Способ и набор для иммуноферментного определения функциональной активности компонента с3 комплемента человека по способности связываться с пептидогликаном

Группа изобретений относится к медицинской иммунологии, а именно к способам определения функциональной активности компонентов комплемента в сыворотке крови человека при диагностике ряда заболеваний и в биологических препаратах. Сущность изобретения состоит в том, что в лунках микропанели сорбируют препарат пептидогликана, затем вносят пробу, содержащую компонент C3 комплемента человека с неизвестной активностью, проводят инкубацию в присутствии ЭДТА, а затем вносят конъюгат фермента с антителами против компонента C3 человека и субстрат этого фермента, расчет активности компонента C3 проводят по количеству образовавшегося продукта ферментативной реакции. Набор для определения функциональной активности компонента C3 комплемента человека содержит плоскодонную микропанель с сорбированным препаратом пептидогликана, конъюгат фермента с антителами к компоненту C3 комплемента человека, субстратный буфер и донорскую сыворотку крови с известной активностью C3 в качестве стандарта. Группа изобретений позволяет определять функциональную активность компонента C3 системы комплемента человека и обладает хорошей воспроизводимостью результатов. 2 н. и 1 з.п. ф-лы, 1 ил.

 

Изобретение относится к медицинской иммунологии, а именно к способам определения функциональной активности компонентов комплемента в сыворотке крови человека при диагностике ряда заболеваний и в биологических препаратах.

Наиболее перспективным из современных методов определения белков сыворотки крови является метод иммуноферментного анализа благодаря своей чувствительности, избирательности и возможности автоматизации аналитического процесса.

Известен способ определения функциональной активности компонента C3 [1], который предусматривает сорбцию в лунках микропанели иммуноглобулина G, затем внесения в лунки микропанели комплемента морской свинки, служащего в качестве источника компонентов C1, C2 и C4 (присутствующий компонент C3 морской свинки не обнаруживается специфическими антителами против C3 человека) и анализируемой пробы, содержащей компонент C3 человека с неизвестной активностью, и проведения инкубации для активации комплемента, в ходе которой происходит связывание C3 на молекулах активатора - сорбированного иммуноглобулина. Количество ковалентно связавшегося в результате активации компонента C3 человека определяют по продукту ферментативной реакции с помощью антител к C3, конъюгированных с ферментом.

Известен также способ [2], позволяющий определять функциональную активность компонента C3 комплемента человека с использованием доступного и хорошо сохраняемого в обычных условиях коммерческого препарата дерината для использования в качестве активатора классического пути комплемента и заменой комплемента морской свинки гомологичным реагентом R3 - сыворотки крови человека, лишенной активности C3.

Наконец, для активации компонента C3, необходимой для связывания на микропанели с последующим определением количества связавшегося теми же приемами, в способе [3] используется альтернативная C3 конвертаза, формируемая в результате активации альтернативного пути с помощью сорбируемого на микропанели лизоцима - активатора альтернативного пути и реагента R3, как источника факторов В и D человека, необходимых для формирования C3 конвертазы альтернативного пути комплемента.

Недостатком всех этих способов является участие в процессе активации компонента C3, C3 конвертазы, формируемой из компонентов комплемента морской свинки в первом случае либо из компонентов или факторов комплемента реагента R3, во втором и в третьем случаях, поскольку при проведении определения активности компонента C3 в сыворотках крови неизбежно создаются условия активации комплемента по классическому или альтернативному пути, что затрагивает и другие компоненты комплемента и может приводить к их неспецифической сорбции на поверхности лунок микропанели.

Задачей заявленного изобретения является разработка способа и набора на основе иммуноферментного метода, позволяющего определять функциональную активность компонента C3 комплемента человека в условиях отсутствия активации ни одного из путей комплемента и не требующего участия других компонентов комплемента и не затрагивающего их, если они присутствуют в анализируемой пробе.

Поставленная задача достигается путем разработки способа определения и набора для иммуноферментного определения функциональной активности компонента C3 комплемента человека. Способ определения предусматривает сорбцию в лунках микропанели препаратов, содержащих пептидогликан, затем внесение в лунки микропанели раствора, содержащего компонент C3 комплемента человека с неизвестной активностью, проведение инкубации в присутствии ЭДТА для блокирования всех путей активации комплемента, в ходе которой происходит связывание C3 на сорбированном пептидогликане, выливание содержимого лунок, а затем внесение конъюгата фермента с антителами против компонента C3 человека, отмывание несвязавшегося конъюгата, внесение субстрата конъюгированного фермента и проведение расчета активности компонента C3 по количеству образовавшегося продукта ферментативной реакции. Тем самым достигается определение функциональной активности C3 иммуноферментным методом, пригодным для стандартизации.

Набор содержит плоскодонную микропанель с сорбированным пептидогликаном, конъюгат фермента с антителами к компоненту C3 комплемента человека, субстратный буфер и донорскую сыворотку крови с известной активностью C3 в качестве стандарта.

Техническим результатом заявленного изобретения является разработка способа и набора для определения функциональной активности компонента C3 комплемента человека, обладающего хорошей воспроизводимостью результатов и отсутствием необходимости активации всей системы комплемента.

В основе предлагаемого способа лежит обнаруженная способность препаратов пептидогликана прочно и одинаково связывать (по-видимому, ковалентно) только функционально активные молекулы компонента C3, которая не зависит от наличия в среде солей кальция и магния, необходимых для активации классического и лектинового путей, только магния для альтернативного пути, а также в среде с ЭДТА, когда отсутствие ионов кальция и магния полностью блокирует возможность активации комплемента.

Иммуномодулирующие свойства пептидогликана известны давно [4, 5]. В 1983 г. было впервые показано, что пептидогликан из Lactobaccilus bulgaricus (бластолизин) активирует альтернативный путь комплемента [6], и тем самым было доказано, что иммуномодулирующие свойства пептидогликанов из клеточных стенок бактерий обусловлены его воздействием на систему комплемента. Кроме того, в литературе неоднократно публиковались работы, посвященные иммуномодулирующей активности пептидогликанов. В частности, это касалось свойств препарата иммуномакса [7, 8], представляющего собой кислый пептидогликан растительного происхождения.

Пример 1. Определение функциональной активности компонента C3 комплемента человека. Пептидогликан - аптечный препарат иммуномакс в 0,05 М натрий-карбонатном буфере, pH 9,5, с конечной концентрацией 5-20 мкг/мл вносят по 100 мкл раствора в каждую лунку плоскодонного полистиролового 96-луночного планшета. Закрывают крышкой и оставляют на ночь при 4°C. Три раза отмывают микропанель 0,2 М натрий-фосфатным буферным раствором, pH 7,4, содержащим 0,15 М NaCl и 50 мМ ЭДТА (этилендиаминтетраацетат натрия), заливая по 150 мкл в каждую лунку, затем микропанель осушают путем вытряхивания остатка жидкости. В лунки микропанели вносят по 100 мкл раствора, содержащего определяемый компонент C3 в том же буфере. После инкубации в термостате в течение 1 ч при 37°C, трехкратной отмывки фосфатным буфером, pH 7,4, содержащим 0,15 М NaCl и 0,05% Твин-20, и осушения планшета в каждую лунку вносят по 100 мкл конъюгата пероксидазы с антителами против C3 человека в том же буфере в подобранном разведении. После инкубации в термостате в течение 1 ч при 37°C, пятикратной отмывки с детергентом и осушения планшета в каждую лунку вносят по 100 мкл субстратного буфера (3,3',5,5'-тетраметилбензидин в 15 мл цитратно-фосфатного буфера, pH 5,0, и 50 мкл 3% перекиси водорода). После 15-30 мин инкубации в темноте реакцию останавливают внесением в каждую лунку 50 мкл 14% серной кислоты. Результаты реакции учитывают с помощью спектрофотометра с вертикальным лучом измерением светопоглощения при 450 нм. Количество активного компонента C3 рассчитывают по стандартной кривой (рис.1), где представлено определение активности компонента C3 комплемента человека иммуноферментным методом на иммуномаксе. (R2=0.98).

Пример 2. Набор для определения функциональной активности компонента C3. Набор содержит плоскодонную микропанель с сорбированным препаратом пептидогликана, конъюгат пероксидазы с антителами к компоненту C3 комплемента человека, субстратный буфер и донорскую сыворотку крови с известным содержанием активного компонента C3 в качестве стандарта. Данный набор используется в соответствии с примером 1.

Из приведенных результатов следует, что измеряемая оптическая плотность линейно зависит от концентрации активного компонента C3 и позволяет достоверно определять функциональную активность компонента C3 в количествах от 1 нг описанным способом с использованием описанного набора.

ЛИТЕРАТУРА

1. Козлов Л.В., Романов С.В., Дьяков В.Л. Способ определения функциональной активности компонента C3 комплемента человека по классическому пути. 2005. Патент РФ 2251397. Бюл. №13. 10.05.2005.

2. Козлов Л.В., Гора Н.В., Бичучер A.M. Способ и набор для иммуноферментного определения функциональной активности компонента C3 комплемента человека. Патент РФ 2417375. Бюл. №12. 27.04.2011.

3. Козлов Л.В., Гора Н.В. Способ и набор для иммуноферментного определения функциональной активности компонента C3 комплемента человека по альтернативному пути активации. Патент 2380707. 27.01.2010.

4. White R.G., Bernstock L., Johns R.G.S., Lederer E. The influence of components of M. tuberculosis and other Mycobacteria upon antibody production to ovalbumin. Immunology. 1958. V.1. P.54-66.

5. Ellouz F., Adam A., Ciorbaru R., Lederer E. Minimal structural requirements for adjuvant activity of bacterial peptidoglycan derivatives. Biochem. Biophys. Res. Comm. 1974. V.59. No.4. P.1317-1325.

6. Козлов Л.В., Зинченко А.А., Соляков Л.С., Сизой М.Н., Ищенко A.M., Мартюшин С.В., Андреев С.В. Механизм активации комплемента человека иммуностимуляторами из клеточных стенок бактерий. Биоорган. химия. 1983. Т.9. №8. С.1047-1055.

7. Атауллаханов Р.И.; Пичугин А.В.; Хаитов P.M. Способ получения вещества, обладающего иммуностимулирующей, противовирусной и антибактериальной активностью, вещество, полученное этим способом, и фармацевтическая композиция на его основе. Патент 2195308. 27.12.2002.

8. Атауллаханов Р.И., Пичугин А.В., Шишкова Н.М., Мастернак Т.Е., Малкина Е.Ю., Ульянова Л.И., Стеценко О.Н. Клеточные механизмы иммуномодулирующего действия препарата иммуномакса. Иммунология. 2005. №2. С.111-120.

1. Способ определения функциональной активности компонента С3 комплемента человека, отличающийся тем, что сорбируют в лунках микропанели препарат пептидогликана, затем в лунки микропанели вносят анализируемую пробу, содержащую компонент С3 комплемента человека с неизвестной активностью, проводят инкубацию в присутствии ЭДТА, выливают содержимое лунок, а затем вносят конъюгат фермента с антителами против компонента С3 человека и субстрат этого фермента, после чего проводят расчет активности компонента С3 по количеству образовавшегося продукта ферментативной реакции.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что в качестве пептидогликана используют аптечный препарат иммуномакс.

3. Набор для определения функциональной активности компонента С3 комплемента человека, характеризующийся тем, что он содержит плоскодонную микропанель с сорбированным препаратом пептидогликана, конъюгат фермента с антителами к компоненту С3 комплемента человека, субстратный буфер и донорскую сыворотку крови с известной активностью С3 в качестве стандарта.



 

Похожие патенты:

Изобретение относится к медицине и описывает способ идентификации модуляторов активности фермента катехол-O-метилтрансферазы (СОМТ), включающий а) получение 4-нитрокатехола, ковалентно связанного с Alexa Fluor® 488, б) приведение в контакт молекулы из этапа а) с ферментом катехол-O-метилтрансферазой (COMT), S-аденозилметионином (SAM) и соединением-кандидатом и в) измерение показателей флуоресценции смеси из этапа б), в котором измененные показатели флуоресценции в присутствии соединения-кандидата по сравнению с контролем являются признаком наличия модулятора фермента катехол-O-метилтрансферазы (COMT).
Изобретение относится к медицине, а именно к педиатрии, инфектологии и гепатологии, и может быть использовано для дифференциальной диагностики стадий хронизации вирусного гепатита С у подростков.
Изобретение относится к области медицины и предназначено для прогнозирования неблагоприятного исхода гипертрофической кардиомиопатии. Методом твердофазного иммуноферментного анализа (ИФА) в крови пациента определяют величины тканевого ингибитора металлопротеиназы 1 (TIMP 1) и терминального фрагмента мозгового натрийуретического пептида (NT pro BNP).

Группа изобретений относится к области медицинской диагностики, иммунологии и онкологии, в частности к новым онкомаркерам и способам диагностики онкологических заболеваний.

Изобретение относится к области биохимии и предназначено для определения IgG-протеиназной активности. В лунках полистиролового планшета сорбируют полимерные матрицы небелковой природы - ДНК, хитин, затем в лунки добавляют специфические к этой матрице IgG и раствор, содержащий протеолитические ферменты.

Изобретение относится к области биотехнологии и представляет собой способ определения неспецифической устойчивости патогенных микроорганизмов к антибиотикам и факта присутствия бактериальных биопленок на основании измерения каталитической активности фосфодиэстераз, расщепляющих циклический дигуанозинмонофосфат, с пороговой чувствительностью 50 пг/мл, включающий: 1) выделение фосфодиэстеразы-мишени из лизированных бактериальных клеток; 2) связывание фосфодиэстеразы биотинилированными антителами, специфичными к некаталитическим доменам фосфодиэстеразы; 3) аффинную очистку комплексов, сформированных фосфодиэстеразой-мишенью и биотинилированным антителом при помощи парамагнитных частиц, содержащих нейтравидин или его аналоги, связывающие биотин; 4) взаимодействие комплексов фосфодиэстераза/биотинилированное антитело, иммобилизованных на парамагнитных частицах, с комплексами, содержащими с-di-GMP в форме G-квадруплексов с интеркалированным красителем, сопровождающееся падением интенсивности флуоресценции по мере разрушения комплексов интеркалирующего красителя c-di-GMP; 5) измерение падения флуоресценции при гидролизе c-di-GMP и разрушении комплекса c-di-GMP с интеркалирующим красителем с последующим количественным определением активности фосфодиэстеразы на основании калибровочных кривых, построенных с использованием известных количеств рекомбинантного фермента фосфодиэстеразы, идентичного исследуемой мишени; 6) выявление повышенного уровня фосфодиэстеразной активности, обнаруживаемого тестируемыми антибиотикоустойчивыми бактериальными штаммами, способными к формированию биопленок, по сравнению с уровнем фосфодиэстеразной активности, обнаруживаемым для контрольных штаммов бактерий того же вида, не обладающих антибиотикоустойчивостью и способностью к формированию биопленок.

Группа изобретений относится к медицине, фармакологии, к способам и композициям ингибиторов фосфатазы PTEN для созревания овариальных фолликулов и ооцитов in vitro. Использование ингибиторов фосфатазы PTEN, таких как комплексы оксованадата и пероксованадата: биспероксо (бипиридин) оксованадат, биспероксо (1,10-фенантролин) оксованадат, биспероксо (пиколинато) оксованадат, биспероксо (5-гидроксипиридин-2-карбоксил) оксованадат, ди-(пиколинат) оксованадат, ди-(3-гидроксипиколинат) оксованадат, биспероксо (фенилбигуанид) оксованадат, ди-(фенилбигуанид) оксованадат и биспероксо (изохинолинкарбоновой кислоты) оксованадат, обеспечивает созревание и/или активацию in vitro ооцитов и фолликулов, таких как примордиальные, промежуточные и первичные фолликулы.
Изобретение относится к химическим композициям реагентов. .
Изобретение относится к лабораторной диагностике осложнений инфекционных болезней и может быть использовано для оценки степени выраженности цитолиза кардиомиоцитов при поражениях миокарда, развивающихся на фоне различных острых инфекционных заболеваний.
Изобретение относится к области медицины, а именно к лабораторной диагностике, и применяется для оценки остеорепаративных процессов. .
Способ культивирования дрожжей Phaffia rhodozyma для получения кормовой добавки, содержащей астаксантин, предусматривает приготовление культуры дрожжей на твердой агаризованной среде, выращивают посевной материал на качалке в колбах.

Изобретение относится к области микробиологии и биотехнологии, а именно к мобильным комплексам для наращивания суспензий микроорганизмов в полевых условиях, и может быть использовано в методах биологической рекультивации земель, очистке водных поверхностей и/или биологических методах увеличения нефтеотдачи.

Группа изобретений относится к биотехнологии. Предложен способ выращивания колоний микробных клеток на поверхности пористой пластины.

Изобретение относится к области биотехнологии, в частности к биоэнергетике. Анаэробный реактор содержит корпус с камерами гидролизного и метанового брожения, устройства загрузки и перемешивания субстрата в камерах, гидравлический затвор и колонну для обогащения биогаза, разделенную перегородками на сборник биогаза и секции, заполненные иммобилизирующей засыпкой.

Группа изобретений относится к биотехнологии. Предложена группа изобретений: способ получения химического продукта и аппарат для получения химического продукта указанным способом.

Изобретение относится к биотехнологии. Предложен контейнер для изоляции и идентификации микроорганизма.

Изобретение относится к области биотехнологии, фармацевтической промышленности, в частности к оборудованию для культивиротвания фотосинтезирующих микроорганизмов, преимущественно микроводорослей.

Изобретение относится к области агропромышленного комплекса, характеризующейся высокой бактериальной обсемененностью воздуха рабочей зоны, рабочих поверхностей и перерабатываемых материалов, в частности к устройствам для определения микробной обсемененности спецодежды.

Изобретение относится к устройствам биологической очистки, преимущественно для очистки воздуха от загрязняющих органических соединений, болезнетворных микроорганизмов, запахов и может быть использовано в агропромышленном комплексе.

Группа изобретений относится к области биотехнологии, в частности к биореакторному устройству (1) для выращивания биологических видов (2) и способу выращивания. Биореакторное устройство содержит, по меньшей мере, одно устройство-резервуар (3) с первой средой (4a) обитания для первого вида (2a) и первое устройство (5a) освещения, имеющее, по меньшей мере, один светодиодный источник (6) освещения, адаптируемый под первый вид (2a) с помощью излучения света (L), имеющего первый спектр.

Группа изобретений относится к области биологии, в частности к иммунологическим исследованиям, являющимися предпочтительным методом тестирования биологических продуктов и при которых используется планшет для образцов, в частности, при осуществлении энзим-связывающего иммуносорбентного анализа - ELISA, или других процедур, связанных с иммунным анализом, использующих нуклеиново-кислотный зонд, а также при использовании для проведения тестирования на наличие ДНК- или РНК-последовательностей. Планшет содержит одну или более лунок для образцов, причем каждая лунка для образцов имеет основание и одно или более открытых сквозных отверстий, выполненных в основании. Каждое из открытых сквозных отверстий имеет в поперечном сечении круглую форму и выполнено цилиндрическим, причем диаметром, меньшим, чем диаметр введенной в него гранулы или микросферы реагента. Гранула или микросфера реагента удерживается или фиксируется в указанном сквозном отверстии посредством посадки с натягом или фрикционной посадки с формированием периферийного уплотнения, непроницаемого для текучей среды относительно стенки основания, образующей указанное сквозное отверстие. Группа изобретений обеспечивает повышение эффективности и качества исследований при одновременном сокращении временных затрат. 5 н. и 4 з.п. ф-лы, 34 ил.

Группа изобретений относится к медицинской иммунологии, а именно к способам определения функциональной активности компонентов комплемента в сыворотке крови человека при диагностике ряда заболеваний и в биологических препаратах. Сущность изобретения состоит в том, что в лунках микропанели сорбируют препарат пептидогликана, затем вносят пробу, содержащую компонент C3 комплемента человека с неизвестной активностью, проводят инкубацию в присутствии ЭДТА, а затем вносят конъюгат фермента с антителами против компонента C3 человека и субстрат этого фермента, расчет активности компонента C3 проводят по количеству образовавшегося продукта ферментативной реакции. Набор для определения функциональной активности компонента C3 комплемента человека содержит плоскодонную микропанель с сорбированным препаратом пептидогликана, конъюгат фермента с антителами к компоненту C3 комплемента человека, субстратный буфер и донорскую сыворотку крови с известной активностью C3 в качестве стандарта. Группа изобретений позволяет определять функциональную активность компонента C3 системы комплемента человека и обладает хорошей воспроизводимостью результатов. 2 н. и 1 з.п. ф-лы, 1 ил.

Наверх