Система векторов экспрессии, включающая два селективных маркера

Изобретение относится к биотехнологии и представляет собой вектор экспрессии целевого продукта и комбинацию двух векторов экспрессии для экспрессии целевого продукта. Вектор экспрессии целевого продукта включает полинуклеотид, кодирующий целевой продукт, полинуклеотид, кодирующий первый селективный маркер (sm I), полинуклеотид, кодирующий второй селективный маркер (sm II), отличающийся от первого селективного маркера (sm I). На действие селективного маркера (sm I) или (sm II) по меньшей мере частично влияет действие другого селективного маркера. Селективные маркеры (sm I) и (sm II) участвуют в метаболизме фолата. Первый селективный маркер (sm I) является рецептором фолата альфа человека (huFolR). Второй селективный маркер (sm II) является ДГФР или его функциональным вариантом или производным. Предложенное изобретение позволяет получить эффективную систему отбора клеток-хозяев, вырабатывающих на высоком уровне целевой продукт. 2 н. и 6 з.п. ф-лы, 14 табл., 4 пр.

 

Область техники, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение относится к новой системе отбора, применимой для отбора клеток-хозяев, в частности клеток-хозяев млекопитающих, экспрессирующих целевой продукт. Указанная система отбора основана на применении по меньшей мере двух селективных маркеров (sm I и sm II), причем на действие селективного маркера (sm I) или (sm II) частично влияет действие другого селективного маркера. Настоящее изобретение предусматривает соответствующие векторы экспрессии, клетки-хозяева и способы отбора клеток-хозяев, экспрессирующих целевой продукт с высоким выходом. Кроме того, настоящее изобретение относится к способу эффективного получения полипептидов с высоким выходом.

Предпосылки создания изобретения

Способность клонировать и экспрессировать в больших количествах целевые продукты, например рекомбинантные пептиды и белки, приобретает все большее значение. Способность получать белки с высокой степенью очистки является важной задачей в области фармацевтики и биотехнологии, например, для получения белковых фармацевтических средств, а также в фундаментальных исследованиях, например, для кристаллизации белков с целью определения их трехмерной структуры. Белки, которые иным образом трудно получить в достаточном количестве, могут быть подвергнуты повышенной экспрессии в клетках-хозяевах и затем выделены и очищены.

Выбор системы экспрессии для выработки рекомбинантных белков зависит от многих факторов, включая особенности роста клеток, уровни экспрессии, внутриклеточную и внеклеточную экспрессию, посттрансляционные модификации и биологическое действие целевого белка, а также результаты регуляции и экономические обоснования при выработке терапевтических белков. Принципиальными преимуществами клеток млекопитающих относительно других систем экспрессии, например бактерий или дрожжей, являются их способность осуществлять правильную укладку белка, сложное N-связанное гликозилирование и аутентичное O-связанное гликозилирование, а также широкий спектр других посттрансляционных модификаций. Учитывая указанные преимущества, эукариотические клетки, и особенно клетки млекопитающих, в настоящее время являются предпочтительными системами экспрессии для выработки сложных белков терапевтического назначения, например, моноклональных антител.

Наиболее общий подход к получению клеток-хозяев с высоким уровнем экспрессии (также называемых высокоактивными продуцентами) сводится к получению соответствующего вектора экспрессии для экспрессии целевого продукта в качестве первой стадии. Вектор экспрессии индуцирует экспрессию полинуклеотида, кодирующего целевой продукт, в клетках-хозяевах и предусматривает по меньшей мере один селективный маркер для получения линии рекомбинантных клеток. К ключевым элементам векторов экспрессии млекопитающих обычно относится конститутивный или индуцибельный промотор, способный к надежной транскрипции; оптимизированный процессинг иРНК и сигналы трансляции, которые обычно включают последовательность Kozak, кодон терминации трансляции, сигналы расщепления иРНК и полиаденилирования, терминатор транскрипции и селективные маркеры для получения линий стабильных клеток и для амплификации гена; кроме того, начало репликации прокариот и селективные маркеры для размножения вектора в бактериях могут быть обеспечены вектором экспрессии.

В предшествующие годы внимание было сосредоточено на конструировании усовершенствованных векторов для экспрессии генов в организме хозяина, в частности в клетках млекопитающих. Несмотря на избыток доступных векторов, по-прежнему требуется надежная выработка полипептида/белка на высоком уровне в клетках млекопитающих.

Одним из общепринятых методов получения линий высокопродуктивных клеток, экспрессирующих целевой продукт на высоком уровне, является стабильная трансфекция клеток-хозяев. Однако стабильная интеграция в геном является редким событием, и только небольшая часть стабильно трансфецированных клеток представлена высокоэффективными продуцентами.

Селективные маркеры и системы селекции широко применяются в генной инженерии, методах рекомбинантной ДНК и в выработке рекомбинантных продуктов для получения клеток-хозяев, экспрессирующих на высоком уровне целевой продукт. Соответствующие системы также применяют для получения и идентификации стабильно трансфецированных клонов. Основной целью применения соответствующих селективных маркеров и селективных систем является внедрение селективного гена, который при воздействии селективных условий роста позволяет идентифицировать клетки, способные вырабатывать на высоком уровне целевые продукты рекомбинации. Повышение уровня экспрессии продукта может быть достигнуто, например, амплификацией гена, используя линии клеток, например, недостаточных по ферменту, например, по дигидрофолатредуктазе (ДГФР) или глутаминсинтетазе (ГС), соединенного с векторами экспрессии, содержащими гены, кодирующие такие ферменты - селективные маркеры, и агенты, например метотрексат (МТК), который ингибирует ДГФР, и метионин сульфоксамин (МСА), который ингибирует ГС. Более чувствительные мутантные формы соответствующих селективных маркеров также могут применяться в сочетании с клетками дикого типа. Используемые векторы экспрессии, содержащие рекомбинантный ген под контролем сильного промотора, и гены, кодирующие селективные маркеры, например ДГФР или ГС, ДГФР (плюс) или ГС (плюс) трансфектанты, соответственно, сначала получают, а затем гены амплифицируют путем выращивания трансфектантов при постепенном повышении концентраций МТК или МСА. Цель обеспечения такого селективного давления заключается в выделении клеток, которые экспрессируют селективные маркеры и соответственно на высоком уровне экспрессируют целевой продукт.

Таким образом, высокая эффективность системы отбора имеет принципиальное значение для накопления высокопродуктивных клеток в популяции трансфецированных клеток. Чем выше эффективность системы отбора, тем ниже количество низкопродуктивных вариантов после процесса отбора и выше вероятность обнаружения очень редких клонов с чрезвычайно высоким уровнем продуктивности.

Задача настоящего изобретения заключается в получении эффективной системы отбора для отбора клеток-хозяев, вырабатывающих на высоком уровне целевой продукт, а также соответствующих векторов экспрессии и клеток-хозяев.

Краткое описание изобретения

Настоящее изобретение относится к системе отбора для отбора клеток-хозяев, экспрессирующих целевой продукт на высоком уровне, и к получению соответствующих продуктов, в частности полипептидов.

В одном из вариантов осуществления настоящее изобретение относится к вектору экспрессии или к комбинации по меньшей мере двух векторов экспрессии, включающих по меньшей мере:

(а) полинуклеотид, кодирующий целевой продукт или сайт инсерции для инкорпорирования полинуклеотида, кодирующего целевой продукт,

(б) полинуклеотид, кодирующий первый селективный маркер (sm I),

(в) полинуклеотид, кодирующий второй селективный маркер (sm II), который отличается от первого селективного маркера (sm I), причем на действие селективного маркера (sm I) или (sm II) по меньшей мере частично влияет действие другого селективного маркера, и селективные маркеры (sm I) и (sm II) участвуют в метаболизме фолата.

Настоящее изобретение также относится к клетке-хозяину, особенно к клетке-хозяину млекопитающего, по меньшей мере включающей:

(а) интродуцированный полинуклеотид, кодирующий целевой продукт,

(б) интродуцированный полинуклеотид, кодирующий первый селективный маркер (sm I),

(в) интродуцированный полинуклеотид, кодирующий второй селективный маркер (sm II), который отличается от первого селективного маркера (sm I),

причем на действие селективного маркера (sm I) или (sm II) по меньшей мере частично влияет действие другого селективного маркера, и селективные маркеры (sm I) и (sm II) участвуют в метаболизме фолата.

Кроме того, предусмотрен способ отбора по меньшей мере одной клетки-хозяина, способной экспрессировать целевой продукт, включающий:

(а) получение множества клеток-хозяев, включающий по меньшей мере

(i) интродуцированный полинуклеотид, кодирующий целевой продукт,

(ii) интродуцированный полинуклеотид, кодирующий первый селективный маркер (sm I),

(iii) интродуцированный полинуклеотид, кодирующий второй селективный маркер (sm II), который отличается от первого селективного маркера (sm I),

причем на действие селективного маркера (sm I) или (sm II) по меньшей мере частично влияет действие другого селективного маркера, и селективные маркеры (sm I) и (sm II) участвуют в метаболизме фолата,

(б) культивирование указанного множества клеток-хозяев в условиях, избирательных для селективных маркеров (sm I) и (sm II), тем самым получая клетку-хозяина, экспрессирующую целевой продукт.

Также предусмотрена селективная культуральная среда, которая может применяться в способе отбора по настоящему изобретению и которая включает фолат в предельно допустимой концентрации и антифолат.Понятие «селективная культуральная среда» означает культуральную среду, применимую для отбора клеток-хозяев.

Настоящее изобретение также относится к способу получения целевого продукта, включающему культивирование клеток-хозяев по настоящему изобретению или клеток-хозяев, отобранных по рекомендациям настоящего изобретения в условиях, допускающих экспрессию целевого продукта.

Настоящее изобретение также относится к применению первого селективного маркера (sm I) в комбинации со вторым селективным маркером (sm II), который отличается от первого селективного маркера (sm I). На действие селективного маркера (sm I) или (sm II) по меньшей мере частично влияет действие другого селективного маркера при отборе эукариотической клетки-хозяина, в частности клетки-хозяина млекопитающего, экспрессирующей целевой продукт. Селективные маркеры (sm I) и (sm II) предпочтительно участвуют в одном и том же или согласованном метаболическом процессе или пути, важном для выживаемости или размножения клеток. Предпочтительно селективные маркеры (sm I) и (sm II) участвуют в метаболизме фолата.

Стратегия настоящего изобретения заключается в применении двух селективных маркеров (sm I) и (sm II), причем на действие селективного маркера (sm I) или (sm II) по меньшей мере частично влияет действие другого селективного маркера, и оба селективных маркера (sm I) и (sm II) участвуют в одном и том же метаболическом пути, важном для выживаемости и деления клеток, что приводит к очень эффективным условиям отбора. В настоящем изобретении это может быть объяснено, исходя из предпочтительного варианта осуществления настоящего изобретения, в котором оба селективных маркера (sm I) и (sm II) участвуют в метаболизме фолата. Метаболизм фолата представляет важный метаболический путь, принципиально важный для выживаемости и роста клеток. Поскольку действие селективного маркера (sm I) или (sm II) влияет на действие другого селективного маркера, и оба селективных маркера участвуют в метаболизме фолата, метаболизм фолата проявляется в селективных культуральных условиях эффективно только в том случае, если оба селективных маркера (sm I) и (sm II) экспрессируются в достаточном количестве и соответственно экспрессируются на высоком уровне в реципиентных клетках-хозяевах. Таким образом, селективное давление на клетки-хозяева в существенной степени повышается.

В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения, который также объясняет, каким образом на действие селективного маркера (sm II) по меньшей мере частично влияет действие селективного маркера (sm I), селективный маркер (sm I) является полипептидом-переносчиком или включает полипептид-переносчик, который инкорпорирует фолат в клетку-хозяина. Селективный маркер (sm II) является каталитическим полипептидом, процессирующим в качестве субстрата фолат, инкорпорированный селективным маркером (sm I), или последующий продукт, полученный или выработанный из указанного импортированного фолата. Предпочтительным примером соответствующего каталитического полипептида является ДГФР. Полагают, что в таком варианте осуществления настоящего изобретения второй селективный маркер (sm II) действует с повышенной эффективностью или с повышенной скоростью оборота, если переносчик фолата (sm I) инкорпорирует достаточные количества фолата в клетки-хозяева. Не опираясь на теорию, полагают, что эффективная экспрессия переносчика фолата в качестве селективного маркера (sm I) на высоком уровне позволяет клеткам-хозяевам импортировать больше фолата из культуральной среды в клетку и, соответственно, позволяет клеткам-хозяевам переносить пониженные концентрации фолата в культуральной среде. Экспрессия на высоком уровне переносчика фолата (sm I) приводит к тому, что достаточное количество субстрата для каталитического полипептида (sm II) (или предшественника указанного субстрата) импортируется в клетку-хозяина и таким образом становится доступным для каталитического полипептида (sm II). Таким образом, на действие каталитического полипептида (sm II) влияет действие переносчика фолата (sm I), поскольку действие каталитического полипептида (sm II) зависит от того, что достаточные количества фолата импортируются в клетку-хозяина переносчиком фолата (sm I). Поэтому жизнеспособность поддерживается/повышается в том случае, когда клетка-хозяин на высоком уровне экспрессирует первый селективный маркер (sm I) и таким образом импортирует достаточные количества фолата в клетку для поддержания метаболизма фолата, даже если концентрация фолата в культуральной среде очень низкая. Из-за действия переносчика фолата (sm I) доступность субстрата для каталитического полипептида (sm II) повышается. Селективная культуральная среда может включать ингибитор каталитического полипептида (sm II), например конкурента его фактического субстрата. Клетки, интенсивно экспрессирующие каталитический полипептид (sm II), устойчивы к повышенным концентрациям указанного ингибитора, особенно при высоких концентрациях субстрата, причем указанная концентрация по меньшей частично зависит от действия переносчика фолата, используемого в качестве селективного маркера (sm I). Такое соединение активности/функциональности селективных маркеров (sm I) и (sm II) проявляется в том, что жизнеспособность клеток-хозяев и/или скорость роста значительно повышена в условиях селективной среды, если оба селективных маркера (sm I) и (sm II) интенсивно экспрессируются. Выживание/пролиферация клеток-хозяев, происходящая независимо от условий селективной среды, может сохранить на достаточном уровне метаболизм фолата, что позволяет допустить выживание и рост клеток.

Уникальная структура системы экспрессии по настоящему изобретению обеспечивает в высокой степени интенсивную систему отбора, позволяющую накапливать высокопродуктивные клетки из популяции трансфецированных клеток-хозяев. Такая высокая точность системы отбора по настоящему изобретению снижает число низкопродуктивных продуцентов в популяции после отбора и повышает вероятность обнаружения очень редких клонов с чрезвычайно высоким уровнем продуктивности. Это повышает продуктивность отбора популяции клеток по выживаемости. В примерах показано, что клетки-хозяева, полученные с помощью системы отбора по настоящему изобретению, вырабатывают целевой продукт с высокой продуктивностью. Также повышена средняя продуктивность отдельных клонов-продуцентов. Таким образом, система отбора по настоящему изобретению повышает вероятность обнаружения клонов с высокой продуктивностью при меньших усилиях, затраченных на скрининг.

Приведенные выше предположения отражают современное понимание лежащих в основе механизмов, но на низ не замыкаются, поскольку могут быть другие объяснения наблюдаемой зависимости/повышения в селективном давлении при использовании селективных маркеров (sm I) и (sm II), которые оба вовлечены в метаболизм фолата. Кроме того, согласно изложенному в подробном описании, основное положение настоящего изобретения также применимо к другим метаболическим процессам или метаболическим путям и другим селективным маркерам помимо (sm I) и (sm II). Однако важно отметить, что на действие селективного маркера (sm I) или (sm II) по меньшей мере частично влияет действие другого селективного маркера для повышения селективного давления. Таким образом, другие положения, свойства, преимущества и объекты настоящего изобретения станут ясны специалистам в данной области из последующего описания и прилагаемой формулы изобретения. Следует учитывать, однако, что приводимые ниже описание, формула изобретения и конкретные примеры, отражающие предпочтительные варианты осуществления настоящего изобретения, приводятся только в качестве иллюстрации. Различные изменения и модификации в рамках охвата описанного изобретения станут очевидны специалистам в данной области после ознакомления с последующим описанием.

Подробное описание изобретения

Согласно одному из объектов настоящего изобретения предусмотрены вектор экспрессии или комбинация по меньшей мере двух векторов экспрессии, включающие по меньшей мере:

(а) полинуклеотид, кодирующий целевой продукт или сайт инсерции для инкорпорирования полинуклеотида, кодирующего целевой продукт,

(б) полинуклеотид, кодирующий первый селективный маркер (sm I),

(в) полинуклеотид, кодирующий второй селективный маркер (sm II), который отличается от первого селективного маркера (sm I),

причем на действие селективного маркера (sm I) или (sm II) по меньшей мере частично влияет действие другого селективного маркера.

Понятие «селективный маркер (selectable marker - sm)» означает маркер, который экспрессируется интродуцированным полинуклеотидом и позволяет в определенных условиях селективной культуры отбирать клетки-хозяева, экспрессирующие указанный селективный маркер. Селективным маркером предпочтительно является биомолекула, в частности полипептид. Соответствующие селективные маркеры подробно описаны ниже.

Понятие «вектор» по настоящему изобретению означает полинуклеотид, способный нести по меньшей мере один полинуклеотидный фрагмент. Вектор функционирует в качестве носителя молекул, высвобождающего фрагменты нуклеиновых кислот, соответственно полинуклеотиды, в клетку-хозяина. Он может представлять по меньшей мере одну кассету экспрессии, включающую регуляторные последовательности для правильной экспрессии полинуклеотида, инкорпорированного в этот вектор. Полинуклеотиды (например, кодирующие целевой продукт или селективные маркеры), интродуцируемые в клетку, могут быть инсертированы в кассету (кассеты) экспрессии вектора для экспрессии с него. Вектор по настоящему изобретению может быть в кольцевой или линейной (линеаризированной) форме, и к этому понятию также относятся фрагменты вектора. Понятие «вектор» также включает искусственные хромосомы или близкие соответствующие полинуклеотиды, позволяя трансфецировать фрагменты чужеродной нуклеиновой кислоты.

Понятие «полинуклеотид» относится к полимеру из нуклеотидов, которые обычно связаны через одну дезоксирибозу или рибозу с другой, и относится к ДНК и РНК в зависимости от контекста. Понятие «полинуклеотид» не подразумевает каких-либо ограничений по размеру и также охватывает полинуклеотиды, включающие модификации, в частности модифицированные нуклеотиды.

Понятие «интродуцированный полинуклеотид» относится к полинуклеотиду, который был интродуцирован в клетку-хозяина, например, за счет применения методов рекомбинации, например трансфекции. Клетка-хозяин может включать или не включать эндогенный полинуклеотид, соответствующий или идентичный интродуцированному полинуклеотиду. Интродукции можно достичь, например, путем трансфекции соответствующего вектора, который может интегрировать в геном клетки-хозяина (стабильная трансфекция). Соответствующие векторы, допускающие интродукцию полинуклеотида в клетку-хозяина, подробно описаны ниже. В том случае, если интродуцированный полинуклеотид не инсертирован в геном, интродуцированный полинуклеотид может быть потерян на более поздней стадии, например, если клетка претерпевает митоз (кратковременная трансфекция). Соответствующие векторы также могут поддерживаться в клетке-хозяине без интеграции в геном, например, путем эписомальной репликации. Однако в предшествующем уровне техники также известны другие методы интродукции полинуклеотида в клетку-хозяина, подробно описанные ниже.

Понятие «целевой продукт» относится к продукту, который экспрессируется в указанной клетке-хозяине. Целевой продукт может быть, например, полипептидом или полинуклеотидом, например РНК. Предпочтительно целевой продукт является полипептидом, в частности молекулой иммуноглобулина. Примеры описаны ниже.

Понятие «полипептид» относится к молекуле, представляющей полимер из аминокислот, связанных вместе пептидными связями (связью). К полипептидам относятся полипептиды какой-либо длины, включая белки (например, имеющие более 50 аминокислот) и пептиды (например, включающие 2-49 аминокислот). К полипептидам относятся белки и/или пептиды какого-либо действия или биологической активности. Соответствующие примеры приведены ниже.

Признак, заключающийся в том, что «на действие селективного маркера (sm I) или (sm II) по меньшей мере частично влияет действие другого селективного маркера», в частности означает, что на действие одного селективного маркера влияет и/или от него зависит по меньшей мере в определенной степени прямо или опосредованно действие другого селективного маркера (и необязательно vice versa). В данном контексте понятие «действие» в частности описывает какую-либо функцию или действие селективного маркера, которое обеспечивает, индуцирует и/или повышает устойчивость к селективному давлению и включает, но ими не ограничивается, каталитическое действие, степень оборота, скорость кинетической реакции и/или скорость переноса селективного маркера. Такая зависимость/взаимодействие селективных маркеров (sm I) и (sm II) может существенно повысить селективное давление на клетки-хозяева в селективных культуральных условиях. Предпочтительно селективный маркер (sm I) и селективный маркер (sm II) участвуют в одном и том же или в близком метаболическом процессе или метаболическом пути, важном для жизнеспособности или деления клеток. Соответствующие примеры селективных маркеров (sm I) и (sm II) и метаболических процессов и метаболических путей подробно описаны ниже.

Впоследствии в настоящем изобретении описывают варианты его осуществления и преимущества вектора экспрессии или комбинаций векторов экспрессии по настоящему изобретению. В соответствующих местах настоящего изобретения описаны указанные преимущества вместе с применением указанного вектора (векторов) при отборе клеток-хозяев, экспрессирующих целевой продукт.

На основании рекомендаций, приведенных в настоящем изобретении, на действие селективного маркера (sm I) или (sm II) влияет и, соответственно, по меньшей мере частично зависит действие другого селективного маркера в культуральных условиях, избирательных для обоих селективных маркеров. Из-за такого взаимодействия селективных маркеров (sm I) и (sm II) повышается селективное давление на клетки-хозяева. Благодаря уникальному строению предусмотрена в высокой степени эффективная система отбора, позволяющая обогащать содержание высокопродуктивных клеток из популяции трансфецированных клеток-хозяев. Такая в высокой степени эффективная система отбора по настоящему изобретению снижает число низкопродуктивных клеток в популяции после отбора и повышает вероятность обнаружения очень редких чрезвычайно продуктивных клонов.

В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения оба селективных маркера (sm I) и (sm II) вовлечены в один и тот же метаболический процесс, который предпочтительно важен для жизнеспособности и/или пролиферации клеток, например синтез нуклеиновых кислот или полипептидов. Таким образом, если вектор экспрессии или комбинацию по меньшей мере двух векторов экспрессии интродуцируют в реципиентную клетку-хозяина, действие/наличие указанных селективных маркеров (sm I) и (sm II) в сочетании с селективными условиями культуральной среды воздействуют/атакуют один и тот же метаболический процесс в реципиентных клетках-хозяевах. Таким образом, действие селективных маркеров (sm I) и (sm II) влияет друг на друга в указанном метаболическом процессе, тем самым повышая селективное давление на клетку-хозяина. Клетки-хозяева выживают/пролиферируют в селективных культуральных условиях и, несмотря на селективные культуральные условия, могут поддерживать указанный метаболический процесс в достаточной мере для того, чтобы допустить выживание и рост клеток. Выживание/рост индуцируются, если указанные клетки-хозяева экспрессируют оба селективных маркера (sm I) и (sm II) и соответственно интродуцированные вектор (векторы) экспрессии с высоким уровнем продуктивности. Таким образом, отбирают клетки-хозяева, которые экспрессируют на высоком уровне целевой продукт.

Понятие «метаболический путь» особенно относится к процессу в клетках-хозяевах, который важен для выживания клеток и/или для пролиферации клеток. К примерам метаболических путей относится синтез нуклеиновой кислоты или полипептида. Понятие «метаболический путь» в частности относится к подгруппе метаболических процессов и описывает определенные серии химических реакций, имеющихся в клетке. В каждом метаболическом пути основное химическое вещество модифицируется химическими реакциями. Классическим примером метаболического пути является синтез нуклеотидов (принадлежащий к метаболическому процессу синтеза нуклеиновых кислот), в частности биосинтез пурина или пиримидина, или синтез аминокислот (принадлежащих к метаболическому процессу синтеза полипептидов). Известно несколько уровней метаболических путей, которые также часто являются взаимозависимыми и таким образом связанными. Таким образом, указанные термины следует понимать скорее функционально, поскольку отдельные метаболические пути и метаболические процессы часто перекрещиваются.

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения первый селективный маркер (sm I) и/или второй селективный маркер (sm II) участвуют в метаболическом процессе или в метаболическом пути, который выбран из

а) синтеза нуклеиновых кислот и/или синтеза полипептидов,

б) синтеза нуклеотидов и/или синтеза аминокислот, и

в) метаболизма фолата.

Указанные метаболические процессы/пути важны для поддержания клеточной жизнеспособности клеток-хозяев и/или для пролиферации клеток-хозяев. Таким образом, они являются точками приложения усилий для селективной системы по настоящему изобретению. Таким образом, такие метаболические пути весьма применимы для выбора соответствующих селективных маркеров, участвующих в этом отношении в качестве селективного маркера (sm I) и селективного маркера (sm II), и соответствующих селективных условий, позволяя отбирать клетки-хозяева, экспрессирующие указанные маркеры. Применимые селективные маркеры, участвующие в соответствующих метаболических путях, а также соответствующие клетки-хозяева и соответствующие селективные условия, известны в предшествующем уровне техники и описаны ниже и таким образом могут применяться вместе с настоящим изобретением.

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения первый селективный маркер (sm I) и/или второй селективный маркер (sm II) является селективным эукариотическим маркером. Понятие «эукариотический селективный маркер» относится к маркеру, который позволяет отбирать эукариотические клетки-хозяева, отличающиеся соответственно экспрессией указанного селективного маркера. Указанный эукариотический селективный маркер может быть метаболическим селективным маркером и таким образом маркером, который участвует в метаболическом процессе или пути в клетке, например в синтезе нуклеиновой кислоты или полипептида.

Кроме того, первый селективный маркер (sm I) и/или второй селективный маркер (sm II) может быть амплифицируемым селективным маркером. Амплифицируемый селективный маркер позволяет отбирать клетки-хозяева, содержащие вектор, и индуцирует амплификацию гена. Примеры соответствующих амплифицируемых селективных маркеров известны из предшествующего уровня техники, например ДГФР и ГС.

Первый селективный маркер (sm I) и/или второй селективный маркер (sm II) может быть каталитическим полипептидом или транспортерным полипептидом. Есть много соответствующих применимых селективных маркеров, которые могут применяться вместе с настоящим изобретением и будут подробно объяснены ниже.

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения второй селективный маркер (sm II) является каталитическим полипептидом, процессирующим:

(а) субстрат, который представляет соединение, инкорпорированное первым селективным маркером (sm I) в клетку-хозяина, или последующий продукт, полученный из указанного инкорпорированного соединения, и/или

(б) субстрат или его предшественник, которые получаются под действием первого селективного маркера (sm I).

Поэтому указанный каталитический полипептид, используемый в качестве селективного маркера (sm II), может процессировать субстрат, импортируемый в клетку-хозяина, за счет действия первого селективного маркера (sm I). Он также может процессировать субстрат, который вырабатывается под действием первого селективного маркера (sm I). Указанное соединение, которое, например, инкорпорировано в клетку-хозяина первым селективным маркером (sm I), также может быть предшественником конкретного субстрата, который процессируется вторым селективным маркером (sm II). Таким образом, каталитический полипептид (sm II) также может процессировать субстрат, который представляет последующий продукт, полученный из соединения, которое инкорпорировано в клетку-хозяина под действием первого селективного маркера (sm I). Тот же подход применяют в случае селективного маркера (sm I), который является каталитическим полипептидом вместо полипептида-переносчика.

Не опираясь на теорию, полагают, что в настоящем изобретении действие второго селективного маркера (sm II) четко зависит от действия первого селективного маркера (sm I) в культуральных условиях, селективных для обоих маркеров. Наличие и/или количество субстрата для второго селективного маркера (sm II) зависит по меньшей мере в некоторой степени от надлежащей экспрессии/действия селективного маркера (sm I). Интенсивная сверхэкспрессия первого селективного маркера (sm I) приводит к повышенной доступности субстрата для второго селективного маркера (sm II). Повышенная доступность субстрата повышает действие второго селективного маркера (например, интенсивность оборота). Однако если селективный маркер (sm I) не экспрессируется на достаточном уровне, не вырабатывается или вырабатывается в меньшем количестве субстрат для селективного маркера (sm II), действие которого также снижается.

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения первым селективным маркером (sm I) является полипептид-переносчик, ответственный за интродукцию/инкорпорирование соединения из культуральной среды в клетку-хозяина, которое является субстратом или предшественником субстрата второго селективного маркера (sm II). Предпочтительно указанное соединение важно для выживаемости и/или пролиферации клеток. Полагают, что в таком варианте осуществления настоящего изобретения второй селективный маркер (sm II) действует с повышенной интенсивностью оборота, если первый селективный маркер (sm I) инкорпорирует достаточные количества указанного соединения в клетки-хозяева. Не опираясь на теорию, полагают, что интенсивная сверхэкспрессия первого селективного маркера (sm I) позволяет клеткам-хозяевам импортировать большее количество указанного соединения из культуральной среды в клетку и соответственно позволяет клеткам-хозяевам переносить пониженные концентрации указанного соединения в культуральной среде. Это также приводит к повышенной доступности указанного соединения и соответственно субстрата (или предшественника указанного субстрата) второго селективного маркера (sm II) в клетке-хозяине. Те же принципы применимы в случае, когда первый селективный маркер (sm I) является каталитическим полипептидом, вырабатывающим субстрат или предшественник субстрата, который прицессируется/используется вторым селективным маркером (sm II). Такое допущение отражает современное понимание лежащих в основе механизмов, однако не является непременным, поскольку могут быть другие объяснения наблюдаемой зависимости/повышению селективного давления.

Действие селективных маркеров (sm I) или (sm II) влияет на действие других селективных маркеров, и оба нацеливаются на один и тот же или на связанный процесс или метаболический путь, например синтез нуклеотида или метаболизм фолата, которые соответственно функционируют более эффективно в селективных культуральных условиях, если оба селективных маркера экспрессируются в достаточных количествах и, соответственно, экспрессируются на повышенном уровне в клетке-хозяине. Это приводит к селективным условиям особой точности.

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения первый селективный маркер (sm I) действует ранее по цепи относительно второго селективного маркера (sm II). Это означает, например, что в том же или в согласованном метаболическом пути первый селективный маркер (sm I) может, например, действовать в начале указанного метаболического пути, а второй селективный маркер (sm II) действует далее по цепи от селективного маркера (sm I).

В одном из предпочтительных вариантов осуществления настоящего изобретения первый селективный маркер (sm I) является полипептидом-переносчиком или включает полипептид-переносчик. Понятие «полипептида-переносчика» относится к определенному полипептиду, опосредующему перенос соединения из одного компартмента в другой, в частности из культуральной среды в клетку-хозяина. К примерам соответствующих полипептидов-переносчиков относятся рецепторные полипептиды, каналы и носители.

В качестве полипептида-переносчика указанный селективный маркер (sm I) предпочтительно импортирует соединение в клетку-хозяина, которая участвует в жизнеспособности или пролиферации клетки-хозяина и/или важна для них. Таким образом, клеточная жизнеспособность или пролиферация зависит по меньшей мере частично от импорта указанного соединения в клетку-хозяина. Второй селективный маркер (sm II), используемый в комбинации с полипептидом-переносчиком (sm I), предпочтительно является ферментом, который участвует в метаболическом пути или процессе, на который влияет/от которого зависит действие по переносу первого селективного маркера (sm I), поскольку он позволяет, например, применять импортированное соединение или его последующий продукт. В таком варианте осуществления настоящего изобретения действие и в особенности скорость оборота указанного второго селективного маркера (sm II) по меньшей мере частично зависит от действия полипептида-переносчика (sm I), который импортирует указанное соединение в клетку-хозяина. В соединении с данным вариантом осуществления настоящего изобретения может применяться селективная культуральная среда, которая включает ограничивающую концентрацию указанного соединения, которое импортируется полипептидом-переносчиком (sm I) в клетку-хозяина.

Понятие «ограничивающей концентрации» относится к концентрации указанного соединения в селективной культуральной среде, которая обеспечивает селективное давление на клетку-хозяина. Поэтому указанное соединение не включается в селективную культуральную среду в достатке, тем самым обеспечивая селективное давление на клетку-хозяина. Таким образом, селективная культуральная среда может быть, например, истощенной, соответственно, может содержать небольшие количества указанного соединения, которое включено/перенесено в клетку полипептидом-переносчиком (sm I).

Таким образом, выживаемость клеток поддерживается/повышается в случае сверхэкспрессии клеткой-хозяином первого селективного маркера (sm I) и таким образом импортируются достаточные количества указанного соединения в клетку для поддержания вовлеченного метаболического пути, даже в концентрации указанного соединения в культуральной среде в очень низком количестве. Если экспрессия и соответственно действие полипептида-переносчика (sm I) повышается, доступность субстрата второго селективного маркера (sm II) повышается. Если второй селективный маркер (sm II) является каталитическим полипептидом, селективная культуральная среда может включать ингибитор указанного второго селективного маркера (sm II), например конкурента имеющегося субстрата второго селективного маркера (sm II). Клетки, интенсивно сверхэкспрессирующие второй селективный маркер (sm II), переносят повышенные концентрации указанного ингибитора, особенно при высоких концентрациях субстрата (который по меньшей мере частично зависит от действия селективного маркера (sm I)). Имеющийся эффект выражается в том, что жизнеспособность клетки-хозяина существенно повышается в селективных условиях, если оба селективных маркера (sm I) и (sm II) усиленно экспрессируются. Таким образом, степень экспрессии целевого продукта является повышенной. Таким образом, объединение действия/функциональности селективных маркеров (sm I) и (sm II) приводит к усиленным селективным условиям, которые позволяют отбирать клоны клеток с высокой и чрезвычайно высокой экспрессией. Тот же принцип применим в случае первого селективного маркера (sm I), который является ферментом, участвующим в получении/выработке субстрата для второго селективного маркера (sm II) (см. выше).

В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения первый селективный маркер (sm I) и второй селективный маркер (sm II) участвуют в метаболизме фолата. Фолат по настоящему изобретению, например, может быть окисленным фолатом (т.е. фолиевой кислотой) или восстановленным фолатом или его производным. В общем фолат применим в настоящем изобретении до тех пор, пока фолат может поступать в клетку-хозяина, в частности в клетку-хозяина млекопитающего. Окисленный фолат, т.е. фолиевая кислота, а также восстановленные производные фолиевой кислоты, известные в качестве восстановленных фолатов или тетрагидрофолатов (ТГФ), представляют группу витаминов В9, которые представляют важные кофакторы и/или коферменты для биосинтеза пуринов, тимидилата и определенных аминокислот у эукариотических клеток, в частности клеток млекопитающих. Кофакторы ТГФ особенно важны для репликации ДНК и соответственно для пролиферации клеток. Конкретно кофакторы ТГФ функционируют в качестве доноров одноуглеродных блоков в сериях взаимосвязанных метаболических путей, вовлеченных de novo в биосинтез пуринов и тимидилата, аминокислот, а также в метаболизм метильной группы, включая метилирование островков CpG в ДНК. Конкретно кофакторы ТГФ, включающие 10-формил-ТГФ (10-СНО-ТГФ), включают одноуглеродные блоки в две ключевые de novo реакции формилтрансферазы, вовлеченные de novo в биосинтез пуринов. Предпочтительным примером окисленного фолата является фолиевая кислота. Предпочтительными примерами восстановленных фолатов являются 5-метил-тетрагидрофолиевая кислота, 5-формил-террагидрофолиевая кислота и 5,10-метилен-тетрагидрофолиевая кислота.

В отличие от большинства прокариот, растений и грибов, которые синтезируют свои собственные фолаты, млекопитающие и другие виды эукариот лишены биосинтеза кофакторов ТГФ и поэтому должны получать их из экзогенных источников, обычно из культуральной среды. В настоящее время известны три независимые системы переноса для опосредования потребления фолатов и антифолатов в клетках млекопитающих:

а) Преобладающая клеточная система переноса восстановленных кофакторов фолата представляет носитель восстановленного фолата (НВФ). НВФ (также называемый представителем 1 семейства 19 растворимых носителей - solute carrier family 19 member 1 (SLC19A1)) является повсеместно экспрессируемым мембранным гликопротеином с примерной массой ~85 кДа в качестве двунаправленного облегченного носителя, который опосредует транспорт вверх восстановленных фолатов путем обмена органических фосфатов, например адениновых нуклеотидов, о которых известно, что они аккумулируются до очень высоких внутриклеточных уровней, а также тиамина монофосфата и тиамина пирофосфата. НВФ проявляет высокое сродство в отношении кофакторов ТГФ, включая лейковорин (5-формил-ТГФ; Kt=1 мкМ), хотя испытывают очень слабое связывающее сродство (Kt=200-400 мкМ) для фолиевой кислоты, окисленного фолата.

б) Другой путь потребления фолата обеспечивает протон-сопряженный переносчик фолата (ПСПФ, также обозначаемый SLC46A), который ранее был клонирован. Складывается представление, что ПСПФ экспрессируется независимо от НВФ, функционирует оптимально при кислом значении рН (5,5) и опосредует приток и окисленных фолатов (например, фолиевой кислоты), и кофакторов ТГФ (т.е. восстановленных фолатов), а также гидрофильных антифолатов, включая МТК. ПСПФ, который проявляет оптимальный транспорт фолатов и антифолатов при кислом значении рН (5,5), но не проявляет его при физиологическом значении рН (7,4), играет ключевую роль в поглощении и фолатов, и антифолатов в верхнем отделе тонкого кишечника.

в) Третий путь транспорта включает рецепторы фолата (РФ). РФ являются гликопротеины, связывающие фолат с высоким сродством, кодируемые тремя разными генами - РФ альфа, РФ бета и РФ гамма. РФ альфа также называют «фолат-связывающим белком взрослых» или «FDP», фолатным рецептором 1 или FOLR (у мышей - folbpl) и ассоциированным с раком яичника антигеном или MOv 18. РФ бета также обозначают «FOLR2» (фетальный) и «FBP/PL-1» (плацентарный). РФ гамма также обозначают «FOLR3» и «РФ-G» (см. обзор M.D.Salazar и М.Ratnam, Cancer Metastasis Rev. 26 (1), 2007, cc.141-152). Зрелые РФ, которые хорошо описаны, являются гомологичными белками с ~70-80% идентичностью аминокислот, которые содержат от 229 до 236 аминокислот, а также от двух до трех сайтов N-гликозилирования. РФ альфа и РФ бета являются связанными с мембраной, в частности заякорены гликозилфосфатидилинозитолом (ГФИ), с белками поверхности клеток, тогда как РФ гамма избегает заякоривания через ГФИ и является секретируемым белком. РФ альфа и РФ бета проявляют высокое сродство с фолиевой кислотой (Kd=0,1-1 нМ), 5,10-дидеазатетрагидрофолиевой кислотой (ДДАТГФ; лометрексол; Ki=0,4-1,3 нМ, используя [³Н]фолиевую кислоту в качестве субстрата) и BGC945 (который является основанным на циклопента[³H]квиназолине, ингибитор тимидилатсинтазы, специфически транспортируемым исключительно через РФ альфа, а не через восстановленный носитель фолата) (Kd=1 нМ), но намного более низкое сродство в отношении МТК (Kd>100 нМ). РФ-зависимое потребление фолата и антифолата протекает через классический механизм рецептор-опосредованного эндоцитоза.

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения первым селективным маркером (sm I) является транспортный полипептид, который импортирует по меньшей мере один фолат из культуральной среды в клетку-хозяина. В целом фолат применим в рамках настоящего изобретения до тех пор, пока такой фолат будет способен потребляться клеткой-хозяином, особенно клеткой млекопитающего, первым селективным маркером (sm I).

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения первый селективный маркер (sm I) является или включает восстановленный носитель фолата (НВФ), или его функциональный вариант или фрагмент. НВФ является повсеместно экспрессируемым мембранным гликопротеином, который выступает в качестве главного переносчика для потребления восстановленных фолатов, например 5-метил-ТГФ и 5-формил-ТГФ, в клетке. Однако НВФ проявляет очень слабое сродство с окисленным фолатом, фолиевой кислотой. Таким образом, клетка, утратившая экспрессию НВФ или в геноме которой был делегирован локус НВФ, может служить в качестве реципиента для трансфекции гена селективного маркера НВФ (наподобие (sm I)) в условиях, при которых восстановленные фолаты, например 5-формил-ТГФ, постепенно истощаются из культуральной среды, тем самым заставляя клетки экспрессировать повышенные уровни такого переносчика фолата.

В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения, который также подробно описан в разделе примеров, первый селективный маркер (sm I) является полипептидом-переносчиком фолата или включает его и предпочтительно является функциональным рецептором фолата. Применение рецептора фолата или функционального варианта или его фрагмента имеет несколько преимуществ относительно применения системы отбора НВФ. Нет необходимости применять клетки, в которых эндогенный локус РФ был подвергнут нокауту, или инактивирован целевым нокаутом, или утратил функциональные мутации. Кроме того, НВФ обладает слабым транспортным сродством в отношении фолиевой кислоты и, таким образом, такой окисленный фолат не может применяться в культуральной среде для отбора. Однако фолиевая кислота может процессироваться рецептором фолата. Кроме того, основанная на рецепторе фолата система отбора представляет систему однонаправленного потребления фолата, причем НВФ является двунаправленным переносчиком фолата, который проявляет равноценные по силе импорт и экспорт фолатов. Таким образом, применение рецептора фолата обладает несколькими важными преимуществами. Однако он может также применяться в комбинации с НВФ в качестве селективного маркера.

Соответствующие рецепторы фолата могут быть интродуцированы в эукариотическую клетку, предназначенную для выработки целевого продукта, через вектор экспрессии или комбинацию по меньшей мере двух векторов экспрессии по настоящему изобретению. После интродукции полинуклеотида, кодирующего рецептор фолата в качестве первого селективного маркера (sm I), a также полинуклеотида, кодирующего целевой продукт (типа полипептида), и полинуклеотида, кодирующего второй селективный маркер (sm II), клетки выращивают в селективной среде, содержащей предельно допустимые концентрации фолатов. Пониженная концентрация фолата в культуральной среде создает более жесткие условия отбора. Предпочтительно если первый селективный маркер (sm I) является рецептором фолата или включает его, второй селективный маркер (sm II) является каталитическим полипептидом, процессирующим субстрат, который является или фолатом и/или последующим продуктом, полученным из фолата. Поэтому клетки, которые избыточно экспрессируют интродуцированный рецептор фолата, могут потреблять достаточные количества фолатов для устойчивого роста клеток, репликации ДНК и таким образом клеточной пролиферации. Этот эффект дополнительно повышается из-за обстоятельства, заключающегося в том, что действие второго селективного маркера (sm II) зависит от действия первого селективного маркера (sm I) или на него влияет действие этого маркера, в данном случае действие по переносу рецептора фолата (см. выше). В результате выживают только те клетки, которые усиленно сверхэкспрессируют интродуцированные селективные маркеры (sm I) и (sm II) и, соответственно, сверхэкспрессируют целевой продукт. Такой подход не требует зависимости выбранного варианта осуществления настоящего изобретения от проведенной ранее делеции гена эндогенного рецептора фолата (РФ), хотя такой вариант осуществления настоящего изобретения также допустим.

Рецептор фолата, интродуцированный в эукариотическую клетку-хозяина с помощью вектора экспрессии, применяемого в настоящем изобретении, может быть получен из какого-либо вида, если он может быть функциональным в рамках настоящего изобретения, т.е. совместимым с применяемой эукариотической клеткой. Предпочтительно рецептор фолата, полученный от вида млекопитающего животного, может применяться, например, будучи полученным от грызуна, или, что наиболее предпочтительно, будучи рецептором фолата человека.

В целом переносчик фолата, особенно рецептор фолата, интродуцированный в эукариотическую клетку-хозяина и используемый в качестве селективного маркера, может быть гомологичным или гетерологичным по отношению к эндогенному рецептору фолата клетки-хозяина. В случае гомологичного рецептора, рецептор может быть получен от того же вида, что и клетка-хозяин, и может, например, быть идентичным эндогенному рецептору фолата клетки-хозяина. В случае гетерологичного рецептора, рецептор может быть получен от другого вида, отличного от вида-хозяина, и таким образом может быть отличным от эндогенного рецептора фолата клетки-хозяина. Обычно интродуцированный переносчик фолата, предпочтительно рецептор, применяемый в качестве селективного маркера, может быть гетерологичным для клетки-хозяина. Например, полученный от человека рецептор фолата может применяться в качестве селективного маркера для клетки-хозяина грызуна, например для клетки СНО.

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения рецептор фолата является функциональным связанным с мембраной рецептором фолата. Указанный рецептор может быть функциональным связанным с мембраной рецептором, способным к однонаправленному импорту или потреблению фолата или его производного в эукариотическую клетку. Связанный с мембраной рецептор фолата может быть производным от какого-либо вида согласно указанному выше.

Функциональный связанный с мембраной рецептор фолата, применяемый в качестве первого селективного маркера (sm I), может быть выбран из группы, состоящей из рецептора фолата альфа, рецептора фолата бета, рецептора фолата гамма, рецептора фолата, имеющего или включающего аминокислотную последовательность SEQ. ID. NO.1, 2 или 3, и функциональные варианты вышеупомянутых соединений. Предпочтительным является рецептор фолата альфа человека или его функциональный вариант.

Функциональный вариант включает производное рецептора фолата, которое функционально является физиологическим, т.е. способным потреблять фолат клеткой-хозяином (которая предпочтительно является эукариотической, предпочтительно клеткой-хозяином млекопитающего), и содействует жизнеспособности клетки через метаболизм фолата в клетке. Например, вариантная форма рецептора фолата может включать одну или несколько аминокислотных мутаций, например замещение, делецию и/или добавление одной или нескольких аминокислот. К настоящему термину также относятся варианты гибридных белков, включающие соответствующий рецептор фолата.

Предпочтительно рецептором фолата является рецептор альфа фолата человека, рецептор бета фолата человека или их функциональный вариант.Наиболее предпочтителен рецептор альфа фолата человека, имеющий или включающий следующую аминокислотную последовательность (SEQ. ID. NO.1, однобуквенный код, показанный в направлении от N-конца к С-концу): MAQRMTTQLLLLLVWVAVVGEAQTRIAWARTELLNVCMNAKHHKEKPGPEDKLHEQCRPWRKNACCSTNTSQEAHKDVSYLYRFNWNHCGEMAPACKRHFIQDTCLYECSPNLGPWIQQVDQSWRKERVLNVPLCKEDCEQWWEDCRTSYTCKSNWHKGWNWTSGFNKCAVGAACQPFHFYFPTPTVLCNEIWTHSYKVSNYSRGSGRCIQMWFDPAQGNPNEEVARFYAAAMSGAGPWAAWPFLLSLALMLLWLLS.

Другой предпочтительный вариант осуществления настоящего изобретения относится к рецептору бета фолата человека, имеющему или включающему следующую аминокислотную последовательность (SEQ. ID. NO.2, однобуквенный код, показанный в направлении от N-конца к С-концу): MVWKWMPLLLLLVCVATMCSAQDRTDLLNVCMDAKHHKTKPGPEDKLHDQCSPWKKNACCTASTSQELHKDTSRLYNFNWDHCGKMEPACKRHFIQDTCLYECSPNLGPWIQQVNQTWRKERFLDVPLCKEDCQRWWEDCHTSHTCKSNWHRGWDWTSGVNKCPAGALCRTFESYFPTPAALCEGLWSHSYKVSNYSRGSGRCIQMWFDSAQGNPNEEVARFYAAAMHVNAGEMLHGTGGLLLSLALMLQLWLLG.

В другом варианте рецептор фолата применяют в качестве первого селективного маркера (sm I), который в норме не связан с мембраной. Такой несвязанный с мембраной рецептор может быть изменен для того, чтобы стать связанным с мембраной. Например, мембранный якорь может быть получен и/или указанный рецептор фолата может экспрессироваться в качестве гибридного белка, включающего несвязанный с мембраной рецептор фолата и трансмембранную область другого полипептида. Подобным образом могут применяться другие варианты, которые легко доступны для специалистов в данной области. Связанные с ними предпочтительные примеры могут основываться на растворимом рецепторе гамма фолата, предпочтительно на растворимом рецепторе гамма фолата человека. В наиболее предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения растворимый рецептор гамма фолата человека может иметь/включать следующую аминокислотную последовательность (SEQ. ID. NO. 3, однобуквенный код, показанный в направлении от N-конца к С-концу): MDMAWQMMQLLLLALVTAAGSAQPRSARARTDLLNVCMNAKHHKTQPSPEDELYGQCSPWKKNACCTASTSQELHKDTSRLYNFNWDHCGKMEPTCKRHFIQDSCLYECSPNLGPWIRQVNQSWRKERILNVPLCKEDCERWWEDCRTSYTCKSNWHKGWNWTSGINECPAGALCSTFESYFPTPAALCEGLWSHSFKVSNYSRGSGRCIQMWFDSAQGNPNEEVAKFYAAAMNAGAPSRGIIDS.

Указанный рецептор может быть мутирован или иным способом генетически изменен, получен в качестве производного или модифицирован для формирования функционального связанного с мембраной рецептора фолата, способного потреблять фолат в контексте настоящего изобретения.

Из вышесказанного следует, что селективный маркер (маркеры) (sm I) и/или (sm II) может быть или может включать каталитический полипептид, участвующий в синтезе нуклеиновых кислот и/или в метаболизме фолата. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения первый селективный маркер (sm I) является переносчиком или включает переносчик, инкорпорирующий соединение, участвующее и/или важное для синтеза нуклеиновых кислот в клетке-хозяине, и второй селективный маркер (sm II) является каталитическим полипептидом, участвующим в синтезе нуклеиновых кислот, например в синтезе нуклеотидов. Предпочтительно второй селективный маркер (sm II) является каталитическим полипептидом, предпочтительно ферментом, участвующим в синтезе нуклеиновых кислот, в частности в метаболизме фолата. Это особенно полезно, если первый селективный маркер (sm I) переносит фолат в клетку-хозяина и является, например, рецептором фолата.

В процессе синтеза нуклеиновых кислот первый фермент, глицинамидрибонуклеотидтрансформилаза (ГАРТФ), участвует в формировании имидазольного кольца пуринов, а расположенная ниже по цепи реакция, опосредованная 5-аминоимидазол-4-карбоксамидрибонуклеотидтрансформилазой (АИКАРТФ), приводит к формированию пуринового промежуточного продукта инозин-5'-монофосфата (ИМФ). ИМФ выступает ключевым предшественником для регулируемого биосинтеза АМФ и ГМФ. Кроме того, 5,10-метилен-ТГФ (5,10-СН2-ТГФ) является другим важным коферментом ТГФ, который функционирует в качестве решающего кофактора фермента тимидилатсинтазы (ТС). ТС катализирует формирование дезокситимидинмонофосфата (дТМФ) из дезоксиуридинмонофосфата (дУМФ), используя 5,10-метилен-ТГФ (5,10-СН₂-ТГФ), тем самым представляя дигидрофолиевую кислоту. Дигидрофолатредуктаза (ДГФР) катализирует НАДФ-зависимое восстановление дигидрофолиевой кислоты до тетрагидрофолиевой кислоты (ТГФ). Затем ТГФ внутренне конвертирует в 10-формил-ДГФ и 5,10-метилен-ДГФ, которые используются в биосинтезе de novo пуринов и тимидилата, соответственно. Эта реакция катализируется сериновой гидроксиметилтрансферазой (СГМТ). ДГФ представляет побочный продукт каталитического действия тимидилатсинтазы (ТС), которая катализирует конверсию дезоксиуридинмонофосфата (дУМФ) в дезокситимидин монофосфат (дТМФ) в ходе 5,10-метилен-ТГФ-зависимой реакции. Таким образом, ДГФР принципиально важен для рециклирования кофакторов ТГФ, существенных для биосинтеза пуриновых и пиримидиновых нуклеотидов, которые необходимы для репликации ДНК.

Описанные ферменты, которые до некоторой степени зависимы от фолата, являются ключевыми медиаторами биосинтеза de novo пуриновых и тиминовых нуклеотидов, важных для репликации ДНК, и применимы в качестве первого селективного маркера (sm I) и/или (sm II), поскольку они участвуют в одном и том же метаболическом процессе, а именно в синтезе нуклеиновых кислот.

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения второй селективный маркер (sm II) перерабатывает субстрат, которым является фолат, производное фолата и/или продукт, который может быть получен процессингом фолата, например, ДГФ, или ТГФ, или функциональный вариант или производное указанных соединений. Соответствующие субстраты важны для выработки нуклеиновых кислот. Предпочтительно указанным вторым селективным маркером (sm II) является или включает в себя дегидрофолатредуктаза (ДГФР) или фермент, действующий ниже по цепи/соответственно вместе с ДГФР, например ТС и СГМТ. Такой вариант осуществления настоящего изобретения особенно применим, если селективный маркер (sm I) является переносчиком фолата.

Несколько соответствующих ферментов ДГФР и соответственно генов, известных из предшествующего уровня техники, могут применяться в настоящем изобретении. ДГФР может быть ферментом ДГФР дикого типа или его функциональным вариантом или производным. Понятие «вариант» или «производное» включает ферменты ДГФР, имеющие одно или несколько изменений в аминокислотной последовательности (например, делеций, замещений или добавлений) по сравнению с аминокислотной последовательностью соответствующего фермента ДГФР, гибридные белки, включающие фермент ДГФР или его функциональный фрагмент, и ферменты ДГФР, которые были модифицированы для получения дополнительной структуры и/или функции, а также функциональные фрагменты перечисленных молекул, которые сохраняют по меньшей мере одну функцию фермента ДГФР. Например, фермент ДГФР может применяться в качестве селективного маркера (sm II), который, например, в той или иной степени чувствителен к антифолатам, например к МТК, по сравнению с ферментом ДГФР дикого типа и/или с ферментом ДГФР, эндогенно экспрессируемым клеткой-хозяином (если он экспрессируется). Фермент ДГФР можно получить от какого-либо вида, если он может быть функциональным в рамках настоящего изобретения, т.е. совместимым с используемой клеткой-хозяином. Например, мутантный мышиный фермент ДГФР со значительной устойчивостью к МТК активно применяли в качестве доминантного селективного маркера, что существенно повышает приобретение высокого уровня МТК-устойчивости в клетках-трансфектантах. Предпочтительно фермент ДГФР применяют в качестве селективного маркера, который менее чувствителен к ингибитору ДГФР, например МТК, чем фермент ДГФР, эндогенно экспрессируемый в клетке-хозяине ДГФР+(плюс).

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения интрон или его фрагмент помещают с 3'-конца открытой рамки считывания гена ДГФР. Это оказывает полезное воздействие на степень экспрессии/амплификации конструкции. Интрон, применяемый в кассете экспрессии ДГФР, приводит к меньшему нефункциональному варианту гена ДГФР (Grillari и др., J. Biotechnol. 87, 2001, cc.59-65). В результате уровень экспрессии гена ДГФР понижается и таким образом может дополнительно повышать силу системы отбора. Соответственно клетка-хозяин может включать интродуцированный полинуклеотид, кодирующий фермент ДГФР, указанный полинуклеотид включает интрон, который локализован с 3'-конца кодирующей последовательности ДГФР. Другие способы, в которых применяют интрон для снижения уровня экспрессии гена ДГФР, описаны в ЕРО 724639 и также могут применяться.

В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения первым селективным маркером (sm I) является рецептор фолиевой кислоты, а вторым селективным маркером является вариант ДГФР, который менее чувствителен к МТК, чем фермент ДГФР дикого типа и/или фермент ДГФР, эндогенно экспрессируемый клеткой-хозяином. Указанный вариант ДГФР также предпочтительно включает интрон согласно описанному выше. Соответствующая маркерная комбинация особенно предпочтительна в комбинации с клетками ДГФР (плюс).

Рекомендации по настоящему изобретению могут быть выполнены, используя разные варианты осуществления векторов экспрессии и/или комбинации по меньшей мере двух векторов экспрессии, согласно описанию настоящего изобретения. Полинуклеотид, кодирующий целевой продукт или сайт инсерции для инкорпорирования соответствующего полинуклеотида, полинуклеотид, кодирующий первый селективный маркер (sm I), и/или полинуклеотид, кодирующий второй селективный маркер (sm II), и необязательно дополнительные элементы вектора, например дополнительные селективные маркеры, могут быть локализованы на одном и том же или на разных векторах экспрессии.

Например, применение вектора экспрессии, включающего по меньшей мере все принципиально важные описанные выше элементы, т.е. полинуклеотид, кодирующий целевой продукт (или сайт инсерции для включения соответствующего полинуклеотида), полинуклеотид, кодирующий первый селективный маркер (sm I), и полинуклеотид, кодирующий второй селективный маркер (sm II), обладает преимуществом, которое заключается в том, что только один вектор экспрессии должен быть интродуцирован в клетку-хозяина. Кроме того, в частности при получении стабильной линии экспрессии повышаются шансы того, что все элементы равны или по меньшей мере экспрессируются в сходной пропорции клеткой-хозяином, поскольку они могут вместе интегрировать в геном.

Однако в рамках охвата настоящего изобретения также можно применять комбинацию по меньшей мере двух или трех векторов экспрессии для трансфекции, причем соответствующие полинуклеотиды локализованы в разных векторах экспрессии. Указанную комбинацию векторов экспрессии затем трансфецируют в клетку-хозяина. При применении комбинации по меньшей мере двух векторов экспрессии, предпочтительно подбирают вариант комбинации, в которой по меньшей мере один полинуклеотид, кодирующий целевой продукт (или сайт инсерции для интродукции целевого полинуклеотида), и по меньшей мере один из селективных маркеров (sm I) или (sm II) собраны в одном и том же векторе экспрессии. Это особенно важно, если комбинацию векторов экспрессии применяют для того, чтобы установить линию клеток со стабильной экспрессией для того, чтобы обеспечить тесное соединение экспрессии селективного маркера ((sm I) и/или (sm II) с экспрессией целевого продукта. Другой селективный маркер (sm I) или (sm II) может быть локализован на отдельном векторе экспрессии указанной комбинации векторов экспрессии. Указанный отдельный вектор экспрессии, который соответственно включает другой селективный маркер (sm I) или (sm II), может включать дополнительный полинуклеотид, кодирующий целевой продукт. Соответствующий вариант может, например, применяться для экспрессии молекул иммуноглобулина. Однако в настоящем изобретении также предусмотрено, что все полинуклеотиды (кодирующие целевой продукт, (sm I) и (sm II)) локализованы на разных и таким образом индивидуальных векторах экспрессии.

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения вектор по настоящему изобретению включает сайт инсерции для инсерции полинуклеотида, кодирующего целевой продукт, но еще не включает полинуклеотид, кодирующий целевой продукт. Соответствующий «пустой» вектор экспрессии может применяться для инсерции полинуклеотида, кодирующего требуемый целевой продукт, тем самым получая готовый к применению вектор экспрессии, который может быть инкорпорирован в клетку-хозяина для экспрессии целевого продукта. Инкорпорирование может быть достигнуто за счет применения соответствующих методов клонирования, например, путем применения ферментов рестрикции для инсерции полинуклеотида, кодирующего целевой продукт. Для этой цели вектор экспрессии может включать, например, множественный сайт для клонирования (полилинкер, multiple cloning site - MCS), который, например, может применяться во всех рамках считывания. Соответствующий множественный сайт для клонирования в качестве примера сайта инсерции может быть локализован в кассету экспрессии. Соответствующий «пустой» вектор экспрессии представляет полезный инструмент для экспрессии разных целевых продуктов в качестве вектора экспрессии и может быть легко адаптирован для намеченного применения путем инсерции полинуклеотида, кодирующего требуемый целевой продукт.

Вектор экспрессии или комбинация по меньшей мере двух векторов экспрессии могут дополнительно включать другие элементы вектора. Например, может быть предусмотрен по меньшей мере один дополнительный полинуклеотид, кодирующий другой целевой продукт. Такой вариант осуществления настоящего изобретения особенно применим для экспрессии молекул иммуноглобулина. Другие общие элементы вектора, которые могут применяться, известны в предшествующем уровне техники и включают, но ими не ограничиваются, репликоны, дополнительные селективные маркеры, промоторы для экспрессии в разных клетках-хозяевах или для экспрессии in vitro.

Вектор экспрессии или комбинация по меньшей мере двух векторов экспрессии по настоящему изобретению могжет включать по меньшей мере один полинуклеотид, кодирующий по меньшей мере функциональный фрагмент тяжелой цепи молекулы иммуноглобулина, и по меньшей мере один полинуклеотид, кодирующий по меньшей мере функциональный фрагмент легкой цепи молекулы иммуноглобулина. Указанные полинуклеотиды могут быть локализованы в один и тот же или в разные векторы экспрессии в случае применения комбинации по меньшей мере двух векторов экспрессии. В рамках охвата настоящего изобретения также предусмотрено применение комбинации по меньшей мере двух векторов экспрессии, причем один вектор экспрессии включает по меньшей мере полинуклеотид, кодирующий первый селективный маркер (sm I), и по меньшей мере полинуклеотид, кодирующий по меньшей мере функциональный фрагмент легкой цепи молекулы иммуноглобулина, и/или полинуклеотид, кодирующий тяжелую цепь указанной молекулы иммуноглобулина, и другой вектор экспрессии указанной комбинации включает по меньшей мере полинуклеотид, кодирующий второй селективный маркер (sm II), и по меньшей мере полинуклеотид, кодирующий по меньшей мере функциональный фрагмент легкой цепи указанной молекулы иммуноглобулина и/или полинуклеотид, кодирующий тяжелую цепь указанной молекулы иммуноглобулина. Соответствующий вариант также описан в примерах. При экспрессии указанных полинуклеотидов в клетке-хозяине получают функциональную молекулу иммуноглобулина. Полинуклеотид, кодирующий по меньшей мере функциональный фрагмент тяжелой цепи молекулы иммуноглобулина, и полинуклеотид, кодирующий по меньшей мере функциональный фрагмент легкой цепи молекулы иммуноглобулина, могут быть включены в одну и ту же кассету экспрессии или в разные кассеты экспрессии, что также описано ниже.

Вектор экспрессии или комбинация по меньшей мере двух векторов экспрессии по настоящему изобретению могут дополнительно включать один или несколько дополнительных полинуклеотидов, кодирующих один или несколько дополнительных селективных маркеров. Указанный дополнительный маркер (маркеры) может участвовать в том же или согласованном метаболическом процессе или метаболическом пути, что и селективные маркеры (sm I) и (sm II). Однако он также может участвовать в другом метаболическом пути. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения может быть применен совместный отбор, в котором применяют систему по настоящему изобретению, вместе с одной или несколькими другими системами отбора (например, системами отбора по устойчивости к антибиотикам, например, neo/G418), для дополнительного улучшения процесса. Помимо дополнительных эукариотических селективных маркеров, которые позволяют производить отбор эукариотических клеток-хозяев, также могут применяться прокариотические селективные маркеры. «Прокариотический селективный маркер» представляет селективный маркер, допускающий отбор прокариотических клеток-хозяев в определенных селективных условиях. Примерами соответствующих прокариотических селективных маркеров являются маркеры, которые обеспечивают устойчивость к антибиотикам, например к ампициллину, канамицину, тетрациклину и/или хлорамфениколу.

Векторы, применяемые для экспрессии целевых продуктов, обычно содержат элементы контроля транскрипции, применимые для индукции транскрипции, например, промоторы, энхансеры, сигналы полиаденилирования, сигналы остановки или прекращения транскрипции, в качестве элемента кассеты экспрессии. Если требуемым продуктом является белок, соответствующие элементы контроля транскрипции предпочтительно включены в вектор, например, 5'-нетранслируемые области, приводящие к 5'-кэповым структурам, применимым для рекрутинга рибосом, и стоп-кодоны для терминации процесса трансляции. В частности, полинуклеотиды, выступающие в качестве генов селективных маркеров, а также полинуклеотид, кодирующий целевой продукт, могут транскрибироваться под контролем элементов транскрипции, имеющихся в соответствующих промоторах. Получаемые транскрипты генов селективного маркера и целевого продукта несут функциональные элементы трансляции, которые способствуют формированию высоких уровней экспрессии белка (т.е. трансляции) и истинной терминации трансляции. Единица функциональной экспрессии, способная правильно индуцировать экспрессию инкорпорированного полинуклеотида, в контексте настоящего изобретения также относится к понятию «кассета экспрессии». Полинуклеотид (полинуклеотиды), кодирующие целевой продукт, и полинуклеотиды, кодирующий селективные маркеры sm (I) и (sm II), предпочтительно включены в кассету экспрессии. Применимы несколько вариантов осуществления настоящего изобретения, например, каждый из указанных полинуклеотидов может быть включен в другую кассету экспрессии. Однако в рамках охвата настоящего изобретения также предусмотрено, что по меньшей мере два соответствующих полинуклеотида включены в одну кассету экспрессии.

Соответственно, вектор экспрессии или комбинация векторов экспрессии по настоящему изобретению может включать по меньшей мере один промотор и/или элемент промотора/энхансера в качестве элемента кассеты экспрессии. Хотя физические границы между такими двумя контрольными элементами не всегда ясны, понятие «промотор» обычно относится к сайту молекулы нуклеиновой кислоты, с которым связывается РНК-полимераза и/или какие-либо ассоциированные факторы и с которого начинается транскрипция. Энхансеры усиливают действие промотора во времени и в пространстве. Многие промоторы проявляют действие по индукции транскрипции в широком диапазоне типов клеток. Промоторы могут быть поделены на два класса - те, которые действуют конститутивно, и те, которые регулируются за счет индукции или дерепрессии. Промоторы обоих классов применимы вместе со способами по настоящему изобретению. Промоторы, применяемые для выработки на высоком уровне белков в клетках млекопитающих, должны быть сильными и предпочтительно действующими в широком диапазоне типов клеток.

К сильным конститутивным промоторам, которые индуцируют экспрессию в клетках многих типов, относятся, но ими не ограничиваются, главный поздний промотор аденовируса, предранний промотор цитомегаловируса человека, промотор SV40 и вируса саркомы Рауша, а также промотор 3-фосфоглицераткиназы мыши EF1a. Хорошие результаты получают с вектором экспрессии по настоящему изобретению, если применяют промотор и/или энхарсер из CMV и/или SV40. Промоторы транскрипции могут быть выбраны из группы, состоящей из промотора SV40, промотора CMV, промотора ЕF1альфа, промотора RSV, промотора BROAD3, промотора мыши rosa26, промотора pCEFL и промотора β-актина.

Предпочтительный вариант осуществления настоящего изобретения относится к вектору экспрессии по настоящему изобретению, в котором полинуклеотид, кодирующий целевой продукт, полинуклеотид, кодирующий первый селективный маркер (sm I) и/или полинуклеотид, кодирующий второй селективный маркер (sm II), находятся под контролем отличных промоторов транскрипции. В целом промотор, способный к индукции экспрессии, в частности транскрипции, необходимых полинуклеотидов в клетке-хозяине, особенно в эукариотической клетке-хозяине, могут быть применимы. Другие промоторы транскрипции, индуцирующие экспрессию с полинуклеотидов, могут быть теми же или отличными.

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения применяют более сильный промотор и/или энхансер для индукции экспрессии полинуклеотида, кодирующего целевой продукт, чем для индукции экспрессии полинуклеотида, кодирующего первый селективный маркер (sm I) и/или (sm II). Такая сборка обладает таким свойством, что вырабатывается больше транскрипта для целевого продукта, чем для селективных маркеров. Преимущество заключается в том, что выработка целевого продукта доминирует над выработкой селективных маркеров, поскольку мощность отдельной клетки по выработке гетерологичных продуктов не ограничена, поэтому следует сосредоточиться на целевом продукте. Кроме того, способ отбора происходит только на начальных стадиях создания линии экспрессирующих клеток, которые затем постоянно вырабатывают целевой продукт. Таким образом, полезно сосредоточить ресурсы клеток на экспрессии/выработке целевого продукта. Кроме того, применение менее сильного промотора для экспрессии селективного маркера (маркеров) (sm I) и/или (sm II) по сравнению с промотором целевого продукта, дополнительно повышает селективное давление.

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения промотор, индуцирующий экспрессию полинуклеотида, кодирующего целевой продукт, является промотором CMV, и промотор, индуцирующий экспрессию полинуклеотида, кодирующего селективный маркер (sm I) и/или (sm II), является промотором SV40. Известно, что промотор CMV является одним из наиболее сильных промоторов, доступных для экспрессии у млекопитающих, и приводит к очень хорошей степени экспрессии. Предполагают, что промотор CMV дает намного больше транскрипта, чем промотор SV40.

В другом варианте осуществления настоящего изобретения полинуклеотид, кодирующий целевой продукт, полинуклеотид, кодирующий первый селективный маркер (sm I), и/или полинуклеотид, кодирующий второй селективный маркер (sm II), находятся под контролем одного и того же промотора транскрипции. Соответствующие промоторы описаны выше. В таком варианте осуществления настоящего изобретения один длинный транскрипт получают с соответствующей кассеты экспрессии, которая находится под контролем указанного промотора транскрипции. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения по меньшей мере один элемент IRES функционально локализован между полинуклеотидом, кодирующим первый селективный маркер (sm I), и/или полинуклеотидом, кодирующим второй селективный маркер (sm II). Таким образом, гарантируется, что с указанного транскрипта получают раздельные продукты трансляции.

Вектор экспрессии или комбинация по меньшей мере двух векторов экспрессии могут включать соответствующий сайт терминации транскрипции в качестве элемента кассеты экспрессии. По мере продолжения транскрипции с расположенного выше по цепи промотора через вторую единицу транскрипции он может ингибировать функцию расположенного ниже по цепи промотора, этот феномен называется окклюзией промотора или интерференцией транскрипции. Это явление описано и для прокариот, и для эукариот. Правильное размещение сигналов терминации транскрипции между двумя единицами транскрипции может предотвратить окклюзию промотора. Сайты терминации транскрипции описаны и показано, что их включение в векторы экспрессии оказывает множественные полезные воздействия на генную экспрессию.

Применяемая клетка-хозяин предпочтительно является эукариотической, особенно принадлежащей млекопитающему. Большинство возникающих эукариотических иРНК имеет поли-А хвост с 3'-конца, который добавляется во время сложного процесса, включающего расщепление первичного транскрипта и связанную с ним реакцию полиаденилирования. Хвост поли-А полезен для стабильности и перемещаемости иРНК. Поэтому кассеты экспрессии вектора по настоящему изобретению обычно включают сайт полиаденилирования для терминации транскрипции и полиаденилирования. Имеется несколько эффективных сигналов поли-А, которые могут применяться в векторах экспрессии млекопитающих, в том числе производные бычьего гормона роста (bovine growth hormone - bgh), бета-глобина мыши, единиц ранней транскрипции SV40 и гена тимидинкиназы вируса Herpes simplex. Однако также известны синтетические сайты полиаденилирования (см., например, вектор экспрессии pCI-neo фирмы Promega, который обоснован Levitt и др., 1989, Genes Dev. 3(7), 1989, cc.1019-1025). Сайт полиаденилирования может быть выбран из группы, состоящей из сайта поли-А SV40, например, позднего и раннего сайта поли-А SV40 (см., например, плазмиду pSV2-ДГФР по описанию Subramani и др., Mol.Cell. Biol., 1981, cc.854-864), синтетического сайта поли-А (см., например, вектор экспрессии pCI-neo фирмы Promega, основанный на работе Levitt и др., Genes Dev. 3(7), 1989, cc.1019-1025) и сайта поли-А bgh (bovine growth hormone - бычьего гормона роста).

Кроме того, кассета экспрессии, включающая полинуклеотид, кодирующий целевой продукт, полинуклеотид, кодирующий первый селективный маркер (sm I), и/или полинуклеотид, кодирующий второй селективный маркер (sm II), может включать по меньшей мере один интрон. Такой вариант осуществления настоящего изобретения особенно применим, когда клетку-хозяина млекопитающего применяют для экспрессии. Большинство генов высших эукариот содержит интроны, которые удаляют во время процессинга РНК. Соответствующие конструкции экспрессируются более эффективно в трансгенных системах, чем идентичные конструкции, утратившие интроны. Обычно интроны помещают с 5'-конца открытой рамки считывания, но они также могут быть помещены с 3'-конца. Соответственно интрон может быть включен в кассету (кассеты) экспрессии для повышения степени экспрессии. Указанный интрон может быть локализован между элементом (элементами) промотора или промотора/энхансера и 5'-концом открытой рамки считывания экспрессируемого полинуклеотида. В данной области известно несколько соответствующих интронов, которые могут применяться в рамках настоящего изобретения.

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения интроном, применяемым в кассетах экспрессии для экспрессии целевого продукта, является синтетический интрон, например интрон SIS или RK. Интрон RK является сильным синтетическим интроном, который предпочтительно помещен перед стартовым кодоном ATG целевого гена. Интрон RK состоит из сайта сплайсирования интрона донора промотора CMV и сайта сплайсирования акцептора вариабельной области тяжелой цепи IgG мыши (см., например, Eaton и др., Biochemistry 25, 1986, cc.8343-8347, Neuberger и др., ЕМВО J. 2(8), 1983, cc.1373-1378; от может быть получен из вектора pRK-5 (фирма BD PharMingen)).

Вектор экспрессии или комбинация векторов экспрессии по настоящему изобретению могут быть трансфецированы в клетку-хозяина в свойственной ему кольцевой форме. Суперскрученные молекулы вектора обычно могут быть конвертированы в линейные молекулы в ядре из-за действия эндо- и экзонуклеаз. Однако линеаризация вектора экспрессии перед трансфекцией часто улучшает эффективность стабильной трансфекции. Точка линеаризации также может контролироваться, если вектор экспрессии линеаризуют перед трансфекцией. Соответственно в одном из вариантов осуществления настоящего изобретения вектор экспрессии или комбинация по меньшей мере двух векторов экспрессии включает по меньшей мере один предопределенный сайт рестрикции, который может применяться для линеаризации вектора (векторов) перед трансфекцией. Продуманное размещение указанного сайта рестрикции для линеаризации обладает преимуществом, поскольку указанный сайт рестрикции определяет, является ли вектор открытым/линеаризованным и, таким образом определяет порядок/сборку кассет экспрессии, если конструкция интегрирована в геном эукариотической клеткой, особенно клетки млекопитающего. В том случае, когда вектор применяют в качестве стандартного вектора экспрессии, предназначенного, например, для применения в качестве инструмента экспрессии нескольких разных продуктов/полипептидов, полезно обеспечить сайт рестрикции для линеаризации, включая сайты множественного распознавания для ферментов, имеющие низкую частоту разрезания. Ферменты рестрикции, выбранные для линеаризации, предпочтительно не должны производить разрезов внутри кассет экспрессии для получения инсерции, селективных маркеров или других каркасных последовательностей вектора, чтобы убедиться, что фермент производит только один разрез для должной линеаризации вектора. За счет обеспечения сайта рестрикции для линеаризации, включая сайты множественного распознавания для ферментов рестрикции, обладающие низкой частотой разрезания, для работы может быть выбран соответствующий фермент рестрикции для линеаризации из предоставленных возможностей, чтобы надежно избежать рестрикции в полинуклеотиде, кодирующем целевой продукт. Однако, согласно отмеченному выше, дополнительные сайты рестрикции могут быть мутированы или может проводиться их частичное рестрикционное расщепление. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения сайт линеаризации собран таким образом, что при линеаризации полинуклеотид, кодирующий эукариотический амплифицируемый селективный маркер, локализован с 5'-конца полинуклеотида, кодирующего целевой продукт. Такая сборка имеет преимущество для генной амплификации. В случае дополнительного использования прокариотического селективного маркера полинуклеотид, кодирующий указанный маркер, локализован с 3'-конца полинуклеотида, кодирующего целевой продукт. В этом случае прокариотический ген селективного маркера расположен с 3'-конца и таким образом находится «за пределами» частей «млекопитающего» нуклеиновой кислоты линеаризованного вектора. Такая сборка имеет преимущество, поскольку прокариотические гены предположительно не являются предпочтительными для эукариотической экспрессии, в частности для экспрессии у млекопитающих, поскольку прокариоические последовательности могут привести к повышенному метилированию или другим проявлениям сайленсинга в клетках млекопитающих.

Вектор экспрессии может включать дополнительные элементы, чтобы осуществить комбинацию способа отбора по настоящему изобретению с другими системами отбора, известными в данной области. Один из принятых в предшествующем уровне техники способов отбора основан на применении жидкостной цитометрии, в частности флуоресцентно-активированной сортировки клеток (fluorescence-activated cell sorting - FACS). Способы отбора, в которых используют жидкостную цитометрию, обладают преимуществом, заключающимся в том, что можно быстро проводить скрининг большого количества клеток. В одном из способов отбора, который особенно применим для идентификации клонов высокопродуктивных клеток, часть целевого продукта, например антитела, экспрессируется в качестве связанного с мембраной гибридного полипептида. Таким образом, часть продукта представлена в качестве гибридного полипептида на поверхности клетки. Поскольку количество выработанного гибридного полипептида коррелирует с общей степенью экспрессии, клетки-хозяева могут быть отобраны жидкостной цитометрией, основанной на количестве гибридного полипептида, представленного на поверхности клеток. Это позволяет быстро отбирать высокопродуктивные клетки-хозяева. Установлено, что система отбора по настоящему изобретению преимущественно может быть объединена с соответствующими методами отбора, которые основаны на применении жидкостной цитометрии. Для проведения эффективного отбора с помощью FACS предпочтительно используют специальную кассету экспрессии для экспрессии целевого продукта. Таким образом, в одном из вариантов осуществления настоящего изобретения вектор экспрессии, или комбинация по меньшей мере двух векторов экспрессии по настоящему изобретению, включает кассету экспрессии для экспрессии полинуклеотида, кодирующего целевой продукт, который сконструирован таким образом, что часть экспрессированного целевого продукта включает трансмембранный якорь. Существует несколько вариантов достижения такого результата.

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения указанная кассета экспрессии включает по меньшей мере:

(а) полинуклеотид, кодирующий целевой продукт,

(б) по меньшей мере один стоп-кодон ниже по цепи от полинуклеотида, кодирующего целевой продукт, и

(в) другой полинуклеотид ниже по цепи от стоп-кодона, кодирующий мембранный якорь и/или сигнал для мембранного якоря.

Конструкция экспрессирующей кассеты обладает свойством, которое заключается в том, что через процессы сквозного прочтения трансляции (стоп-кодон представляет мутацию типа «leaky») вырабатывается часть целевого продукта в качестве гибридного полипептида, включающего мембранный якорь. В результате такой гибридный полипептид представлен на поверхности клетки, и клетки, представляющие высокие уровни заякоренного в мембране гибридного полипептида, могут быть выбраны жидкостной цитометрией, предпочтительно методом FACS. Таким образом, отбирают клетки-хозяева с высокой степенью экспрессии. Детали и предпочтительные варианты осуществления такого метода, основанного на стоп-кодоне, описаны в WO 2005/073375 и РСТ/ЕР2009/006246. Он рассмотрен в настоящем описании.

В другом варианте осуществления настоящего изобретения указанная кассета экспрессии включает по меньшей мере:

(а) полинуклеотид, кодирующий целевой продукт,

(б) интрон, включающий 5'-сайт-донор сплайсинга и 3'-сайт акцептор сплайсинга, а также включающий в рамке стоп-кодон трансляции и сигнал полиаденилирования, и

(в) полинуклеотид, расположенный ниже по цепи от указанного интрона, кодирующий мембранный якорь и/или сигнал для мембранного якоря.

Конструкция экспрессирующей кассеты обладает свойством, которое заключается в том, что через транскрипцию и процессинг транскрипта по меньшей мере две разные зрелые иРНК (иРНК-POI) и (nRNA-POI-ANCHOR) получают с кассеты экспрессии. Трансляция иРНК-POI приводит к целевому продукту. Трансляция иРНК-POI-ANCHOR приводит к гибридному полипептиду, включающему целевой продукт и мембранный якорь. В результате такой гибридный полипептид опять представляется на поверхности клетки, и клетки, представляющие высокие уровни заякоренного в мембране гибридного полипептида, могут быть отобраны методом жидкостной цитометрии, предпочтительно методом FACS. Таким образом, отбирают клетки-хозяева, которые обладают высоким уровнем экспрессии. Детали и предпочтительные варианты осуществления метода на основе интрона описаны в WO 2007/131774. Этот патент цитируется в настоящем описании.

В одном из предпочтительных вариантов осуществления настоящего изобретения, который особенно полезен для экспрессии антител в качестве целевого продукта, мембранным якорем является трансмембранный якорь иммуноглобулина. Другие соответствующие мембранные якори и предпочтительные варианты трансмембранного якоря иммуноглобулина описаны в WO 2007/131774, WO 2005/073375 и РСТ/ЕР2009/006246.

Также предусмотрена клетка-хозяин, включающая по меньшей мере:

(а) интродуцированный полинуклеотид, кодирующий целевой продукт,

(б) интродуцированный полинуклеотид, кодирующий первый селективный маркер (sm I),

(в) интродуцированный полинуклеотид, кодирующий второй селективный маркер (sm II), отличающийся от первого селективного маркера (sm I),

причем на действие селективного маркера (sm I) или (sm II) по меньшей мере частично влияет действие другого селективного маркера.

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения клетка-хозяин включает вектор экспрессии или комбинацию по меньшей мере двух векторов экспрессии согласно приведенному выше подробному описанию и формуле изобретения. См. приведенное выше описание.

Кроме того, клетка-хозяин может обладать по меньшей мере одним из следующих признаков.

Клетка-хозяин предпочтительно является эукариотической клеткой-хозяином. Указанная эукариотическая клетка предпочтительно является выбранной из группы, состоящей из клеток млекопитающих, клеток насекомых, клеток растений и клеток грибов. Клетки грибов и растений могут быть прототрофами по фолатам (т.е. такие клетки могут автономно синтезировать свои собственные фолаты, необходимые для выживания клеток, т.е. роста клеток и их размножения). В частности, настоящее изобретение охватывает такие грибные и растительные клетки, которые являются ауксотрофами по фолатам или могут ими стать. Это может произойти, например, из-за генетической манипуляции, т.е. клетки в настоящее время не могут синтезировать достаточные количества фолатов, необходимых для их клеточной жизнеспособности. Например, способность таких грибных или растительных клеток к эндогенному биосинтезу фолатов, например, по соответствующему метаболическому пути, может быть инактивирована, например, разрушением генов или сайленсингом генов соответствующих генов-мишеней, или ингибированием ключевых ферментов и т.д. Предпочтительно клетка-хозяин является клеткой млекопитающего. Указанная клетка млекопитающего предпочтительно выбрана из группы, состоящей из клеток грызуна, клеток человека и клеток обезьян. Особенно предпочтительны клетки грызунов, которые предпочтительно выбраны из группы, состоящей из клеток СНО, клеток ВПК, клеток NSO, клеток фибробластов мыши 3Т3 и клеток SP2/0. Особенно предпочтительными клетками грызунов являются клетки СНО. Также предпочтительны клетки человека, которые преимущественно выбраны из группы, состоящей из клеток НЕК293, клеток MCF-7, клеток PerC6 и клеток HeLa. Кроме того, предпочтительны клетки обезьян, которые преимущественно выбраны из группы, состоящей из клеток COS-1, клеток COS-7 и клеток Vero.

Клетка-хозяин и инкорпорированные селективные маркеры (sm I) и (sm II) будут совместимы, что означает, что выбранная комбинация клетки-хозяина и селективных маркеров (sm I) и (sm II) допускает отбор клеток-хозяев, экспрессирующих соответствующие маркеры в селективных культуральных условиях. Экспрессия селективных маркеров (sm I) и (sm II) обеспечивает селективное преимущество в селективных культуральных условиях. Таким образом, предпочтительно выбирают клетку-хозяина, которая чувствительна к отбору с помощью селективных маркеров (sm I) и (sm II) в селективных условиях роста. Например, при использовании определенного фермента в виде селективного маркера (sm I) и/или (sm II) клетка-хозяин может не экспрессировать соответствующий фермент эндогенно или может по меньшей мере экспрессировать указанный фермент в недостаточном количестве или с достаточным действием для побуждения клетки к должной функции/росту в селективных культуральных условиях при отсутствии достаточной экспрессии гетерологичных полинуклеотидов, кодирующих селективные маркеры (sm I) и (sm II). Таким образом, клетка-хозяин может только выживать/пролиферировать с удовлетворительной интенсивностью, если клетка-хозяин экспрессирует интродуцированные селективные маркеры и соответственно полинуклеотид, кодирующий целевой продукт с достаточной продуктивностью для выживания в селективных условиях роста. Выбор/конструирование соответствующих клеток-хозяев зависит от выбранных селективных маркеров (sm I) и (sm II). Соответствующие клетки-хозяева известны в предшествующем уровне техники или могу быть получены путем создания соответствующих линий клеток, например, методом генной инженерии (например, мутагенезом, нокаутом гена; сайленсингом гена и др.). Эти принципы известны из предшествующего уровня техники и таким образом не требуют подробного разъяснения.

Например, клетки-хозяева (например, клетки СНО), которые утратили ген ДГФР (например, за счет прицельной делеции в геноме, так называемые ДГФР - клетки-хозяева) могут применяться в качестве реципиентов для трансфекции гена ДГФР в качестве гена селективного маркера в среде, не содержащей нуклеотидов. Однако также можно применять клетки-хозяева, которые экспрессируют ДГФР эндогенно (клетки-хозяева ДГФР (плюс)), когда проводят отбор по ДГФР, если применяют соответствующие селективные условия культуральной среды. В этом случае предпочтительно применяют фермент ДГФР в качестве селективного маркера (sm II), который в меньшей степени чувствителен к МТК по сравнению с эндогенным ферментом ДГФР, экспрессированным клетками-хозяевами ДГФР (плюс). После трансфекции гетерологичных полинуклеотидов, например вектора экспрессии по настоящему изобретению, включающего ген ДГФР в качестве второго селективного маркера (sm II), клетки могут подвергаться постепенному повышению концентраций ингибиторов ДГФР. Одним из примеров являются антифолаты, например МТК, который является мощным ингибитором ДГФР (Kd=1 пМ). Наличие в среде антифолата, например МТК, вынуждает клетки вырабатывать повышенные уровни ДГФР для выживания. Для этого при многих кругах отбора селективный маркер ДГФР часто претерпевает существенную амплификацию гена. В предшествующем уровне техники требуется применять в существенной степени высокие концентрации антифолата/МТК для достижения существенной амплификации гена и соответственного повышения выработки целевого продукта. Это неприемлемо, поскольку антифолаты токсичны и могут изменять клетки-хозяева. Новый подход настоящего изобретения по комбинированию двух селективных маркеров (sm I и sm II), которые участвуют в том же или в близком метаболическом пути (предпочтительно в метаболизме фолата), обладает преимуществом, заключающемся в том, что эффективность отбора является существенно повышенной уже при низких уровнях ингибитора (например, МТК). Таким образом, нужны сниженные количества ингибитора и соответственно токсических агентов, необходимых в связи с требованиями настоящего изобретения, по сравнению с подходами, описанными в предшествующем уровне техники, для обеспечения высокоточных условий отбора.

Соответствующие примеры селективных маркеров (sm I) и (sm II), а также их комбинаций, подробно описаны выше; см. приведенное описание выше.

Полинуклеотид, кодирующий целевой продукт, полинуклеотид, кодирующий первый селективный маркер (sm I), и/или полинуклеотид, кодирующий второй селективный маркер (sm II), может быть стабильно интродуцирован в указанную клетку-хозяина. Стабильная интродукция, соответственно трансфекция, является предпочтительной для создания линий экспрессирующих клеток и особенно для крупномасштабного и соответственно промышленного получения целевого продукта.

Полинуклеотид, кодирующий целевой продукт, полинуклеотид, кодирующий первый селективный маркер (sm I), и/или полинуклеотид, кодирующий второй селективный маркер (sm II), может быть локализован на одном и том же или на разных векторах экспрессии, включенных в указанные клетки-хозяева. Подробности, касающиеся таких вариантов осуществления настоящего изобретения, описаны выше; см. приведенное выше описание.

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения клеточная жизнеспособность или степень пролиферации применяемых клеток-хозяев может зависеть от потребления соединения (например, фолата), которое инкорпорировано первым селективным маркером (sm I) в клетку-хозяина. Выше подчеркивалось, что первый селективный маркер (sm I) может кодировать полипептид-переносчик, способный импортировать соединение в указанного хозяина. Согласно одному из вариантов осуществления настоящего изобретения, подробно описанному выше, первый селективный маркер (sm I) импортирует по меньшей мере один фолат в клетку-хозяина и предпочтительно является рецептором фолата, что следует из приведенного выше описания. Такой вариант осуществления настоящего изобретения особенно эффективен при использовании ДГФР в качестве второго селективного маркера (sm II). В одном из предпочтительных вариантов осуществления настоящего изобретения первый селективный маркер (sm I) является рецептором фолиевой кислоты, а второй селективный маркер является вариантом ДГФР, который менее чувствителен МТК, чем фермент ДГФР дикого типа. Соответствующая комбинация маркеров особенно предпочтительна в комбинации с ДГФР (плюс) клетками. В таком случае предпочтительно фермент ДГФР используют в качестве селективного маркера (sm II), который менее чувствителен МТК по сравнению с эндогенным ферментом ДГФР, экспрессируемым клетками-хозяевами ДГФР (плюс). Подробное описание приведено выше и ниже.

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения клетка-хозяин полностью утрачивает активность по меньшей мере одного эндогенного функционального связанного с мембраной рецептора фолата. Соответствующие линии клеток могут быть получены за счет способов отбора/скрининга или методами генной инженерии, например, для выработки нокаутных линий клеток. Таким образом, также предусмотрены клетки-хозяева, в которых эндогенная однонаправленная функциональная система транспорта фолата, например, включающая по меньшей мере один эндогенный функциональный связанный с мембраной рецептор фолата, полностью утрачивают активность, т.е. являются аттенуированными. Такое аттенуирование может быть обеспечено, например, каким-либо типом мутагенеза эндогенной системой транспорта фолата, о которой идет речь, например, эндогенного функционального связанного с мембраной рецептора фолата, например, точечной мутацией, разрушением гена и др. Аттенуирование может быть частичным или полным. В последнем случае эукариотическая клетка по настоящему изобретению не содержит эндогенной функциональной однонаправленной системы транспорта фолата, например, эндогенного функционального связанного с мембраной рецептора фолата.

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения клетка-хозяин по настоящему изобретению включает по меньшей мере одну эндогенную функциональную однонаправленную функциональную систему транспорта фолата помимо гетерологичного функционального связанного с мембраной рецептора фолата, интродуцированного в указанную клетку-хозяина, например, через вектор экспрессии, описанный выше, в частности один или несколько эндогенных функциональных связанных с мембраной рецепторов (рецептора) фолата. Преимущество настоящего изобретения заключается в том, что система отбора, описанная в настоящем изобретении, может быть использована даже в присутствии такой эндогенной однонаправленной функциональной системы транспорта фолата, т.е. если такая эндогенная система сохраняется. Это, а также в равной степени применение соответствующих клеток-хозяев для последующей выработки целевого продукта в неселективных условиях, легче для работы, если эндогенная система сохраняется и следовательно функционирует.

Таким образом, другой предпочтительный вариант осуществления настоящего изобретения относится к клетке-хозяину по настоящему изобретению, включая по меньшей мере одну эндогенную однонаправленную функциональную систему транспорта фолата, причем такая эндогенная однонаправленная функциональная система транспорта фолата предпочтительно включает по меньшей мере один эндогенный функциональный связанный с мембраной рецептор фолата. В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения эндогенный функциональный связанный с мембраной рецептор фолата выбран из группы, состоящей из рецептора фолата альфа и рецептора фолата бета.

Другие допустимые комбинации представляют выбор рецептора фолата в качестве первого селективного маркера (sm I), объединенного с мутантным ДГФР в качестве второго селективного маркера (sm II), который менее чувствителен к ингибитору ДГФР, например, МТК, чем фермент ДГФР, который эндогенно экспрессируется в клетках-хозяевах ДГФР (плюс). Указанные клетки-хозяева также могут быть НВФ (плюс), согласно описанному выше.

Также предусмотрен способ получения клеток-хозяев, согласно описанному выше, включающий стадию интродукции в указанные клетки-хозяева по меньшей мере:

(а) полинуклеотида, кодирующего целевой продукт,

(б) полинуклеотида, кодирующего первый селективный маркер (sm I),

(в) полинуклеотида, кодирующего второй селективный маркер (sm II), отличающийся от первого селективного маркера (sm I),

причем на действие селективного маркера (sm I) или (sm II) по меньшей мере частично влияет действие другого селективного маркера.

Известно несколько соответствующих методов в предшествующем уровне техники для интродукции полинуклеотидов и векторов экспрессии в клетки-хозяева, включая эукариотические клетки-хозяева, например клетки-хозяева млекопитающих. Соответствующие методы включают, но ими перечень не ограничивается, трансфекцию с применением кальция фосфата, электропорацию, липофекцию, биолистический и полимер-опосредованный перенос генов. Помимо методов, основанных на традиционной случайной интеграции, также могут применяться подходы, основанные на рекомбинации, для переноса полинуклеотида, кодирующего целевой продукт, полинуклеотидов, кодирующих первый селективный маркер (sm I), и/или полинуклеотида, кодирующего второй селективный маркер (sm II), в геном клетки-хозяина. К таким методам рекомбинации может относиться применение сайт-специфичных рекомбиназ, например, Cre, Flp или ФС31 (см., например, Oumard и др., Cytotechnology, 50, 2006, cc.93-108), которые могут опосредовать направленную инсерцию трансгенов. В другом варианте механизм гомологичной рекомбинации может применяться для инсерции указанных полинуклеотидов (см. обзор Sorrell и др., Biotechnology Advances 23, 2005, cc.431-469). Основанная на рекомбинации инсерция генов позволяет минимизировать число элементов для включения в гетерологичную нуклеиновую кислоту, которая трансфецируется/ интродуцируется в клетку-хозяина. Например, может применяться локус инсерции, который уже содержит промотор и сайт поли-А (экзогенный или эндогенный), при этом требуется трансферировать/трансфецировать в клетку-хозяина только оставшиеся элементы (например, полинуклеотид, кодирующий целевой продукт, полинуклеотид, кодирующий первый селективный маркер (sm I), и/или полинуклеотид, кодирующий второй селективный маркер (sm II)). Варианты соответствующего вектора экспрессии или комбинации векторов экспрессии по настоящему изобретению, а также соответствующие клетки-хозяева, подробно описаны выше; см. приведенное выше описание.

Полинуклеотиды, кодирующие соответствующие селективные маркеры, (sm I) и (sm II), а также их комбинации, подробно описаны выше; см. приведенное выше описание. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения вектор экспрессии или комбинацию векторов экспрессии по настоящему изобретению интродуцируют в клетку-хозяина. Вектор экспрессии и комбинация векторов экспрессии подробно описаны выше и в прилагаемой формуле изобретения.

Также предусмотрен способ отбора по меньшей мере одной клетки-хозяина, способной экспрессировать целевой продукт, включающий

(а) получение множества клеток-хозяев, включающих по меньшей мере

(i) интродуцированный полинуклеотид, кодирующий целевой продукт,

(ii) интродуцированный полинуклеотид, кодирующий первый селективный маркер (sm I),

(iii) интродуцированный полинуклеотид, кодирующий второй селективный маркер (sm II), который отличается от первого селективного маркера (sm I),

причем действие селективного маркера (sm I) или (sm II) по меньшей мере частично зависит от действия другого селективного маркера,

(б) культивирование указанного множества клеток-хозяев в условиях, селективных для селективных маркеров (sm I) и (sm II), тем самым получая клетку-хозяина, экспрессирующую целевой продукт.

В контексте настоящего изобретения понятие «отбор» в частности относится к процессу применения селективного маркера и селективных условий культивирования для отбора и соответственно получения клеток-хозяев, которые включают вектор или комбинацию векторов по настоящему изобретению. Таким образом, успешно трансфецированные клетки-хозяева могут быть выделены и/или обогащены в популяции трансфецированных клеток-хозяев.

Клетки-хозяева, в которые не удалось внедрить вектор или комбинацию векторов по настоящему изобретению, предпочтительно погибают или отстают в росте в условиях селективного культивирования по сравнению с клетками-хозяевами, в которые были успешно внедрены вектор или комбинация векторов по настоящему изобретению. При отборе клетки-хозяева, которые успешно включают вектор или комбинацию векторов по настоящему изобретению, могут быть обогащены в качестве совокупности клеток из популяции трансфецированных клеток-хозяев. Отдельные клетки-хозяева также могут быть выделены из популяции трансфецированных клеток-хозяев при отборе (например, путем селекции клонов). Соответствующие варианты осуществления процедур отбора для получения успешно трансфецированных клеток-хозяев (например, с помощью сортировки методом FACS или серийных разведении) известны в предшествующем уровне техники и не нуждаются в подробном описании.

Соответствующие клетки-хозяева и конкретные варианты осуществления настоящего изобретения, в частности относительно выбора селективных маркеров (sm I) и (sm II) и их комбинаций, подробно описаны выше. См. приведенное выше описание.

В зависимости от применяемых клеток-хозяев и соответственно выбранных селективных маркеров (sm I) и (sm II) условия роста адаптированы для осуществления селективного давления на клетки-хозяева. Например, селективная культуральная среда может включать соответствующие ингибиторы для каталитических полипептидов, выбранных в качестве селективных маркеров (sm I) и/или (sm II). Например, антифолаты, например МТК, могут применяться для подавления действия ДГФР, если ДГФР используют в качестве селективного маркера (sm II). В зависимости от применяемой концентрации указанного ингибитора в культуральной среде (которая также может постепенно повышаться) повышается эффективность условий отбора. Кроме того, для поддержания селективного давления селективная среда не должна включать существенных количеств метаболитов, которые допускают шунтирование действия селективных маркеров (sm I) и/или (sm II). Например, если применяют ДГФР в качестве селективного маркера (sm II), предпочтительно, чтобы культуральная среда не включала значимых нуклеотидов. Обычно метаболиты, интерферирующие с указанной стратегией отбора, находятся под контролем, например, их исключают.

Кроме того, если первый селективный маркер (sm I) является полипептидом-переносчиком, селективная культуральная среда должна включать ограничивающую концентрацию указанных соединений, важных для роста клеток, которые импортируются первым селективным маркером (sm I), например, фолаты в случае первого селективного маркера (sm I), переносят фолат в клетку-хозяина. Принципы выбора таких селективных условий известны в данной области и могут быть определены экспериментально, поэтому не требуют подробного описания. Соответствующие концентрации фолатов и антифолатов, особенно применимые для быстрого роста суспензии клеток, также описаны в настоящем изобретении.

Условия отбора для селективных маркеров (sm I) и (sm II) могут применяться одновременно. Это повышает селективное давление и позволяет быстрее проводить отбор, сокращая одну стадию отбора при применении оптимальных условий. В результате уменьшается время, требуемое для получения соответствующих линий клеток. Например, для комбинации селективных маркеров рецептора фолата/ДГФР может применяться культуральная среда, включающая пониженные количества фолатов и включающая ингибитор ДГФР. Соответствующие ингибиторы являются антифолатами, например МТК.

При применении другого селективного маркера помимо (sm I) и (sm II) селективные условия для указанного селективного маркера могут применяться до (например, на стадии предшествующего отбора) или одновременно с применением селективных условий для селективных маркеров (sm I) и/или (sm II). Например, если ген неомицин-фосфотрансферазы (neo) используют в качестве селективного маркера, клетки могут быть выращены в среде, например, содержащей антибиотик G418, для отбора клеток, в которые включен вектор экспрессии или комбинация по меньшей мере двух векторов экспрессии по настоящему изобретению. Такая первая среда также может быть уже селективной по меньшей мере для одного из селективных маркеров (sm I) или (sm II). Впоследствии применяют селективные условия для селективного маркера (sm I) и/или (sm II). Такая процедура в частности применима в том случае, когда один из селективных маркеров (sm I) и/или (sm II) является амплифицируемым селективным маркером.

Выше было отмечено, что предпочтительно (sm I) является переносчиком фолата, в частности рецептором фолата, и соответственно один из вариантов осуществления настоящего изобретения основан на ограниченной доступности фолата в культуральной среде клеток. Это система может широко применяться, особенно к эукариотическим клеткам, у которых клеточная выживаемость зависит от потребления фолата. Такой вариант осуществления настоящего изобретения может применяться для повышенного отбора, скрининга и создания клеток-хозяев, в частности эукариотических, например, клеток млекопитающих, клонов клеток, которые предпочтительно стабильно сверхэкспрессируют высокие уровни рекомбинантных продуктов. В большей степени, и в отличие от других известных систем отбора, нет существенной потребности (хотя это иногда возможно) для модифицированных клеток, получаемых, например, мутированием или нокаутом эндогенного гена (генов). Позднее, например, РФ альфа проявляет повышенное сродство в отношении ФК (kd=0,1 нМ) по сравнению, например, с НВФ для лейковорина (Kt=1 мкМ) и транспортирует фолиевую кислоту в клетки по однонаправленному метаболическому пути, настоящее изобретение предусматривает применение РФ альфа и других рецепторов фолата в качестве заметно улучшенного доминантного метаболического селективного маркера, в частности, по постепенному истощения фолата (например, фолиевой кислоты) из культуральной среды. Такой основанный на фолате отбор представляет превосходную стратегию, которая хорошо соответствует повышенной стабильной и проходящей на высоком уровне сверхэкспрессии белков-мишеней у культивируемых клеток млекопитающих.

Стратегия настоящего изобретения по применению двух до известной степени взаимозависимых селективных маркеров (sm I) и (sm II), которые предпочтительно вовлечены в общий или близкий метаболический процесс или метаболический путь, обладает преимуществом, заключающимся в том, что получают крайне высокую степень эффективности из-за аддитивных/синергетических эффектов условий отбора, нацеливаясь на один метаболический путь. Таким образом, производительность отбора на выживаемость популяции клеток является очень сильно повышенной. Показано, что клетки-хозяева, полученные после применения способа отбора, вырабатывают целевой продукт с высокой продуктивностью. Также повышена средняя продуктивность отдельных клеток-хозяев. Таким образом, улучшаются возможности по обнаружению высокопродуктивных клонов при пониженных усилиях, затраченных на скрининг. Таким образом, система отбора по настоящему изобретению превосходит системы отбора, применявшиеся в предшествующем уровне техники. В частности, для предпочтительной комбинации применения рецептора фолата в соединении с ферментом ДГФР в качестве селективных маркеров (sm I) и (sm II) получают клетки-хозяева, которые обладают повышенной продуктивностью по сравнению с применением соответствующих селективных маркеров по отдельности. Таким образом, из-за повышенной эффективности условий отбора оптимизируют процедуру отбора.

Способ отбора по настоящему изобретению также может быть осуществлен быстрее и более эффективно, чем традиционные стратегии отбора, известные в предшествующем уровне техники, в виде отбора по селективным маркерам (sm I) и (sm II), могут быть осуществлены за одну стадию отбора, если применяют оптимальные условия культивирования клеток.

Указанный способ может дополнительно включать стадию

(в) отбора по меньшей мере одной клетки-хозяина, которая экспрессирует целевой продукт на необходимом уровне продуктивности.

Клетки, полученные в результате методики эффективного скрининга/отбора по настоящему изобретению, могут быть полностью выделены и могут быть обогащены относительно не отобранных клеток из исходной клеточной популяции. Они могут быть выбраны и могут культивироваться в качестве отдельных клеток. Однако также возможно применение обогащенной популяции. Полученные клетки-хозяева также могут применяться на одном или нескольких дополнительных кругах отбора, необязательно для дополнительного качественного или количественного анализа, или могут применяться, например, при создании линии клеток для выработки белка. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения обогащенную популяцию продуцирующих клеток-хозяев, выбранных согласно приведенному выше описанию, непосредственно применяют в качестве популяции для получения целевого продукта с хорошим уровнем продуктивности.

Предпочтительно отбирают клетку-хозяина, которая стабильно экспрессирует целевой продукт. Преимущества стабильной трансфекции/экспрессии подробно описаны выше. См. указанное выше описание.

В наиболее предпочтительном варианте осуществления способа отбора по настоящему изобретению множество клеток-хозяев включает клетки-хозяева по настоящему изобретению, т.е. описанные в настоящем изобретении. См. приведенное выше подробное описание, в частности касающееся соответствующих селективных маркеров (sm I) и (sm II) и их комбинаций.

Дополнительные предпочтительные варианты осуществления настоящего изобретения, касающиеся клеток-хозяев и вектора экспрессии, соответственно комбинации векторов экспрессии, подробно описаны выше. См. приведенное выше описание.

Предпочтительно первый селективный маркер (sm I) является переносчиком/рецептором, способным переносить фолат в клетку-хозяина. Такой вариант осуществления системы отбора по настоящему изобретению не нуждается в геномной делеции или ослаблении генов эндогенных рецепторов альфа, бета или гамма для фолата до трансфекции и таким образом могут быть применены к какой-либо реципиентной клетке даже при наличии некоторой эндогенной экспрессии гена рецептора фолата (см. выше). Такое ключевое преимущество основано на том обстоятельстве, что после трансфекции рецептора альфа для фолата клетки могут подвергаться внезапной и тяжелой деприватизации фолатов (например, фолиевой кислоты) из культуральной среды. В результате только трансфецированные клетки, которые экспрессируют достаточные количества селективного маркера рецептора альфа для фолата, могут транспортировать достаточное количество фолата для поддержания репликации ДНК и клеточной пролиферации. Это происходит при отсутствии какого-либо существенного повышения экспрессии гена эндогенного рецептора альфа для фолата. Кроме того, такой вариант осуществления настоящего изобретения, касающийся системы отбора по настоящему изобретению, не ухудшается от утраты жесткости отбора из-за ослабления селективного давления через повышенную экспрессию других путей потребления фолата, включая повышенную экспрессию эндогенного НВФ. Такое важное преимущество связано с тем обстоятельством, что хотя рецептор альфа для фолата обладает выдающимся сродством с фолиевой кислотой (Kd=0,1 нМ), НВФ проявляет чрезвычайно слабое сродство с фолиевой кислотой (Km=0,2-0,4 мМ).

Если (sm II) является ДГФР или другим ферментом метаболического пути синтеза нуклеиновых кислот или конкретно метаболизма фолата, селективная культуральная среда содержит дополнительно ингибитор соответствующего фермента, например, антифолаты, например МТК, для обеспечения селективных условий.

Селективная среда, которая может применяться по меньшей мере на одной стадии отбора, может включать один или несколько типов фолата. Фолат, включенный в селективную культуральную среду в предельно допустимой концентрации, может потребляться и перерабатываться клеткой-хозяином. Фолаты и в частности производные фолата, которые не могут процессироваться клеткой-хозяином, не могут участвовать в селективном давлении и соответственно не могут участвовать в предельно допустимой концентрации. Селективная культуральная среда может обладать одним или несколькими из следующих признаков:

(а) включает предельно допустимую концентрацию фолата, предпочтительно в концентрации примерно 500 нМ или менее, примерно 250 нМ или менее, примерно 150 нМ или менее, примерно 100 нМ или менее, примерно 75 нМ или менее, примерно 50 нМ или менее, примерно 25 нМ или менее, примерно 15 нМ или менее, примерно 10 нМ или менее, примерно 5 нМ или менее, или примерно до 2,5 нМ, причем указанным фолатом предпочтительно является фолиевая кислота, и/или

(б) включает фолиевую кислоту в концентрации примерно 500 нМ или менее, примерно 250 нМ или менее, примерно 150 нМ или менее, примерно 100 нМ или менее, примерно 75 нМ или менее и предпочтительно примерно 50 нМ или менее, и/или

(в) включает ингибитор ДГФР, и/или

(г) включает антифолат, и/или

(д) включает антифолат в концентрации примерно 500 нМ или менее, примерно 350 нМ или менее, примерно 200 нМ или менее, предпочтительно примерно 150 нМ или менее, и/или

(е) включает МТК в качестве антифолата, и/или

(ж) включает МТК в концентрации примерно 350 нМ или менее, 200 нМ или менее, предпочтительно примерно 150 нМ или менее, и/или

(з) включает фолиевую кислоту в концентрации до 100 нМ, предпочтительно до 50 нМ, и в эквимолярной концентрации или до 20-кратной концентрации антифолат.

Предпочтительные концентрации фолата и в частности фолиевой кислоты выбраны из:

(а) примерно от 500 нМ до 100 пМ,

(б) примерно 250-1 нМ, предпочтительно примерно 250-2,5 нМ или примерно от 250 нМ до 5 или 10 нМ,

(в) примерно 150-1 нМ, предпочтительно примерно 150-2,5 нМ или примерно от 150 нМ до 5 или 10 нМ,

(г) примерно 100-1 нМ, предпочтительно примерно 100-2,5 нМ или примерно от 100 нМ до 5 или 10 нМ,

(д) примерно 75-1 нМ, предпочтительно примерно 75-2,5 нМ или примерно от 75 нМ до 5 или 10 нМ,

(е) примерно 50-1 нМ, предпочтительно примерно 50-2,5 нМ или примерно от 50 нМ до 5 или 10 нМ,

(ж) примерно 50-12,5 нМ, и

(з) примерно 25-2,5 нМ или примерно 25-5 нМ.

Предпочтительные концентрации антифолата и в частности МТК выбраны из:

(а) примерно 500-5 нМ,

(б) примерно 350-5 нМ,

(в) примерно 200-5 нМ,

(г) примерно 100-10 нМ,

(д) примерно 50-10 нМ, и

(е) примерно 50 нМ.

Предпочтительные концентрации и диапазоны концентраций фолата и антифолата, описанные выше, могут комбинироваться друг с другом. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения концентрацию фолата, примерно составляющую 12,5-50 нМ, используют в комбинации с антифолатом в концентрации 10-100 нМ. Согласно описанному, предпочтительно фолиевую кислоту используют в качестве фолата и МТК в качестве антифолата.

Кроме того, также было установлено, что применяемые концентрации фолата и антифолата могут влиять друг на друга. Таким образом, несмотря на абсолютную концентрацию фолатов и антифолатов, соотношение также может быть фактором обеспечения соответствующих селективных условий. Концентрация антифолатов (предпочтительно МТК) может примерно до 20 раз превышать концентрацию фолата (предпочтительно фолиевой кислоты). Концентрация антифолата (предпочтительно МТК) может примерно до 10 раз превышать концентрацию фолата (предпочтительно фолиевой кислоты). Предпочтительно селективная культуральная среда включает фолат и антифолат в соотношении концентраций от 1:10 до 10:1, предпочтительно в соотношении концентраций от 1:5 до 5:1. Очень хорошие результаты получают, если применяют примерно эквимолярные концентрации фолата и антифолата. В примерах показано, что такие соотношения обеспечивают в высокой степени применимые селективные культуральные условия для получения высокопродуктивных клеток-хозяев. Селективная культуральная среда, описанная выше, также составляет отдельный элемент настоящего изобретения, поскольку настоящее изобретение также предусматривает соответствующие селективные культуральные среды, пригодные для отбора клеток-хозяев согласно способу по настоящему изобретению.

Описанные выше концентрации особенно применимы для быстро растущей суспензии клеток, которая представляет предпочтительный фенотип для коммерческих линий клеток-продуцентов. Однако разные линии клеток могут обладать разными потребностями в фолиевой кислоте. Кроме того, ограничивающие концентрации могут варьировать в зависимости от применяемого фолата, соответственно антифолата. Таким образом, ограничивающие концентрации фолата, в частности фолиевой кислоты и антифолата, в частности МТК, а также соответствующие соотношения фолиевой кислоты к МТК, могут отличаться в зависимости от выбранных клеток-хозяев и фолата, соответственно антифолата. Соответствующие концентрации, однако, могут быть легко определены экспериментально опытным специалистом.

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения клетки-хозяева предварительно культивируют в культуральной среде без фолата или в культуральной среде, включающей ограничивающую концентрацию фолата перед трансфекцией и/или отбором. Соответствующие предельно допустимые концентрации фолата описаны выше. Предпочтительно указанная культуральная среда для предварительного культивирования клеток-хозяев включает фолат, в частности фолиевую кислоту, в концентрации 50 нМ или менее.

Выше отмечено, что способ отбора по настоящему изобретению может комбинироваться со способами, основанными на жидкостной цитометрии, известными в предшествующем уровне техники. Таким образом, согласно одному из вариантов осуществления настоящего изобретения стадию отбора, включающую жидкостную цитометрию, проводят после отбора клеток-хозяев способом по настоящему изобретению для отбора клеток-хозяев, которые экспрессируют целевой продукт на высоком уровне. Для этой цели предпочтительно по меньшей мере часть целевого продукта экспрессируется в виде заякоренного в мембране гибридного полипептида, который проявляется на поверхности клеток-хозяев. Основываясь на количестве проявленного гибридного полипептида, могут быть отобраны клетки-хозяева, используя жидкостную цитометрию, предпочтительно используя FACS, которые экспрессируют целевой продукт на высоком уровне.

В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения целевой полинуклеотид таким образом экспрессируется с:

а) кассеты экспрессии, которая включает по меньшей мере:

аа) полинуклеотид, кодирующий целевой продукт,

бб) по меньшей мере один стоп-кодон, расположенный вниз по цепи полинуклеотида, кодирующего целевой продукт, и

вв) полинуклеотид, расположенный вниз по цепи от стоп-кодона, кодирующего мембранный якорь и/или сигнал для мембранного якоря, или

б) кассеты экспрессии, которая включает по меньшей мере:

аа) полинуклеотид, кодирующий целевой продукт,

бб) интрон, включающий 5'-сайт-донор сплайсинга и 3'-сайт акцептор сплайсинга, а также включающий в рамке стоп-кодон трансляции и сигнал полиаденилирования, и

вв) полинуклеотид, расположенный вниз по цепи от указанного интрона, кодирующий мембранный якорь и/или сигнал для мембранного якоря.

Детали, касающиеся конструирования таких кассет экспрессии, обсуждаются выше. Это относится к соответствующему описанию. Для отбора клетки-хозяева культивируют для осуществления экспрессии целевого продукта таким образом, что по меньшей мере часть целевого продукта экспрессируется в качестве гибридного полипептида, включающего мембранный якорь, причем указанный гибридный полипептид проявляется на поверхности указанных клеток-хозяев, отбирают, основываясь на количестве гибридного полипептида, проявленного на поверхности клетки. Выше отмечалось, что клетки-хозяева предпочтительно отбирают, используя жидкостную цитометрию, в частности FACS. В примерах по настоящему изобретению показано, что комбинация способа отбора по настоящему изобретению с соответствующим подходом к отбору, основанному на жидкостной цитометрии, является весьма перспективной, а выявленные клетки-хозяева обладают очень хорошей степенью экспрессии.

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения также предусмотрена селективная культуральная среда, включающая фолат в предельно допустимой концентрации и антифолат. Выше было отмечено, что фолат, включенный в селективную культуральную среду в предельно допустимой концентрации, может быть потреблен и переработан клеткой-хозяином. Фолаты и в частности производные фолата, которые не могут процессироваться клеткой-хозяином, не могут содействовать селективному давлению и, соответственно, не могут влиять на предельно допустимую концентрацию. Указанная селективная культуральная среда предпочтительно обладает одним или несколькими свойствами, описанными выше для селективной культуральной среды, применяемой в сочетании с описанным способом отбора по настоящему изобретению, в частности относительно концентрации фолата и антифолата, включенных в среду и предпочтительные варианты осуществления настоящего изобретения. Кроме того, преимущества подробно описаны выше. Это относится к приведенному выше описанию, которое также здесь применяется. Указанная селективная культуральная среда может применяться в соединении с системой отбора по настоящему изобретению.

Также предусмотрен способ получения целевого продукта, включающего стадию культивирования клеток-хозяев по настоящему изобретению и/или клеток-хозяев, выбранных по рекомендациям настоящего изобретения, в условиях, допускающих экспрессию целевого продукта.

Использование клетки-хозяина по настоящему изобретению для получения целевого продукта, в частности полипептида, обладает преимуществом, заключающемся в том, что целевой продукт может быть получен на очень высоком уровне. Это особенно проявляется при проведении способа отбора по настоящему изобретению для отбора соответствующих клеток-хозяев для экспрессии. Таким образом, настоящее изобретение предусматривает улучшенный способ получения целевого продукта. Соответствующие клетки-хозяева описаны выше; см. приведенное выше описание.

Экспрессируемый целевой продукт может быть получен путем разрушения клеток-хозяев. Полипептиды также могут быть экспрессированы, например, секретированы в культуральную среду и могут быть получены из нее. Также возможны комбинации соответствующих способов. Таким образом, продукты, особенно полипептиды, могут быть эффективно выработаны и получены/выделены с высоким выходом. Полученный продукт также может быть объектом для последующих стадий процессинга, например, стадий очистки и/или модификации для получения целевого продукта с требуемым качеством. Согласно одному из вариантов осуществления настоящего изобретения указанные клетки-хозяева выращивают в условиях, исключающих содержание сыворотки.

Способ получения целевого продукта может включать по меньшей мере одну из следующих стадий:

- выделения целевого продукта из указанной среды для культивирования клеток и/или из указанных клеток-хозяев, и/или

- процессинга выделенного целевого продукта.

Целевой продукт, например, полипептид, полученный в соответствии с настоящим изобретением, может быть выделен, дополнительно очищен, выделен и/или модифицирован методами, известными в данной области. Например, продукт может быть выделен из питательной среды традиционными методами, включая, но ими не ограничиваясь, центрифугирование, фильтрацию, ультрафильтрацию, экстракцию или преципитацию. Очистка может быть произведена разными методами, известными в данной области, включая, но ими не ограничиваясь, хроматографию, (например, ионообменную, аффинную, гидрофобную, метод хромофокусирования и эксклюзионную хроматографию), методы электрофореза (например, препаративное изоэлектрофокусирование), избирательную растворимость (например, осаждение сульфатом аммония) или экстракцию.

Целевой продукт может быть каким-либо биологическим продуктом, который может быть получен путем транскрипции, трансляции или каким-либо другим способом экспрессии генетической информации, кодируемой указанным полинуклеотидом. В этом отношении продукт может быть продуктом экспрессии. Целевой продукт может быть выбран из группы, состоящей из полипептидов и нуклеиновых кислот, в частности РНК. Продукт может быть фармацевтически или терапевтическим действующим соединением или инструментом исследования для применения в анализах и т.п. В особенно предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения продукт является полипептидом, предпочтительно фармацевтически или терапевтическим действующим полипептидом, или инструментом исследования для применения в диагностических или других исследованиях и т.п. Соответственно полипептид не ограничивается каким-либо определенным белком или группой белков, но, напротив, может быть каким-либо белком какого-либо размера, функции или происхождения, который требуется выбрать и/или экспрессировать способами, описанными в настоящем изобретении. Таким образом, несколько разных целевых полипептидов может быть экспрессировано/выработано. Понятие «полипептид» относится к молекуле, представляющей полимер из аминокислот, связанных вместе пептидной связью (связями). К полипептидам относятся полипептиды какой-либо длины, включая белки (например, содержащие более 50 аминокислот) и пептиды (например, 2-49 аминокислот). К полипептидам относятся белки и/или пептиды какого-либо действия или какой-либо биологической активности, включая, например, биологически активные полипептиды, например, ферментативные белки или пептиды (например, протеазы, киназы, фосфатазы), рецепторные белки или пептиды, транспортные белки или пептиды, бактерицидные и/или эндотоксин-связывающие белки, структурные белки или пептиды, иммунные полипептиды, токсины, антибиотики, гормоны, ростовые факторы, вакцины или др. Указанный полипептид может быть выбран из группы, состоящей из пептидных гормонов, интерлейкинов, тканевых активаторов плазминогена, цитокинов, иммуноглобулинов, в частности антител или функциональных фрагментов антител или их вариантов. В наиболее предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения полипептидом является молекула иммуноглобина или антитело, или его функциональный вариант, например, химерное или частично или полностью гуманизированное антитело. Такое антитело может быть диагностическим антителом или фармацевтически или терапевтически действующим антителом.

Также предусмотрен продукт, полученный способом по настоящему изобретению, согласно описанному выше и изложенному в формуле изобретения. Указанный продукт предпочтительно является полипептидом, в частности молекулой иммуноглобулина или ее функциональным фрагментом.

Другой объект по настоящему изобретению касается применения первого селективного маркера (sm I) в комбинации со вторым селективным маркером (sm II), отличающимся от первого селективного маркера (sm I), причем на действие селективного маркера (sm I) или (sm II) по меньшей мере частично влияет действие другого селективного маркера, для отбора клетки-хозяина, способной экспрессировать целевой продукт.

Первый селективных маркер (sm I) и/или второй селективный маркер (sm II) могут обладать по меньшей мере одним из следующих признаков:

(а) первый селективный маркер (sm I) и/или второй селективный маркер (sm II) участвуют в метаболическом процессе или пути, выбранном из:

(аа) синтеза нуклеиновых кислот и/или синтеза полипептида,

(аб) синтеза нуклеиновых кислот и/или синтеза аминокислот, и

(ав) метаболизма фолата, и/или

(б) первый селективный маркер (sm I) и/или второй селективный маркер (sm II) является каталитическим полипептидом или транспортным полипептидом, и/или

(в) второй селективный маркер (sm II) является каталитическим полипептидом, процессирующим

(ва) субстрат, который является соединением, импортируемым первым селективным маркером (sm I) в клетку-хозяина или последующим продуктом, полученным из указанного инкорпорированного соединения, и/или

(вб) субстрат, или его предшественник, который вырабатывается под действием первого селективного маркера (sm I), и/или

(г) первый селективный маркер (sm I) действует выше по цепи от второго селективного маркера (sm II), и/или

(д) первый селективный маркер (sm I) представляет или включает транспортный полипептид, импортирующий соединение, участвующее и/или важное для жизнеспособности клеток и/или пролиферации в клетке-хозяине, и/или

(е) первый селективный маркер (sm I) транспортирует/инкорпорирует по меньшей мере один фолат в клетку-хозяина, и/или

(ж) первый селективный маркер (sm I) представляет или включает функциональный связанный с мембраной рецептор фолата, и/или

(з) второй селективный маркер (sm II) является каталитическим полипептидом, процессирующим субстрат, который является или фолатом, и/или последующим продуктом, полученным из фолата, и/или

(и) первый селективный маркер (sm I) представляет функциональный связанный с мембраной рецептор фолата, который представляет или включает рецептор фолата, обладающий одним или несколькими из следующих признаков:

(иа) рецептор фолата выбран из группы, состоящей из рецептора фолата альфа, рецептора фолата бета, рецептора фолата гамма и функциональных вариантов указанных рецепторов, и/или

(иб) рецептор фолата представляет рецептор фолата человека или его функциональный вариант, и/или

(ив) рецептор фолата представляет рецептор фолата человека альфа или его функциональный вариант, и/или

(иг) рецептор фолата представляет рецептор фолата, имеющий или включающий аминокислотную последовательность SEQ ID NO 1, 2 или 3 или функциональный вариант указанных последовательностей, и/или

(к) селективный маркер (маркеры) (sm I) и/или (sm II) представляет или включает каталитический полипептид, участвующий в синтезе нуклеиновой кислоты и/или в метаболизме фолата, предпочтительно ДГФР или его функциональный вариант или фрагмент, и/или

(л) первый селективный маркер (sm I) представляет или включает транспортный полипептид, инкорпорирующий соединение, участвующее и/или имеющее важное значение для синтеза нуклеиновых кислот в клетке-хозяине, и второй селективный маркер (sm II) представляет каталитический полипептид, участвующий в синтезе нуклеиновой кислоты, и/или

(м) первый селективный маркер (sm I) и/или второй селективный маркер (sm II) является эукариотическим селективным маркером, и/или

(н) первый селективный маркер (sm I) и/или второй селективный маркер (sm II) является амплифицируемым селективным маркером.

Детали, комбинации и преимущества таких вариантов осуществления настоящего изобретения описаны выше. См. приведенное выше описание. Особенно предпочтительной является комбинация переносчика фолата, например, рецептора фолата, с ДГФР или его функциональный вариантом или переносчиком.

Полнее содержание текстов и документов, указанных выше, включено в настоящее изобретение в виде ссылок и таким образом составляет часть настоящего изобретения.

Приводимые ниже примеры предназначены для иллюстрации настоящего изобретения, но никоим образом не ограничивают его области охвата. В частности примеры относятся к предпочтительным вариантам осуществления настоящего изобретения.

Примеры

В общем, соответствующие материалы, например, реагенты, знакомы специалистам в данной области, коммерчески доступны и могут применяться в соответствии с инструкциями производителей. Примеры выполняют в соответствии с описанными инструкциями.

1. Пример 1. Отбор

Эксперимент по совместной трансфекции в клетки СНО осуществляют, используя векторы с идентичными кассетами экспрессии для одного и того же целевого белка (моноклонального антитела), но с разными комбинациями селективных маркеров. Настоящий эксперимент показывает, что комбинированный отбор по МТК и ограничивающим концентрациям фолиевой кислоты в культуральной клеточной среде позволяет получить популяцию клеток, сверхэкспрессирующую на высоком уровне целевой продукт, в данном случае молекулу иммуноглобулина, и что продуктивность таких популяций выше по сравнению со стратегиями, использующими ДГФР или рецептор фолиевой кислоты альфа (FoIR) в качестве единственного метаболического селективного маркера.

1.1. Материалы и методы

1.1.1. Конструкция вектора:

ВЕКТОР I содержит ДГФР (мутантные по ДГФР+(плюс) линии клеток) кассету экспрессии. Указанный плазмидный вектор (ВЕКТОР I), применимый для экспрессии в эукариотических клетках, в частности в клетках СНО, включает:

(i) кассету экспрессии, которая включает полинуклеотид, кодирующий тяжелую цепь, и кассету экспрессии, кодирующую легкую цепь секретированного рекомбинантного антитела человека типа IgGl. Экспрессия рекомбинантного антитела находится под контролем промотора CMV и стандартного сигнала полиаденилирования,

(ii) другая кассета экспрессии, которая включает полинуклеотид, кодирующий ДГФР (мутантная форма с пониженной чувствительностью в отношении МТК), в качестве гена селективного маркера (sm II). Экспрессия ДГФР находится под контролем промотора SV40 и стандартного сигнала полиаденилирования (SV40).

Плазмидный вектор (ВЕКТОР II) включает рецептор альфа фолиевой кислоты человека в качестве первого селективного маркера (sm I) вместо ДГФР. Таким образом, оба вектора содержат ген устойчивости к G418 (neo), но отличаются по дополнительным маркерам, а именно по ДГФР или рецептору альфа фолиевой кислоты человека. ВЕКТОР I и ВЕКТОР II включают следующие важные элементы:

Элементы ВЕКТОРА I	Элементы ВЕКТОРА II
Промотор/энхансер CMV	Промотор/энхансер CMV
RK-интрон	RK-интрон
Полинуклеотид, кодирующий легкую цепь антитела	Полинуклеотид, кодирующий легкую цепь антитела
Сайт поли-А вируса SV40	Сайт поли-А вируса SV40
Промотор/энхансер CMV	Промотор/энхансер CMV
RK-интрон	RK-интрон
Полинуклеотид, кодирующий тяжелую цепь антитела	Полинуклеотид, кодирующий тяжелую цепь антитела
Сайт поли-А вируса SV40	Сайт поли-А вируса SV40
Энхансер/промотор SV40	Энхансер/промотор SV40
Ген устойчивости к неомицину	Ген устойчивости к неомицину
Синтетический сайт поли-А	Синтетический сайт поли-А
Ген устойчивости к ампициллину	Ген устойчивости к ампициллину
Промотор SV40	Промотор SV40
Полинуклеотид, кодирующий ДГФР (мутантный)	huFolR
Фрагмент интрона SV40
Сайт поли-А вируса SV40	Сайт поли-А вируса SV40

1.1.2. Трансфекция и отбор клеток СНО

Культивирование клеток, трансфекцию и скрининг проводят в качалочных колбах, используя растущие клетки СНО в виде суспензии в обычной культуральной среде. Для снижения внутриклеточных вместилищ фолиевой кислоты в клетках-хозяевах и для предупреждения одновременного переноса фолиевой кислоты из среды предварительного культивирования в селективную среду, клетки пассируют в среде без фолиевой кислоты или в среде с пониженным содержанием фолиевой кислоты (например, 50 нМ) перед трансфекцией и отбором.

Клетки одновременно трансфецируют ВЕКТОРОМ I и ВЕКТОРОМ II с помощью электропорации. В зависимости от жизнеспособности клеток первую стадию отбора начинают через 24-48 ч после трансфекции добавлением к клеткам селективной среды, содержащей антибиотик G418 и 10 нМ фолиевой кислоты. По мере достижения клетками жизнеспособности примерно 80% проводят вторую стадию отбора путем пассирования клеток в среде без G418, содержащей 100 нМ МТК и 10 нМ фолиевой кислоты. Концентрация фолиевой кислоты может быть повышена до 20 нМ и затем до 100 нМ, если клетки не выделяют при более жестких условиях. Такие совокупности клеток, у которых по-прежнему нет роста, но может наблюдаться повышенная жизнеспособность, переносят в культуральную среду, содержащую 11,3 мкМ фолиевой кислоты и не содержащую МТК. После такого переноса популяции совместно трансфецированных клеток, которые начинают расти, размножают для последующего анализа.

1.1.3. Определение продуктивности совокупности клеток

Продуктивность отобранных популяций клеток анализируют после первой и конечной стадий отбора через выросшие периодические культуры в качалочных колбах в среде, содержащей 11,3 мкМ фолиевой кислоты без G418 и МТК.

Периодические культуры высевают в качалочные колбы емкостью 125 мл с рабочим объемом 50 мл и культивируют в качалочной камере (без увлажнения) при 150 об/мин в атмосфере 10% СО₂. Жизнеспособность клеток в начале исследования составляет >90%. Плотность клеток при засеве обычно составляет примерно 2×10⁵ клеток/мл. Титр определяют на 13 сутки. Титры антител в супернатантах культур клеток определяют методом ВЭЖХ с белком А на 13 сутки после начала культивирования.

1.2. Результаты

Для демонстрации эффективности стратегии отбора, используя ДГФР и FolR в качестве селективных маркеров, проводят совместную трансфекцию векторами, кодирующими ДГФР (ВЕКТОР I) и FolR (ВЕКТОР II), и получают идентичное моноклональное антитело. Оба вектора также содержат ген устойчивости к антибиотику G418 (см. выше).

1.2.1. Первая стадия отбора

Сначала популяции трансфецированных клеток отбирают путем добавления антибиотика G418 и снижения концентрации фолиевой кислоты до 10 нМ. Первоначальная стадия предварительного отбора способствует уничтожению нетрансфецированных клеток и параллельно заставляет клетки потреблять собственные внутриклеточные запасы фолиевой кислоты до более строгих условий отбора, применяемых на второй стадии отбора. При таких условиях первого отбора все популяции трансфецированных клеток обычно восстанавливают и оценивают продуктивность согласно описанному в разделе материалов и методов. Трансфецированные клетки, отобранные на среде с добавлением антибиотика G418 и 10 нМ фолиевой кислоты, исследуют в периодических культурах в качалочных колбах. На 13 сутки культивирования берут образцы культуральной среды и исследуют содержание антитела с помощью ВЭЖХ с белком А. Табл.1 суммирует результаты по продуктивности, полученные в соответствующем примере.

Таблица 1.
Продуктивность клеточных популяций после первой стадии отбора без МТК.
Вектор	Вектор I (ДГФР) и вектор II (FolR)
Номера пулов	мг/л
1	53
2	42
3	62
4	66
5	47

Все популяции клеток вырабатывают антитело. Клетки, трансфецированные вектором FolR (ВЕКТОРОМ II) в комбинации с вектором ДГФР (ВЕКТОРОМ I), отвечают повышенной средней продуктивностью отбора по сравнению с методами в предшествующем уровне техники (например, только ДГФР). Ограниченное содержание фолиевой кислоты в культуральной среде индуцирует рост клеток, сверхэкспрессирующих FolR.

1.2.2. Вторая стадия отбора

Для повышения интенсивности отбора на следующей стадии удаляют G418, но к культуральной среде добавляют 100 нМ МТК и поддерживают фолиевую кислоту на уровне 10 нМ. При таких условиях выживаемость клеток всех трансфецированных популяций резко падает и остается на низких уровнях. Кроме того, обычно не выявляют роста клеток. Селективное давление может быть снижено путем повышения содержания фолиевой кислоты сначала до 20 нМ и затем до 100 нМ. Для того чтобы индуцировать рост отобранных популяций для оценки продуктивности, выделенные жизнеспособные клетки могут быть перенесены на среду без МТК и с 11,3 мкМ фолиевой кислоты. Одну уже частично выделенную совокупность после двойной трансфекции содержат отдельно в среде, содержащей 100 нМ фолиевой кислоты, а другие совокупности каждой комбинации векторов сочетают для повышения плотности клеток и тем самым для повышения шансов на выживание. Дважды трансфецированные клетки, отвечающие быстрым ростом, дополнительно размножают и исследуют их продуктивность. Результаты представлены в табл.2.

Таблица 2.
Продуктивность популяций клеток после второй стадии отбора
Вектор	Вектор I (ДГФР) и вектор II (FolR)
№№ совокупностей клеток	мг/л
1	1110
2-5	524

Популяции клеток, отобранные на среде с G418 и 10 нМ фолиевой кислоты, дополнительно отбирают путем добавления 100 нМ МТК и постепенно повышают концентрацию фолиевой кислоты. В итоге клетки переносят на среду без МТК и с 11,3 мкМ фолиевой кислоты и восстановленные популяции анализируют в периодических культурах в качалочных колбах. На 13 сутки культивирования берут образцы культуральной среды и исследуют на содержание антитела методом ВЭЖХ с белком-А.

Продуктивность популяций дважды трансфецированных клеток после такого процесса отбора является удивительно высокой. По сравнению с первой стадией отбора титры антител повышены примерно в 20 раз в случае совокупности 1 и превышают 1 г/л и в 10 раз в случае объединенных совокупностей 2-5. Кроме того, при сравнении с намного более интенсивно оптимизированными процедурами отбора, используя, например, только ДГФР или ДГФР в комбинации с G418 в качестве селективных маркеров, установлено, что продуктивности после двойного отбора намного выше с комбинацией векторов по настоящему изобретению. Предшествующие эксперименты с применением комбинации ДГФР/G418 для того же антитела привели к получению совокупностей клеток с существенно более низкими титрами.

Таким образом, совместный отбор с применением ДГФР и FolR в качестве селективных маркеров приводит к получению клеток с высокой сверхэкспрессией целевого белка. Такая комбинация также превосходит применяемые в данной области системы отбора (например, ДГФР/0418).

2. Пример 2. Оптимизация условий отбора

2.1. Трансфекция, отбор и описание клонов

2.1.1. Трансфекция и отбор

Для оптимизации условий отбора исследуют дополнительные комбинации фолиевой кислоты и МТК в двух последовательных стадиях отбора. Сначала среду, содержащую 0,8 г/л G418 и фолиевую кислоту в концентрациях 12,5 нМ, 25 нМ, 50 нМ и 11,3 мкМ (контроль), комбинируют с 2,5 нМ, 5 нМ или 10 нМ МТК или без МТК. Затем популяции клеток, выделенные в указанных условиях на второй стадии отбора, переносят в среду без G418, содержащую ту же концентрацию фолиевой кислоты, но в 10 раз большую концентрацию МТК, чем на первой стадии отбора. Контрольные клетки переносят в среду, содержащую 500 нМ МТК, согласно стандартному протоколу по отбору ДГФР.

2.1.2. Клонирование и описание клонов

Клонирование осуществляют с помощью серийных разведений клеток, высеянных в 96-луночные планшеты при плотности 0,5 клеток на лунку. Затем клетки размножают сначала в 24-луночных планшетах и затем в качалочных колбах для скрининга продуктивности.

Продуктивность клонов исследуют в экспериментах с периодической культурой или с периодической культурой с подпиткой, используя разные форматы. Первоначальный скрининг проводят в экспериментах с периодической культурой 24-луночных планшетах путем посева клеток в 24-луночные планшеты для культивирования в условиях встряхивания. Титры антител в супернатанте культуры клеток определяют количественным методом ВЭЖХ-белок А через 10 суток после начала культивирования. Клоны с наивысшим уровнем продуктивности затем исследуют на моделях качалочных колб с периодической культурой или с периодической культурой с подпиткой. Периодические ферментации в культуральной среде, содержащей 11,3 мкмолей фолиевой кислоты, засевают в качалочные колбы (вместимость 500 мл или 250 мл) с рабочим объемом 100 мл или 50 мл и культивируют в качалочной камере (без увлажнения) при 150 об/мин, 36,5°С и 10% СО₂. Жизнеспособность клеток составляет >90% в начале исследования. Плотность засеваемых клеток составляет 2×10⁵ клеток/мл. Титр антител, число клеток и жизнеспособность могут определять в определенные сроки культивирования. Эксперименты по периодической ферментации с подпиткой проводят, используя те же условия, но при начальной плотности клеток 4×10⁵ клеток/мл и с регулярным добавлением подпитки, начиная с плотности жизнеспособных клеток примерно 7×10⁶ клеток/мл. Стабильность клонов оценивают путем культивирования клеток на протяжении периода до 19 недель, проводя измерения продуктивности примерно каждые две недели, с применением модели периодического культивирования в качалочных колбах.

2.2. Результаты

2.2.1. Первая стадия отбора

Трансфецированные клетки отбирают на первой стадии отбора при концентрациях фолиевой кислоты, варьирующих от 12,5 нМ до 50 нМ, в комбинации с концентрациями МТК от 2,5 нМ до 10 нМ. В качестве контроля также исследуют 11,3 мкМ фолиевой кислоты (ФК). Уровни продуктивности, полученные после первой стадии отбора, суммированы в табл.3.

Таблица 3.
Продуктивность клеток после первой стадии отбора при разных комбинациях концентраций фолиевой кислоты и МТК. Все величины приведены в мг/л.
Селективный маркер	Фолиевая кислота	без МТК	2,5 нМ МТК	5 нМ МТК	10 нМ МТК
ДГФР и FolR	12,5 нМФК	16	19	27	333
	25 нМ ФК	18	16	24	70
	50 нМ ФК	12	18	13	887
Только ДГФР в качестве контроля	11,3 мкМ ФК	16	11	16	11

Установлено, что наибольшую концентрацию получают после отбора с применением 10 нМ МТК. Клетки, совместно трансфецированные ВЕКТОРОМ I и ВЕКТОРОМ II, вырабатывают неожиданно высокие концентрации продукта (до 887 мг/л). Это намного больше, чем продуктивность клеток, трансфецированных только ДГФР (только ДГФР в качестве контроля).

2.2.2. Вторая стадия отбора

Вторую стадию отбора применяют к выбранным популяциям путем переноса клеток на среду без G418, сохраняя концентрацию фолиевой кислоты с первой стадии отбора, но повышая концентрацию МТК в 10 раз. Продуктивность исследуют у популяции клеток, которую выделяют в указанных условиях. Результаты суммированы в табл.4.

Таблица 4.
Продуктивность клеток после второй стадии отбора при разных комбинациях концентраций фолиевой кислоты и МТК. Все величины указаны вмг/л.
Селективный маркер	Фолиевая кислота	10 нМ МТК	25 нМ МТК	50 нМ МТК	100 нМ МТК	500 нМ МТК
ДГФР и FolR	12,5 нМ ФК	457	869	1170	193	Не определяли
	25 нМ ФК	624	967	842	907	Не определяли
	50 нМ ФК	27	68	1540	1320	Не определяли
Только ДГФР в качестве контроля	11,3 мкМ ФК	Не определяли	Не определяли	Не определяли	Не определяли	31

Неожиданно было установлено, что при соответствующих условиях отбора клетки, трансфецированные ВЕКТОРОМ I и ВЕКТОРОМ II и соответственно комбинацией по настоящему изобретению, обладают намного более высокой продуктивностью (до 1,5 г/л) по сравнению с клетками, трансфецированными только одним ВЕКТОРОМ I. Из этого следует, что комбинация ДГФР и FolR в качестве селективных маркеров обеспечивает намного более высокую точность отбора. Таким образом, настоящее изобретение обеспечивает существенное улучшение относительно предшествующего уровня техники.

2.2.3. Сравнение продуктивности клонов

Клоны получают клонированием путем серийных разведении из совместно трансфецированных совокупностей клеток после отбора. Клоны с наивысшей продуктивностью, выявленные скринингом в 24-луночных планшетах, дополнительно размножают в качалочных колбах. Продуктивность анализируют в исследованиях переросшихся периодических культур в качалочных колбах и сравнивают с результатами наиболее продуктивных клонов, полученных с помощью отдельных векторов в предшествующих экспериментах.

Таблица 5.
Продуктивность 5 наиболее продуктивных клонов, полученных в результате клонирования путем серийных разведений, в модели периодической культуры в качалочных колбах. Все величины антител приведены в г/л на 13-15 сутки культивирования.
	Вектор/отбор
Клоны	ДГФР	FolR	ДГФР/folR
1	0,52	1,10	1,46
2	0,51	1,09	1,44
3	0,50	0,99	1,44
4	0,49	0,85	1,41
5	0,47	0,85	1,40

Клоны с наивысшей продуктивностью получают путем совместной трансфекции векторов, содержащих ДГФР и folR в качестве селективных маркеров, и отбором трансфецированных клеток в условиях предельно допустимых концентраций фолиевой кислоты плюс МТК.

2.2.4. Анализ стабильности продуктивности клонов Стабильность продуктивности клонов лучших 10 совместно трансфецированных и отобранных ДГФР/folR клонов определяют на протяжении 19 недель, начиная с оттаивания флаконов, и первую оценку продуктивности проводят через 5 недель после оттаивания. Клетки культивируют в селективных условиях при наличии 50 нМ фолиевой кислоты и 50 нМ МТК. Анализ продуктивности проводят на культуральной среде, содержащей 11,3 мкМ фолиевой кислоты.

Таблица 6.
Стабильность продуктивности 10 лучших клонов, полученных в результате клонирования методом серийных разведений в модели периодической культуры в качалочных колбах. Все величины антитела приведены в г/л на 13-15 сутки культивирования.
Клон	5 недель	8 недель	12 недель	15 недель	17 недель	19 недель
6А8	1070	1230	1040	924	980	987
7F2	1090	1140	1120	971	975	1060
7F7	1120	1240	1140	904	917	937
9С4	1110	1200	1030	769	560	573
9G12	1150	1240	1140	938	775	538
9Н9	1100	1150	1130	969	1000	1040

Клон	5 недель	8 недель	12 недель	15 недель	17 недель	19 недель
10D3	1140	1130	1090	1020	1040	1090
10G10	1060	1180	1080	987	1080	1080
10Н5	1100	1240	1170	1050	1140	1190
10Н8	1050	1120	1140	1050	1020	1170

Проанализированные 8 из 10 клонов проявляют высокую стабильность продуктивности на протяжении 19 недель, и все 10 клонов проявляют существенную стабильность на протяжении 12 недель.

3. Пример 3. Отбор с применением комбинированного вектора и сортировки FACS

3.1. Конструирование вектора

Создают ВЕКТОР III, содержащий селективные маркеры ДГФР и FolR на одном каркасе молекулы, который также допускает дополнительный отбор, используя сортировку методом FACS. Указанный ВЕКТОР III включает кассету экспрессии для экспрессии тяжелой цепи антитела, которая содержит стоп-кодон типа «leaky» и трансмембранный якорь иммуноглобулина. В описании выше было отмечено, что структура кассеты экспрессии обладает эффектом (в результате процесса трансляционного прочтения), заключающимся в том, что часть антител вырабатывается в виде гибридных белков, которые заякорены на клеточной поверхности клетки-хозяина. ВЕКТОР III включает следующие основные элементы;

Элементы ВЕКТОРА III:
Промотор/энхансер CMV
RK-интрон
Полинуклеотид, кодирующий легкую цепь антитела
Поли-А сайт SV40
Промотор/энхансер CMV
RK-интрон
Полинуклеотид, кодирующий тяжелую цепь антитела
Стоп-кодон (пропускающий)
Полинуклеотид, кодирующий трансмембранный якорь иммуноглобулина, включающий цитоплазматический домен
Поли-А сайт SV40
Промотор/энхансер SV40
Полинуклеотид, кодирующий huFolR
Синтетический сайт поли-А
Ген устойчивости к ампициллину
Промотор SV40
Полинуклеотид, кодирующий ДГФР (мутант)
Фрагмент интрона SV40

Поли-А сайт SV40

Такой вектор ДГФР/FolR-FACS (ВЕКТОР III) сравнивают с контрольным вектором ДГФР-FACS, который содержит ген neo в качестве второго селективного маркера (ВЕКТОРА IV). ВЕКТОР IV включает следующие основные элементы:

Элементы ВЕКТОРА IV:
Промотор/энхансер CMV
RK-интрон
Полинуклеотид, кодирующий легкую цепь антитела
Поли-А сайт SV40
Промотор/энхансер CMV
RK-интрон
Полинуклеотид, кодирующий тяжелую цепь антитела
Стоп-кодон (мутация типа «leaky»)
Полинуклеотид, кодирующий трансмембранный якорь иммуноглобулина, включающий цитоплазматический домен
Поли-А сайт SV40
Промотор/энхансер SV40
Ген устойчивости к неомицину
Синтетический сайт поли-А
Ген устойчивости к ампициллину
Промотор SV40
Полинуклеотид, кодирующий ДГФР (мутантный)
Фрагмент интрона SV40
Поли-А сайт SV40

Кроме того, для экспериментов по совместной трансфекции с применением двух векторов экспрессии и сортировки методом FACS, создают ВЕКТОР V, который не включает ген ДГФР, но включает ген nео huFolR. ВЕКТОР V включает следующие основные элементы:

Элементы ВЕКТОРА V:
Промотор/энхансер CMV
RK-интрон
Полинуклеотид, кодирующий легкую цепь антитела
Поли-А сайт SV40
Промотор/энхансер CMV
RK-интрон
Полинуклеотид, кодирующий тяжелую цепь антитела
Стоп-кодон (мутация типа «leaky»)
Полинуклеотид, кодирующий трансмембранный якорь иммуноглобулина, включающий цитоплазматический домен
Поли-А сайт SV40
Промотор/энхансер SV40
Ген устойчивости к неомицину
Синтетический сайт поли-А

Ген устойчивости к ампициллину
Промотор SV40
huFolR
Поли-А сайт SV40

3.2. Отбор, клонирование и описание клонов

Клетки, трансфецированные комбинированным ВЕКТОРОМ III, отбирают в среде, содержащей 12,5 нМ фолиевой кислоты и 5 нМ МТК. Клетки, трансфецированные контрольным вектором, отбирают в среде, содержащей 12,5 нМ фолиевой кислоты, 5 нМ МТК и 0,8 г/л G418. На второй стадии отбора, проводимой после цикла обогащения методом FACS, концентрацию МТК повышают до 50 нМ, хотя концентрация фолиевой кислоты остается постоянной, а антибиотик G418 удален. Выделенные популяции клеток (совокупности) подвергают скринингу на продуктивность в периодических культурах в качалочных колбах.

Анализ FACS, обогащение и клонирование клеток

Нанесение метки на клетки: 2×10⁷ клеток в совокупности трансфецированных клеток центрифугируют, промывают 5 мл охлажденного ФСБ и ресуспендируют в 1 мл холодного ФСБ. Соответствующее количество меченого FITC анти-IgG антитела (от поставщика) добавляют к клеткам и инкубируют на льду в течение 30 мин в темноте. Затем клетки дважды отмывают при комнатной температуре с помощью 5 мл ФСБ, ресуспендируют в 1 мл ФСБ, фильтруют и помещают в пробирку FACS для анализа, сортируют и клонируют. Сортировку клеток проводят с помощью сортировщика клеток FACSAria (фирма Becton Dickinson), оборудованного блоком Automatic Cell Deposition Unit (ACDU), используя программное обеспечение FACSDiva. Маломощный охлаждаемый воздухом и твердотельный лазер (твердотельный лазер Coherent® Sapphire™), настроенный на 488 нм, применяют для стимуляции флуоресцеиновых красителей, связанных со вторым антителом. Относительную интенсивность флуоресценции красителя FITC измеряют на детекторе Е через фильтр 530/30 ВР. Пять процентов наиболее интенсивно FITC флуоресцирующих клеток пропускают и сортируют или вместе, или в виде отдельных клеток в 96-луночных планшетах.

Клоны вырабатывают или путем серийных разведении из обогащенных FACS совокупностей, или путем клонирования FACS из обогащенных или необогащенных совокупностей клеток.

Определение выработки антител и стабильности клонов

Продуктивность клонов исследуют в экспериментах с периодической культурой и с периодической ферментацией с подпиткой, используя разные форматы. Начальный скрининг проводят в исследованиях периодических культур в 24-луночных планшетах путем засева клеток во встряхиваемые 24-луночные планшеты. Титры антител в супернатантах культур клеток определяют с помощью метода количественного ВЭЖХ-белок А через 10 суток после начала культивирования. Наиболее высоко продуцируемые клоны затем исследуют на моделях периодической культуры и периодической ферментации с подпиткой в качалочных колбах. Периодические культуры в культуральной среде, содержащей 11,3 мкМ фолиевой кислоты, высевают в качалочные колбы (емкостью 500 мл или 250 мл) с полезным объемом 100 мл или 50 мл и культивируют на качалке (без увлажнения) при 150 об/мин, 36,5°С и 10% СО₂. Жизнеспособность клеток должна быть >90% в начале исследования. Плотность засеваемых клеток составляет 2×10⁵ клеток/мл. Титр антитела, число клеток и жизнеспособность могут быть определены в определенное время культивирования. Эксперименты с периодической ферментацией с подпиткой проводят, используя те же условия, но при начальной плотности клеток 4×10⁵ клеток/мл и с регулярным добавлением подпитки (культуральной среды), начиная с плотности жизнеспособных клеток примерно 7×10⁶ клеток/мл. Стабильность клонов оценивают путем культивирования клеток на протяжении периода вплоть до 19 недель с измерением продуктивности, используя модель периодической культуры в качалочных колбах, примерно каждые две недели.

3.3. Результаты

Пять популяций клеток, трансфецированных комбинированным вектором ДГФР/FolR (ВЕКТОРОМ III), и три популяции, трансфецированные контрольным вектором (ВЕКТОРОМ IV), получают и проводят отбор согласно описанному выше. Продуктивность совокупностей выделенных клеток в культурах периодической ферментации в качалочных колбах суммированы в табл.5.

Таблица 7.
Продуктивность клеток после одной стадии отбора, трансфецированных комбинированным вектором ДГФР/FolR или вектором ДГФР/Neo (контроль). Все величины указаны в мг/л.
	Вектор ДГФР/FolR (ВЕКТОР III)	Вектор ДГФР/Neo (ВЕКТОР IV)
Совокупность 1	80	19
Совокупность 2	53	9
Совокупность 3	73	10
Совокупность 4	147	Не определяли
Совокупность 5	104	Не определяли

Применение ДГФР/FolR комбинированного вектора (ВЕКТОРА III) приводит к неожиданно хорошей продуктивности уже после одной стадии отбора.

Совокупности клеток дополнительно процессируют путем применения цикла обогащения методом FACS и второй стадии отбора с 10-кратными повышенными концентрациями МТК. Опять получают совокупности клеток с очень высокими уровнями продуктивности, посредством чего комбинированный вектор действует так же хорошо, как и при подходе, заключающемся в совместной трансфекции (см. табл.8).

Таблица 8.
Модель периодической культуры в качалочных колбах: обогащенные методом FACS совокупности клеток после 2й стадии отбора (50 нМ МТК). Все величины указаны в мг/л.
Вектор	Средняя продуктивность совокупности клеток после цикла обогащения FACS и 2й стадии отбора (мг/л)
Совместная трансфекция ВЕКТОРА I и ВЕКТОРА II	418 (n=1)
Совместная трансфекция векторов FACS ВЕКТОРА IV и ВЕКТОРА V	797+/-87 (n=2)
Трансфекция комбинации-FACS-вектора (ВЕКТОРА III)	709+/-400 (n=2)

Клоны получают серийным разведением из совокупности клеток, обогащенных методом FACS, и размножают в 24-луночных планшетах для первичного скрининга. Наилучших продуцентов дополнительно размножают в качалочных колбах. Продуктивность анализируют в периодических культурах в качалочных колбах и сравнивают с результатами лучших клонов, полученных в предшествующих экспериментах, с контрольным вектором ДГФР путем клонирования методом FACS.

Продуктивность клонов, трансфецированных комбинированным ВЕКТОРОМ III, на модели в виде качалочных колб существенно выше по сравнению с клонами, которые трансфецируют контрольным ВЕКТОРОМ IV, который включает только ген ДГФР (см. табл.9).

Таблица 9.
Модель периодического культивирования в качалочных колбах: наиболее продуктивные 5 клонов с контрольным вектором ДГФР (ВЕКТОРОМ IV) и комбинированным вектором (ВЕКТОРОМ III). Все величины приведены вг/л.
	Вектор/клонирование
Клоны	ДГФР-FACS (ВЕКТОР IV)	ДГФР/folR/FACS (ВЕКТОР III)
1	1,12	1,90
2	1,11	1,58
3	1,10	1,42
4	1,10	1,39
5	1,10	1,26

Клоны, трансфецированные ВЕКТОРОМ III, дополнительно анализируют на стабильность клональной выработки путем оттаивания замороженных ампул и продуктивность подвергают мониторингу на модели периодического культивирования в качалочных колбах. Продуктивность подвергают мониторингу, начиная с 5 недели после оттаивания и до 19 недели после оттаивания, и сравнивают с продуктивностью до криоконсервации. Клоны культивируют в селективных условиях, хотя погруженные культуры в качалочных колбах выращивают в средах с высоким содержанием фолиевой кислоты (11,3 мкМ).

Таблица 10.
Анализ стабильности продуктивности клонов
Клон (ВЕКТОР III)	До замораживания	5 недель (после размораживания)	8 недель (после размораживания)	12 недель (после размораживания)	15 недель (после размораживания)	17 недель (после размораживания)	19 недель (после размораживания)
14Е3	1,06	1,16	1,17	1,17	0,92	1,02	1,08

Клон (ВЕКТОР III)	До замораживания	5 недель (после размораживания)	8 недель (после размораживания)	12 недель (после размораживания)	15 недель (после размораживания)	17 недель (после размораживания)	19 недель (после размораживания)
15D1	1,12	1,09	1,10	1,13	0,84	0,89	0,91
15Н7	1,42	1,32	1,36	1,34	1,09	1,15	1,13
15Н9	1,58	1,68	1,69	1,50	1,22	1,35	1,29
17А10	1,26	1,16	1,14	1,07	0,90	1,00	1,00
17Е7	1,90	1.79	1,82	1,76	1,56	1,78	1,76
17G3	1,16	1,13	1,14	1,14	0,87	0,94	0,95
17G11	1,26	1,19	1,21	1,14	0,98	0,96	1,03
19D1	1,39	1,15	1,18	1,11	0,86	0,85	0,87
19D7	1,17	0,95	1,02	1,05	0,82	0,90	0,97
19Е11	1,14	1,01	1,04	1,08	0,88	1.06	1,00
20А7	1,07	1,00	1,00	0,98	0,84	0,89	0,91

Только один из 12 исследованных клонов проявляет более чем 25% утрату продуктивности на протяжении 19 недель, все другие показывают высокую стабильность продуктивности,

IV. Пример 4. Крупномасштабная выработка полипептидов трансфецированными клетками СНО

Продуктивность полипептидов при крупномасштабном производстве может проводиться, например, в биореакторе с бегущей волной, стеклянном биореакторе или биореакторе из нержавеющей стали. Для этой цели клетки размножают, обычно начиная с одной замороженной ампулы, например, от фирмы Master Cell Bank. Клетки оттаивают и размножают на протяжении нескольких стадий. Биореакторы разного масштаба инокулируют соответствующим количеством клеток. Плотность клеток может быть повышена добавлением питательных растворов и добавок в биореактор. Клетки сохраняют высокую степень жизнеспособности на протяжении пролонгированного времени. Концентрации продукта в реакторе, варьирующие от нескольких сотен мг/л до нескольких г/л, достигают при крупномасштабном производстве. Очистка может быть проведена стандартными методами хроматографии, которые могут включать стадии аффинной, ионообменной, хроматографии гидрофобного взаимодействия или эксклюзионной хроматографии. Размер реактора при производстве может быть объемом до нескольких тысяч литров (см. также, например, работу F.Wurm, Nature Biotechnology 22 (11), 2004, cc.1393-1398).

1. Вектор экспрессии целевого продукта, включающий по меньшей мере
(а) полинуклеотид, кодирующий целевой продукт,
(б) полинуклеотид, кодирующий первый селективный маркер (sm I),
(в) полинуклеотид, кодирующий второй селективный маркер (sm II), отличающийся от первого селективного маркера (sm I), причем на действие селективного маркера (sm I) или (sm II) по меньшей мере частично влияет действие другого селективного маркера, и селективные маркеры (sm I) и (sm II) участвуют в метаболизме фолата, где первый селективный маркер (sm I) является рецептором фолата альфа человека (huFolR), а второй селективный маркер (sm II) является ДГФР или его функциональным вариантом или производным.

2. Вектор экспрессии по п.1, в котором второй селективный маркер является вариантом ДГФР, который менее чувствителен к метотрексату (МТК) по сравнению с ферментом ДГФР дикого типа и/или с ферментом ДГФР, эндогенно экспрессируемым клеткой-хозяином.

3. Вектор экспрессии по п.1 или 2, где первый селективный маркер (sm I) имеет или включает аминокислотную последовательность SEQ. ID. NO.1, 2 или 3 или функциональный вариант вышеупомянутых последовательностей.

4. Вектор экспрессии по пп.1-3, где полинуклеотид, кодирующий целевой продукт, включен в кассету экспрессии, которая включает по меньшей мере
(а) полинуклеотид, кодирующий целевой продукт,
(б) по меньшей мере один стоп-кодон ниже по цепи полинуклеотида, кодирующего целевой продукт, и
(в) полинуклеотид ниже по цепи от стоп-кодона, кодирующий мембранный якорь и/или сигнал для мембранного якоря.

5. Комбинация двух векторов экспрессии для экспрессии целевого продукта, где один вектор экспрессии включает
(а) полинуклеотид, кодирующий целевой продукт, и полинуклеотид, кодирующий первый селективный маркер (sm I), и другой вектор экспрессии включает
(в) полинуклеотид, кодирующий целевой продукт, и полинуклеотид, кодирующий второй селективный маркер (sm II), отличающийся от первого селективного маркера (sm I), причем на действие селективного маркера (sm I) или (sm II) по меньшей мере частично влияет действие другого селективного маркера, и селективные маркеры (sm I) и (sm II) участвуют в метаболизме фолата, где первый селективный маркер (sm I) является рецептор фолата альфа человека (huFolR), а второй селективный маркер (sm II) является ДГФР или его функциональным вариантом или производным.

6. Комбинация двух векторов экспрессии по п.5, в которой второй селективный маркер является вариантом ДГФР, который менее чувствителен к метотрексату (МТК) по сравнению с ферментом ДГФР дикого типа и/или с ферментом ДГФР, эндогенно экспрессируемым клеткой-хозяином.

7. Комбинация двух векторов экспрессии по п.5 или 6, где первый селективный маркер (sm I) имеет или включает аминокислотную последовательность SEQ. ID. NO.1, 2 или 3 или функциональный вариант вышеупомянутых последовательностей.

8. Комбинация двух векторов экспрессии по пп.5-7, где полинуклеотид, кодирующий целевой продукт, включен в кассету экспрессии, которая включает по меньшей мере
(а) полинуклеотид, кодирующий целевой продукт,
(б) по меньшей мере один стоп-кодон ниже по цепи полинуклеотида, кодирующего целевой продукт, и
(в) полинуклеотид ниже по цепи от стоп-кодона, кодирующий мембранный якорь и/или сигнал для мембранного якоря.