Штамм культивируемых гибридных клеток животного mus musculus l. cchfv vd-1-продуцент моноклонального антитела 4g4/b6 к вирусу крым-конго геморрагической лихорадки

Авторы патента:

 


Владельцы патента RU 2535982:

Федеральное бюджетное учреждение науки "Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии "Вектор" Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (RU)
Федеральное казенное учреждение здравоохранения "Волгоградский научно-исследовательский противочумный институт" Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (RU)
Федеральное бюджетное учреждение науки "Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии" Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (RU)

Изобретение относится к биотехнологии. Описывается штамм культивируемых гибридных клеток животного Mus musculus L. CCHFV Vd-1. Получение штамма достигается гибридизацией двух типов клеток: спленоцитов инбредной мыши линии BALB/c, иммунизированной антигеном вируса ККГЛ, и клеток мышиной миеломы Sp 2/0. Штамм-продуцент МКА IgG1 к вирусу ККГЛ назван CCHFV Vd-1 (4G4/B6). Штамм депонирован в Государственную коллекцию патогенных микроорганизмов и клеточных культур «ГКПМ-ОБОЛЕНСК» под номером Н-25. Штамм является продуцентом сырья для изготовления диагностического препарата для метода флуоресцирующих антител, а также источником получения одного из компонентов набора моноклональных реагентов для иммуноферментного выявления антигенов вируса ККГЛ. Изобретение может быть использовано в медицинской практике для выявления вируса Крым-Конго геморрагической лихорадки (ККГЛ) в клинических или секционных образцах для уточнения диагноза, а также для решения научно-исследовательских задач по изучению свойств вируса ККГЛ, созданию диагностических препаратов против Крымской геморрагической лихорадки. 1 табл., 4 пр.

 

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к способу получения гибридом-продуцентов моноклональных антител (МКА) заданной специфичности, и может быть использовано в медицинской практике для выявления вируса Крым-Конго геморрагической лихорадки (ККГЛ) в клинических или секционных образцах для уточнения диагноза, а также для решения научно-исследовательских задач по изучению свойств вируса ККГЛ, созданию диагностических препаратов против Крымской геморрагической лихорадки (КГЛ), особо опасной природно-очаговой инфекции. Штамм-продуцент моноклональных антител к вирусу ККГЛ назван CCHFV Vd-1 (4G4/B6). Штамм депонирован в Государственную коллекцию патогенных микроорганизмов и клеточных культур «ГКПМ-ОБОЛЕНСК» под номером Н-25.

При выполнении работ по обнаружению возбудителя в пробах клинического и полевого материала руководствуются изложенными в «Практических руководствах» [1, 2], а также в МУК 4.2.3007-12 [3] принципами организации исследований материала, подозрительного на зараженность вирусом ККГЛ, в учреждениях Роспотребнадзора. Согласно этим документам регламентированными иммунодиагностическими методами обнаружения вируса ККГЛ являются сэндвич-вариант иммуноферментного анализа (ИФА) и метод флуоресцирующих антител (МФА).

Для воспроизведения первого из этих двух методов осуществляется выпуск «Тест-системы иммуноферментной для выявления вируса Крым-Конго геморрагической лихорадки «ВектоКрым-КГЛ-антиген» (ЗАО «Вектор-Бест», Россия; регистрационный номер РК-ИМН-5 №007764, дата регистрации 14.12.2010), изготавливаемой на основе поликлональных антител к вирусу ККГЛ.

Применение в практических лабораториях МФА имеет ряд трудностей, связанных с отсутствием на отечественном рынке медицинских иммунобиологических препаратов «Иммуноглобулинов диагностических флуоресцирующих для обнаружения вируса ККГЛ».

Известно, что применение МКА в качестве основы средств обнаружения возбудителей опасных инфекционных заболеваний, в том числе и вируса ККГЛ, открывает новые перспективы для создания высокоэффективных стандартизированных препаратов для методов экспресс-обнаружения и идентификации искомых патогенов.

О возможностях применения МКА к вирусу ККГЛ сообщали отечественные и зарубежные авторы [4, 5, 6, 7]. Ими были получены экспериментальные образцы препаратов для применения в иммуноферментном и иммунофлуоресцентном методах детекции вируса ККГЛ. Несмотря на то что этими авторами были изучены возможности изготовления иммунодиагностических препаратов с высокими показателями качества на основе МКА к вирусу ККГЛ для выявления этого патогена, производство коммерческих препаратов в нашей стране не было освоено.

В настоящее время существует только один зарегистрированный в качестве медицинского изделия набор, предназначенный для выявления вируса ККГЛ в биологических жидких пробах (набор для иммуноферментного анализа производства ЗАО «Вектор Бест», Новосибирск, кат. № D-5056, «ВектоКрым-КГЛ-антиген», РУ № ФСР 2010/07327). Ввиду отсутствия стандартных препаратов для контроля качества лабораторной диагностики ККГЛ, неизвестна относительная чувствительность и специфичность этого набора.

Зарегистрированных препаратов флуоресцирующих антител для детекции ККГЛ нет.

Цель изобретения - получение штамма гибридомы-продуцента высокоспецифичных моноклональных антител - основы для изготовления иммунодиагностических средств обнаружения вируса ККГЛ.

Получение гибридомы достигается гибридизацией двух типов клеток: спленоцитов инбредной мыши линии BALB/c, иммунизированной антигеном вируса ККГЛ, и клеток мышиной миеломы.

Гибридома-продуцент МКА 4G4/B6 получена путем слияния спленоцитов иммунной мыши линии BALB/c с клетками мышиной миеломы Sp 2/0 в присутствии конъюгирующего агента - полиэтиленгликоля (ПЭГ-4000, «Merck», Германия), последующего рассева взвеси клеток в лунки 96-луночных культуральных пластин, выращивания в селективной среде, отбора первичного клона, его клонирования и реклонирования методом лимитирующих разведений. Полученный штамм, названный CCHFV Vd-1 (4G4/B6), характеризуется перечисленными ниже признаками.

Культуральные признаки. Для культивирования гибридомы in vitro используют среду RPMI-1640 с 15% эмбриональной телячьей сыворотки (ЭТС), 2 mM L-глютамина, 10 mM Hepes, 4 mM пирувата натрия.

Клетки культивируют при 37°C в атмосфере 5-7% CO2 и влажности 70-80%. Пересевы делают каждые 3-4 сут, интенсивность роста популяции клеток контролируют при просмотре лунок пластин в инвертированном микроскопе. Кратность рассева 1:4-1:8. Характер роста культуры - полусуспензионный.

Культивирование в организме сингенного животного. Для накопления асцита in vivo клетки гибридомы вводят внутрибрюшинно предварительно праймированным мышам линии BALB/c по 1·106-2·106 клеток на мышь. Прививаемость гибридных клеток в брюшной полости хорошая. Асцит образуется через 2-4 недели.

Продуктивность штамма. Продукция МКА в среде культивирования составляет 0,64 мкг/мл, в асцитической жидкости - 10-12 мг/мл. Объем асцитической жидкости в среднем равен 3-4 мл.

Характеристика получаемого продукта. Антитела относятся к классу IgG1. Они специфически взаимодействуют с антигеном вируса ККГЛ. Специфичность взаимодействия определяют с помощью твердофазного иммуноферментного метода (ТИФМ).

Криоконсервирование. Вне периода экспериментов по накоплению препаративных количеств МКА 4G4/B6 клетки гибридомы сохраняют в криоконсервированном состоянии. Для перевода их в такое состояние взвесь клеток гибридомы в количестве 4·106 клеток в 1 мл защитной среды, состоящей из среды RPMI-1640 с 20% ЭТС и 7% диметилсульфоксида, переносят в пластиковые ампулы. Ампулы помещают в аппарат для криоконсервирования биологического материала. Используют режим постепенного программируемого понижения температуры: в течение 20 минут - снижение температуры образца до 0°C, далее со скоростью 1°C в минуту - до температуры минус 40°C и далее со скоростью 5°C в минуту - от минус 40°C до минус 70°C. Затем ампулы погружают в биохранилище с жидким азотом и хранят до момента использования. Размораживание производят при 37°C на водяной бане в течение 2-3 минут. Жизнеспособность клеток после размораживания составляет 75% и более.

Пример 1. Получение штамма гибридомы-продуцента. Мышей линии BALB/c иммунизируют инактивированным антигеном вируса ККГЛ. Для стимуляции В-лимфоцитов мыши используют схему дробного введения минимальных доз антигена в течение относительно короткого периода времени (5 недель). Первую инъекцию (0 день) выполняют подкожно в область спины смесью антигена [15 мкг антигена в 0,3 мл физиологического раствора (ФР) с равным объемом неполного адъюванта Фрейнда]. Вторую, третью и четвертую инъекции (7, 14 и 21 день) - внутрибрюшинно по 15 мкг антигена в 0,3 мл ФР, пятую бустирующую инъекцию - через 2 недели внутриселезеночно (20 мкг антигена в 0,3 мл ФР). Суммарная доза антигена не должна превышать 80 мкг белка по Бредфорду. Через 3 суток после этого выполняют гибридизацию 1·108 спленоцитов иммунной мыши с 1·107 клеток мышиной миеломы в присутствии 1 мл 50% ПЭГ-4000 в течение 2 минут при комнатной температуре и постоянном мягком перемешивании. Затем к этой смеси при постоянном перемешивании последовательно добавляют 1, 2, 4 и 8 мл бессывороточной среды, каждую порцию в течение 2 минут. После этого клетки центрифугируют при 800-1000 об/мин в течение 10 минут. Осадок ресуспендируют в селективной НАТ-среде с 15% ЭТС, 2 mM L-глютамина, 10 mM Hepes, 4 mM пирувата натрия. Клетки высевают в 96-луночную пластину с фидером, по 2,5·105-5·105 клеток в лунку. Смену среды производят каждые 3-4 дня. Скрининг антителопродуцирующих гибридных клонов выполняют не ранее 7-10 суток после рассева в 96-луночные пластины. При просмотре лунок регистрируют те из них, в которых имеет место характерный рост групп клеток, затем из них отбирают не более 50 мкл культуральной среды для исследования в непрямом варианте ТИФМ. Положительные результаты этого метода скрининга, полученные с пробой из одной и той же лунки не менее трех раз, являются основанием для отбора первичного клона-продуцента целевого продукта. Все первичные клоны, отобранные в течение месяца, клонируют и реклонируют методом лимитирующих разведений, производя высевы в лунки предварительно подготовленной 96-луночной пластины с фидером - перитонеальными макрофагами сингенной интактной мыши (по 4-6·104 клеток в каждой лунке). На этом этапе используют среду RPMI-1640 с 15% ЭТС и необходимыми добавками. После второго клонирования каждого из первичных вариантов клонов формируют рабочую коллекцию гибридом-продуцентов МКА заданной специфичности. Среди продуктивных клонов, секретирующих моноклональные иммуноглобулины против антигенов вируса ККГЛ, селекционирован клон-продуцент CCHFV Vd-1 (4G4/B6).

Пример 2. Накопление МКА. Ампулу с клетками гибридомы достают из биохранилища с жидким азотом и быстро размораживают на водяной бане при 37°C. Для отмывания восстановленной суспензии клеток от примесей защитной среды ее переносят в центрифужную пробирку с 10 мл бессывороточной среды RPMI-1640 и осторожно наслаивают на поверхность жидкости. Клетки осаждают центрифугированием при 800-1000 об/мин, удаляют надосадок, а осевшие клетки вновь суспендируют в полной среде для культивирования гибридомы (RPMI-1640 с 15% ЭТС и необходимыми добавками). Клетки высевают в 5-6 лунок 12-луночной пластины или в матрас с площадью 25 см2. При увеличении колонии до размеров, покрывающих половину площади и более, производят рассевы на большие площади при обязательном контроле антителопродукции. Условия культивирования in vitro, тактика отбора и замены среды культивирования, рассева размножающейся популяции клеток такие же, как описано выше (пример 1). При корректном выполнении этих условий продукция МКА восстанавливается до уровня 0,56-0,64 мкг/мл. Все образцы культуральной среды, отбираемой в моменты ее замены равными объемами свежей среды, собирают во флакон для последующего выделения из нее моноклональных иммуноглобулинов.

Тиражирование клеток гибридомы in vivo в брюшной полости сингенного животного - наиболее эффективный способ накопления высоких концентраций МКА. Животным предварительно внутрибрюшинно вводят по 0,4 мл стерильного минерального масла, пристана (2,6,10,14-тетраметил-пентадекана) или неполного адъюванта Фрейнда. Через 5-7 суток мышам внутрибрюшинно вводят по 1·106-5·106 клеток гибридомы. После накопления асцитической жидкости ее собирают. Клетки осаждают центрифугированием, надосадочную жидкость отделяют и используют для выделения антител методом сульфатного трехкратного переосаждения белка при 50%-ном насыщении сульфатом аммония. Рыхлый осадок центрифугируют при 10000-15000 об/мин в течение 20 минут, надосадочную жидкость удаляют. Осадок растворяют в 0,01 М фосфатном буфере, диализуют до полного удаления ионов сульфата аммония. Полученный раствор моноклональных иммуноглобулинов стерилизуют методом мембранной фильтрации, ампулируют и хранят при минус 20°C до момента использования. Концентрацию белка в растворе МКА определяют спектрофотометрически при длине волны 280 нм.

Специфическую активность МКА проверяют с помощью ТИФМ. За сутки до постановки реакции в лунки полистироловой пластины для иммуноферментного анализа вносят по 100 мкл раствора антигена (с концентрацией 7-10 мкг/мл по белку) в 0,05 М карбонатно-бикарбонатном буфере, рН 9,5. Пластину в течение ночи выдерживают при 4-8°C, затем трижды отмывают забуференным физраствором с 0,05% твина-20 (ЗФР-Т) и выполняют этап блокирования свободных участков пластика 1%-ным раствором бычьего сывороточного альбумина, внося в каждую лунку по 150 мкл этого раствора. Пластину инкубируют при 37°C в термостате в течение 30 минут и вновь трижды отмывают ЗФР-Т. Следующий этап - внесение в лунки пластины по 100 мкл различных разведений МКА, приготовленных на 0,1 М фосфатном буфере, рН 7,4 с 0,05% твина-20 (ФСБ-Т), последующая инкубация - 1 ч при 37°C, трехкратное отмывание и внесение 100 мкл антивидового конъюгата в рабочем разведении. Конъюгат представляет собой антитела диагностические против IgG (H+L) белой мыши, меченные пероксидазой хрена. Пластину инкубируют при 37°C в течение 1 ч, затем трижды отмывают. В заключение в лунки вносят по 100 мкл смеси перекиси водорода с хромогеном. Пластину помещают в защищенное от света место. Реакция фермент-субстрат длится не более 20-25 минут при комнатной температуре. Для ее остановки используют стоп-реагент. Результаты реакции (оптическую плотность (ОП) содержимого лунок) регистрируют на планшетном фотометре при длине волны, соответствующей характеристике применяемого хромогена. МКА 4G4/B6, выделяемые из асцитической жидкости, активны в разведениях 1:105-1:106.

Средний объем асцитической жидкости, получаемый от одной мыши при культивировании гибридомы CCHFV Vd-1 (4G4/B6) in vivo, составляет 3-4 мл, концентрация МКА - 10-12 мг/мл.

Пример 3. Проверка специфической активности МКА 4G4/B6 в ИФА.

Для оценки эффективности применения полученных МКА при решении вопроса совершенствования средств иммунодиагностики КГЛ была изучена специфическая активность МКА 4G4/B6 в реакции с рядом антигенов вируса ККГЛ. В качестве референс-панели были использованы слабые разведения трех образцов, содержащих антигены вируса ККГЛ, и один концентрированный образец, не содержащий их.

Образец 1. Рекомбинантный белок, содержащий аминокислотные последовательности, аналогичные белкам вируса ККГЛ, изолят «1-2».

Образец 2. Рекомбинантный белок, содержащий аминокислотные последовательности, аналогичные белкам вируса ККГЛ, изолят «3».

Образец 3. Природный неочищенный вирус ККГЛ, депонированный в Государственную коллекцию возбудителей вирусных инфекций и риккетсиозов ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор» под № VK 28848.

Образец 4. Отрицательный контроль - смесь лизатных белков перевиваемой линии клеток аденокарциномы надпочечников человека SV-13 и E. coli (вероятные примеси образцов №№1-3).

Диагностическая конструкция построена по схеме прямого твердофазного трехстадийного иммуноферментного анализа разновидности двойной сэндвич. Ее основу составляют два компонента: планшет-иммуносорбент с иммобилизованными на поверхности лунок МКА к белкам вируса ККГЛ и конъюгат МКА-биотин, выявляющий образованные иммунные комплексы антител иммуносорбента с антигенами вируса ККГЛ. Для увеличения чувствительности диагностической тест-системы последовательно применяются два конъюгата: МКА-биотин и образующий крепкую связь с ним стрептавидин-полипероксидаза хрена (СПХ, «STD GmbH», Германия). Последний состоит из одной молекулы стрептавидина и 800 молекул пероксидазы, его применение повышает чувствительность ИФА в 200-300 раз относительно классического конъюгата белок-фермент. Визуализация результатов анализа осуществляется добавлением к образовавшимся иммунным комплексам раствора хромогена 3,3′,5,5′-тетраметиленбензидина («Moss Inc», США) с последующей фиксацией окраски раствором серной кислоты и регистрацией на планшетном фотометре в единицах ОП.

Для активации иммуносорбента (96-луночный планшет из модифицированного полистирола, международная классификация «Maxisorp») был подобран состав сорбционного раствора. Для уменьшения фона в результатах анализа, а также придания иммуносорбенту стабильности при хранении наиболее эффективным оказалось использование карбонатного буферного раствора с последующей блокировкой свободных участков пластика раствором казеина и сахарозы. Выбор варианта МКА, пригодного для выполнения функции «захвата» антигена, и подбор его оптимальной концентрации при подготовке иммуносорбента был выполнен в результате сравнительного анализа данных, полученных в опыте с тремя раздельно раститрованными МКА (1Е25, 3H6/F2, 4G4/B6) из рабочей панели моноклональных иммуноглобулинов к антигенам вируса ККГЛ. Наиболее эффективным антителом, сорбируемым на планшете, оказалось МКА 3H6/F2, используемое в концентрации 1,5 мкг/мл.

После определения варианта МКА для использования на этапе подготовки твердой фазы для ИФА (планшет с сорбированными на поверхности его лунок антителами с функцией «захвата» искомого антигена) необходимо было приготовить конъюгат «детектирующего» антитела с биотином.

Для получения конъюгата МКА-биотин была использована рутинная процедура биотинилирования: добавление к диализованным против гидрокарбонатного раствора МКА сульфо-NHS-биотина с последующей очисткой конъюгата от не связавшегося биотина гель-фильтрацией на колонке с сефадексом G-25.

Конъюгат МКА 4G4/B6-биотин получен согласно этой методике. Оптимальная концентрация была установлена в ИФА путем использования четырех последовательных отличающихся в 10 раз разведений биотинилированных МКА по отдельности, начиная с максимальной - 150 мкг/мл.

Исходные образцы антигенов референс-панели разводили в 100 раз раствором трис-ЭДТА с добавлением тритона Х-100 и инкубировали 1 ч при 37°C. После пятикратной отмывки ФСБ-Т в лунки планшета вносили биотинилированный конъюгат МКА 4G46-биотин и инкубировали 1 ч при 37°C. Затем после аналогичной отмывки в лунки планшета вносили раствор СПХ и инкубировали 1 ч при 37°C. На стадии визуализации иммунных комплексов в лунки планшета вносили раствор хромогена и инкубировали 15 мин при 37°C. Результаты учитывали при длине волны поглощения 450 нм. Для каждого значения ОП трех образцов, содержащих антигены ККГЛ (№1, №2 и №3) определяли коэффициент позитивности (Кпоз) как отношение ОП образца, содержащего антигены вируса ККГЛ, к ОП отрицательного контроля №4 в каждой точке разведения МКА иммуносорбента и биотинилированного конъюгата.

Данные по определению оптимальной концентрации конъюгата МКА 4G4/B6-биотин для выполнения сэндвич-варианта ИФА представлены в таблице 1.

Таблица 1
Определение оптимального разведения конъюгата МКА 4G46-биотин, обеспечивающего эффективное выявление антигенов вируса ККГЛ в исследованных пробах с помощью сэндвич-варианта ИФА
Конъюгат Разведение конъюгата (мкг/мл) Показатели коэффициента позитивности (Кпоз) в индивидуальных лунках реакции
Исследованные образцы антигенов
№1 №2 №3
МКА 4G46-биотин 150 1,1 1,1 1,1
15 0,9 1,0 0,9
1,5 12,9 13,0 13,0
0,15 0,5 0,9 1,2
Примечания:
- в качестве антител первого порядка, сорбированных на планшете для ИФА, выполняющих функцию «захвата» искомого антигена, использованы МКА 3H6/F2 в концентрации 1,5 мкг/мл;
- испытуемые антигены: №1 - рекомбинантный белок, содержащий аминокислотные последовательности, аналогичные белкам вируса ККГЛ, изолят «1-2», №2 - рекомбинантный белок, содержащий аминокислотные последовательности, аналогичные белкам вируса ККГЛ, изолят «3», №3 - природный неочищенный вирус ККГЛ;
- коэффициент позитивности (Кпоз) - показатель отношения ОП испытуемого образца, содержащего антигены вируса ККГЛ, к ОП отрицательного контроля в каждой точке разведения биотинилированного конъюгата 4G4/B6;
- показатели Кпоз, выделенные в таблице, соответствуют положительным результатам анализа.

Эффективность выявления антигенов вируса ККГЛ оценивали по максимальному показателю Кпоз.

Как видно из представленной таблицы, максимально эффективное выявление антигена в трех образцах, содержащих антигены вируса ККГЛ (№1, №2 и №3), происходит при использовании конъюгата МКА 4G46-биотин в конечном разведении 1,5 мкг/мл.

Пример 4. Использование МКА 4G4/B6 для выявления вируса ККГЛ методом флуоресцирующих антител. При использовании МКА в качестве сырья для изготовления диагностического препарата для МФА моноклональные иммуноглобулины метят флуорохромом - флуоресцеинизотиоцианатом (ФИТЦ) [8]. Метке флуорохромом подлежат МКА, накопленные in vivo. Процедуру конъюгирования МКА с флуорохромом выполняют с соблюдением следующих условий: комнатная температура, постоянное перемешивание реагентов, нагрузка ФИТЦ - 25 мг на 1 г иммуноглобулинов, дробное внесение раствора флуорохрома в течение первых 30 минут, суммарное время конъюгирования - 2,5 ч. Все перечисленные этапы выполняют при постоянном контроле рН раствора, не допуская превышения этого показателя более 9,0. Последующую очистку конъюгата от немеченого белка и не связавшегося красителя проводят на колонке с сефадексом G-25, используя для элюирования ОДМ фосфатный буфер, рН 7,2. При расчете показателей концентрации белка и молярного соотношения МФИТЦбелок используют методику The Т.Н. и Feltkamp Т.Е. [9]. После определения рабочего разведения препарата его ампулируют, лиофилизируют или хранят при минус 20°C. Целевое назначение препарата - обнаружение вируса ККГЛ в пробах биологического материала методом МФА. Диагностические возможности экспериментального препарата иммуноглобулинов флуоресцирующих моноклональных, приготовленного на основе иммуноглобулинов 4G4/B6, были проверены в МФА с использованием фиксированных и обеззараженных мазков-отпечатков органов шести умерших пациентов с диагнозом лихорадка неясного генеза. При просмотре мазков-отпечатков органов пяти пациентов были получены положительные результаты и у одного - отрицательные. У тех же пяти пациентов диагноз Крымская геморрагическая лихорадка впоследствии был подтвержден лабораторно. У пациента с отрицательным результатом в МФА диагноз КГЛ другими методами также не был подтвержден.

Таким образом, перечисленные выше свойства гибридомы-продуцента МКА позволили сделать следующее заключение. Штамм культивируемых гибридных клеток животного Mus musculus L. (авторское название клеточной линии CCHFV Vd-1) предназначен для получения моноклонального антитела 4G4/B6 к вирусу Крым-Конго геморрагической лихорадки, относящегося к классу IgG1. Концентрация иммуноглобулинов в культуральной среде составляет 0,64 мкг/мл. Штамм является продуцентом сырья для изготовления диагностических средств обнаружения вируса Крым-Конго геморрагической лихорадки в пробах биологического материала.

Источники информации

1. Лабораторная диагностика опасных инфекционных болезней / Практическое руководство / Под ред. Г.Г. Онищенко, В.В. Кутырева. - М.: ОАО "Издательство "Медицина", издательство "Шико", 2009. - 472 с.

2. Специфическая индикация патогенных биологических агентов / Практическое руководство. Под ред. Г.Г. Онищенко. - М., 2006. - 288 с.

3. МУК 4.2.3007-12. Порядок организации и проведения лабораторной диагностики Крымской геморрагической лихорадки для лабораторий территориального, регионального и федерального уровней.

4. Вышемирский О.И., Костиков М.А., Гордеева З.Е., Мельникова Е.Э., Свешникова Н.А., Гайдамович С.Я. Выделение и идентификация шести штаммов вируса Крымской геморрагической лихорадки от больных в Таджикистане // ВИНИТИ, т.27, Вирусология, М., 1992. - С.53-57.

5. Вышемирский О.И. Анализ антигенной структуры штаммов вируса Крымской-Конго геморрагической лихорадки с помощью моноклональных антител // Автореферат диссертации на соискание ученой степени канд. мед. наук. - М., 1993.

6. Blackburn N.K., Besselaar T.G., Shepherd A.J., Swanepoel R. Preparation and use of monoclonal antibodies for identifying Crimean-Congo hemorrhagic fever virus // Am. J. Trop. Med. Hyg. - 1987. - V.37, N2. - P.392-397.

7. Saijo M., Tang Q., Shimayi B. et al. Antigen-capture enzyme-linked immunosorbent assay for the diagnosis of crimean-congo hemorrhagic fever using a novel monoclonal antibody // J. Med. Virol. - 2005. - V.77, N1. - P.83-88.

8. Goding J.W. Monoclonal antibodies: principles and practice. - Acad. Press Inc., London Ltd., 1986. - 2nd ed. - P.59-103.

9. The Т.Н., Feltkamp Т.Е. Conjugation of fluorescein isothiocyanate to antibodies. I. Experiments on the conditions of conjugation // Immunology. - 1970. - N.18. - P.865-873.

Штамм культивируемых гибридных клеток животного Mus musculus L. CCHFV Vd-1, депонированный в Государственную коллекцию патогенных микроорганизмов и клеточных культур «ГКПМ-ОБОЛЕНСК» под номером Н-25, являющийся продуцентом моноклонального антитела 4G4/B6 к вирусу Крым-Конго геморрагической лихорадки, пригодного для изготовления на его основе регламентированных средств обнаружения антигенов вируса ККГЛ в пробах биологического материала с помощью твердофазного иммуноферментного анализа и метода флуоресцирующих антител.



 

Похожие патенты:

Изобретение относится к области биотехнологиии и может быть использовано в гибридомной технологии для получения антител заданной специфичности против рекомбинантных антигенов, экспрессированных в клетках мыши.

Настоящее изобретение относится к иммунологии и биотехнологии. Предложены: изолированное антитело или его вариант, специфически распознающие PCSK9, и фармацевтическая композиция для снижения уровня холестерина-LDL на их основе.

Изобретение относится к иммунологии. .

Изобретение относится к области биотехнологии и иммунологии. .

Изобретение относится к иммунологии и биотехнологии. .

Настоящее изобретение относится к области иммунологии и вирусологии и предполагает использование антител, представляющих собой тримеризованные однодоменные антитела, для профилактики и терапии бешенства.

Изобретение относится к области иммунологии и биотехнологии. Представлены выделенное, искусственное или рекомбинантное антитело или его функциональная часть, способные специфически связывать F-антиген респираторно-синцитиального вируса, которые включают: вариабельную последовательность тяжелой цепи, содержащую CDR1 NYIIN (SEQ ID NO:1), CDR2 GIIPVLGTVHYAPKFQG (SEQ ID NO:2), CDR3 ETALVVSTTYLPHYFDN (SEQ ID NO:3), и вариабельную последовательность легкой цепи, содержащую CDR1 QASQDIVNYLN (SEQ ID NO:4), CDR2 VASNLET (SEQ ID NO:5), CDR3 QQYDNLP (SEQ ID NO:6); а также нуклеотидная последовательность, кодирующая указанное антитело.

Изобретение относится к биохимии и представляет собой варианты гуманизированных антител и их фрагменты, которые связываются с белком Е2 вируса гепатита С. .
Изобретение относится к области иммунологии и может быть использовано для диагностики, профилактики и лечения ВИЧ-инфекции. .

Изобретение относится к выделенному вирусу растений, названному вирус томата торрадо (ToTV), и его компонентам, а также к способам получения устойчивых к ToTV растений. .

Изобретение относится к области иммунологии и вирусологии. .

Настоящее изобретение относится к вирусологии и предполагает использование однодоменных мини-антител для профилактики и терапии гриппа. Заявлено однодоменное мини-антитело, специфически связывающееся с определенным эпитопом гемагглютинина вируса гриппа типа A (H5N2) и подавляющее инфекцию вируса гриппа типа A (H5N2). Создан аденовирусный вирусный вектор, экспрессирующий однодоменное мини-антитело, которое может эффективно связывать определенный эпитоп гемагглютинина вируса гриппа и тем самым блокировать развитие гриппозной инфекции. Предлагается композиция, состоящая из эффективного количества однодоменного мини-антитела и вирусного вектора, экспрессирующего такое однодоменное мини-антитело. Предлагается способ профилактики или терапии инфекции вируса гриппа A (H5N2), предусматривающий введение нуждающемуся в этом пациенту профилактически или терапевтически эффективного количества фармацевтической композиции интраназально в форме капель или спрея. 5 н. и 4 з.п. ф-лы, 10 ил., 2 табл., 10 пр.
Наверх