Синтетические олигонуклеотидные праймеры для идентификации вируса блютанга нуклеотипа а (4, 10, 11, 17, 20 и 24 серотипы) методом от-пцр


 


Владельцы патента RU 2534358:

Государственное научное учреждение Всероссийский научно-исследовательский институт ветеринарной вирусологии и микробиологии Россельхозакадемии (RU)

Изобретение относится к биотехнологии, генетической инженерии и ветеринарной вирусологии. Предложены синтетические олигонуклеотидные праймеры, комплементарные участкам вариабельного 2-го сегмента генома вируса блютанга серотипов, входящих в состав нуклеотипа А (4, 10, 11, 17, 20 и 24 серотипы) для выявления РНК вируса блютанга нуклеотипа А, имеющие следующий нуклеотидный состав (5′-3′): прямой TATTGGCATAGRCAGTGG; обратный GTAAGYGTAAGAGGCCA. Праймеры позволяют одновременно идентифцировать 4, 10, 11, 17, 20 и 24 серотипы вируса блютанга нуклеотипа A методом ОТ-ПЦР, что позволяет ускорить процедуру выявления различных серотипов вируса блютанга А в образце. 2 табл., 1 ил.

 

Изобретение относится к биотехнологии, а именно к генетической инженерии, и может быть использовано в ветеринарной вирусологии для выявления РНК вируса блютанга генетической группы (нуклеотип А), объединяющей 4, 10, 11, 17, 20 и 24 серотипы.

Блютанг - трансмиссивное, неконтагиозное вирусное заболевание домашних и диких жвачных животных, протекает чаще в субклинической форме с инфицированием большого поголовья животных, в клинической же симптомы зависят от вида и породы животного [5]. Заболевание вызывает вирус блютанга (ВБ), входящий в состав рода Orbivirus семейства Reoviridae [1, 10]. Генетически ВБ высокогетерогенен, по данным на 2012 г. выделяют 25 (1-24, 26) серотипов и один генетический вариант, так называемый «25 серотип» - Toggenburg orbivirus [3]. Десять линейных дцРНК сегментов генома ВБ варьируют по размеру от 3944 п.о. до 822 п.о. (пример для ВБ 8 серотипа) [14]. Они обозначены как сегменты 1-10, в соответствии с уменьшением молекулярной массы. Геном ВБ кодирует 10 белков вируса, каждый белок - одним из сегментов дцРНК [9]. Семь белков (VP1-VP7) являются структурными компонентами вирусной частицы, остальные три (NS1, NS2 и NS3) являются неструктурными белками, которые синтезируются во время репликации вируса в инфицированных клетках [11, 12]. С помощью исследования перекрестной гибридизации [8] и сравнения нуклеотидных последовательностей были установлены изменения в нуклеотидных последовательностях сегментов генома ВБ и структуре белков, которые они кодируют. Белки капсида, расположенные на поверхности вирусной частицы более вариабельны, чем белковые компоненты кора вируса или неструктурные белки [13].

Внешний капсид частицы вируса ВБ состоит из двух белков VP2 и VP5, они являются наименее консервативными, их кодируют 2 и 6 сегменты соответственно. Изменения в этих компонентах наружного капсида отражают адаптационные процессы вируса к хозяину и вектору, продиктованные необходимыми условиями для прикрепления и проникновения вируса в клетки разных видов/тканей и ответа на воздействие антител хозяев-позвоночных. В основном VP2 белок детерминирует серотип, он содержит большинство нейтрализующих эпитопов вируса [1]. Исследования реассортантных вариантов ВБ показали, что оба белка внешнего капсида VP2 и VP5 ВБ влияют на специфичность взаимодействий между вирусной частицей и нейтрализующими антителами [4]. Однако VP2 поверхностный белок капсида ВБ представляет главную антигенную мишень для связывания нейтрализующими антителами [11]. Анализ нуклеотидных последовательностей 2-го сегмента референтных штаммов 26 серотипов ВБ также подтвердил, что он представляет собой наименее консервативный участок генома ВБ (рис.1) и имеет от 29% до 59% нуклеотидных изменений между серотипами [1].

Филогенетический анализ 2 сегмента более 300 изолятов ВБ подтвердил их разделение на 26 групп или кладов, точно отражая серотип вируса, с менее 33% нуклеотидных изменений в последовательности внутри каждого серотипа и от 29% до 59% замен между серотипами [1]. Однако некоторые серотипы ВБ наиболее близко генетически связаны, чем другие, что позволяет сгруппировать их в 12 различных генетических групп - нуклеотипов, стандартно они обозначаются буквами A, B, C, D, E, F, G, H, I, J, K, L и имеют от 29% до 33% нуклеотидных различий между вирусами, принадлежащими к разным серотипам, но одному и тому же нуклеотипу по 2 сегменту (рис.1). Это является очевидной предпосылкой для разработки методов выявления целой группы серотипов ВБ с помощью ПЦР. Способы, основанные на ПЦР, необходимы в диагностике блютанга для экспресс-типирования новых изолятов вируса.

С 2010 г. по 2012 г. (данные сайтов http://eubtnet.org и базы данных WAHID) были зарегистрированы вспышки блютанга 1, 2, 4, 5, 8, 9, 14, 16 и 24 серотипов. Так, в Алжире, Тунисе, Франции, Италии, Португалии и Испании за этот период зарегистрировали 157 вспышек блютанга 1 серотипа; на Кипре, в Греции, Италии и Испании - 19 вспышек 4 серотипа; в Италии и Испании - 7 вспышек 8 серотипа и на Кипре и в Греции - 28 вспышек 16-го. По генотипу изоляты ВБ данных серотипов относились к европейским линиям/группам и соответствовали: 1, 4 и 8 серотип - западному топотипу и 16 серотип - восточному.

Для РФ проблема контроля блютанга обозначилась в 2006 г., когда российскими внешнеторговыми организациями и холдинговыми компаниями был начат (и продолжается в настоящее время) импорт стельных нетелей крупного рогатого скота (КРС) из различных стран ЕС, в том числе и из неблагополучных по блютангу - Германии и Голландии. Всего за период с 2006 по 2011 гг. было ввезено примерно 172 тыс. гол. животных в фермы, расположенные на всей территории европейской части РФ, на Урале и незначительное количество в Алтайский край.

С 2009 г. за рубежом для идентификации серотипа ВБ широко применяют средства, основанные на ОТ-ПЦР, что в случае вспышки заболевания позволяет быстро и в каждом конкретном случае дифференцировать серотип [2, 5, 7].

Поэтому целью данного изобретения является разработка специфической системы олигонуклеотидных праймеров для идентификации вируса блютанга генетической группы (нуклеотип A), объединяющей 4, 10, 11, 17, 20 и 24 серотипы.

Изобретение - олигонуклеотидные праймеры для выявления РНК вируса блютанга нуклеотипа A, а именно участка нуклеотидной последовательности 2 сегмента генома вируса блютанга 4, 10, 11, 17, 20 и 24 серотипов методом ОТ-ПЦР с электрофоретической детекцией продуктов амплификации. Процедура анализа включает следующие этапы: денатурация дцРНК вируса блютанга, обратная транскрипция - синтез кДНК, ПЦР, электрофоретическая детекция продуктов амплификации.

Денатурацию дцРНК осуществляют при температуре 95°C в течение 5 минут в реакционной смеси с нуклеотипспецифической парой олигонуклеотидных праймеров, фиксируют денатурированную РНК путем замораживания. Синтез кДНК осуществляют при температуре 42°C в течение 30 минут в реакционной смеси для обратной транскрипции, включающей дезоксирибонуклеотидтрифосфаты (ДНТФ), буфер для обратной транскрипции и фермент ревертазу (обратную транскриптазу). Затем реакцию терминируют при 88°C в течение 5-ти минут. Полученную кДНК используют для проведения полимеразной цепной реакции. Готовят стандартную смесь для ПЦР, включающую буфер для ПЦР, ДНТФ, пару олигонуклеотидных нуклеотипспецифических праймеров, и фермент ДНК-полимеразу. Используют следующий профиль реакции: удержание температуры - 95°C - 3 мин; циклирование: 95°C - 15 с, 58°C - 15 с, 72°C - 15 с. Цикл повторить 45 раз. Анализ результатов ПЦР проводят методом электрофореза в агарозном геле. Готовят 2% ТАЕ-гель с добавлением бромистого этидия - 0,5 мкг/мл. Электрофорез проводят при не более 8 В/см в течение 20 мин. Результаты электрофореза учитывают с помощью трансиллюминатора в ультрафиолетовом свете с длиной волны 254 нм. Амплифицированные фрагменты ДНК выявляются в виде светящихся оранжевых полос, на уровне 663 п.о. относительно маркера молекулярного веса. Для сохранения результатов реакции используются гельдокументирующие системы.

Выбор и анализ нуклеотипспецифических праймеров (табл.1) проводили при помощи пакета прикладных программ «BioEdit 7.0.8», «Oligo 6.0» на основании анализа нуклеотидных последовательностей 2-го сегмента референтных штаммов и изолятов 26 (1-26) серотипов вируса, опубликованных в GenBank.

Таблица 1
Олигонуклеотидные праймеры для выявления РНК вируса блютанга нуклеотипа А (4, 10, 11, 17, 20 и 24 серотипы)
ПЦР-мишень праймеры нуклеотидная последовательность, 5'-3' локализация, нт
RSArrrr/04 RSArrrr/10 RSArrrr/11 RSArrrr/17 RSArrrr/20 RSArrrr/24
2 сегмент прямой TATTggCATAgRCAgTgg 2264-2281 2264-2281 2264-2281 2261-2278 2264-2281 2262-2279
обратный gTAAgYgTAAgAggCCA 2910 2910 2910 2907 2909 2908

Техническим результатом изобретения является возможность определения генетической группы - нуклеотипа A вируса блютанга с помощью ОТ-ПЦР, что позволит существенно сократить материальные затраты и время проведения работ по определению серотипа вируса в образцах исследуемого биологического материала.

Сущность изобретения состоит в том, что при помощи указанных нуклеотипспецифических олигонуклеотидных праймеров проводят ОТ-ПЦР, позволяющую выявить РНК вируса блютанга нуклеотипа A (4, 10, 11, 17, 20 и 24 серотипы).

Выявление РНК вируса блютанга нуклеотипа A (4, 10, 11, 17, 20 и 24 серотипы) проводили в образцах биологического материала: кровь от инфицированных вирусом блютанга животных, культуральный материал вируса, лиофилизированный культуральный материал вируса из музея штаммов микроорганизмов ГНУ ВНИИВВиМ Россельхозакадемии, а также в образцы интактных культур клеток, кровь от интактных животных и культуральный материал гетерологичных вирусов.

Из представленных образцов с использованием реагента Тризол (Invitrogen) и согласно инструкции производителя были выделены нуклеиновые кислоты. Далее препараты нуклеиновых кислот использовали в реакции: 8 мкл образца добавляли к реакционной смеси для денатурации дцРНК. В пробирку с денатурированной РНК добавляли смесь для реакции обратной транскрипции. Препарат кДНК в количестве 10 мкл использовали для постановки собственно ПЦР (результаты представлены в таблице 2).

Проведение реакции обратной транскрипции

В подготовленные пробирки вносят по 7 мкл смеси для денатурации дцРНК, сверху наслаивают 40 мкл минерального масла. Под масло вносят 8 мкл препарата выделенных нуклеиновых кислот. Реакцию денатурации проводят при температуре 95°C в течение 5 минут. Далее необходимо поместить пробирки в условия с отрицательной температурой, для этого используют штатив с хладагентом. Готовят смесь для обратной транскрипции, для этого на одну пробу в отдельной пробирке смешивают 9,8 мкл смеси для обратной транскрипции и 0,2 мкл MMLV-ревертазы, смесь перемешивают. В пробирки с денатурированной РНК вносят по 10 мкл смеси для обратной транскрипции с ферментом. Обратную транскрипцию проводят при температуре 42°C в течение 40 минут. После окончания реакции к ДНК используют для постановки ПЦР.

Проведение ПЦР

В отдельной пробирке готовят общую реакционную смесь на необходимое количество образцов, для этого на одну пробу добавляют 13 мкл смеси для ПЦР, 2 мкл смеси праймеров и 0,2 мкл Taq-полимеразы. Смесь перемешивают, избегая образования пены, и раскапывают по 15 мкл в пробирки объемом 0,6 или 0,2 см3, на поверхность смеси вносят воск в объеме 25 мкл. В подготовленные для ПЦР пробирки на воск вносят по 10 мкл кДНК. Профиль реакции: удержание температуры 94°C - 3 мин; циклирование 40 повторов 94°C - 20 с, 58°C - 20 с, 72°C - 20 с; хранение при 4°С.

Анализ продуктов амплификации ПЦР методом электрофореза

Приготовление геля агарозы: взвешивают 2,0 г агарозы, помещают в стеклянную посуду, заливают 100 мл рабочего 1ХТАЕ - буфера и доводят до кипения в микроволновой печи для полного растворения агарозы. Охлаждают раствор агарозы до температуры примерно 60-65°C и заливают в специальную форму с гребенкой, дают гелю затвердеть. После этого гребенку осторожно вынимают и форму с агарозным гелем переносят в камеру для горизонтального электрофореза. Заливают в камеру рабочий 1XTAE-буфер так, чтобы он покрывал гель на 5-10 мм.

Проведение электрофореза: из пробирок с исследуемыми образцами после завершения ПЦР отбирают из-под масла по 12 мкл реакционной смеси и вносят в лунки агарозного геля, в последнюю лунку вносят 5 мкл маркера молекулярной массы. Электрофорез проводят при не более 8 В/см в течение 30 мин. Направление движения образцов в геле от "-" к "+". Длину амплифицированного фрагмента определяют в соответствии с маркером молекулярной массы (100-1000 пар оснований) и положительным контролем.

Результаты электрофореза учитывают на трансиллюминаторе в ультрафиолетовом свете с длиной волны 254 нм. Амплифицированные фрагменты ДНК выявляются в виде светящихся оранжевых полос. Для сохранения результатов реакции используются гельдокументирующие системы. Положительными считаются пробы, полосы в которых располагаются в геле на таком же расстоянии от старта, что и полоса положительного контроля. Размеры фрагментов, синтезируемых в ПЦР, составляют 663 п.о. Исследуемые пробы считаются отрицательными, если в дорожках не выявлено никаких полос или полосы не соответствуют по размеру фрагмента в контрольной пробе (т.е. располагаются на другом расстоянии от старта). Результаты ОТ-ПЦР с использованием нуклеотипспецифической системы олигонуклеотидов представлены в таблице 2.

Таблица 2
Результаты выявления РНК вируса блютанга нуклеотипа А (4, 10, 11, 17, 20 и 24 серотипы) методом ОТ-ПЦР
№№ проб Характеристика биоматериала Результат
1 вирус блютанга 1 серотип, RSArrrr/01 (AJ585122) референтный штамм -
2 вирус блютанга 2 серотип, RSArrrr/02 (AJ585123) референтный штамм -
3 вирус блютанга 3 серотип, RSArrrr/03 (AJ585124) референтный штамм -
4 вирус блютанга 4 серотип, RSArrrr/04 (AJ585125) референтный штамм +
5 вирус блютанга 5 серотип, RSArrrr/05 (AJ585126) референтный штамм -
6 вирус блютанга 6 серотип, RSArrrr/06 (AJ585127) референтный штамм -
7 вирус блютанга 7 серотип, RSArrrr/07 (AJ585128) референтный штамм -
8 вирус блютанга 8 серотип, RSArrrr/08 (AJ585129) референтный штамм -
9 вирус блютанга 9 серотип, RSArrrr/09 (AJ585130) референтный штамм -
10 вирус блютанга 10 серотип, RSArrrr/10 (AJ585131) референтный штамм +
11 вирус блютанга 11 серотип, RSArrrr/11 (AJ585132) референтный штамм +
12 вирус блютанга 12 серотип, RSArrrr/12 (AJ585133) референтный штамм -
13 вирус блютанга 13 серотип, RSArrrr/13 (AJ585134) референтный штамм -
14 вирус блютанга 14 серотип, RSArrrr/14 (AJ585135) референтный штамм -
15 вирус блютанга 15 серотип, RSArrrr/15 (AJ585136) референтный штамм -
16 вирус блютанга 16 серотип, RSArrrr/16 (AJ585137) референтный штамм -
17 вирус блютанга 17 серотип, RSArrrr/17 (AJ585138) референтный штамм +
18 вирус блютанга 18 серотип, RSArrrr/18 (AJ585139) референтный штамм -
19 вирус блютанга 19 серотип, RSArrrr/19 (AJ585140) референтный штамм -
20 вирус блютанга 20 серотип, RSArrrr/20 (AJ585141) референтный штамм +
21 вирус блютанга 21 серотип, RSArrrr/21 (AJ585142) референтный штамм -
22 вирус блютанга 22 серотип, RSArrrr/22 (AJ585143) референтный штамм -
23 вирус блютанга 23 серотип, RSArrrr/23 (Ат585144) референтный штамм -
24 вирус блютанга 24 серотип, RSArrrr/24 (А1585145) референтный штамм +
25 вирус блютанга 26 серотип, KUW2010/02 (НМ590642) -
27 интактная культура клеток Vero -
28 интактная культура клеток ВНК-21 -
29 кровь от интактного животного (корова) -
30 кровь от интактного животного (овца) -

Таким образом, разработана система олигонуклеотидных праймеров, позволяющая с помощью классической ОТ-ПЦР выявить РНК вируса блютанга нуклеотипа А (4, 10, 11, 17, 20 и 24 серотипы). Основными преимуществами заявляемого изобретения являются: специфичность и чувствительность способа выявления РНК вируса блютанга нуклеотипа А (4, 10, 11, 17, 20 и 24 серотипы) с помощью ОТ-ПЦР, благодаря избирательному выявлению уникальной нуклеотидной последовательности 2-го сегмента генома вируса блютанга группы серотипов; простота выполнения методики, исключающая необходимость привлечения высококвалифицированного персонала; относительная дешевизна метода, благодаря использованию ОТ-ПЦР для идентификации целой генетической группы.

Источники информации

1. Analysis and phylogenetic comparisons of full-length VP2 genes of the 24 bluetongue virus serotypes / S. Maan, N.S. Maan, A.R. Samuel, S. Rao, H. Attoui, P.P.C. Mertens // J Gen Virol. - 2007. - Vol.88. - P.621-630.

2. Bluetongue virus detection by two real-time RT-qPCRs targeting two differ-ent genomic segments / J.F. Toussaint, C. Sailleau, E. Breard, S. Zientara, K. De Clercq // J. Virol. Methods. - 2007. - Vol.140. - P.115-123.

3. Complete genome characterisation of a novel 26th bluetongue virus serotype from Kuwait / Maan S, Maan NS, Nomikou K, Veronesi E, Bachanek-Bankowska K, et http://dX.ll PLoS One. - 2011. - 6:e26147.

4. Cowley, J.A. Cross-neutralization of genetic reassortants of bluetongue virus serotypes 20 and 21 / J.A. Cowley and B.M. Gorman // Vet. Microbiol. - 1989. - Vol.19. - P.37-51.

5. Development and initial evaluation of a real-time RT-PCR assay to detect bluetongue virus genome segment 1 / A.E. Shaw, P. Monaghan, H.O. Alpar, S. Anthony, K.E. Darpel, C.A. Batten, A. Guercio, G. Alimena, M. Vitale, K. Bankowska, S. Carpenter, H. Jones, C.A.L. Oura, D.P. King, H. Elliott, P.S. Mellor, P.P.C. Mertens // Journal of Virological Methods. - 2007. - Vol.145. - P.115-126.

6. Emergence of Bluetongue Serotypes in Europe, Part 1: Description and Validation of Four Real-Time RT-PCR Assays for the Serotyping of Bluetongue Viruses BTV-1, BTV-6, BTV-8 and BTV-11 / F. Vandenbussche, I. De Leeuw, E. Vandemeulebroucke and K. De Clercq // TransboundEmerg Dis. - 2009. - Vol.56 (9-10). - P.346-54.

7. Hoffmann, B. Real-Time Quantitative Reverse Transcription-PCR Assays Specifically Detecting Bluetongue Virus Serotypes 1, 6, and 8 / B. Hoffmann, M. Eschbaumer, and M. Beer // Journal of Clinical Microbiology. - 2009. - Vol.47. - P.2992-2994.

8. Huismans, H. A comparison of an Australian bluetongue virus isolate (CSIRO 19) with other bluetongue virus serotypes by cross-hybridization and cross-immune precipitation / H. Huismans and C.W. Bremer // Onderstepoort J. Vet. Res. - 1981. - Vol.48. - P.59-67.

9. Mertens, P.P.C. Assignment of the genome segments of Bluetongue Virus Type-1 to the proteins which they encode / P. P. C. Mertens, F. Brown, D.V. Sangar // Virology. - 1984. - Vol.135. - P.207-217.

10. Mertens, P.P.C. ThedsRNA viruses / P.P.C. Mertens // Virus Res. - 2004. - Vol.101. - P.3-13.

11. Roy, P. Structure of the bluetongue virus genome and its encoded proteins / P. Roy, J.J.A. Marshall and T.J. French // Current Topics in Microbiology and Immunology: Bluetongue Viruses. - Springer-Verlag, Germany. - 1990. - Vol.162. - P.43-87.

12. Roy, P. Bluetongue virus assembly and morphogenesis / P. Roy, R. Noad // Curr Top Microbiollmmunol. - 2006. - Vol.309. - P.87-116.

13. Sequence analysis of bluetongue virus serotype 8 from the Netherlands 2006 and comparison to other European strains / S. Maan, N.S. Maan, N. Ross-smith, C.A. Batten, A.E. Shaw, S.J. Anthony, A.R. Samuel, K.E. Darpel, E. Veronesi, C. A. L. Oura, K.P. Singh, K. Nomikou, A.C. Potgieter, H. Attoui, E. van Rooij, P. van Rijn, K.D. Clercq, F. Vandenbussche, S. Zientara, E. Bre'ard, C. Sailleau, M. Beer, B. Hoffman, P.S. Mellor and P. P. C. Mertens // Virology. - 2008. - Vol.377. - P.308-18.

Синтетические олигонуклеотидные праймеры, комплементарные участкам вариабельного 2-го сегмента генома вируса блютанга серотипов, входящих в состав нуклеотипа А (4, 10, 11, 17, 20 и 24 серотипы) для идентификации вируса блютанга нуклеотипа А, используемые для выявления РНК вируса блютанга нуклеотипа А, имеющие следующий нуклеотидный состав (5′-3′):

Прямой TATTGGCATAGRCAGTGG
Обратный GTAAGYGTAAGAGGCCA



 

Похожие патенты:

Изобретение относится к биотехнологии и представляет собой способ прогнозирования эффективности лечения пациентов с неходжкинскими злокачественными лимфомами высокой степени злокачественности.

Изобретение относится к биотехнологии и представляет собой способ и устройство для электрохимической идентификации целевых последовательностей нуклеотидов. Способ включает получение биологического образца, который может содержать целевую последовательность нуклеотидов.

Группа изобретений относится к области молекулярно-диагностических исследований. Устройство для комплексного качественного или количественного анализа нуклеиновых кислот в реальном времени используют в способе определения целевой нуклеиновой кислоты.

Изобретение относится к биотехнологии и молекулярной биологии. Предложен олигонуклеотидный зонд MS8 Flip-R для флуоресцентной детекции возбудителя гистоплазмоза Histoplasma capsulatum методом полимеразной цепной реакции с олигонуклеотидными праймерами HcMs8s, HcMs8as3, имеющий следующую структуру: MS8 Flip-R 5'(ROX)-GGCCTGACCAGTATAACCAAGGCC-(BHQ2) 3', где ROX - флуоресцентный краситель карбокси-Х-родамин, BHQ2 - гаситель флуоресценции "Black Hole 2".

Изобретение относится к области медицины и касается способа диагностики гриппа С. Представленный способ включает выявление РНК вируса в мазках из носоглотки человека и животных путем проведения этапов обратной транскрипции и амплификации в одной пробирке методом полимеразной цепной реакции в режиме реального времени со специфичными зондом (5'-TGCTCCTGAAACCAGGACAG-3') и праймерами (5'-GAAATATTGATTGCTGAGACAGA-3', 5'-CCCTCCTGTTATTGCTGAAATTA-3').
Изобретение относится к области генетики безжировой массы тела и ожирения у животных и человека. Изобретение представляет собой комбинацию полинуклеотидов или экспрессируемых из них белков, которые дифференциально экспрессируются в животных, демонстрирующих безжировой фенотип, являющийся результатом одной или нескольких стимулирующих безжировой фенотип обработок, содержащих введение CLA, потребление диеты с высоким содержанием белка и увеличение физических упражнений.

Изобретение относится к области медицины, а именно к гинекологии и молекулярной биологии, и может быть использовано для оценки риска развития рака шейки матки при цервикальной интраэпителиальной неоплазии и носительстве вируса папилломы человека (ВПЧ) у женщин репродуктивного возраста.

Изобретение относится к области молекулярной биологии, генной инженерии и медицины. Способ оценки цитолитической активности единичных эффекторных клеток, при этом определяя профиль секретированного продукта, используя матрицы микролунок, включает мониторинг лизиса инфицированных клеток-мишеней с помощью эффекторных клеток в микролунках, где микролунки содержат в среднем одну эффекторную клетку и по меньшей мере одну инфицированную клетку-мишень на микролунку; где мониторинг включает стадию детекции лизиса указанных инфицированных клеток-мишеней с помощью эффекторных клеток, используя флуоресцентный индикатор, при этом определяя профиль одного или более секретированных продуктов.
Изобретение относится к биотехнологии и микробиологии и представляет собой способ идентификации кластера генов, кодирующих стафилококковые белки, являющиеся экзотоксинами.

Представленные решения касаются способа генерирования заквасочной культуры, заквасочной культуры и способа ферментации с использованием такой заквасочной культуры.

Группа изобретений относится к области медицины и молекулярной биологии. Способ предусматривает измерение экспрессии следующих кислородчувствительных генов: Pdk4, Nid2, Golph2, Actr1a, Api5, Mrp13, Scn7a, Асох3, Lamr1, Sv2b, Stmn2, Тrрс3, Crebzf, Herс1, Ssc1, Snrpb, Zfhx1b, sc125b, Rn. 48050, Rn. 42485, MPP3, AI 101224, Abca1, Appbp1, Rn. 96234, Nptxr, Rn. 16755, Vamp2, Ghr, Calm1, Cyp51, и ID1, и по определенному различию в уровне экспрессии данных генов у животных, подвергнутых и не подвергнутых воздействию окислительного стресса, делают вывод о наличии окислительного стресса у млекопитающего. Способ позволяет диагностировать состояние окислительного стресса у организма как во время, так и после воздействия окислительного стресса. 2 н. и 4 з.п. ф-лы, 2 ил., 2 табл., 2 пр.

Изобретение относится к области радиобиологии и экспериментальной медицины. Способ оценки фармакологических и токсикологических свойств веществ заключается в том, что исследуемое вещество вносят в питательную среду личинок и мух Drosophila melanogaster, сочетающих в своем геноме гипоморфные мутации ss- и СG5017-генов. Облучают личинок и мух ионизирующими лучами дозой в 1-10 рентген. Оценивают жизнеспособность, структуры конечностей и уровень транскрипции генов CG 1681, CYP6G1 и ss. Сравнивают полученные характеристики мух, выращенных на среде, содержащей исследуемое вещество, и мух, выращенных на среде, не содержащей исследуемое вещество, облученных и необлученных, и определяют фармакологические свойства вещества по результатам сравнения жизнеспособности, количества тарзальных сегментов конечности и уровня транскрипции генов CG 1681, CYP6G1 и ss у мух всех сформированных групп. Способ позволяет осуществить эффективный быстрый направленный отбор и определить свойства веществ с токсикопротекторными, радиопротекторными, токсикосенсибилизирующими и радиосенсибилизирующими свойствами. 7 ил., 2 табл., 2 пр.

Изобретение относится к области молекулярной генетики, геносистематики и фармакогнозии и предназначено для выявления видовой принадлежности аралии высокой (Aralia elata (Miq.) Seem.). Предложен набор синтетических олигонуклеотидов для ПЦР с фрагментом ITS2 ядерной ДНК, включающий прямой и обратный праймеры и разрушаемый зонд. Набор обладает высокой чувствительностью и специфичностью и позволяет быстро и достоверно провести идентификацию лекарственного растения. 1 ил., 1 пр.

Изобретение относится к области молекулярной генетики, геносистематики и фармакогнозии и предназначено для выявления видовой принадлежности сушеницы болотной (Filaginella uliginosa (L.) Opiz). Предложен набор синтетических олигонуклеотидов для ПЦР с фрагментом ITS2 ядерной ДНК, включающий прямой и обратный праймеры и разрушаемый зонд. Набор обладает высокой чувствительностью и специфичностью и позволяет быстро и достоверно провести идентификацию лекарственного растения. 1 ил., 1 пр.

Изобретение относится к области молекулярной генетики, геносистематики и фармакогнозии и предназначено для выявления видовой принадлежности свободноягодника колючего, элеутерококка (Eleutherococcus senticocus (Rupr. et Maxim.) Maxim.). Предложен набор синтетических олигонуклеотидов для ПЦР с фрагментом ITS2 ядерной ДНК, включающий прямой и обратный праймеры и разрушаемый зонд. Набор обладает высокой чувствительностью и специфичностью и позволяет быстро и достоверно провести идентификацию лекарственного растения. 1 ил., 1 пр.

Изобретение относится к медицине и биологии и предназначено для использования при проведении ПЦР-исследований. Устройство для полимеразной цепной реакции содержит, по крайней мере, четыре части, каждая из которых имеет две плоские, параллельные поверхности, перпендикулярные общей оси, и отверстия. Относительно общей оси части имеют возможность поворачиваться относительно друг друга. Первая часть имеет, по крайней мере, шесть сквозных отверстий, соединяющих две ее плоские поверхности, из которых, по крайней мере, четыре отверстия снабжены гидрофильными фильтрами, установленными с возможностью контакта с плоской поверхностью второй части. Вторая часть выполнена с, по крайней мере, двумя сквозными отверстиями, соединяющими две ее плоские поверхности, из которых, по крайней мере, одно отверстие содержит сорбент, зафиксированный гидрофильными фильтрами, контактирующими с плоскими поверхностями первой и третьей частей. Третья часть имеет, по крайней мере, два сквозных отверстия, соединяющих две ее плоские поверхности, из которых, по крайней мере, одно отверстие содержит гидрофильный фильтр, размещенный с возможностью контакта с плоскими поверхностями второй и четвертой частей, и, по крайней мере, три несквозных отверстия, каждое из которых содержит гидрофильные фильтры, размещенные с возможностью контакта с плоской поверхностью второй части. Четвертая часть выполнена с, по крайней мере, одним несквозным, оптически прозрачным отверстием, содержащим гидрофильный фильтр, размещенный с возможностью контакта с плоской поверхностью третьей части, не контактирующий с дном отверстия его содержащим. Изобретение обеспечивает расширение технологических возможностей - проведение в одном устройстве этапов выделения (очистки) нуклеиновых кислот и последующей ПЦР с детекцией результатов реакции при одновременном упрощении устройства. 7 з.п. ф-лы, 5 ил.

Группа изобретений относится к области биотехнологии и направлена на молекулы нуклеиновых кислот, которые кодируют белок, проявляющий свойства биосенсора для детекции пероксида водорода в живых клетках, обладающий флуоресценцией в красной области спектра. Молекулы нуклеиновых кислот получены методами генной инженерии. Белок для детекции пероксида водорода имеет аминокислотную последовательность, показанную в SEQ ID NO:2. Также обеспечиваются клетка-хозяин и кассета экспрессии, содержащие указанные молекулы нуклеиновых кислот. Использование изобретений позволяет осуществлять микроскопию в толстых слоях тканей, а также обеспечивает возможность совместной микроскопии нескольких флуоресцентных конструкций. 4 н.п. ф-лы, 7 ил.
Изобретение относится к области биохимии, в частности к набору синтетических олигонуклеотидов для выявления ДНК пародонтопатогенного микроорганизма Tannerella forsythensis методом полимеразной цепной реакции. Указанный набор включает специфичные к фрагменту гена bspA микроорганизма Tannerella forsythensis праймеры 5′-TGGCACCCTCCGATGCCGAC-3′ и 5′-GCGCAGACCGTTGGGTTTCA-3′, а также зонд (BHQ1)-5′-CCGCGCCCGA(FdT)GCGTCGCTGGC-3′-Р, где BHQ1 означает присоединенный к 5'-концевому нуклеотиду темновой гаситель флуоресценции, a FdT - флуоресцентный краситель FAM, присоединенный к нуклеотиду Т. Предлагаемое изобретение позволяет достоверно обнаруживать присутствие в биологическом материале микроорганизма Tannerella forsythensis.

Изобретение относится к области молекулярной биологии и биотехнологии и касается сухой смеси для амплификации нуклеиновой кислоты и способа ее получения. Охарактеризованная смесь содержит термостабильную ДНК-полимеразу, обратную транскриптазу, первый стабилизатор, выбранный из группы, включающей моносахариды, дисахариды, полиспирты и второй стабилизатор, выбранный из группы, включающей полисахариды, альбумины, поливинилпирролидон. При осуществлении способа получения сухой смеси готовят водный раствор, содержащий указанные выше вещества, и лиофилизируют его. Полученный продукт может храниться до 1 года при температуре выше 0°С с сохранением активностей обратной транскриптазы и ДНК-полимеразы. Представленные изобретения могут быть использованы для амплификации как одновременно ДНК и РНК, так и по отдельности. 2 н. и 24 з.п. ф-лы, 13 ил., 7 табл., 4 пр.

Группа изобретений относится к области биохимии. Заявлены варианты способа скрининга и мониторинга онкологических заболеваний, включающего забор образца ткани, выделение из образца ткани РНК, синтез кДНК, амплификацию методом множественной обратной транскрипции полимеразой цепной реакции с последующим анализом амплифицированных продуктов. При этом ПЦР проводят с использованием композиции праймеров с последовательностями SEQ ID NO: 1-24 и 26-29, специфических к мРНК генов MAGEA1-6, GAGE1-8, NY-ESO-1, SSX1, 2, 4, XAGE1, TRAG3 и MAGEC1. Анализ амплифицированных продуктов проводят в том числе с использованием зондов, представленных последовательностями SEQ ID NO: 30-35 и 37. Также заявлены варианты набора для осуществления скрининга и мониторинга онкологических заболеваний. Набор включает праймеры с последовательностями SEQ ID NO: 1-24 и 26-29, а также может дополнительно включать зонды с последовательностями SEQ ID NO: 30-35 и 37. Изобретение позволяет повысить точность диагностики онкологических заболеваний различных органов. 4 н. и 3 з.п. ф-лы, 3 ил., 2 табл.
Наверх