Молекула rnai, нацеливающая тимидилатсинтазу и ее применение

Изобретение относится к области молекулярной биологии и генной инженерии. Предложена молекула RNAi для супрессии экспрессии тимидилатсинтазы за счет действия RNAi, содержащая домен двухцепочечной РНК, состоящий из смысловой цепи, состоящей из нуклеотидной последовательности, представленной SEQ ID NO: 1, гибридизованной с антисмысловой цепью, гибридизующейся в жестких условиях со смысловой цепью. Молекула может существенно потенцировать противоопухолевое действие 5-FU-противоопухолевого агента, в связи с чем может быть использована в медицине при противоопухолевой терапии. 5 н. и 10 з.п. ф-лы, 2 ил., 3 пр.

 

Область техники, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение относится к молекуле RNAi, нацеливающей тимидилатсинтазу, противоопухолевому агенту, содержащему молекулу RNAi, агенту, потенцирующему противоопухолевое действие 5-FU-противоопухолевого агента, содержащему молекулу RNAi, и фармацевтической композиции, содержащей молекулу RNAi и 5-FU-противоопухолевый агент (комбинированному лекарственному средству, содержащему тегафур, гимерацил и отерацил калия, в частности).

Уровень техники

В лечении большого числа типов рака, к которым относятся рак пищеварительной системы и немелкоклеточный рак легких, как правило, используются 5-FU-противоопухолевые агенты, такие как 5-фторурацил (далее в настоящем документе обозначаемый как «5-FU»), комбинированное лекарственное средство, содержащее тегафур и урацил, или комбинированное лекарственное средство, содержащее тегафур, гимерацил и отерацил калия (комбинированное лекарственное средство, содержащее тегафур, гимерацил и отерацил калия в молярном соотношении 1:0,4:1, далее в настоящем документе обозначаемое как «S-1»). Тимидилатсинтаза (далее в настоящем документе обозначаемая как «TS»), вовлеченная в синтез ДНК, известна в качестве молекулы-мишени 5-FU. Ранее в результате большого числа клинических испытаний было сообщено о корреляции между уровнем экспрессии TS и чувствительностью к 5-FU-противоопухолевым агентам. При этом у онкологических пациентов, у которых наблюдаются относительно низкие уровни экспрессии TS, существенно влияние 5-FU-противоопухолевых агентов, вместе с тем многие онкологические пациенты, у которых наблюдаются относительно высокие уровни экспрессии TS, оказались устойчивыми к 5-FU-противоопухолевым агентам (Patrick G. Johnston et al., Cancer Res., 1995; 55: 1407-12; Kun-Huei Yeh et al., Cancer, 1998; 82: 1626-31). В связи с этим, для онкологических пациентов, у которых наблюдаются высокие уровни экспрессии TS и имеется устойчивость к 5-FU-противоопухолевым агентам, предлагается разработать новую технику лечения рака, потенцирующую противоопухолевое действие 5-FU-противоопухолевых агентов.

Также сообщалось, что экспрессия TS может быть супрессирована за счет использования РНК-интерференции (далее в настоящем документе обозначаемой как «RNAi»), которая была разработана как средство для супрессии экспрессии данного гена (японская патентная публикация (Kokai) № 2005-253342 А). В связи с этим, были осуществлены попытки потенцировать противоопухолевое действие 5-FU-противоопухолевых агентов путем супрессии экспрессии TS посредством RNAi, тем не менее эффект потенцированного противоопухолевого действия все-таки неудовлетворителен (Kadota et al., the 67^th Annual Meeting of the Japanese Cancer Association, 2008, p. 235. P-4274).

Сущность изобретения

Цель изобретения

Настоящее изобретение относится к новой молекуле RNAi, которая может существенно потенцировать противоопухолевое действие 5-FU-противоопухолевых агентов.

Способы достижения цели

При указанном выше положении дел авторы настоящего изобретения провели поиск новой молекулы RNAi, которая может существенно потенцировать противоопухолевое действие 5-FU-противоопухолевых агентов. В результате они обнаружили новую молекулу RNAi, которая может супрессировать экспрессию TS на очень существенном уровне. Кроме того, авторы настоящего изобретения подтвердили, что такая молекула RNAi заметно супрессировала бы экспрессию TS и, следовательно, проявляла противоопухолевое действие и потенцировала противоопухолевое действие 5-FU-противоопухолевых агентов (комбинированного лекарственного средства, содержащего тегафур, гимерацил и отерацил калия, в частности). Это привело к завершению настоящего изобретения.

Более конкретно настоящее изобретение описано ниже.

[1] Молекула RNAi, способная подавлять экспрессию тимидилатсинтазы за счет действия RNAi, содержащая домен двухцепочечной РНК, составленный из смысловой цепи, состоящей из нуклеотидной последовательности, представленной SEQ ID NO: 1, 3 или 5, гибридизованной с антисмысловой цепью, гибридизующейся в жестких условиях со смысловой цепью.

[2] Молекула RNAi по [1], которая содержит любую из следующих комбинаций смысловой цепи и антисмысловой цепи:

смысловая цепь, состоящая из нуклеотидной последовательности, представленной SEQ ID NO: 1, и антисмысловая цепь, состоящая из нуклеотидной последовательности, представленной SEQ ID NO: 2;

смысловая цепь, состоящая из нуклеотидной последовательности, представленной SEQ ID NO: 3, и антисмысловая цепь, состоящая из нуклеотидной последовательности, представленной SEQ ID NO: 4; или

смысловая цепь, состоящая из нуклеотидной последовательности, представленной SEQ ID NO: 5, и антисмысловая цепь, состоящая из нуклеотидной последовательности, представленной SEQ ID NO: 6.

[3] Молекула RNAi по [1] или [2], в которой смысловая цепь лигирована с антисмысловой цепью через линкерную область.

[4] Молекула RNAi по [3], которая состоит из нуклеотидной последовательности, представленной SEQ ID NO: 8.

[5] Вектор, содержащий матричную ДНК молекулы RNAi по [3] или [4] и экспрессирующий молекулу RNAi.

[6] Противоопухолевый агент, содержащий молекулу RNAi по любому из [1]-[4] и/или вектор по [5].

[7] Фармацевтическая композиция, использованная для лечения и/или профилактики рака, содержащая молекулу RNAi по любому из [1]-[4] и/или вектор по [5] в сочетании с 5-FU-противоопухолевым агентом.

[8] Фармацевтическая композиция по [7], в которой 5-FU-противоопухолевый агент представляет собой комбинированное лекарственное средство, содержащее тегафур.

[9] Фармацевтическая композиция по [8], в которой 5-FU-противоопухолевый агент представляет собой комбинированное лекарственное средство, содержащее тегафур, гимерацил и отерацил калия.

[10] Фармацевтическая композиция по [9], которая содержит тегафур, гимерацил и отерацил калия в молярном соотношении 1:0,4:1.

[11] Фармацевтическая композиция по любому из [7]-[10], в которой молекула RNAi по любому из [1]-[4] и/или вектор по [5] и 5-FU-противоопухолевый агент каждый представляют собой препарат с одним активным ингредиентом.

[12] Фармацевтическая композиция по любому из [7]-[10], в которой молекула RNAi по любому из [1]-[4] и/или вектор по [5] и 5-FU-противоопухолевый агент присутствуют в виде препаративной формы в наборе.

[13] Агент для потенцирования противоопухолевого действия 5-FU-противоопухолевого агента, содержащий молекулу RNAi по любому из [1]-[4] и/или вектор по [5].

[14] Агент для потенцирования противоопухолевого действия по [13], в котором 5-FU-противоопухолевый агент представляет собой комбинированное лекарственное средство, содержащее тегафур.

[15] Агент для потенцирования противоопухолевого действия по [14], в котором 5-FU-противоопухолевый агент представляет собой комбинированное лекарственное средство, содержащее тегафур, гимерацил и отерацил калия.

Настоящее описание включает часть или все содержание, раскрытое в описании и/или чертежах японской патентной заявки № 2009-086463, которая является приоритетным документом настоящей заявки.

Эффекты изобретения

Молекула RNAi по настоящему изобретению способна супрессировать экспрессию TS на особенно заметном уровне и способна супрессировать рост опухолей, экспрессирующих TS. Дополнительно молекула RNAi по настоящему изобретению способна на заметном уровне потенцировать противоопухолевое действие 5-FU-противоопухолевого агента (комбинированного лекарственного средства, содержащего тегафур, гимерацил и отерацил калия, в частности).

Краткое описание чертежей

На Фиг.1 представлена характеристическая диаграмма, показывающая влияние siRNA, нацеленной на TS, на супрессию экспрессии TS на линии клеток колоректального рака человека DLD-1/5FU.

На Фиг.2 представлена характеристическая диаграмма, показывающая противоопухолевое действие shRNA, нацеленной на TS, и/или S-1 у мышей с линиями клеток колоректального рака человека DLD-1/5FU.

Варианты осуществления изобретения

Молекула RNAi по настоящему изобретению содержит домен двухцепочечной РНК, составленный из смысловой цепи, состоящей из нуклеотидной последовательности, представленной SEQ ID NO: 1, 3 или 5, гибридизованной с антисмысловой цепью, имеющей нуклеотидную последовательность, комплементарную нуклеотидной последовательности смысловой цепи. Молекула RNAi по настоящему изобретению нацеливает домен мРНК фермента TS, имеющий нуклеотидную последовательность, идентичную последовательности смысловой цепи (далее в настоящем документе обозначаемый как «мишеневый домен мРНК»). Таким образом, RNAi действует специфично на TS, и она может существенно супрессировать экспрессию TS.

Ситуация, при которой молекула RNAi по настоящему изобретению «нацеливает» мишеневый домен мРНК, имеет место при условиях, когда антисмысловая цепь домена двухцепочечной РНК молекулы RNAi по настоящему изобретению способна гибридизоваться с мишеневым доменом мРНК в жестких условиях.

Жесткие условия могут быть определены исходя из температуры плавления (Tm) нуклеиновой кислоты, гибридизующейся в соответствии с принятой техникой. В жестких условиях, при которых гибридизованное состояние может поддерживаться, например, отмывку, как правило, осуществляют приблизительно в 1-кратном SSC, 0,1% SDS при 37°С. При более жестких условиях отмывку осуществляют приблизительно в 0,5-кратном SSC, 0,1% SDS при 42°С. При еще более жестких условиях отмывку осуществляют приблизительно в 0,1-кратном SSC, 0,1% SDS при 65°С.

Антисмысловая цепь в домене двухцепочечной РНК молекулы RNAi по настоящему изобретению предпочтительно представляет собой РНК, состоящую из нуклеотидной последовательности, полностью комплементарной мишеневому домену мРНК. Поскольку гибридизация может быть осуществлена в жестких условиях, антисмысловая цепь может содержать несоответствие, к которому относятся делеция, замена или добавка от 1 до 3 нуклеотидов, предпочтительно 1 или 2 нуклеотидов и более предпочтительно 1 нуклеотида.

Предпочтительно, чтобы молекула RNAi по настоящему изобретению содержала домен двухцепочечной РНК, содержащий смысловую цепь, гибридизованную с антисмысловой цепью, как описано ниже:

смысловая цепь, состоящая из нуклеотидной последовательности, представленной SEQ ID NO: 1, и антисмысловая цепь, состоящая из нуклеотидной последовательности, представленной SEQ ID NO: 2;

смысловая цепь, состоящая из нуклеотидной последовательности, представленной SEQ ID NO: 3, и антисмысловая цепь, состоящая из нуклеотидной последовательности, представленной SEQ ID NO: 4; или

смысловая цепь, состоящая из нуклеотидной последовательности, представленной SEQ ID NO: 5, и антисмысловая цепь, состоящая из нуклеотидной последовательности, представленной SEQ ID NO: 6.

Особенно предпочтительно, чтобы молекула RNAi по настоящему изобретению содержала домен двухцепочечной РНК, составленный из смысловой цепи, состоящей из нуклеотидной последовательности, представленной с помощью SEQ ID NO: 1, гибридизованной с антисмысловой цепью, состоящей из нуклеотидной последовательности, представленной SEQ ID NO: 2.

Смысловая или антисмысловая цепь, составляющая молекулу RNAi по настоящему изобретению, при необходимости может содержать на 3' конце липкий конец. Типы и количество нуклеотидов, составляющих такой липкий конец, не ограничены. Например, последовательность липкого конца может состоять из от 1 до 5, предпочтительно от 1 до 3 и более предпочтительно из 1 или 2 нуклеотидов (например, TTT, UU или TT). По настоящему изобретению «липкий конец» представляет собой нуклеотид, добавленный к концу цепи, составляющей молекулу RNAi, не имеющий нуклеотида в соответствующей позиции другой цепи, с которой такой «липкий конец» может комплементарно связаться. Липкий конец может представлять собой нуклеотид, входящий в состав ДНК. Кроме того, смысловая или антисмысловая цепь, составляющая молекулу RNAi, при необходимости может дополнительно включать замену, добавку или делецию от 1 до 3 нуклеотидов и более предпочтительно 1 или 2 нуклеотидов, при условии, что это не влияет на активность RNAi, чтобы можно было благополучно осуществить большое число экспериментальных операций, таких как секвенирование гена.

Кроме того, при необходимости 5' конец смысловой или антисмысловой цепи может быть фосфорилирован, или с 5' концом может быть связана трифосфорная кислота (ррр).

К примерам молекул RNAi по настоящему изобретению относятся двухцепочечные молекулы РНК, такие как молекулы siRNA (малая интерферирующая РНК) и молекулы shRNA (короткая шпилечная РНК), и предпочтительны молекулы siRNA и shRNA.

По настоящему изобретению молекула siRNA представляет собой двухцепочечную молекулу РНК, получаемую при образовании двухцепочечной области посредством гибридизации смысловой цепи с антисмысловой цепью.

Смысловая цепь и антисмысловая цепь, составляющие молекулу siRNA, могут быть синтезированы in vitro в соответствии с известной техникой, такой как химический синтез или применение системы транскрипции с использованием промотора и РНК-полимеразы. Альтернативно, для синтеза интересующих смысловой и антисмысловой цепей in vivo ДНК-матрицы смысловой цепи и антисмысловой цепи могут быть встроены в подходящий экспрессирующий вектор, и полученный вектор может быть введен в подходящую клетку-хозяина. Синтезированные смысловая и антисмысловая цепи могут быть подвергнуты отжигу посредством обычного способа, известного в данной области. Синтезированные смысловую и антисмысловую цепи по отдельности растворяют в буфере для отжига двухцепочечной РНК, их эквивалентные количества (равное число молей) смешивают друг с другом, смесь нагревают до диссоциации двойной цепи, и полученный продукт затем инкубируют с постепенным охлаждением. Отжиг может быть осуществлен выдерживанием смеси при 90°С в течение 1 минуты и затем при 37°С в течение 1 часа, например. После чего осуществляют экстракцию фенол/хлороформом и осаждение этанолом, и может быть получена молекула siRNA (т.е. молекула двухцепочечной РНК).

По настоящему изобретению молекула shRNA представляет собой одноцепочечную РНК, состоящую из смысловой цепи, лигированной с антисмысловой цепью через линкерную область. Она состоит из от 40 до 60 нуклеотидов, линкерная область скручена за счет образования петли, и антисмысловая цепь гибридизована со смысловой цепью. Таким образом, образуется двухцепочечная область.

Линкерная область, содержащаяся в молекуле shRNA, конкретным не ограничивается, и она может представлять собой полинуклеотидный или неполинуклеотидный линкер при условии, что он способен лигировать смысловую цепь с антисмысловой цепью с образованием структуры стебель-петля. Предпочтителен полинуклеотидный линкер, состоящий из от 2 до 22 нуклеотидов, известный в данной области. К конкретным примерам относятся UAGUGCUCCUGGUUG (SEQ ID NO: 7), UUCAAGAGA, CCACC, CUCGAG, CCACACC, UUCAAGAGA, AUG, CCC и UUCG, причем предпочтителен UAGUGCUCCUGGUUG (SEQ ID NO: 7).

Предпочтительная молекула shRNA представляет собой одноцепочечную РНК, состоящую из нуклеотидной последовательности, представленной SEQ ID NO: 8.

Молекула shRNA может быть синтезирована in vitro или in vivo в соответствии с известными техниками, описанными выше. При синтезе молекулы shRNA синтезируют одну цепь РНК, содержащую смысловую цепь и антисмысловую цепь, ориентированную в противоположном направлении, и полученную одну цепь РНК затем подвергают самокомплементарному связыванию с образованием двухцепочечной структуры. Таким образом, может быть получена молекула shRNA.

Кроме того, молекула shRNA может быть получена с помощью экспрессирующего вектора, содержащего матричную ДНК, кодирующую молекулу shRNA.

К примерам векторов, которые могут быть использованы по настоящему изобретению, относятся плазмидные, вирусные и невирусные векторы. К примерам плазмидных векторов, которые могут быть использованы, относятся векторы pBAsi, pSUPER и pBAsi-hU6. К примерам вирусных векторов, которые могут быть использованы, относятся аденовирусные (например, pAxcwit), ретровирусные и лентивирусные векторы. Примером невирусного вектора является липосомный вектор.

Промотор и/или другую контрольную последовательность функционально связывают с матричной ДНК молекулы shRNA, и продукт встраивают в вектор. Под выражением «функционально связанный…встроенный» понимают лигирование и встраивание промотора и/или другой контрольной последовательности в вектор, так что экспрессируется молекула shRNA и в клетке, в которую такой вектор был встроен, мРНК TS-мишени разрушается под контролем промотора и/или другой контрольной последовательности. Промотор и/или другая контрольная последовательность, которая может быть встроена в вектор, конкретными не ограничиваются. Промотор и/или другая контрольная последовательность, известная в данной области, такая как конститутивный промотор, тканеспецифический промотор, промотор, специфичный для стадии развития, промотор тРНК, промотор Н1, промотор U6, промотор полимеразы II, промотор CMV и другой контрольный элемент (например, последовательность терминатора, содержащая по меньшей мере 4 непрерывных тимидиновых остатка), могут быть выбраны надлежащим образом.

Полученный таким образом вектор, экспрессирующий молекулу shRNA, способен экспрессировать молекулу shRNA и специфически разрушать мРНК TS в клетке, в которую вектор был встроен.

Молекула RNAi по настоящему изобретению может быть введена любым способом при условии, что она способна оказывать свое действие на опухоль. Молекула RNAi может быть введена в опухоль или кровь. При введении молекулы RNAi по настоящему изобретению в кровь молекула RNAi может быть модифицирована с помощью известной техники модификации нуклеиновых кислот для того, чтобы предотвратить деградацию молекулы RNAi. Кроме того, могут быть использованы известные системы доставки лекарственных средств (DDS), такие как липосомы или полимерные мицеллы, так что молекула RNAi может без труда достичь опухоли.

Вектор, экспрессирующий молекулу shRNA, по настоящему изобретению может быть введен в клетку посредством, например, транспорта с помощью носителя, опосредованного липидом (например, способ с липофектамином), транспорта, опосредованного химическим веществом (например, фосфатом кальция), микроинъекции, имплантации с помощью генной пушки или электропорации.

Влияние вектора, экспрессирующего молекулу RNAi или молекулу shRNA, по настоящему изобретению может быть оценено, используя в качестве индикатора сниженные уровни экспрессии мРНК или белков TS в клетках, ткани или индивидууме, в которые такую молекулу или вектор ввели, по сравнению с такими уровнями в клетках, ткани или индивидууме, в которые такую молекулу или вектор не вводили (или еще не ввели). При анализе мРНК она может быть оценена посредством нозерн-гибридизации, ОТ-ПЦР, in situ гибридизации или другим способом. При анализе белков они могут быть оценены посредством вестерн-блоттинга, ELISA, анализа белков с использованием белкового чипа, с которым связали антитело, или анализа активности белков или другим способом.

Вектор, экспрессирующий молекулу RNAi или молекулу shRNA, по настоящему изобретению способен снижать уровни экспрессии мРНК или белка TS в клетках, ткани или индивидууме, в которые такую молекулу или вектор ввели, на 50% или больше, 60% или больше, 70% или больше, предпочтительно 80% или больше и более предпочтительно 90% или больше по сравнению с контрольным образцом.

Вектор, экспрессирующий молекулу RNAi или молекулу shRNA, по настоящему изобретению способен супрессировать экспрессию TS в два, три, четыре, пять, десять, двадцать, тридцать, сорок, пятьдесят, сто или больше раз по сравнению с эффективностью векторов, экспрессирующих молекулу RNAi или молекулу shRNA, известных в данной области, которые нацеливают мРНК TS.

В качестве способов выбора нуклеотидных последовательностей в мишеневом домене мРНК при создании молекул RNAi известно большое число техник. Например, может быть использована система поддержки созданию siRNA (продукция фирмы Takara Bio, Inc.). Тем не менее, необходимо отметить, что не все молекулы RNAi, имеющие нуклеотидные последовательности, выбранные посредством такой техники, функционируют как RNAi. Поэтому очень затруднительно среди кандидатных молекул RNAi, имеющих нуклеотидные последовательности, выбранные посредством указанной выше техники, выбрать интересующие молекулы RNAi, существенно супрессирующие экспрессию TS.

Вектор, экспрессирующий молекулу RNAi или молекулу shRNA, описанный выше, может быть использован в качестве активного ингредиента (а) противоопухолевого агента, (b) агента, потенцирующего противоопухолевое действие 5-FU-противоопухолевого агента и (с) фармацевтической композиции, использованной для лечения и/или профилактики рака.

(а) Противоопухолевый агент

Как подробно описано в примерах ниже, вектор, экспрессирующий молекулу RNAi или молекулу shRNA, по настоящему изобретению способен подавлять рост опухолевых клеток. Поэтому вектор, экспрессирующий молекулу RNAi или молекулу shRNA, по настоящему изобретению может быть использован в качестве противоопухолевого агента для лечения и/или профилактики рака.

Рак, у которого наблюдаются высокие уровни экспрессии TS, можно лечить, используя противоопухолевый агент по настоящему изобретению. К примерам такого рака относятся, но ими конкретно не ограничиваясь, колоректальный рак, рак печени, рак почки, рак головы и шеи, рак пищевода, рак желудка, рак желчевыводящих путей, рак желчного пузыря и желчных протоков, рак поджелудочной железы, рак легких, рак молочных желез, рак яичников, рак шейки матки, рак тела матки, рак мочевого пузыря, рак простаты, рак яичка, остеогенная саркома и саркома мягких тканей, лейкоз, злокачественная лимфома, множественная миелома, рак кожи и рак мозга. Предпочтительными примерами являются колоректальный рак, рак желудка, рак головы и шеи, рак легких, рак молочных желез, рак поджелудочной железы, рак желчевыводящих путей и рак печени, причем особенно предпочтителен колоректальный рак.

Противоопухолевый агент по настоящему изобретению может содержать вектор, экспрессирующий молекулу RNAi или молекулу shRNA, по настоящему изобретению самостоятельно или в сочетании двух или больше. Применение в качестве активного ингредиента противоопухолевого агента по настоящему изобретению вектора, экспрессирующего молекулу shRNA, предпочтительно по следующим причинам. А именно, применение такого вектора экономически выгоднее, чем синтез молекул RNAi, такой вектор амплифицируют после введения в клетки, и молекулы shRNA могут стабильно продуцироваться в большом количестве. Таким образом, применение такого вектора количественно более эффективно, чем введение молекул RNAi. Экспрессирующий shRNA вектор предпочтительно экспрессирует молекулу shRNA, представленную SEQ ID NO: 8.

Противоопухолевый агент по настоящему изобретению может содержать помимо вектора, экспрессирующего молекулу RNAi или молекулу shRNA, по настоящему изобретению подходящие вещества, которые обычно используются, такие как носители, разбавители, эмульсии, эксципиенты, наполнители, связующие вещества, увлажняющие агенты, дезинтеграторы, поверхностно активные агенты, смазывающие средства, диспергирующие вещества, буферы, консерванты, солюбилизаторы, антисептики, окрашивающие вещества, улучшающие вкус агенты или стабилизаторы.

Противоопухолевый агент по настоящему изобретению может быть непосредственно введен в рак посредством инъекции. Он также может быть введен пероральным или парентеральным путем (например, внутривенным введением, внутриартериальным введением, местным введением посредством инъекции, внутрибрюшинным или внутригрудным введением, подкожным введением, внутримышечным введением, сублингвальным введением, впитыванием через кожу или интраректальным введением).

Противоопухолевый агент по настоящему изобретению может быть получен в подходящей лекарственной форме в соответствии со способом введения. Конкретно, противоопухолевый агент может быть получен в большом числе лекарственных форм, таких как инъекционные препараты, суспензии, эмульсии, мази, кремы, таблетки, капсулы, гранулированные препараты, порошковые препараты, пилюли, мелкие гранулы, пастилки, лекарственные препараты для введения в прямую кишку, суппозитории на масляной основе или водорастворимые суппозитории.

Количество вектора, экспрессирующего молекулу RNAi или молекулу shRNA, по настоящему изобретению для встраивания в противоопухолевый агент по настоящему изобретению может варьировать в зависимости от факторов, таких как возраст, масса тела или тяжесть заболевания пациента. Доза может быть надлежащим образом определена в диапазоне от 0,0001 мг до 100 мг на кг массы тела.

Вектор, экспрессирующий молекулу RNAi или молекулу shRNA, входящий в состав противоопухолевого агента по настоящему изобретению может быть доставлен в ткань или клетки-мишени посредством большого числа техник, которые обычно используются в области генной терапии. Например, могут быть использованы известные техники DDS, такие как техники с использованием липосом или полимерных мицелл, транспорт с помощью носителя, опосредованный липидом (например, способ с липофектамином), транспорт, опосредованный химическим веществом (например, фосфатом кальция), микроинъекция, имплантация с помощью генной пушки или электропорация, как описано выше.

Влияние противоопухолевого агента по настоящему изобретению может быть оценено путем введения противоопухолевого агента в клетки или ткани, полученные из рака, или индивидуумам, страдающим раком, сравнивая размер опухоли в них с размером опухоли в клетках, ткани или индивидууме, которым противоопухолевый агент не был введен (или еще не был введен), и используя в качестве индикатора результаты сравнения (т.е. уменьшение размеров или устранение опухоли). Раковые клетки, которые могут быть использованы для оценки влияния противоопухолевого агента по настоящему изобретению, конкретными не ограничиваются при условии экспрессии TS. К их примерам относятся линии клеток колоректального рака человека DLD-1/5FU, KM12C/5FU и HT29/5FU и линия клеток рака желудка человека NUGC-3/5FU.

Противоопухолевый агент по настоящему изобретению способен оказывать противоопухолевое действие, которое в два, три, четыре, пять, десять, двадцать, тридцать, сорок, пятьдесят, сто или больше раз выше, чем действие противоопухолевого агента, содержащего в качестве активного ингредиента векторы, экспрессирующие молекулу RNAi или молекулу shRNA, которые нацеливают мРНК TS, известные в данной области.

(b) Агент, потенцирующий противоопухолевое действие 5-FU-противоопухолевого агента

В данной области хорошо известно, что опухоли, у которых наблюдаются высокие уровни экспрессии TS, могут быть устойчивы к 5-FU-противоопухолевому агенту (Johnston P.G. et al., Cancer Res., 1995; 55: 1407-12; Yeh K. H. Et al., Cancer, 1998; 82: 1626-31). Как конкретно описано в примерах ниже, агент, потенцирующий противоопухолевое действие 5-FU-противоопухолевого агента по настоящему изобретению, способен супрессировать экспрессию TS в таких опухолях и усиливать влияние вводимого 5-FU-противоопухолевого агента.

В настоящем изобретении к примерам 5-FU-противоопухолевых агентов относятся 5-FU-и производное 5-FU, содержащее 5-FU-в качестве активного метаболита. Примером производного 5-FU-является агент, содержащий тегафур. Производное 5-FU- предпочтительно представляет собой комбинированное лекарственное средство, содержащее тегафур. К конкретным примерам относятся комбинированное лекарственное средство, содержащее тегафур и урацил, комбинированное лекарственное средство, содержащее тегафур, гимерацил и отерацил калия, доксифлуридин, капецитабин и кармофур. Особенно предпочтительно комбинированное лекарственное средство, содержащее тегафур, гимерацил и отерацил калия (например, TS-1 (зарегистрированный товарный знак), продукция фирмы Taiho Pharmaceutical Co., Ltd.), описанное ниже.

Агент, потенцирующий противоопухолевое действие 5-FU-противоопухолевого агента по настоящему изобретению, может содержать вектор, экспрессирующий молекулу RNAi или молекулу shRNA по настоящему изобретению, самостоятельно или в комбинации из двух или больше. Предпочтительно агент содержит вектор, экспрессирующий молекулу shRNA. Вектор, экспрессирующий shRNA, предпочтительно экспрессирует молекулу shRNA, представленную SEQ ID NO: 8.

Количество вектора, экспрессирующего молекулу RNAi или молекулу shRNA по настоящему изобретению, входящего в состав агента, потенцирующего противоопухолевое действие 5-FU-противоопухолевого агента по настоящему изобретению, может меняться в зависимости от факторов, таких как возраст, масса тела или тяжесть заболевания пациента. Доза может быть надлежащим образом определена в диапазоне от 0,0001 мг до 100 мг на кг массы тела.

Агент, потенцирующий противоопухолевое действие 5-FU-противоопухолевого агента по настоящему изобретению, может быть надлежащим образом получен в соответствии с известной техникой в зависимости от факторов, таких как способ введения или мишень введения, как и в случае противоопухолевого агента. Вектор, экспрессирующий молекулу RNAi или молекулу shRNA, входящий в состав агента, может быть доставлен к ткани или клеткам-мишеням посредством большого числа техник, которые широко используются в области генной терапии.

Влияние агента, потенцирующего противоопухолевое действие 5-FU-противоопухолевого агента по настоящему изобретению, может быть оценено путем введения 5-FU-противоопухолевого агента и агента, потенцирующего противоопухолевое действие 5-FU-противоопухолевого агента по настоящему изобретению, в клетки или ткань, полученные из рака, или индивидуумам, страдающим раком, сравнивая размер опухоли в них с размером опухоли в клетках, ткани или индивидууме, которым 5-FU-противоопухолевый агент был введен самостоятельно, и используя результаты сравнения (т.е. уменьшение размера или устранение опухоли) в качестве индикатора. Раковые клетки, которые могут быть использованы для оценки влияния агента, потенцирующего противоопухолевое действие 5-FU-противоопухолевого агента по настоящему изобретению, конкретными не ограничиваются при условии экспрессии TS. К их примерам относятся линии клеток колоректального рака человека DLD-1/5FU, KM12C/5FU и HT29/5FU и линия клеток рака желудка человека NUGC-3/5FU. 5-FU-противоопухолевый агент и агент, потенцирующий противоопухолевое действие 5-FU-противоопухолевого агента по настоящему изобретению, могут быть введены одновременно или раздельно.

При использовании агента, потенцирующего противоопухолевое действие 5-FU-противоопухолевого агента по настоящему изобретению, в сочетании с 5-FU-противоопухолевым агентом противоопухолевое действие 5-FU-противоопухолевых агентов может быть усилено в два, три, четыре, пять, десять, двадцать, тридцать, сорок, пятьдесят или больше раз.

Агент, потенцирующий противоопухолевое действие 5-FU-противоопухолевого агента по настоящему изобретению, способен усиливать противоопухолевое действие 5-FU-противоопухолевых агентов. Таким образом, может быть уменьшена доза 5-FU-противоопухолевого агента, необходимого для лечения пациентов, страдающих раком, описанным выше. Это может супрессировать или замедлять развитие побочных эффектов, которые могут быть вызваны введением 5-FU-противоопухолевого агента. К примерам побочных эффектов относятся, но ими не ограничиваясь, супрессия костного мозга, гемолитическая анемия, синдром диссеминированного внутрисосудистого свертывания, молниеносная печеночная недостаточность, обезвоживание, энтерит, интерстициальная пневмония, стоматит, язва желудочно-кишечного тракта, желудочно-кишечное кровотечение, прободение пищеварительного тракта, острая почечная недостаточность, злокачественная экссудативная эритема, токсический эпидермальный некролиз, психоневротическое расстройство, острый панкреатит, рабдомиолиз и аносмия.

(с) Фармацевтическая композиция, используемая для лечения и/или профилактики рака

Фармацевтическая композиция, используемая для лечения и/или профилактики рака, по настоящему изобретению содержит в качестве активных ингредиентов вектор, экспрессирующий молекулу RNAi или молекулу shRNA, по настоящему изобретению и 5-FU-противоопухолевый агент. У фармацевтической композиции по настоящему изобретению наблюдаются высокие уровни экспрессии TS и, таким образом, она может быть использована для лечения и/или профилактики рака, резистентного к 5-FU-противоопухолевому агенту.

Рак, у которого наблюдаются высокие уровни экспрессии TS, можно лечить, используя фармацевтическую композицию по настоящему изобретению. К примерам такого рака относятся, но ими конкретно не ограничиваясь, колоректальный рак, рак печени, рак почки, рак головы и шеи, рак пищевода, рак желудка, рак желчевыводящих путей, рак желчного пузыря и желчных протоков, рак поджелудочной железы, рак легких, рак молочных желез, рак яичников, рак шейки матки, рак тела матки, рак мочевого пузыря, рак простаты, рак яичка, остеогенная саркома и саркома мягких тканей, лейкоз, злокачественная лимфома, множественная миелома, рак кожи и рак мозга. Предпочтительными примерами являются колоректальный рак, рак желудка, рак головы и шеи, рак легких, рак молочных желез, рак поджелудочной железы, рак желчевыводящих путей и рак печени, причем особенно предпочтителен колоректальный рак.

5-FU-противоопухолевый агент, входящий в состав фармацевтической композиции по настоящему изобретению, не ограничивается 5-FU, и производное 5-FU, содержащее 5-FU-в качестве активного метаболита, охватывается 5-FU-противоопухолевым агентом. Примером производного 5-FU-является агент, содержащий тегафур. Комбинированное лекарственное средство, содержащее тегафур, предпочтительно, и к конкретным примерам относятся комбинированное лекарственное средство, содержащее тегафур и урацил, комбинированное лекарственное средство, содержащее тегафур, гимерацил и отерацил калия, доксифлуридин, капецитабин и кармофур. Особенно предпочтительно комбинированное лекарственное средство, содержащее тегафур, гимерацил и отерацил калия.

Тегафур представляет собой известное соединение, обозначаемое как 5-фтор-1-(2-тетрагидрофури;)-2,4-(1Н,3Н)-пиримидиндион, он активируется in vivo, и он высвобождает 5-FU, который представляет собой противоопухолевое активное вещество. Тегафур может быть получен в соответствии с известной техникой, такой как способ, описанный японской патентной публикацией (Kokoku) № S49-10510 B (1974).

Гимерацил представляет собой известное соединение, обозначаемое как 2,4-дигидрокси-5-хлорпиридин, и он не обладает какой-либо противоопухолевой активностью. Гимерацил супрессирует инактивацию 5-FU-при метаболизме in vivo, и он может усиливать противоопухолевое действие.

Отерацил калия представляет собой известное соединение, обозначаемое как 1,2,3,4-тетрагидро-2,4-диоксо-1,3,5-триазин-6-карбоксилат монокалия и он не обладает какой-либо противоопухолевой активностью. Отерацил калия распределяется, главным образом, в желудочно-кишечном тракте, и он супрессирует там активацию 5-FU, чтобы подавить расстройства желудочно-кишечного тракта.

Предпочтительные количества тегафура, гимерацила и отерацила калия, встроенных в комбинированное лекарственное средство, содержащее тегафур, гимерацил и отерацил калия, конкретными не ограничиваются при условии, что каждое соединение способно оказывать интересующее действие. Такие количества могут быть теми же, что и количества известного комбинированного лекарственного средства, описанного в японском патенте № 2614164. Например, приблизительно от 0,1 до 5 молей и предпочтительно приблизительно от 0,2 до 1,5 молей гимерацила, и приблизительно от 0,1 до 5 молей и предпочтительно приблизительно от 0,2 до 2 молей отерацила калия может быть введено на каждый моль тегафура в виде ежедневного количества. Особенно предпочтительно, чтобы количества введенных активных ингредиентов (т.е. тегафура, гимерацила и отерацила калия) составляли 1:0,4:1 по молям. Комбинированное лекарственное средство, содержащее тегафур, гимерацил и отерацил калия в молярном соотношении 1:0,4:1, в настоящем документе иногда обозначают как «S-1».

Фармацевтическая композиция по настоящему изобретению может содержать вектор, экспрессирующий молекулу RNAi или молекулу shRNA, по настоящему изобретению самостоятельно или в комбинации двух или больше таких векторов. Фармацевтическая композиция предпочтительно содержит вектор, экспрессирующий молекулу shRNA. Более предпочтительно, чтобы вектор, экспрессирующий молекулу shRNA, экспрессировал молекулу shRNA, представленную SEQ ID NO:8.

Фармацевтическая композиция по настоящему изобретению может представлять собой комбинированное лекарственное средство, содержащее вектор, экспрессирующий молекулу RNAi или молекулу shRNA, и тегафур, гимерацил и отерацил калия в подходящем соотношении компонентов в смеси (т.е. лекарственное средство, содержащее большое число активных ингредиентов; препарат с одним активным ингредиентом). Альтернативно, фармацевтическая композиция может существовать в форме мультикомпонентного лекарственного средства, содержащего любой из вышеуказанных активных ингредиентов в качестве единственного активного компонента (т.е. лекарственного средства, содержащего один активный ингредиент), или комбинированного лекарственного средства (т.е. мультикомпонентной лекарственной формы), так что такие активные ингредиенты могут быть использованы одновременно или по отдельности. Тегафур, гимерацил и отерацил калия предпочтительно получают в форме комбинированных лекарственных средств в одной лекарственной форме, и вектор, экспрессирующий молекулу RNAi или молекулу shRNA, предпочтительно получают в форме препарата с одним активным ингредиентом.

Лекарственные формы для таких лекарственных препаратов конкретными не ограничиваются и могут быть надлежащим образом выбраны в соответствии с целью лечения. К конкретным примерам относятся пероральные препараты (например, таблетки, покрытые таблетки, порошок, гранулы, капсулы и жидкие препараты), инъекционные препараты, суппозитории, липкие трансдермальные пластыри и мази. Если фармацевтическая композиция по настоящему изобретению находится в многокомпонентном лекарственном препарате, то такой лекарственный препарат может иметь ту же или отличную лекарственные формы. Например, предпочтительно, чтобы комбинированное лекарственное средство, содержащее тегафур, гимерацил и отерацил калия, находилось в форме перорального препарата, а вектор, экспрессирующий молекулу RNAi или молекулу shRNA, находился в форме инъекционного препарата.

Фармацевтическая композиция по настоящему изобретению может быть получена, упакована и распределена раздельно для каждого лекарственного препарата при условии, что комбинированное лекарственное средство, содержащее тегафур, гимерацил и отерацил калия, вводят в комбинации с вектором, экспрессирующим молекулу RNAi или молекулу shRNA. Альтернативно, все или некоторые из лекарственных препаратов могут быть получены, упакованы и распределены в форму одной упаковки, подходящую для введения таких лекарственных средств в комбинации (т.е. препаративную форму в наборе).

Лекарственные препараты, содержащие активные ингредиенты фармацевтической композиции по настоящему изобретению, могут быть получены в соответствии с известной техникой с использованием фармакологически приемлемых носителей. К примерам таких носителей относится большое число веществ, которые обычно используют для лекарственных препаратов, таких как эксципиенты, связывающие вещества, дезинтеграторы, смазывающие вещества, разбавители, солюбилизаторы, суспендирующие агенты, изотонизирующие агенты, модификаторы величины рН, буферы, стабилизаторы, красящие вещества, вкусовые добавки и корригирующие вещества.

К примерам эксципиентов относятся лактоза, сахароза, хлорид натрия, глюкоза, мальтоза, маннитол, эритритол, ксилитол, мальтитол, инозитол, декстран, сорбитол, альбумин, мочевина, крахмал, карбонат кальция, каолин, кристаллическая целлюлоза, оксид кремния, метилцеллюлоза, глицерин, альгинат натрия, аравийская камедь и смесь любых из них. К примерам смазывающих средств относятся очищенный тальк, стеарат, борат натрия, полиэтиленгликоль и смесь любых из них. К примерам связывающих средств относятся сахарный сироп, раствор глюкозы, раствор крахмала, раствор желатина, поливиниловый спирт, поливиниловый эфир, поливинилпирролидон, карбоксиметилцеллюлоза, шеллак, метилцеллюлоза, этилцеллюлоза, вода, этанол, фосфат калия и смесь любых из них. К примерам дезинтеграторов относятся сухой крахмал, альгинат натрия, порошок агара, порошок ламинарии, бикарбонат натрия, карбонат кальция, сложные эфиры полиоксиэтиленсорбитана и жирных кислот, лаурилсульфат натрия, моноглицерид стеариновой кислоты, крахмал, лактоза и смесь любых из них. К примерам разбавителей относятся вода, этиловый спирт, макрогол, пропиленгликоль, этоксилированный изостеариловый спирт, полиоксилированный изостеариловый спирт, сложные эфиры полиоксиэтиленсорбитана и жирных кислот и смесь любых из них. К примерам стабилизаторов относятся пиросульфит натрия, этилендиаминтетрауксусная кислота, тиогликолевая кислота, тиомолочная кислота и смесь любых из них. К примерам изотонизирующих агентов относятся хлорид натрия, борная кислота, глюкоза, глицерин и смесь любых из них. К примерам модификаторов величины рН и буферов относятся цитрат натрия, лимонная кислота, ацетат натрия, фосфат натрия и любая их смесь. К примерам успокаивающих агентов относятся гидрохлорид прокаина, гидрохлорид лидокаина и любая их смесь.

Количества активных ингредиентов во вводимой фармацевтической композиции по настоящему изобретению конкретными не ограничены при условии, что такие активные ингредиенты способны оказывать интересующее действие. Такие количества надлежащим образом определяют в соответствии с возрастом, типом рака, стадией, возникновением метастазов, историей болезни, применением других противоопухолевых агентов и другими условиями пациента. Например, количество тегафура составляет от 0,2 до 40 мг/кг/день и предпочтительно от 0,5 до 20 мг/кг/день, количество гимерацила составляет от 0,05 до 12 мг/кг/день и предпочтительно от 0,1 до 6 мг/кг/день, количество отерацила калия составляет от 0,2 до 40 мг/кг/день и предпочтительно от 0,5 до 20 мг/кг/день, и количество вектора, экспрессирующего молекулу RNAi или молекулу shRNA, составляет от 0,0001 до 100 мг/кг/день.

Порядок и интервалы введения активных ингредиентов фармацевтической композиции по настоящему изобретению конкретными не ограничены при условии, что при применении таких активных ингредиентов в комбинации может быть достигнуто синергистическое действие. При получении фармацевтической композиции по настоящему изобретению в форме набора лекарственные средства могут вводиться одновременно или по отдельности.

Влияние фармацевтической композиции по настоящему изобретению может быть оценено путем введения фармацевтической композиции в клетку или ткань, происходящую из вышеперечисленного рака, или индивидууму, страдающему таким раком, сравнивая размер опухоли в них с размером опухоли в клетке или ткани или у индивидуума, в которые фармацевтическую композицию не ввели (или еще не ввели), и используя результаты сравнения (т.е. уменьшение размера или устранение опухоли) в качестве индикатора. Раковые клетки, которые могут быть использованы для оценки влияния фармацевтической композиции по настоящему изобретению, конкретными не ограничиваются при условии экспрессии TS. К их примерам относятся линии клеток колоректального рака человека DLD-1/5FU, KM12C/5FU и HT29/5FU и линия клеток рака желудка человека NUGC-3/5FU.

Противоопухолевое действие фармацевтической композиции по настоящему изобретению не является аддитивным, полученным исходя из противоопухолевого действия каждого активного ингредиента. Противоопухолевое действие фармацевтической композиции по настоящему изобретению может представлять собой синергистическое действие, получаемое исходя из действия 5-FU-противоопухолевого агента, усиливающего активность, проявленную вектором, экспрессирующим молекулу RNAi или молекулу shRNA. «Аддитивное действие» составляет сумму противоопухолевого действия, проявленного каждым активным ингредиентом, и аддитивное действие может быть представлено в виде величины, определенной умножением степеней ингибирования опухолевого роста, проявленных активными ингредиентами, что подробно описано в примерах ниже. Под термином «синергистическое действие» понимают противоопухолевое действие, которое статистически существенно выше, чем аддитивное противоопухолевое действие, проявленное активными ингредиентами. Такие степени ингибирования опухолевого роста статистически существенно выше, чем степень ингибирования опухолевого роста, достигнутая аддитивным действием, вносимым активными ингредиентами, что более подробно описано в примерах ниже.

Настоящее изобретение также относится к способу лечения рака, включающему применение противоопухолевого агента, агента, потенцирующего противоопухолевое действие 5-FU-противоопухолевого агента и/или фармацевтической композиции по настоящему изобретению. К примерам рака, который возможно лечить таким способом, относятся виды рака, описанные выше.

Примеры

Далее в настоящем документе более подробно описывается настоящее изобретение со ссылкой на примеры ниже. Тем не менее, необходимо отметить, что настоящее изобретение не ограничивается этими примерами.

Пример 1

Идентификация молекул siRNA, нацеливающих TS

Линии клеток колоректального рака человека DLD-1/5FU (Int. J. Oncol., 2000; 17: 277-83), о которых было сообщено, что они резистентны к 5-FU, культивировали в культуральной чашке диаметром 6 см в течение 24 часов до достижения клетками от 50% до 60% слияния.

Затем химическим путем синтезировали молекулы siRNA (т.е. молекулы TS-siRNA1 (смысловая цепь: SEQ ID NO: 1; антисмысловая цепь: SEQ ID NO: 2), молекулы TS-siRNA2 (смысловая цепь: SEQ ID NO: 3; антисмысловая цепь: SEQ ID NO: 4) и молекулы TS-siRNA3 (смысловая цепь: SEQ ID NO: 5; антисмысловая цепь: SEQ ID NO: 6), и 2,5 мл раствора, содержащего каждую из указанных выше молекул siRNA (конечная концентрация: 25 нМ) и 25 мкл реагента для трансфекции TransIT-TKO (продукция фирмы Mirus) трансфицировали в указанные выше клетки в соответствии с принятой техникой. В качестве отрицательного контроля использовали зашифрованную siRNA (TS-Scra1).

Влияние молекул siRNA на ингибирование экспрессии TS оценивали посредством ПЦР в режиме реального времени Taqman (система детекции последовательностей ABI PRISM 7700; продукция фирмы Applied Biosystems) через 72 часа после трансфекции. Для праймеров и зондов TS использовали смесь для анализа экспрессии генов Assays-on-Demand (ID анализа Hs00426591_m1; размер ПЦР-продукта: 87 н.п.; продукция фирмы Applied Biosystems). В качестве внутренного стандарта использовали GAPDH (система экспрессии генов Assays-on-Demand; ID анализа: Hs99999905_m1; размер ПЦР-продукта: 122 н.п.; продукция фирмы Applied Biosystems).

Результаты представлены на Фиг.1. У TS-siRNA1 - TS-siRNA3 наблюдаются эффекты ингибирования экспрессии TS, и влияние TS-siRNA1 на ингибирование экспрессии TS оказалось сильнее, чем влияние TS-siRNA2 и TS-siRNA3 (83,5±1,3%).

Пример 2

Создание аденовирусного вектора, экспрессирующего молекулу shRNA, нацеливающую TS

ДНК-матрицу молекулы shRNA, нацеливающей TS, синтезировали исходя из TS-siRNA1 (смысловая цепь TS-siRNA1 (GTAACACCATCGATCATGA, SEQ ID NO: 9), линкерной области (TAGTGCTCCTGGTTG, SEQ ID NO: 10), антисмысловой цепи TS-siRNA1 (TCATGATCGATGGTGTTAC, SEQ ID NO: 11) и терминатора полимеразы III (TTTTTT)). Для получения плазмидного вектора, экспрессирующего молекулу shRNA, нацеливающую TS, полученную матрицу встраивали в плазмидный вектор pBAsi-hU6 (продукция фирмы Takara Bio Inc.), содержащий промотор человека U6.

Затем промотор человека U6, отщепленный от плазмидного вектора с помощью рестриктазы EcoRV, и матрицу встраивали в космидный вектор pAxcwit, используя набор аденовирусного экспрессирующего вектора (продукция фирмы Takara Bio Inc.). Е-1-дефицитный аденовирусный вектор, экспрессирующий молекулу shRNA, нацеливающую TS (далее в настоящем документе обозначаемый как «Ad-shTS»), конструировали с помощью способа COS-TPC (Jpn. J. Med. Sci. Biol., 1994; 47: 157-66). В качестве контроля использовали аденовирусный вектор, содержащий бактериальный ген LacZ (далее в настоящем документе обозначаемый как «Ad-LacZ») (Oncogene, 2004, 23: 7475-83).

Пример 3

Влияние потенцирующей противоопухолевое действие молекулы shRNA, нацеливающей TS, на TS-1

Подкожно субкультивированные фрагменты линий клеток колоректального рака человека DLD-1/5FU, каждый из которых имел размер приблизительно 8 мм³, трансплантировали в спину голых мышей-самцов в возрасте 6 недель, и при достижении опухолью размера приблизительно 200 мм³ мышей делили на группы, каждая из которых состояла из 6 индивидуумов. В группе, которой был введен Ad-shTS (далее в настоящем документе обозначаемой как «группа Ad-shTS»), и в группе, которой были введены Ad-shTS и S-1 (далее в настоящем документе обозначаемой как «группа Ad-shTS+S-1»), каждые 4 дня в течение периода 16 дней в опухоль вводили Ad-shTS (2 × 10⁹ БОЕ). Группе Ad-shTS+S-1 и группе, которой ввели S-1 (далее в настоящем документе обозначаемой как «группа S-1»), перорально вводили 10 мг/кг S-1 (продукция фирмы Taiho Pharmaceutical Co., Ltd.) один раз в день в течение 14 последовательных дней. Первичное введение Ad-shTS осуществляли за 2 дня до начала введения S-1. В отношении контрольных групп, в опухоль через каждые 4 дня в течение периода 16 дней вводили PBS.

После этого измеряли размер опухоли каждые 3 дня в течение периода 30 дней и оценивали рост опухоли у каждой мыши. Размер опухоли и скорость роста опухоли определяли, используя равенства ниже.

Размер опухоли (мм³) = (длинный диаметр опухоли) х (короткий диаметр опухоли)² × 0,5

Скорость роста опухоли = (размер опухоли в день измерения)/ (размер опухоли при начале введения)

Результаты представлены на Фиг.2. В то время как скорость роста опухоли в день 30 контрольной группы составляла 44,5±18,0, эта величина в группе Ad-shTS составляла 22,3±8,2, в группе S-1 составляла 17,4±11,5 и в группе Ad-shTS+S-1 составляла 4,7±0,9. Таким образом, было обнаружено, что противоопухолевое действие группы Ad-shTS+S-1 статистически существенно выше, чем контрольной группы, группы Ad-shTS и группы S-1.

Степень ингибирования роста опухоли (%) группы Ad-shTS составляла 50% и группы S-1 составляла 39% относительно контрольной группы (т.е. скорость роста опухоли группы, которой каждый агент ввели в день 30/ скорость роста опухоли контрольной группы в день 30×100). Если влияние, потенцирующее противоопухолевое действие, достигнутое при применении Ad-shTS в сочетании с S-1, приводит к аддитивному действию, то полагают, что степень ингибирования роста опухоли группы Ad-shTS+S-1 относительно контрольной группы должна составить 20%, что определяют умножением степени ингибирования роста опухоли группы Ad-shTS на эту величину группы S-1 (т.е. 50%×39%=20%). Тем не менее, фактически определенная величина составила 11%. Это указывает на то, что влияние потенцирования противоопухолевого действия, достигнутое применением Ad-shTS в сочетании с S-1, имеет синергистическое действие.

Промышленное применение

Молекула RNAi, нацеливающая мРНК TS, по настоящему изобретению способна ингибировать уровень экспрессии TS в клетках опухоли и также способна ингибировать рост опухолевых клеток. За счет супрессии уровня экспрессии TS с помощью молекулы RNAi по настоящему изобретению может быть потенцировано противоопухолевое действие 5-FU-противоопухолевых агентов и рак можно эффективно лечить и/или упреждать.

Все публикации, патенты и патентные заявки, процитированные в настоящем документе, приводятся в настоящем документе в качестве ссылки в полном объеме.

1. Молекула RNAi для супрессии экспрессии тимидилатсинтазы за счет действия RNAi, содержащая домен двухцепочечной РНК, состоящий из смысловой цепи, состоящей из нуклеотидной последовательности, представленной SEQ ID NO: 1, гибридизованной с антисмысловой цепью, гибридизующейся в жестких условиях со смысловой цепью.

2. Молекула RNAi по п.1, которая содержит сочетание смысловой цепи, состоящей из нуклеотидной последовательности, представленной SEQ ID NO: 1, и антисмысловой цепи, состоящей из нуклеотидной последовательности, представленной SEQ ID NO: 2.

3. Молекула RNAi по п.1 или 2, в которой смысловая цепь лигирована с антисмысловой цепью через линкерную область.

4. Молекула RNAi по п.3, которая состоит из нуклеотидной последовательности, представленной SEQ ID NO: 8.

5. Вектор, содержащий матричную ДНК молекулы RNAi по п.3 или 4 и экспрессирующий молекулу RNAi.

6. Противоопухолевый агент, содержащий молекулу RNAi по любому из п.п.1-4 и/или вектор по п.5.

7. Фармацевтическая композиция для лечения или профилактики рака, содержащая молекулу RNAi по любому из пп.1-4 и/или вектор по п.5 в сочетании с 5-FU-противоопухолевым агентом.

8. Фармацевтическая композиция по п.7, в которой 5-FU-противоопухолевый агент представляет собой комбинированное лекарственное средство, содержащее тегафур.

9. Фармацевтическая композиция по п.8, в которой 5-FU-противоопухолевый агент представляет собой комбинированное лекарственное средство, содержащее тегафур, гимерацил и отерацил калия.

10. Фармацевтическая композиция по п.9, которая содержит тегафур, гимерацил и отерацил калия в молярном соотношении 1:0,4:1.

11. Фармацевтическая композиция по любому из пп.7-10, в которой молекула RNAi по любому из пп.1-4 и/или вектор по п.5 и 5-FU-противоопухолевый агент каждый представляет собой препарат с одним активным ингредиентом.

12. Фармацевтическая композиция по любому из пп.7-10, в которой молекула RNAi по любому из пп.1-4 и/или вектор по п.5 и 5-FU-противоопухолевый агент находятся в виде препаративной формы в наборе.

13. Агент для потенцирования противоопухолевого действия 5-FU-противоопухолевого агента, содержащий молекулу RNAi по любому из пп.1-4 и/или вектор по п.5.

14. Агент для потенцирования противоопухолевого действия по п.13, в котором 5-FU-противоопухолевый агент представляет собой комбинированное лекарственное средство, содержащее тегафур.

15. Агент для потенцирования противоопухолевого действия по п.14, в котором 5-FU-противоопухолевый агент представляет собой комбинированное лекарственное средство, содержащее тегафур, гимерацил и отерацил калия.