Способ проведения иммунохроматографического анализа с диссоциирующей флуоресцентной меткой



Способ проведения иммунохроматографического анализа с диссоциирующей флуоресцентной меткой

 


Владельцы патента RU 2535061:

Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт биохимии имени А.Н. Баха РАН Российской академии наук (ИНБИ РАН) (RU)

Изобретение относится к медицине и касается способа проведения иммунохроматографического анализа с диссоциирующей флуоресцентной меткой, в котором на мембранной тест-полоске формируют комплексы, в состав которых входят молекулы антигена или антигенов, специфичные к ним антитела и молекулы метки. При этом после проведения анализа метка экстрагируется из рабочей мембраны тест-полоски и флуоресцентный сигнал измеряется в объеме жидкости. Способ по изобретению обеспечивает оптимальные условия для флуоресценции метки, а так же устранение мешающего влияния мембраны, которая, будучи непрозрачной, уменьшает интенсивность как возбуждающего, так и испускаемого света. 1 ил., 1 пр.

 

Изобретение относится к иммунологии и биотехнологии и представляет собой способ иммунохроматографического анализа с диссоциирующей флуоресцентной меткой.

Иммунохроматографический способ оценки содержания различных соединений широко используется в практике медицинской диагностики [Raphael С. Wong l Harley Y. Tse (Editors) (2009) Lateral Flow Immunoassay. Springer, USA].

Иммунохроматографический анализ может быть реализован в нескольких вариантах. Рассмотрим в общем виде схему «сэндвич»-формата иммунохроматографии как одного из наиболее часто используемых. Проба, потенциально содержащая определяемое соединение, под действием капиллярных сил перемещается вдоль тест-полоски. При этом она вначале взаимодействует с меченым компонентом (чаще всего антителами против определяемого соединения), затем фронт жидкости преодолевает участок (аналитическую зону) с иммобилизованным компонентом, связывающим определяемое соединение. Степень связывания метки в аналитической зоне и, соответственно, интенсивность окрашивания мембраны определяются концентрацией аналита в пробе. Основными преимуществами иммунохроматографического анализа являются быстрота получения результата (5-15 мин) и возможность бесприборной детекции. В качестве метки в подавляющем большинстве случаев используются частицы коллоидного золота. [Babacar Ngom & Yancheng Guo & Xiliang Wang & Dingren Bi. (2010) Development and application of lateral flow test strip technology for detection of infectious agents and chemical contaminants: a review // Anal Bioanal Chem 397:1113-1135]. Однако если требуется повысить чувствительность анализа, используются другие маркеры, например флуоресцентные красители [Yoo, Jisun, Jung, Young Мее, Hahn, Jong Hoon, Pyo, Dongjin (2010) 'QUANTITATIVE ANALYSIS OF A PROSTATE-SPECIFIC ANTIGEN IN SERUM USING FLUORESCENCE IMMUNOCHROMATOGRAPHY', Journal of Immunoassay and Immunochemistry, 31:4, 259-265]. Хотя в таком случае для регистрации сигнала требуется дополнительное оборудование, данный подход позволяет сочетать быстроту получения результата (благодаря использованию принципа иммунохроматографии) и высокочувствительную детекцию (благодаря низкому пределу обнаружения флуоресцентного красителя).

По сравнению с органическими флуоресцентными красителями флуоресцентные лантанидные (Eu3+, Sm3+, Tb3+, Dy3+, …) комплексы обладают такими преимуществами, как длительное время жизни флуоресценции (до 1000 микросекунд), большой стоксовский сдвиг (>250 нм), узкий профиль эмиссии, что позволяет применять их в методе микросекундной спектроскопии с временным разрешением [Yuan J., Wang G. (2005) Lanthanide complex-based fluorescence label for time-resolved fluorescence bioassay. J. Fluorescence, 15, 559-568].

Флуоресцентные метки на основе лантанидных комплексов успешно используют в высокочувствителых разрешенных во времени флуоресцентных иммунологических методах. Благодаря тому, что технология регистрации сигнала с временным разрешением позволяет легко отделить специфический долгоживущий флуоресцентный сигнал метки от короткоживущих фоновых шумов в биопробах и избавиться от эффектов светорассеяния (рассеяния Тиндалля, Релея и Рамана), предел детекции метода значительно повышается [Yuan J., Wang G. (2005) Lanthanide complex-based fluorescence label for time-resolved fluorescence bioassay. J. Fluorescence, 15, 559-568.], [Hemmila I. (1985) Fluoroimmunoassays and immunofluorometric assays. Clin. Chem., 31, 359-370].

Формирование комплексов с некоторыми органическими лигандами значительно усиливает флуоресценцию ионов лантаноидов. После поглощения света лигандом происходит эффективный перенос энергии с возбужденного синглетного энергетического уровня через триплетный уровень на резонансный энергетический уровень металла [Ferrari М., Ozkan М. and Heller М.J. (2007) BioMEMS and Biomedical Nanotechnology. Volume II: Micro/Nano Technologies for Genomics and Proteomics. - Springer US].

Для диссоциативного метода анализа используют первичные комплексы полиаминополикарбоксилатных хелаторов с лантанидами, которые демонстрируют высокую стабильность и растворимость в воде. Большая часть комплексонов образует лантанидные хелаты с константами связывания порядка 1015 M-1. Для конъюгирования метки с антителами в структуре комплексона присутствует соответствующая химическая группа, такая как, например, диазофенил-ЭДТА или аминофенил-ЭДТА. Эти комплексоны хорошо подходят для диссоциативного анализа с последующим усилением флуоресценции посредством добавления β-дикетонатов. На этом принципе построена система анализа DELFIA (Dissociative-Enhansed Lanthanide Fluorescence Immunoassay). В этой системе европий диссоциирует из комплексона (ИТЦ-ДТТА-Eu) в кислой среде, а затем измеряется флуоресценция хелата Eu с β-дикетон-три-н-октилфосфином в мицеллярном водном растворе [Yuan J., Wang G. (2005) Lanthanide complex-based fluorescence label for time-resolved fluorescence bioassay. J. Fluorescence, 15, 559-68].

Для регистрации флуоресценции лантанидных комплексов используют метод флуориметрии с временным разрешением. После краткосрочного облучения образца люминесценция всех молекул и кюветы (планшета) начинает экспоненциально расти. Короткоживущая фоновая флуоресценция быстро убывает и не мешает измерению флуоресценции метки. Это позволяет измерять исключительно долгоживущую флуоресценцию лантанидной метки. Обычно проводят множество циклов измерений для одного образца (в течение 1 с), что улучшает соотношение сигнал/шум при подсчетах [Hemmila I. (1985) Fluoroimmunoassays and immunofluorometric assays. Clin. Chem., 31, 359-70].

Несмотря на отмеченные выше достоинства диссоциирующих лантанидных меток, ранее данный подход не применялся для усиления сигнала в иммунохроматографических системах.

Если детекция сигнала метки производится не с поверхности мембраны, а из раствора, то в объеме раствора можно создать оптимальные условия для флуоресценции метки, а так же устранить экранирование светового сигнала мембраной тест-полоски. Для этого заявителями предлагается после проведения иммунохроматографического анализа экстрагировать связанные в аналитической зоне молекулы метки и проводить приборную регистрацию активности флуоресцентной метки в объеме экстрагирующего раствора.

Достоинства, сформулированные выше, подтверждены экспериментально и демонстрируются приведенным ниже примером.

Пример:

Определение концентрации моноклональных антител HTM81 против рекомбинантного антигена 38 кДа Mycobacterium tuberculosis.

1. Получение конъюгата антител с ИТЦ-ДТТА-Eu

Для конъюгации использовали набор «DELFIA® Eu-Labelling kit 1244-302» производства компании PerkinElmer™ (Wallac Oy, Финляндия), содержащий:

1) «Eu-labelling reagent» - 0,2 мг (300 нм) N1-(п-изотиоцианатобензил)-диэтилентриамин-N1,N2,N3,N4-тетраацетат Eu3+(ИТЦ-ДТТА-Eu), лиофилизированный.

2) Усиливающий раствор «DELFIA® Enhancement Solution)) - Тритон-X100, уксусная кислота и хелаторы.

2 мг моноклональных антител (мАт) ТВ38 с1.81 в 1 мл 0.1 М карбонатного буфера, pH 8.5 (антитела переводили в буфер диализом в течение 35 мин) перемешивали с 0.2 мл 7.5 мМ водного раствора «Eu-labelling reagent» (ИТЦ-ДТТА-Eu, 500-кратный избыток). Смесь оставляли на ночь при +4°C. Очистку конъюгата мАт-ИТЦ-ДТТА-Eu проводили методом гель-фильтрации с использованием колонки 1.5×28 см с носителем Sephadex G-50, уравновешенной 50 мМ трис-HCl с 0.15 М NaCl и 0.05% NaN3, pH 7.75.

Оптическую плотность полученных фракций измеряли на спектрофотометре Shimadzu 1202 при длине волны 280 нм. Для определения количества включившейся метки аликвоты антител разводили в усиливающем растворе в соотношении 1:10000 до конечного объема 200 мкл в лунках микропланшета, инкубировали 2 мин, а затем регистрировали флуоресценцию на планшетном ридере EnSpire 2300 производства компании PerkinElmer™.

2. Определение количества антител, меченных ИТЦ-ДТТА-Eu, с использованием усиления флуоресценции

В методе использовали хелат Eu3+ с N1(п-изоцианатбензил)диэтилен триамин-N1,N2,N3,N3-тетрауксусной кислоты (ИТЦ-ДТТА-Eu) в качестве метящего реагента. К препарату меченых антитела или конъюгата антител с КЗ добавляли растор β-дикетона (2-нафтилтрифлуороацетон β-NTA) и слабокислый усиливающий флуоресценцию раствор (pH 3,2), содержащий триоктилфосфиноксид (ТОРО) и Тритон Х-100. Ион Eu3+ из меченого агента переходил в раствор и связывался с лигандом. При этом раствор превращался в сильно флуоресцирующий мицеллярный раствор, содержащий Eu(β-ИТА)3(ТОРО)2 хелат, флуоресценцию которого измеряли методом флуорометрии с временным разрешением на приборе Wallac 1234 Fluorimetr (Perkin Elmer, Финляндия) [Ferrari M., Ozkan M., Heller M.J. (2007) BioMEMS and Biomedical Nanotechnology. Volume II: Micro/Nano Technologies for Genomics and Proteomics. - Springer US]. Параметры регистрации флуоресценции Eu3+: время задержки 0.1 мс, частота вспышки 1 мс, время считывания сигнала 0.4 мс, возбуждение на 340 нм и регистрация флуоресценции на 615 нм.

Построение калибровочного графика для определения количества связавшейся метки на молекулу антитела. Меченые антитела (объемом 2-20 мкл, концентрация 1-100 мкг/мл) разводили в усиливающем растворе до конечного объема 200 мкл в лунках разборного прозрачного микропланшета из набора «DELFIA® Eu-Labelling kit 1244-302», инкубировали 10 мин при комнатной температуре, затем измеряли флуоресценцию. Содержание антител во фракциях и количество включившейся метки в полученных препаратах меченых антител рассчитывали по следующим формулам:

C ( E u 3 + ) = E 613 A 1000 B ( м к М ) ,

где A=10000 - фактор разведения;

B=1000000 - сигнал стандартного препарата 1 нМ Eu3+;

C 1 ( м А т ) = A 280 0,008 C ( E u 3 + ) 1,34 ( м г / м л ) ;

C 2 ( м А т ) = C 1 ( м А т ) 1000000 160000 ( м к М ) ;

где 1,34 - поглощение 1 мг/мл антител при 280 нм, 160000 - молекулярная масса IgG, 0,008 - поглощение 1 мкМ хелатного комплекса европия при 280 нм.

Соотношение количества связавшейся метки к количеству антител составило 0,57.

3. Построение калибровочного графика для определения концентрации меченых антител, иммобилизованных на иммунохроматографической мембране, по флуоресценции Eu3+

Антитела наносили на рабочую мембрану CNPC-SN12 L2-P25 (размер пор 15 мкм) «mdi Easypack» фирмы «Advanced Microdevices» (Индия). Затем отрезали участок рабочей мембраны с иммобилизованными антителами и помещали в эппендорф, заполняли эппендорф 100 мкл усиливающего раствора «DELFIA® Enhancement Solution», инкубировали 2 мин, отбирали аликвоты 50 мкл и регистрировали флуоресценцию на планшетном ридере EnSpire 2300 производства компании PerkinElmer™.

Калибровочная кривая определения антител представлена на чертеже.

Предел детекции согласно существующим рекомендациям [Бурдун Г.Д., Марков Б.Н. (1975) Основы метрологии, 2-е изд., М.], [Чарыков А.К. (1984) Математическая обработка результатов химического анализа, Л.] определяли как концентрацию, дающую значение сигнала, равное фоновому сигналу (640 единиц) плюс 3 стандартных отклонения фонового сигнала (3·197 единиц). Предел детекции антител составил 0,9 нг/мл, что соответствует пределу детекции метки 3,1·10-12 М с учетом отношения количества связавшейся метки к количеству антител.

4. Определение предела детекции коллоидного золота, как метки в иммунохроматографическом анализе (для сравнения пределов детекции двух меток)

На иммунохроматографическую мембрану CNPC-SN12 L2-P25 наносили растворы, представляющие собой ряд разведений частиц коллоидного золота размером 25 нм. Затем сканировали изображение тест-полоски и оцифровывали, количественно оценивая интенсивность окраски коллоидного золота на мембране с помощью программы «Nonlinear Dynamics TotalLab TL120 v2009». Как и в случае с флуоресцентной меткой, предел детекции определяли как концентрацию метки, дающую интенсивность окрашивания, на три стандартных отклонения превышающую фоновый сигнал. Предел детекции коллоидного золота составил 1,3·10-10 М, что (при соотношении 1 антитело на 1 частицу коллоидного золота) соответствует пределу детекции антител, равному 20 нг/мл.

Таким образом, предел детекции антител при использовании диссоциирующей флуоресцентной метки более чем в 20 раз ниже, чем при использовании традиционной метки - коллоидного золота (0,9 нг/мл и 20 нг/мл соответственно).

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ

Чертеж. Калибровочный график для определения концентрации меченых антител, иммобилизованных на иммунохроматографической мембране, по флуоресценции Eu3+.

Способ проведения иммунохроматографического анализа с диссоциирующей флуоресцентной меткой, в котором на мембранной тест-полоске формируют комплексы, в состав которых входят молекулы антигена или антигенов, специфичные к ним антитела, и молекулы метки, отличающийся тем, что после проведения анализа метка экстрагируется из рабочей мембраны тест-полоски и флуоресцентный сигнал измеряется в объеме жидкости.



 

Похожие патенты:
Изобретение относится к медицине и касается способа количественного определения D-антигена полиовирусов 1-3 типов иммуноферментным анализом (ИФА). В качестве иммуносорбента используют поливалентный (к трем типам полиовируса) аффинно очищенный иммуноглобулин класса Y (IgY), полученный из яичных желтков куриц, иммунизированных полиовирусами, а в качестве детекторных антител - аффинно очищенный препарат IgG кролика против каждого из трех полиовирусов.

Изобретение относится к области медицины, в частности к лабораторной диагностике, и может быть использовано для оценки угрозы формирования гипоксии у беременных с обострением цитомегаловирусной инфекции в третьем триместре гестации.

Изобретение относится к области медицины, в частности к неврологии, и может быть использовано для прогноза течения ишемического инсульта у больных сахарным диабетом.
Изобретение относится к медицине, а именно к патологической анатомии, и позволяет проводить морфологическую дифференциальную диагностику трофобластической, эндометриальной и смешанной формы первичной плацентарной недостаточности при самопроизвольном прерывании беременности в первом триместре.

Изобретение относится к области медицины, в частности к нейрохирургии, и касается способа диагностики опухоли мозга у пациентов. Сущность способа: в забранной крови определяют процентное количество CD25-лимфоцитов.
Изобретение относится к медицине, а именно к оториноларингологии и иммунологии, и может быть использовано для патогенетического лечения хронического тонзиллита и/или гипертрофии небных миндалин у детей дошкольного возраста с лимфопролиферативным синдромом.
Изобретение относится к области медицины, а именно к способу качественной дифференциальной диагностики доброкачественных и злокачественных новообразований слизистой оболочки дна полости рта.

Изобретение относится к области медицины, а именно к способу выделения ДНК Mycoplasma hominis (М. hominis) для дальнейшего применения в диагностическом алгоритме.
Изобретение относится к области медицины и представляет собой способ прогнозирования риска развития врожденных инфекций путем определения количества специфических антител классов Ig М и Ig G в биологическом материале, отличающееся тем, что в качестве биологического материала используют мазок со слизистой оболочки цервикального канала при первичном обследовании в сроке до 12-й недели гестации, одновременно в мазках определяют количество антител Ig М и Ig G к вирусу краснухи, цитомегаловирусу, парвовирусу B19V, токсоплазмам, вирусу простого герпеса 1 и 2 типов и величины авидности специфических Ig G к этим возбудителям, дополнительно в том же мазке определяют уровень секреторного неспецифического Ig A методом РИФ к антигенам цитомегаловируса, хламидий, микоплазм, и генетического материала этих микроорганизмов методом ПЦР и в зависимости от полученных результатов прогнозируют группы высокого, умеренного или низкого риска развития врожденных инфекций.

Изобретение относится к медицине. Способ включает последовательность этапов количественного определения содержания фактора дифференцировки клеток HLDF у пациента, страдающего заболеванием сердечно-сосудистой системы.
Изобретение относится к области медицины и может быть использовано для оценки угрозы формирования гипоксии в третьем триместре гестации. Способ включает: определение в периферической крови титра антител к цитомегаловирусу, уровня рН крови и содержания оксигемоглобина на биохимическом анализаторе, и при нарастании титра антител к цитомегаловирусу до 1:1600, уменьшении рН крови до 7,25±0,03, а оксигемоглобина до 90,15±0,35% при контроле 95,20% оценивают угрозу формирования гемической гипоксии.

Изобретение относится к области медицины и предназначено для прогнозирования эффекта терапии инфликсимабом у детей с болезнью Крона. Проводят определение сывороточной концентрации фактора некроза опухоли альфа (TNF-α), оценку относительного содержания Th17-лимфоцитов (%CD3+CD4+CD161+ от CD3+CD4+) и активности сукцинатдегидрогеназы в популяции регуляторных Т-клеток (CD3+CD4+CD127low) (SDH-Treg) до и на следующие сутки после введения инфликсимаба.

Изобретение относится к аналитической химии, в частности к аспектам, относящимся к способам неферментативного определения присутствия или количества углеводов в образце, и описывает способ, устройство и набор для анализа образца для определения присутствия или количества анализируемого вещества, в частности углеводорода, более конкретно сахара, в образце при использовании ткани.

Изобретение относится к медицине, а именно к способу определения выраженности воспалительного процесса при остеоартрозе. Сущность способа состоит в том, что проводят люминолзависимую железоиндуцированную хемилюминесценцию модельной системы, которая имеет следующий состав: 2,72 г KH2PO4, 7,82 г KCl, 1,5 г цитрата натрия C6H8O7Na3*5,5H2O на 1 литр дистиллированной воды, pH 7,45 с 0,2 мл 10-5 М раствора люминола, затем в присутствии синовиальной жидкости определяют интенсивность свечения модельной системы до и после добавления синовиальной жидкости.

Изобретение относится к способу обнаружения аналита в пробе жидкости тела путем использования диагностического тестового элемента. Диагностический тестовый элемент (110) для обнаружения аналита в пробе (126) жидкости тела, в частности цельной крови объемом менее 2 микролитров, содержит по меньшей мере одно тестовое поле (116) с по меньшей мере одним реагентом-индикатором, где реагент-индикатор способен при наличии аналита испытывать по меньшей мере одно обнаруживаемое изменение, в частности оптическое изменение.

Изобретение относится к иммунологии и медицинской диагностике и представляет собой способ проведения иммунохроматографического анализа для серодиагностики. Предложенное изобретение предназначено для иммунохроматографического определения в жидких пробах антител к возбудителям инфекционных заболеваний или другим антигенам, например, таким как аллергены.
Изобретение относится к медицине и представляет собой способ ускоренной окраски гистологических препаратов для выявления микобактерий туберкулеза, включающий приготовление гистологических препаратов по общепринятой методике, окрашивание их по Циль-Нильсону, отличающийся тем, что после стандартной подготовки препаратов к окраске срезы проходят процедуру депарафинизации путем последовательного помещения их в ксилол и спирты нисходящей концентрации по 5 минут в термостат при температуре 54°C с последующим помещением их в воду, затем в 1% раствор йодной кислоты на 2 минуты и промыванием в проточной воде в течение 10 секунд, после чего на срез, покрытый фильтровальной бумагой, наливают карбол-фуксин Циля и подогревают над пламенем спиртовки до появления паров в течение 2 минут, оставляют краску на срезе после прекращения подогревания на 3-5 минут, убирают фильтровальную бумагу и ополаскивают срезы в воде, дифференцируют их 1% кислотным буфером, ополаскивают в водопроводной воде в течение 1 минуты, после чего на срез помещают раствор метиленового синего по Лефлеру и подогревают над пламенем спиртовки до появления паров, промывают в воде, дифференцируют в 1% кислотном буфере и хорошо промывают водой, обезвоживают в спиртах восходящей крепости в течение 1 минуты, помещают в ксилол и заключают в бальзам.
Изобретение относится к области медицины и предназначено для прогнозирования гнойных послеоперационных осложнений у больных раком толстой кишки (колоректальный рак) путем динамического исследования крови.

Изобретение относится к медицине, а именно к онкологии, и может быть использовано для прогнозирования течения заболевания у больных раком яичников. Сущность способа: в опухолевой ткани яичников определяют долю клеток в S фазе клеточного цикла, при значении этого показателя менее 15,9% прогнозируют благоприятный исход, а при значении этого показателя более 15,9% прогнозируют неблагоприятный исход.

Изобретение относится к медицине, а именно к терапии, кардиологии и сердечно-сосудистой хирургии, и может быть использовано для диагностики тромбоэмболии легочных артерий (ТЭЛА).

Изобретение относится к медицинской диагностике в области гематологии и может быть использовано для одновременного определения всех производных гемоглобина в крови. Сущность способа: фотометрирование цельной крови осуществляют в видимом и ближнем ИК-диапазоне длин волн, измеряют спектральные коэффициенты пропускания кюветы с цельной кровью, а количественные значения концентрации основных производных гемоглобина, которые определяют путем минимизации невязки Изобретение может быть использовано для контроля газового состава крови в реанимации, токсикологии, при интенсивной терапии, для определения влияния на гемоглобинный состав физиологических, патологических и экологических факторов, а также в родильных домах, акушерских и педиатрических стационарах для контроля гематологических показателей новорожденных и мониторинга гипербилирубинемии. Изобретение обеспечивает повышение информативности анализа крови. 5 ил., 2 табл.
Наверх