера с жидкой картофельно-глюкозной средой из расчета 5%-15% от объема среды, колбы помещают на качалки с круговым типом перемешивания и культивируют штамм от 24 до 40 ч, при температуре от +19°C до +39°C, далее для приготовления препарата в жидкой форме с концентрацией от 10⁶ до 10⁹ КОЕ/мл полученный посевной материал штамма переносят в ферментер с питательной средой, состав которой в г/л указан ниже:
Глюкоза - 15-25
NaNO₃ - 1,8-3,0
MgSO₄ - 0,3-0,8
KH₂PO₄ - 0,7-1,3
NaCl - 0,2-1,0
Подсолнечное масло - 2,0-4,0
Остальное - вода (доводят объем до 1 л)
рН - 4,0
и культивируют в течение 18-30 ч при температуре от +19°C до +39°C, либо в случае необходимости получения препарата в сыпучей форме вносят посевной материал в стерилизованный субстрат в объеме от 5% до 20% от субстрата и производят инкубирование штамма в течение 5-7 суток при температуре от +19°C до +39°C и экспозиции освещения от 10 до 20 ч в сутки, 2-10 тыс. люкс, далее полученный сыпучий препарат сушат с использованием принудительной низкотемпературной сушки, в результате чего получают препарат на основе штамма гриба рода Trichoderma в сыпучей форме, причем для изготовления субстрата для культивирования штамма берут зерна или шелуху зерновых культур, отличающийся тем, что зерна или шелуху зерновых культур увлажняют мелассно-дрожжевой суспензией, причем мелассы берут в количестве от 0,5% до 2% от объема субстрата, дрожжевой суспензии берут в количестве от 3% до 10% от объема субстрата либо в случае необходимости препарат в сыпучей форме промывают водой, которую собирают, для получения жидкой формы препарата с концентрацией от 10⁶ до 10⁹ КОЕ/мл.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что препарат в сыпучей форме перемешивают с минеральным удобрением в массовом соотношении минерального удобрения к грибному препарату от 1/1 до 1/10.

3. Способ по п.1, отличающийся тем, что препарат в сыпучей форме перемешивают с органическим удобрением в массовом соотношении грибного препарата к органическому удобрению от 1/1 до 1/50.

4. Способ по п.1, отличающийся тем, что препарат в сыпучей форме перемешивают с бактериальным удобрением в массовом соотношении грибного препарата к бактериальному удобрению от 1/1 до 1/5.

5. Способ по п.1, отличающийся тем, что препарат в жидкой форме с концентрацией от 10⁶ до 10⁹ КОЕ/мл смешивают с раствором бактериального удобрения в соотношении объемов жидкой формы препарата к раствору удобрений от 1/1 до 1/10.

6. Биологическое средство для защиты растений от фитопатогенов и нематод на основе штамма гриба рода Trichoderma, полученное способом по пп.1-5.