Хромогенная питательная среда для одноэтапного выделения и идентификации возбудителей уроинфекций

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано для диагностики неспецифических инфекционных заболеваний мочеполовой системы. Питательная среда содержит питательный агар, сухой, из каспийской кильки, парааминобензойную кислоту, трис-(оксиметил) аминометан (трис-буфер), салицин, нейтральный красный, L-триптофан, 5-бром-4-хлор-3-индолил β-D-глюкуронид циклогексиламмонийной соли, 2-нитрофенил β-D-галактопиранозид и дистиллированную воду в заданном соотношении компонентов. Изобретение позволяет повысить дифференцирующие свойства питательной среды и сократить сроки выделения возбудителей уроинфекций. 1 табл., 3 пр.

 

Изобретение относится к медицине, а именно к клинической микробиологии, и может быть использовано для диагностики неспецифических инфекционных заболеваний мочеполовой системы, а также как питательная среда общего назначения.

В этиологической структуре возбудителей неспецифических инфекционных заболеваний мочеполовой системы значительную роль играют условно патогенные микроорганизмы (УПМ). Наибольший удельный вес среди них (до 80%) составляют условно патогенные энтеробактерии, чаще всего кишечная палочка, протеи, клебсиеллы, энтеробактеры, цитробактеры, а также синегнойная палочка. Среди грамположительных микроорганизмов в качестве этиологического фактора наиболее часто регистрируют энтерококки, стафилококки (Божкова С.А. Госпитальные инфекции мочевыводящих путей, Омарова С.М. Мониторинг микрофлоры госпитальных инфекций мочевыводящих путей при выборе эффективной антибактериальной терапии).

Аналоги

Условно патогенные микроорганизмы (УПМ) также являются основными возбудителями различных внутрибольничных инфекций, представляющих серьезную проблему современной медицины как в нашей стране, так и за рубежом. Присоединение виутрибольничных инфекций к основному заболеванию снижает эффективность операций на жизненно важных органах, увеличивает послеоперационную летальность, наносит экономический ущерб за счет длительного пребывания в больнице. Около 40% всех виутрибольничных инфекций приходится на инфекции мочевыводящих путей (Божкова С.А. Госпитальные инфекции мочевыводящих путей, Омарова С.М. Мониторинг микрофлоры госпитальных инфекций мочевыводящих путей при выборе эффективной антибактериальной терапии). Хотя такие инфекции в подавляющем большинстве случаев не представляют серьезной угрозы жизни пациентов, они могут потребовать дополнительной антибактериальной терапии и привести к удлинению сроков госпитализации. Тяжелые инфекционные патологии, как бактериемия и сепсис, формируется также, в основном, как внутрибольничные инфекции и в 95% случаев вызываются УПМ - стафилококками, кишечной палочкой, клебсиеллами, протеями, энтерококком и др. (Горелова В.Г. Этиологическая структура и антибиотикорезистентность возбудителей бактериемии, выделенных в медицинских учреждениях г. Махачкалы). В настоящее время в нашей стране бактериологическое исследование мочи на уроинфекцию проводят с использованием питательного агара. Недостаток этого способа заключается в том, что питательный агар не подавляет роение протея, в силу чего в случае наличия в микробной ассоциации роящихся форм протеев (Р. mirabilis, P. vulgaris) невозможно определить степень бактериурии вследствие образования сплошной пленки протеев на поверхности среды. Кроме того, питательный агар не обеспечивает идентификацию возможных возбудителей уроинфекции.

Известны отечественные питательные среды для выделения и идентификации клинически значимых УПМ: ДагХром агар (патент РФ № 2386696 от 20.04.2010 г.), позволяющий в течение 24 ч идентифицировать до вида кишечную палочку среди других условно патогенных энтеробактерий; Клебсиелла хром агар (патент РФ №2416635 от 20 апреля 2011 г), позволяющий выделить и идентифицировать клебсиеллы; а также среды для выделения и идентификации протеев, морганелл и провиденций - ППМ-агар, элективный солевой агар для выделения стафилококков; питательная среда для выделения энтерококков (Меджидов М.М. Справочник по микробиологическим питательным средам).

Критика аналогов

К недостаткам указанных питательных сред следует отнести невозможность одновременной идентификации на каждой из них грамотрицательных и грамположительных УПМ. Вследствие этого, для выделения и идентификации возможного возбудителя уроинфекции требуется посев исследуемого материала проводить одновременно на ряд вышеназванных питательных сред, что громоздко и трудоемко.

Прототип

Наиболее близким решением задачи того же назначения по совокупности признаков и достигаемому эффекту является сухая питательная среда фирмы "Fluka" - HiCrome™ UTI Agar/Modified, содержащая в г/л: агар - 15,0, говяжий экстракт - 4,0, ферментативный гидролизат казеина - 4,0, пептический перевар животной ткани - 18,0, а также хромогенную микстуру - 12,44, состав которой не расшифровывается (Каталог фирмы "Fkika Riedel-de-Наеп"). При использовании этой среды возможно на одной чашке Петри обнаружить и идентифицировать клинически значимые уропатогенные бактерии по различной окраске колоний. Характер окраски определяется взаимодействием родо- и видоспецифических ферментов бактерий с хромогенными субстратами, входящими в состав микстуры. Дифференциация E.coli от других колиформных бактерий требует постановки дополнительного индольного теста, обнаруживающего специфический для E.coli фермент - триптофаназу по изменению окраски колоний в красный цвет.

К причинам, препятствующим достижению указанного ниже технического результата при использовании HiCrome™ UTI Agar/Modified - среды, принятой за прототип, является сложность в приготовлении этой среды, т.к. требуется использование пищевого сырья - мясо говядины для получения экстракта, а также получение специального перевара животной ткани. Кроме того, среда требует стерилизации при 121°C.

Цель изобретения - получение отечественной среды аналогичного назначения с упрощением процесса ее приготовления и не уступающей по дифференцирующим свойствам прототипу.

Указанный технический результат при осуществлении изобретения достигается тем, что предлагаемая питательная среда для удовлетворения питательных потребностей бактерий содержит питательный агар, сухой, из каспийской кильки, в качестве фактора роста содержит парааминобензойную кислоту, для обеспечения поддержания рН в процессе роста микроорганизмов в среду введен трис-оксиметил аминометан (трис-буфер). Для идентификации E.coli среда содержит 5-бром-4-хлоро-3-индолил β-D-глюкуронид циклогексиламмонийной соли, выявляющий β-глюкуронидазу кишечной палочки. Для идентификации остальных колиформных бактерий среда содержит 2-нитрофенил β-D-галактопиранозид, выявляющий β-галактозидазу колиформных бактерий. Идентификация бактерий рода протея осуществляется введением в среду триптофана, выявляющего триптофандезаминазу (ТДА) протеев. Для идентификации энтерококка в среду введены салицин и нейтральный красный, обеспечивающие выявление кислотообразования при ферментации салицина энтерококком.

Состав предлагаемой среды - ДагУроХром агар в г/л дистиллированной воды:

питательный агар, сухой,

из каспийской кильки ФС42-188 ВС-88	35,0-40,0
парааминобензойная кислота, фирма «Sigma»	0,01-0,015
трис-оксиметил аминометан (трис-буфер) ТУ6-09-4292-76	0,3-0,4
2-нитрофенил β-D-галактопиранозид, фирма «Sigma»	0,4-0,5

5-бром-4-хлор-3-индолил β-D-глюкуронид

циклогексиламмонийной соли, фирма «Sigma»	0,4-0,5
L-триптофан ТУб-09-1492-77	6,0-7,0
салицин, фирма «Sigma»	5,0-5,5
нейтральный красный ТУ 6-09-07-1634-91	0,03-0,04

Сухую питательную среду ДагУроХром агар получают следующим образом.

Пример 1. В шаровую мельницу-смеситель емкостью 100 литров загружают последовательно 25,0 кг питательного агара, сухого, из каспийской кильки, 0,01 кг парааминобензойной кислоты, 0,3 кг трис-буфера, 0,03 кг нейтрального красного, 0,4 кг 5-бром-4-хлор-3-индолил β-D-глюкуронида циклогексиламмонийной соли и 0,4 кг 2-нитрофенил β-D-галактопиранозида. Люк мельницы закрывают и перемешивают все ингредиенты в течение 20 минут. Затем в мельницу-смеситель вносят последовательно 6,0 кг L-триптофана, 5,0 кг салицина и 10 кг питательного агара, сухого, из каспийской кильки. Люк мельницы закрывают и содержимое мельницы-смесителя перемешивают в течение 60 мин, после чего получают гомогенную сухую питательную среду.

Для приготовления плотной среды, готовой к употреблению, в 1 л дистиллированной воды растворяют 47,1 г сухой среды, трехкратно кипятят по 1-2 мин при помешивании, не допуская пригорания агара, до появления крупнопузырчатой пены, среда не требует автоклавирования. Среду охлаждают до температуры 45-50°C, после чего разливают в стерильные чашки Петри. После застывания агаровой пластинки чашки со средой подсушивают в термостате при 37°C в течение 50-60 мин с соблюдением правил асептики. Готовая к употреблению среда прозрачная, бледно-розового цвета, рН среды 7,4±0,2.

Пример 2. В шаровую мельницу-смеситель емкостью 100 литров загружают последовательно 27,5 кг питательного агара, сухого, из каспийской кильки, 0,013 кг парааминобензойной кислоты, 0,35 кг трис-буфера, 0,035 кг нейтрального красного, 0,45 кг 5-бром-4-хлоро-3-индолил β-D-глюкуронида циклогексиламмонийной соли и 0,45 кг 2-нитрофенил β-D-галактопиранозида. Люк мельницы закрывают и перемешивают все ингредиенты в течение 20 минут. Затем в мельницу-смеситель вносят последовательно 6,5 кг L-триптофана, 5,25 кг салицина и 10 кг питательного агара, сухого, из каспийской кильки. Люк мельницы закрывают и содержимое мельницы-смесителя перемешивают в течение 60 мин, после чего получают гомогенную сухую питательную среду. Для приготовления плотной среды, готовой к употреблению, в 1 л дистиллированной воды растворяют 50,5 г сухой среды. Далее - по примеру 1.

Пример 3. В шаровую мельницу-смеситель емкостью 100 литров загружают последовательно 30,0 кг питательного агара, сухого, из каспийской кильки, 0,015 кг парааминобензойной кислоты, 0,4 кг трис-буфера, 0,04 кг нейтрального красного, 0,5 кг 5-бром-4-хлор-3-индолил β-D-глюкуронида циклогексиламмонийной соли и 0,5 кг 2-нитрофенил β-D-галактопиранозида. Люк мельницы закрывают и перемешивают все ингредиенты в течение 20 минут. Затем в мельницу-смеситель вносят последовательно 7,0 кг L-триптофана, 5,5 кт салицина и 10 кг питательного агара, сухого, из каспийской кильки. Люк мельницы закрывают и содержимое мельницы-смесителя перемешивают в течение 60 мин, после чего получают гомогенную сухую питательную среду. Для приготовления плотной среды, готовой к употреблению, в 1 л дистиллированной воды растворяют 54,0 г сухой среды. Далее - по примеру 1,2.

Через 18-24 ч инкубации посевов (при 37±1°C) на предлагаемой среде колонии E.coli вырастают размером 2,0±0,2 мм и окрашиваются в сине-зеленый цвет, т.к. продуцируют ферменты β-глюкуронидазу и β-галактозидазу, которые расщепляют оба хромогенных субстрата - β-D-глюкуронид и β-D-галактопиранозид с выделением в среду хромофоров соответственно синего и желтого цвета. Колонии Enterobacter cloacae и Citrobacter freundii вырастают размером 2,0±0,2 мм и окрашиваются в желтый цвет, т.к. продуцируют только фермент β-галактозидазу, расщепляющую хромогенный субстрат - β-D-галактопиранозид с выделением в среду хромофора желтого цвета. Klebsiella spp.вырастают крупными слизистыми колониями размером 2,5±0,2 мм и окрашиваются в красно-оранжевый цвет с желтым ореолом вокруг колоний, т.к. одновременно расщепляют салицин и продуцируют фермент β-галактозидазу. Колонии Proteus spp. вырастают размером 2,0±0,2 мм и окрашиваются в коричневый цвет с коричневым преципитатом в среде вокруг колоний в связи с расщеплением триптофана родоспецифическим ферментом протеев трипофандезаминазой, с образованием продуктов расщепления триптофана коричневого цвета. Enterococcus faecalis вырастает мелкими колониями размером 0,8±0,2 мм и окрашивается в темно-красный цвет в связи с расщеплением салицина с образованием кислых продуктов, понижающих рН среды и, соответственно, изменяющих окраску индикатора нейтрального красного. Staphylococcus aureus вырастает размером 1,8±0,2 мм в виде бесцветных колоний, т.к. не расщепляет салицин и триптофан и не продуцирует вышеназванных специфических ферментов. Колонии Pseudomonas aeruginosa вырастают размером 1,5±0,2 мм с серо-зеленым пигментом.

Признаки изобретения, отличительные от прототипа

- в качестве источников азота и углерода содержит питательный агар, сухой, из каспийской кильки

- в качестве фактора роста содержит парааминобензойную кислоту

- в качестве буфера применяется трис-оксиметил аминометан (трис-буфер)

- для идентификации выявленных УПМ содержит салицин, нейтральный красный, L-триптофан, два хромогенных субстрата: 5-бром-4-хлор-3-ипдолил β-D-глюкуронид циклогексиламмонийной соли и 2-нитрофенил β-D-галактопиранозид.

Положительный эффект

Предлагаемая среда проста в изготовлении, т.к. не требует продуктов животного происхождения и дополнительных технологических операций для приготовления из них экстрактов и переваров. Кроме того, в отличие от прототипа, при использовании предлагаемой среды отсутствует необходимость постановки дополнительного теста на индол для идентификации кишечной палочки и среда не требует стерилизации.

Аналогичной отечественной среды, позволяющей на одной чашке выявить сразу несколько клинически значимых УПМ, различающихся по цвету, не выпускается. Предлагаемая среда по диагностической ценности не уступает прототипу. Использование предлагаемой среды в широкой лабораторной практике существенно снизит трудоемкость при проведении клинических исследований.

Источники информации, принятые во внимание

1. Божкова С.А. Госпитальные инфекции мочевыводящих путей: Мониторинг микрофлоры как средство выбора эффективной терапии. / Афиногенов Г.Е. // ЖМЭИ. - 2005.- Т. 7. - №2. - Приложение 1.- С. 16.

2. Горелова В.Г. Этиологическая структура и антибиотикорезистентность возбудителей бактериемии, выделенных в медицинских учреждениях г. Махачкалы. / Юпусова Р.Ю., Меджидов М.М., Степанова Э.Д., Омарова С.М. // Материалы 2 Всероссийской научно-практической конференции «Антибиотикорезистентность и антимикробная химиотерапия». - Махачкала. - 2008.- С. 41-43.

3. Меджидов М.М. Справочник по микробиологическим питательным средам. М., 2003, 30, 33-34.

4. Омарова С.М. Мониторинг микрофлоры госпитальных инфекций мочевыводящих путей при выборе эффективной антибактериальной терапии. / Ахмедова Э.М., Тагирова Г.М. // Материалы 2 Всероссийской научно-практической конференции «Антибиотикорезистентность и антимикробная химиотерапия». - Махачкала. - 2008. - С. 32-33.

5. Каталог фирмы "Fluka Riedel-de-Haen". 2007/2008., С 1074. - прототип.

СРАВНИТЕЛЬНАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ДИФФЕРЕНЦИРУЮЩИХ СВОЙСТВ ПРЕДЛАГАЕМОЙ

СРЕДЫ И ИЗВЕСТНОЙ, ВЗЯТОЙ ЗА ПРОТОТИП.

Таблица 1
Тест - штаммы	Предлагаемая среда - ДагУроХром агар	Известная среда-HiCrome™ UTI Agar/Modified
Цвет и форма колоний	Цвет и форма колонии	Индол
E.coli Su 3912/41 O55:К59	Сине-зеленые с желтым ореолом, S-форма	Розовые, S-форма	+(красные)
Е.cloacae 1005	Желтые с желтым ореолом, S-форма	-//-	-
С.freundii 101/57	-//-	-//-	-
K.pneumoniae3435/51	Красно-оранжевые с желтым ореолом, S-форм	Фиолетовые, S-форма	-
P. mirabilis 3177	Коричневые, О-форма	Светло-коричневые, О-форма	-
E. faecalis775	Красные, мелкие, S-форма	Синие, S-форма	-
S. aureusATCC25923	Бесцветные, S-форма	Золотисто-желтые, S-форма	-
P. aeruginosa 68	Серо-зеленый пигмент, S-форма	Бесцветные, S-форма	-
Стерилизация	Не требуется	Автоклавирование при 121°C

Хромогенная питательная среда для одноэтапного выделения и идентификации возбудителей уроинфекций, содержащая источники азота и углерода для удовлетворения питательных потребностей условно патогенных микроорганизмов (УПМ), факторы роста, а также хромогенную смесь для идентификации УПМ, отличающая тем, что в качестве источников азота и углерода содержит питательный агар, сухой, из каспийской кильки, в качестве фактора роста содержит парааминобензойную кислоту, в качестве буфера трис-(оксиметил) аминометан (трис-буфер), а для идентификации выявленных УПМ содержит салицин, нейтральный красный, L-триптофан и два хромогенных субстрата: 5-бром-4-хлор-3-индолил β-D-глюкуронид циклогексиламмонийной соли и 2-нитрофенил β-D-галактопиранозид и при следующем соотношении компонентов, г/л дистиллированной воды:

питательный агар, сухой,
из каспийской кильки	35,0-40,0
парааминобензойная кислота, фирма «Sigma»	0,01-0,015
трис-(оксиметил)аминометан (трис-буфер)	0,3-0,4
2-нитрофенил β-D-галактопиранозид, фирма «Sigma»	0,4-0,5
5-бром-4-хлор-3-индолил β-D-глюкуронид
циклогексиламмонийной соли, фирма «Sigma»	0,4-0,5
L-триптофан	6,0-7,0
салицин, фирма «Sigma»	5,0-5.5
нейтральный красный	0,03-0,04