Цитологическая и гистологическая фиксирующая композиция и способ окрашивания



Цитологическая и гистологическая фиксирующая композиция и способ окрашивания
Цитологическая и гистологическая фиксирующая композиция и способ окрашивания
Цитологическая и гистологическая фиксирующая композиция и способ окрашивания
Цитологическая и гистологическая фиксирующая композиция и способ окрашивания
Цитологическая и гистологическая фиксирующая композиция и способ окрашивания
Цитологическая и гистологическая фиксирующая композиция и способ окрашивания
Цитологическая и гистологическая фиксирующая композиция и способ окрашивания
Цитологическая и гистологическая фиксирующая композиция и способ окрашивания
Цитологическая и гистологическая фиксирующая композиция и способ окрашивания
Цитологическая и гистологическая фиксирующая композиция и способ окрашивания
Цитологическая и гистологическая фиксирующая композиция и способ окрашивания
Цитологическая и гистологическая фиксирующая композиция и способ окрашивания
Цитологическая и гистологическая фиксирующая композиция и способ окрашивания
Цитологическая и гистологическая фиксирующая композиция и способ окрашивания
Цитологическая и гистологическая фиксирующая композиция и способ окрашивания
Цитологическая и гистологическая фиксирующая композиция и способ окрашивания

 

G01N1/30 - Исследование или анализ материалов путем определения их химических или физических свойств (разделение материалов вообще B01D,B01J,B03,B07; аппараты, полностью охватываемые каким-либо подклассом, см. в соответствующем подклассе, например B01L; измерение или испытание с помощью ферментов или микроорганизмов C12M,C12Q; исследование грунта основания на стройплощадке E02D 1/00;мониторинговые или диагностические устройства для оборудования для обработки выхлопных газов F01N 11/00; определение изменений влажности при компенсационных измерениях других переменных величин или для коррекции показаний приборов при изменении влажности, см. G01D или соответствующий подкласс, относящийся к измеряемой величине; испытание

Владельцы патента RU 2536502:

Р.А.Л. ДИАГНОСТИК (FR)

Группа изобретений относится к композиции для фиксации тканей и/или клеток, и/или клеточных структур на предметных стеклах в целях их окрашивания и их анализа под микроскопом или с помощью системы анализа изображений, к применению данной композиции и вариантам способа ее получения, а также к вариантам способа окрашивания структур с ее использованием. Композиция содержит по меньшей мере следующие соединения (процентные содержания указаны в расчете на полную массу композиции): от 40 до 60% этанола и/или изопропанола, диметилсульфоксид, от 0,1 до 1% этиленгликоля, от 2 до 12% воды и от 0,1 до 0,5% хлорида натрия. Способ получения композиции включает по меньшей мере смешение этанола и/или изопропанола с этиленгликолем, чтобы получить раствор 1, растворение хлорида натрия в воде, чтобы получить раствор 2, добавление раствора 2 в раствор 1 при перемешивании с получением раствора 3, затем добавление диметилсульфоксида и фильтрацию. Также способ может включать стадию приготовления раствора 4, содержащего по меньшей мере диметилсульфоксид, синий краситель и красный краситель, который затем смешивают с раствором 3. Способ окрашивания клеток или клеточных структур, в частности для крови и костного мозга, включает по меньшей мере контактирование окрашиваемого препарата с указанной фиксирующей композицией, причем время контактирования может составлять 5-8 минут. Затем осуществляют контактирование зафиксированного препарата с буферным раствором, рН которого составляет от 6,5 до 7,0. Также возможно использование при окрашивании буферного раствора с рН от 6,8 до 7, 2, причем время контактирования зафиксированного препарата с таким раствором составляет 2-3 минуты. И после осуществляют контактирование препарата с промывным раствором, время контактирования с промывным раствором может составлять 5-20 секунд. Достигаемый при этом технический результат заключается в эффективном удерживания клеток в целях их окрашивания для обеспечения возможности поучения воспроизводимых и стабильных результатов. 9 н. и 4 з.п. ф-лы, 2 пр., 16 ил.

 

Настоящее изобретение относится к композиции для фиксации тканей, клеток или компонентов клеток на предметных стеклах в целях их окрашивания и анализа.

Изобретение относится также к способу получения этого фиксатора и к его применению в гистологии или цитологии. Особым применением настоящего изобретения является способ окрашивания тканей, клеток или компонентов клеток, в частности для крови и костного мозга, с использованием этого фиксатора.

Для идентификации тканей, клеток или частей клеток используют методы окрашивания клеток, комбинируемые с исследованием под микроскопом или с помощью систем анализа изображений.

Эти методы окрашивания необходимы во многих областях биологии, а также в фундаментальных исследованиях, например в медицинском или ветеринарном анализе для гистологической диагностики или цитодиагностики.

В частности, в гематологии уже очень много лет используют окрашивание, известное под названием МГГ (от Май-Грюнвальд/Гимза). Этот способ окрашивания состоит в:

- фиксации клеток, которые требуется окрасить, на предметном стекле раствором Май-Грюнвальда, состоящим из эозин-метиленового синего, растворенного в метаноле,

- контактировании предметного стекла с буферным раствором,

- затем в контактировании с раствором Гимза, состоящим из синего и азур II-эозина, растворенного в метаноле, с глицерином,

- и, наконец, в промывке предметного стекла и сушке.

В этом случае получают окрашивания, известные всем практикующим врачам, что делает этот метод стандартным и позволяет устанавливать надежное сравнение.

Однако окрашивание по МГГ имеет много недостатков. В частности, в нем используются токсичные и летучие растворители. Кроме того, присутствие глицерина также создает неудобства, так как он затрудняет промывку предметных стекол и может вызвать забивку фильтров при фильтрации.

Кроме того, чтобы получить хорошее окрашивание, важно, чтобы краситель был стабильным и не оставлял отложений красителей после промывки предметного стекла. Однако при использовании МГГ такие отложения могут появляться. Эти отложения мешают работе автоматических устройств окрашивания и систем распознавания клеток и затрудняют распознавание разных клеточных элементов и различение здоровых клеток и больных клеток в случае цитодиагностики.

Чтобы устранить эти недостатки, были попытки заменить МГГ другими способами окрашивания.

Однако большинство способов, разработанных для замены МГГ, не позволяют ни сохранить воспроизводимость, важнейшую для анализа, ни получить сравнимые результаты.

Кроме того, как и способ МГГ, они используют метанол как для получения самих красителей, так и раствора для фиксации клеток. Действительно, метанол имеет особые физические свойства, которые позволяют ему хорошо фиксировать клетки.

Однако метанол является токсичным и летучим продуктом, использование которого желательно ограничить, так как он может оказаться опасным для врача-практика.

Предлагались решения заменить метанол этанолом, но один этанол не дает удовлетворительных результатов, в частности, когда он применяется для фиксации.

Другие решения состоят в использовании в качестве фиксатора клеточных структур пикриновой кислоты, формальдегида, глутаральдегида или же осмиевой кислоты.

Однако хотя полученные результаты могут быть качественными, присутствие токсичных продуктов влечет опасность для людей, вынужденных обращаться с ними.

Кроме того, с созданием систем анализа изображений необходимо использовать окрашивающие автоматы, чтобы всегда обеспечивать идентичное протекание стадий окрашивания. Однако при современных реагентах и продуктах фиксации эти автоматы требуют сложного обслуживания, так как эти реагенты и продукты вызывают быстрое засорение схем и емкостей.

Наконец, известно, что исторически сложилось так, что в разных странах окрашивающие реактивы могут быть разными, даже в одной и той же области биологии. Это отражается в разных цветах и более или менее резкой визуализации того или иного типа клеточного элемента. В гематологии классически различают окрашивания, использующие комбинацию окрашивающих реагентов (как краситель МГГ, применяющийся в странах "европейской культуры"), и окрашивания, в которых применяется единственный окрашивающий реактив (как красители Райта и Лейшмана, использующиеся в странах "англосаксонской или азиатской культуры"). Однако применяющиеся в настоящее время фиксирующие растворы являются специфическими для данного способа окрашивания, и нельзя использовать один и тот же фиксатор для двух разных способов.

Таким образом, существует потребность в продуктах, предназначенных для окрашивания тканей, клеток или компонентов клеток, нетоксичных, стабильных, недорогих, легких в обращении, позволяющих получать воспроизводимые результаты и подходящие для окрашивающих автоматов. В частности, существует потребность в продукте для фиксации тканей, клеток или клеточных элементов на предметных стеклах в целях их исследования под микроскопом, который отвечает этим требованиям и который подходит для разных способов окрашивания.

На эти потребности отвечает настоящее изобретение, предлагая использовать гистологическую или цитологическую фиксирующую композицию, ослабляющую недостатки предшествующего уровня, особенно хорошо подходящую в области гематологии.

С этой целью изобретение направлено на применение композиции, содержащей по меньшей мере:

- спирт,

- диметилсульфоксид,

- этиленгликоль,

- воду и

- хлорид натрия,

для фиксации тканей, клеток или компонентов клеток на предметном стекле в целях их окрашивания и их микроскопического исследования или исследования системой анализа изображений.

Изобретение относится также к используемой гистологической или цитологической фиксирующей композиции или фиксатору.

Предпочтительно такая фиксирующая композиция не содержит токсичных продуктов. Она позволяет эффективно удерживать клетки в целях их окрашивания, чтобы получить воспроизводимые и стабильные результаты, которые можно легко исследовать под микроскопом или системами анализа изображений.

Изобретение относится также к способу получения этой композиции.

Предпочтительно фиксирующая композиция содержит также по меньшей мере один синий краситель и по меньшей мере один красный краситель и может использоваться одновременно для фиксации и окрашивания клеток.

Наконец, изобретение относится также к способу окрашивания клеток или клеточных элементов, подходящему, в частности, для крови и костного мозга, с использованием этой фиксирующей композиции.

Предпочтительно способ согласно изобретению позволяет получить воспроизводимые результаты очень хорошего качества. Кроме того, он является экономичным, быстрым, надежным, легким в применении и требует лишь низкого содержания красителей.

Далее изобретение будет описано подробно в сочетании с приложенными фигурами, на которых:

- фиг.1a показывает мазок крови перед окрашиванием по способу МГГ,

- фиг.1b показывает мазок крови после окрашивания по способу МГГ с плохой фиксацией,

- фиг.1c показывает мазок крови после окрашивания по Райту,

- фиг.1d показывает мазок крови после окрашивания по Лейшману,

- фиг.2a показывает мазок крови после фиксации и окрашивания композицией согласно изобретению, в результате применения способа окрашивания по МГГ,

- фиг.2b показывает мазок крови после фиксации и окрашивания композицией согласно изобретению, в результате применения способа окрашивания по Райту/Лейшману,

- фиг.3a показывает мазок крови после быстрого окрашивания согласно способу, содержащему этап предварительной фиксации в течение 1 минуты смесью 70°-ный этанол + 2% этиленгликоля,

- фиг.3b показывает мазок крови после быстрого окрашивания согласно способу, содержащему этап предварительной фиксации в течение 1 минуты смесью 99,9°-ный этанол + 2% этиленгликоля,

- фиг.3c показывает мазок крови после быстрого окрашивания согласно способу, содержащему этап предварительной фиксации в течение 5 минут смесью 99,9°-ный этанол + 2% этиленгликоля,

- фиг.4 показывает мазок крови после быстрого окрашивания согласно способу, содержащему этап предварительной фиксации в течение 5 минут смесью 99,9°-ный этанол + 2% этиленгликоля + диметилсульфоксид,

- фиг.5a показывает мазок крови после быстрого окрашивания согласно способу, содержащему этап предварительной фиксации в течение 5 минут смесью 99,9°-ный этанол + 2% этиленгликоля + диметилсульфоксид + 5 мл воды,

- фиг.5b показывает мазок крови после быстрого окрашивания согласно способу, содержащему этап предварительной фиксации в течение 5 минут смесью 99,9°-ный этанол + 2% этиленгликоля + диметилсульфоксид + 10 мл воды,

- фиг.5c показывает мазок крови после быстрого окрашивания согласно способу, содержащему этап предварительной фиксации в течение 5 минут смесью 99,9°-ный этанол + 2% этиленгликоля + диметилсульфоксид + 20 мл воды,

- фиг.6a показывает мазок крови после быстрого окрашивания согласно способу, содержащему этап предварительной фиксации в течение 5 минут смесью 99,9°-ный этанол + 2% этиленгликоля + диметилсульфоксид + 5 мл воды + 0,1 г хлорида натрия,

- фиг.6b показывает мазок крови после быстрого окрашивания согласно способу, содержащему этап предварительной фиксации в течение 5 минут смесью 99,9°-ный этанол + 2% этиленгликоля + диметилсульфоксид + 5 мл воды + 0,3 г хлорида натрия, и

- фиг.6c показывает мазок крови после быстрого окрашивания согласно способу, содержащему этап предварительной фиксации в течение 5 минут смесью 99,9°-ный этанол + 2% этиленгликоля + диметилсульфоксид + 5 мл воды + 0,2 г хлорида натрия.

Изобретение относится к применению для осуществления фиксации тканей, и/или клеток, и/или клеточных структур на предметном стекле в целях их окрашивания и их микроскопического исследования или исследования с помощью системы анализа изображений, композиции, содержащей по меньшей мере один спирт, диметилсульфоксид, этиленгликоль, воду и хлорид натрия.

Предпочтительно, композицию используют для фиксации клеток и/или клеточных структур крови или костного мозга.

Композиция может также предпочтительно содержать один или несколько красителей и применяться для осуществления одновременной фиксации и окрашивания тканей, и/или клеток, и/или клеточных структур.

Изобретение относится также к особой гистологической или цитологической фиксирующей композиции, называемой также фиксатором.

Под фиксирующей композицией, или фиксатором, в контексте настоящего изобретения понимается реагент, позволяющий остановить процессы аутолиза клеток и тканей, чтобы сохранить их в виде, как можно более близком тому, какой они имели в живом состоянии. Таким образом, такой реагент позволяет не нарушать морфологию и иммобилизовать клетки и ткани в целях получения микроскопических препаратов, которые можно бы было хранить. Он должен также позволять проводить дополнительные обработки, такие как окрашивание, гистохимические или иммунологические реакции, чтобы выявить некоторые структурные, функциональные или генетические аспекты клеток и тканей.

Композиция содержит по меньшей мере один спирт, диметилсульфоксид, этиленгликоль, воду и хлорид натрия.

Спирт может быть выбран из любых нетоксичных спиртов. Предпочтительно спирт является этанолом или изопропанолом.

Можно также использовать смесь спиртов.

Согласно одному особенно подходящему варианту осуществления, спирт является этанолом. Вода может быть деминерализованной водой или деионизованной водой.

Чтобы достичь лучшей эффективности композиции, вода и хлорид натрия должны присутствовать в особых пропорциях. Так, согласно одному особенно подходящему варианту осуществления, хлорид натрия содержится в количестве от 0,1 до 0,5% от полной массы композиции, а вода в количестве от 2 до 12%, предпочтительно от 2,6 до 8,0% от полной массы композиции. Еще более предпочтительно содержание хлорида натрия составляет от 0,2 до 0,3%, а воды от 3 до 6%. Также спирт составляет от 40 до 60% от полной массы композиции и этиленгликоль от 0,1 до 1% от полной массы композиции. Еще более предпочтительно, содержание спирта составляет от 50 до 60%, а этиленгликоля от 0,1 до 0,5%.

Кроме того, особенно интересные результаты получаются, когда содержание ДМСО составляет от 30 до 40% от полной массы композиции.

Сравнивая разные фиг.3a-6c, можно утверждать, что важно присутствие каждого из компонентов: спирта, этиленгликоля, диметилсульфоксида, хлорида натрия и воды. Именно смесь этих особых составляющих дает возможность композиции фиксировать клетки, которые позднее можно легко окрасить и исследовать.

На фиг.3a-6c клетки фиксированы композициями, содержащими все или часть компонентов композиции согласно изобретению, затем они окрашены методом быстрого окрашивания, какой используется в наборе RAL 555 (RAL®): предметное стекло с зафиксированным веществом погружают в первый красный краситель на 5 секунд, затем в синий краситель на 5 секунд и, наконец, предметное стекло промывают и сушат. Полученные результаты лучше, когда в фиксирующей композиции присутствуют спирт, этиленгликоль, диметилсульфоксид, хлорид натрия и вода.

Композиция согласно изобретению может быть получена способом, включающим проведение по меньшей мере следующих стадий:

- смешение спирта и этиленгликоля, чтобы получить раствор 1,

- растворение хлорида натрия в воде, чтобы получить раствор 2,

- добавление раствора 2 в раствор 1 при перемешивании, затем добавление диметилсульфоксида и

- фильтрация.

В одном варианте фиксирующая композиция согласно изобретению содержит также по меньшей мере один синий краситель и по меньшей мере один красный краситель.

Синий краситель может быть выбран из метиленового синего, и/или азура I, и/или синего красителя, относящегося к группе тиазинов.

Красный краситель может быть выбран из эозина и/или эритрозина.

Предпочтительно, синий и красный красители растворяют в диметилсульфоксиде.

Согласно одному особенно подходящему варианту осуществления, композиция по изобретению содержит:

- диметилсульфоксид,

- спирт, например этанол или изопропанол, или смесь спиртов,

- этиленгликоль,

- воду,

- хлорид натрия,

- эозин-метиленовый синий,

- эозин-азур I,

- метиленовый синий,

- азур I метиленового синего и

- соединение группы тиазинов.

В частности, композиция согласно изобретению может содержать:

- около 32% (по объему) ДМСО,

- около 63% (по объему) спирта,

- около 0,1% (по объему) этиленгликоля,

- около 4,9% (по объему) воды,

- около 20% (в расчете на вес сухих веществ) эозин-метиленового синего,

- около 20% (в расчете на вес сухих веществ) азур I-эозина,

- около 8% (в расчете на вес сухих веществ) метиленового синего,

- около 8% (в расчете на вес сухих веществ) азур I метиленового синего,

- около 4% (в расчете на вес сухих веществ) соединения группы тиазинов и

- около 40% (в расчете на вес сухих веществ) хлорида натрия.

Предпочтительно такая композиция позволяет одновременно провести окрашивание и фиксацию тканей, клеток или компонентов клеток.

Она может быть получена способом, включающим проведение по меньшей мере следующих стадий:

- приготовление раствора 4, содержащего по меньшей мере диметилсульфоксид, синий краситель и красный краситель,

- смешение спирта и этиленгликоля, чтобы получить раствор 1,

- растворение хлорида натрия в воде, чтобы получить раствор 2,

- добавление раствора 2 в раствор 1 при перемешивании, чтобы получить раствор 3,

- добавление раствора 3 при перемешивании в раствор 4 и

- фильтрация.

Красители раствора 4 растворяют в ДМСО.

Спирт предпочтительно является этанолом.

Предпочтительно фиксатор согласно изобретению не содержит токсичных продуктов, позволяя одновременно хорошую фиксацию тканей, клеток и клеточных структур. Он особенно хорошо подходит для фиксации мазков крови и костномозгового вещества.

Согласно другому преимуществу, фиксирующая композиция может использоваться разными способами и применяться с разными способами окрашивания, как с теми, в которых используется комбинация окрашивающих реагентов, так и с теми, в которых используется единственный окрашивающий реактив.

Тем не менее, изобретение направлено на особые способы окрашивания, в которых применяется этот фиксатор. Речь идет о способах окрашивания клеток или клеточных структур, в частности для крови и костного мозга.

Эти способы включают по меньшей мере одну стадию, состоящую в контакте окрашиваемого препарата с фиксирующей композицией, являющейся объектом изобретения.

В первом варианте способ окрашивания включает по меньшей мере следующие стадии:

- контактирование окрашиваемого препарата, например, предметного стекла, на которое нанесены мазки крови или костномозгового вещества для анализа, с фиксирующей композицией согласно изобретению, предпочтительно в течение 5-10 минут;

- контактирование зафиксированного препарата с буферным раствором, pH которого составляет от 6,5 до 7, предпочтительно в течение 3-8 минут, чтобы запустить и управлять процессом окрашивания, подготовленным фиксатором по изобретению; на этой стадии может быть выгодным не удалять весь фиксатор при проведении в буферный раствор,

- контактирование, возможно при легком перемешивании, препарата с промывным раствором, предпочтительно в течение 5-20 секунд, функциями которого является остановить окрашивание, удаляя лишние красители, и улучшить окрашивание клеточных структур.

Этот способ соответствует окрашиванию типа "окрашивание по Райту/Лейшману".

Согласно второму варианту, способ окрашивания включает по меньшей мере следующие стадии:

- контактирование окрашиваемого препарата с фиксирующей композицией согласно изобретению, предпочтительно в течение 5-8 минут,

- контактирование связанного препарата с буферным раствором, pH которого составляет от 6,8 до 7,2, предпочтительно от 2 до 3 минут, чтобы запустить и управлять процессом окрашивания, подготовленным фиксатором по изобретению,

- контактирование, возможно при легком перемешивании, препарата с дополнительным окрашивающим реактивом, предпочтительно в течение 1-3 минут, который действует в буферной среде и позволяет улучшить окрашивание для определенных условий применения,

- контактирование препарата с промывным раствором, предпочтительно 5-20 секунд.

Этот способ соответствует окрашиванию по типу "Май-Грюнвальд/Гимза".

Буфер, используемый для осуществления способов по изобретению, может состоять из воды, динатрийфосфата, монокальцийфосфата, противомикробного средства и неионного ПАВа.

Дополнительный окрашивающий реактив может состоять из метиленового синего, азур I-метиленового синего и соединения группы тиазинов, растворенного в ДМСО, и динатрийфосфата и монокальцийфосфата, растворенного в воде.

Что касается промывочной жидкости, она может состоять из динатрийфосфата, монокальцийфосфата, противомикробного средства и изопропанола, растворенных в воде.

После сушки на воздухе предметное стекло готово для прямого наблюдения в микроскоп или для исследования системой анализа изображений.

Предпочтительно с используемыми продуктами, в частности с фиксатором согласно изобретению, можно гарантировать стандартизацию окрашивания и получить воспроизводимость цветов. Это связано с составами продуктов, в частности фиксатора, а также с тем, что это продукты, готовые к применению. Действительно, использование таких продуктов позволяет исключить человеческий фактор при приготовлении растворов, в частности, отменяя стадии разбавления и использования дополнительных продуктов переменного качества, которые ухудшают качество и воспроизводимость окрашивания.

Эта воспроизводимость представляет стабильную базу, на которую могут опираться системы анализа изображений. Эти системы, на которые возложены идентификация и классификация различных клеточных типов, при обнаружении случайных аномалий возможных признаков наличия патологии могут применяться, только если полученные результаты являются воспроизводимыми.

Кроме того, фиксатор и реагенты, используемые согласно изобретению, могут применяться в окрашивающих автоматах, так как их применение ограничивает осаждение, таким образом значительно снижая эксплуатационные расходы на эти автоматы.

Другим преимуществом является то, что изобретение позволяет получить отличный визуальный контраст, позволяющий точную идентификацию разных клеточных типов, причем без отложений красителя, являющихся источниками различных артефактов. Из фиг.2a и 2b установлено, в частности, что полученная контрастность лучше, чем получаемая с продуктами уровня техники (фиг.1a, 1b, 1c и 1d).

Далее изобретение иллюстрируется неограничивающим примером, применимым в гематологии.

Материал

Фиксирующая композиция (продукт 1)

Фиксирующую композицию готовят, как описано ниже.

Для получения 1 л продукта:

- готовят раствор A, растворяя в 280-380 мл ДМСО следующие красители: метиленовый синий - эозин, азур I - эозин, метиленовый синий, азур I метиленового синего, соединение группы тиазинов,

- готовят раствор B, смешивая от 550 до 680 мл этанола с примерно 1 мл этиленгликоля,

- готовят раствор C, растворяя от 1 до 4 г хлорида натрия в 40-60 мл воды,

- готовят раствор D, добавляя раствор C при перемешивании к раствору B,

- добавляют при перемешивании раствор A к раствору D и

- смесь фильтруют.

Буфер (продукт 2)

Буфер готовят, применяя описываемый ниже протокол.

Для получения 1 л продукта в примерно 1 л воды растворяют от 0,189 до 0,530 г динатрийфосфата, от 0,399 до 0,726 г монокальцийфосфата, около 1 г противомикробного агента и около 1 г неионного ПАВа. Затем все это фильтруют.

Дополнительный окрашивающий реактив (продукт 3)

Дополнительный окрашивающий реактив готовят следующим образом.

Для получения 1 л продукта:

- готовят первый раствор, растворяя в 10-15 мл ДМСО следующие красители: метиленовый синий, азур I метиленового синего и соединение группы тиазинов,

- готовят второй раствор, растворяя в 985-990 мл воды от 5 до 8 г динатрийфосфата и от 1,5 до 3 г монокальцийфосфата,

- при перемешивании добавляют первый раствор ко второму раствору, и

- смесь фильтруют.

Промывочная жидкость (продукт 4)

Для получения 1 л промывочной жидкости растворяют в примерно 940 мл воды от 0,3 до 0,5 г динатрийфосфата, от 0,3 до 0,5 г монокальцийфосфата, около 0,1 г противомикробного средства и от 45 до 50 г спирта (предпочтительно изопропанола). Затем все это фильтруют.

Пример способа окрашивания: результаты типа "окрашивание по Май-Грюнвальду/Гимзе"

Для получения результатов, признаваемых специалистами как окрашивание по "Май-Грюнвальду/Гимзе", можно осуществить последовательность следующих этапов:

- контактирование в течение 5-8 минут предметного стекла, на которое нанесен мазок крови или костномозгового вещества для анализа, с продуктом 1,

- контактирование в течение 2-3 минут предметного стекла с продуктом 2,

- контактирование в течение 1-3 минут предметного стекла с продуктом 3 и

- контактирование в течение 5-20 секунд, возможно при легком перемешивании, предметного стекла с продуктом 4.

После сушки на воздухе предметное стекло готово для прямого наблюдения в микроскоп или для исследования системой анализа изображений.

Полученные результаты представлены на фиг.2a.

Пример способа окрашивания: результаты типа "окрашивание по Райту/Лейшману"

Чтобы получить результаты, признаваемые специалистами в данной области как "окрашивание по Райту/Лейшману", можно осуществить последовательность следующих стадий:

- контактирование в течение 5-10 минут предметного стекла, на которое нанесен мазок крови или костномозгового вещества для анализа, с продуктом 1,

- контактирование в течение 3-8 минут предметного стекла с продуктом 2, и

- контактирование в течение 5-20 секунд, возможно при легком помешивании, предметного стекла с продуктом 4.

После сушки на воздухе предметное стекло готово для прямого наблюдения в микроскоп или для исследования системой анализа изображений.

Полученные результаты представлены на фиг.2b.

Само собой разумеется, изобретение не ограничено представленным и описанным выше вариантом осуществления, но, напротив, оно охватывает все варианты.

1. Композиция для фиксации тканей, и/или клеток, и/или клеточных структур в целях их окрашивания и их анализа под микроскопом или с помощью системы анализа изображений, отличающаяся тем, что она содержит по меньшей мере следующие соединения (процентные содержания указаны в расчете на полную массу композиции):
- от 40 до 60% этанола и/или изопропанола,
- диметилсульфоксида,
- от 0,1 до 1% этиленгликоля,
- от 2 до 12% воды и
- от 0,1 до 0,5% хлорида натрия.

2. Композиция по п.1, отличающаяся тем, что диметилсульфоксид составляет от 30 до 40% от полной массы композиции.

3. Композиция по одному из предыдущих пунктов, отличающаяся тем, что она дополнительно содержит по меньшей мере один синий краситель и по меньшей мере один красный краситель.

4. Композиция по п.3, отличающаяся тем, что синий краситель выбран из метиленового синего, и/или азура I, и/или синего красителя, относящегося к группе тиазинов, и тем, что красный краситель выбран из эозина и/или эритрозина.

5. Применение композиции по одному из пп.3 или 4 для одновременного осуществления фиксации и окрашивания тканей, и/или клеток, и/или клеточных структур.

6. Способ получения композиции по одному из пп.1-4, отличающийся тем, что он включает проведение по меньшей мере следующих стадий:
- смешение этанола и/или изопропанола с этиленгликолем, чтобы получить раствор 1,
- растворение хлорида натрия в воде, чтобы получить раствор 2,
- добавление раствора 2 в раствор 1 при перемешивании, затем добавление диметилсульфоксида, и
- фильтрация.

7. Способ получения композиции по одному из пп.1-4, отличающийся тем, что он включает проведение по меньшей мере следующих стадий:
- приготовление раствора 4, содержащего по меньшей мере диметилсульфоксид, синий краситель и красный краситель,
- смешение этанола и/или изопропанола с этиленгликолем, чтобы получить раствор 1,
- растворение хлорида натрия в воде, чтобы получить раствор 2,
- добавление раствора 2 в раствор 1 при перемешивании, чтобы получить раствор 3,
- добавление раствора 3 при перемешивании в раствор 4, и
- фильтрация.

8. Способ получения по п.7, отличающийся тем, что раствор 4 получен растворением в диметилсульфоксиде следующих красителей:
- эозин-метиленовый синий,
- азур I-эозин,
- метиленовый синий,
- азур I метиленового синего,
- соединение группы тиазинов.

9. Способ окрашивания клеток или клеточных структур, в частности для крови и костного мозга, отличающийся тем, что он включает по меньшей мере одну стадию, состоящую в контактировании окрашиваемого препарата с фиксирующей композицией по одному из пп.3 или 4.

10. Способ окрашивания клеток или клеточных структур, в частности для крови и костного мозга, отличающийся тем, что он включает по меньшей мере следующие стадии:
- контактирование окрашиваемого препарата с фиксирующей композицией по одному из пп.3 или 4,
- контактирование зафиксированного препарата с буферным раствором, рН которого составляет от 6,5 до 7,0,
- контактирование препарата с промывным раствором.

11. Способ окрашивания клеток или клеточных структур, в частности для крови и костного мозга, отличающийся тем, что он включает по меньшей мере следующие стадии:
- контактирование в течение 5-10 минут окрашиваемого препарата с фиксирующей композицией по одному из пп.3 или 4,
- контактирование в течение 3-8 минут зафиксированного препарата с буферным раствором, рН которого составляет от 6,5 до 7,0,
- контактирование в течение 5-20 секунд препарата с промывным раствором.

12. Способ окрашивания тканей, и/или клеток и/или клеточных элементов, в частности для крови и костного мозга, отличающийся тем, что он включает по меньшей мере следующие стадии:
- контактирование окрашиваемого препарата с фиксирующей композицией по одному из пп.3 или 4,
- контактирование связанного препарата с буферным раствором, рН которого составляет от 6,8 до 7,2,
- контактирование препарата с дополнительным окрашивающим реактивом,
- контактирование препарата с промывным раствором.

13. Способ окрашивания тканей, и/или клеток, и/или клеточных элементов, в частности для крови и костного мозга, отличающийся тем, что он включает по меньшей мере следующие стадии:
- контактирование в течение 5-8 минут окрашиваемого препарата с фиксирующей композицией по одному из пп.3 или 4,
- контактирование в течение 2-3 минут зафиксированного препарата с буферным раствором, рН которого составляет от 6,8 до 7,2,
- контактирование в течение 1-3 минут препарата с дополнительным окрашивающим реактивом,
- контактирование в течение 5-20 секунд препарата с промывным раствором.



 

Похожие патенты:

Изобретение относится к области материаловедения и может быть использовано при исследовании структурного состояния, морфологии поверхности образцов из композиций, содержащих графит, например в графитопластах (с термопластом или реактопластом в качестве связующего).
Способ определения величины свободнорадикальной активности твердых материалов относится к области экологического тестирования, контроля качества строительных и др.

Изобретение относится к способу исследования загрязнений поверхности линейных сооружений и предназначено, в частности, для исследования загрязненной территории на поверхности железнодорожного пути.

Изобретение относится к устройству для замера толщины слоя нефти над водой и может быть использовано для оценки количества нефти в скважинной продукции с большой долей воды, а также для определения объема нефти на поверхности природного водоема при аварийных изливах нефти из трубопровода или резервуара.

Изобретение относится к медицине и может быть использовано при определении чувствительности химиопрепарата к злокачественной опухоли. В качестве препарата используют материал, взятый из опухоли.

Изобретение относится к горнодобывающей, обогатительно-металлургической и химической областям промышленности и может быть использовано в автоматических системах аналитического контроля при измерении жидких проб в виде суспензий, фильтратов и растворов.

Изобретение относится к устройству для отбора образцов различных почв и может быть использовано для проведения лабораторных исследований их физико-механических свойств.

Изобретение относится к области экологии и предназначено для мониторинга загрязнения природной среды от техногенного точечного источника аэрозольно-пылевых загрязнений.

Изобретение относится к области экологического мониторинга, почвоведения и лесоведения. Способ включает определение места, частоты, длительности отбора проб почвы на исследуемой территории.

Изобретение относится к пробоотборнику для сыпучих материалов, например, порошков химически активных металлов с размерами частиц до 15 мм. Пробоотборник содержит цилиндрическую трубу с засыпными окнами, снабженными отбойными козырьками.

Изобретение относится преимущественно к инструментам, используемым космонавтом в открытом космосе. Устройство содержит корпус из химически, термически, механически устойчивого и γ-проницаемого материала. В корпусе выполнены одна или более глухих полостей с резьбой и конической поверхностью на входе. В полость ввернут пробоотборник с ответной конической поверхностью, обеспечивающей герметизацию полости при контакте обеих конических поверхностей. К корпусу прикреплена металлическая пластина, вырез в которой образует ручку для захвата корпуса наддутой перчаткой скафандра космонавта. На Земле устройство в собранном и загерметизированном виде стерилизуется γ-облучением. На орбите космонавт, удерживая корпус за ручку, извлекает пробоотборник из полости. После взятия проб и герметизации пробоотборника устройство возвращается на Землю для исследований. Техническим результатом изобретения является обеспечение отбора проб с внешней поверхности космических объектов космонавтом в скафандре и их изоляция от внешней среды, в т.ч. среды гермоотсеков данных объектов. 2 ил.

Изобретение относится к области получения и подготовки образцов проб балластной воды, а именно к способу и устройству для отбора воды и балластных емкостей теплоходов и судов типа «река-море» с целью проведения бактериологических исследований. Способ включает взятие воды из емкостей с последующим их исследованием на присутствие патогенных бактерий и микроорганизмов. При этом из выборочных емкостей формируют объединенную пробу, для чего проводят прокачку балластной воды каждой отобранной емкости отдельно в течение 5-10 минут в объеме не менее 200 литров через механические фильтры. Холерные вибрионы оседают на картриджи с порами от 2 мкм, а более крупные микроорганизмы - на картриджи с порами от 10 до 50 мкм. По завершению отбора картриджи вытаскивают и помещают в стерильные емкости, которые доставляют для исследования в лабораторию. Процедуры отбора проб проводят за 2-2,5 часа и по объединенной пробе судят о зараженности судна. Устройство включает откачивающий насос с закрепленным на нем всасывающим патрубком и выполнено в виде переносной конструкции, имеющей основания и крышку с ручкой. На основании устройства последовательно закреплены откачивающий насос и два фильтра, снабженные сменными картриджами механической отчистки. Насос и фильтры связаны между собой трубопроводом, а между насосом и первым фильтром встроен водомер для фиксации прокачиваемой балластной воды. Достигаемый технический результат заключается в повышении эффективности проведения бактериологических исследований балластных вод. 2 н.п. ф-лы, 1 ил.
Группа изобретений относится к отбору проб, в частности к способу и устройству получения образцов для исследования и взятия проб в жидком или текучем состоянии в условиях невесомости. Способ заключается в том, что размещают фильтр в отдельном держателе с отверстием, наносят пробу на открытую часть фильтра и после взятия пробы оставляют фильтр в держателе до полного высыхания пробы. Перед отбором пробы распечатывают и извлекают пинцетом аналитические аэрозольные двусторонние фильтры АФА-Х из пакетов типа ZipLock, затем фильтр укладывают на нижнюю пластину держателя своей рабочей ворсистой стороной в сторону отверстия в верхней пластине держателя. При этом используют винипластовые держатели и производят отбор пробы на открытую часть фильтра. После высыхания пробы фильтр извлекают из держателя, помещают в отдельный пакет ZipLock и сохраняют при температуре окружающей среды. Устройство содержит фильтры, размещаемые в держателе, а именно по меньшей мере два аналитических аэрозольных двусторонних фильтра АФА-Х с одной ворсистой стороной и по меньшей мере два держателя фильтра из листового винипласта, выполненные с возможностью их крепления к рабочему столу. Каждый держатель состоит из двух прямоугольных пластин - верхней и нижней, со скругленными краями и отверстием по центру, и снабжен текстильной застежкой из номекса, выполненной из двух частей - крючковой и петельной. Технический результат заключается в повышении надежности устройства при увеличении срока хранения взятой пробы. 2 н.п. ф-лы.

Изобретение относится к устройству травления поверхности для металлографического анализа образцов. Устройство включает ячейку для протравливания и средства, изолирующие протравливаемую зону от окружающих областей поверхности. При этом в ячейку включены средства для крепления к протравливаемому объекту, а указанные изолирующие средства выполнены в виде эластичной прокладки. Также к ячейке присоединен резервуар с протравливающим раствором, резервуар с промывочным раствором и выпускной шланг для сбора отработанных растворов. Конструкция устройства позволяет повысить чистоту подготовки поверхности для анализа и воспроизводимость результатов, а также обеспечивает возможность работы не только на горизонтальных, но и на наклонных и вертикальных поверхностях конструктивных элементов действующего оборудования в полевых условиях. 5 з.п. ф-лы, 2 ил.

Изобретение относится к области машиностроения, в частности, к технологии изготовления изделий из композиционных материалов, а именно, тел вращения с радиальными складками материала, и может найти применение при контроле качества изготовления крупногабаритных деталей из композиционных материалов. Способ изготовления образцов деталей из композиционных материалов включает разметку и вырезку образцов из припуска детали. При этом из припуска детали вырезают кольцо, продольное сечение которого соответствует поперечному сечению заготовки образца. Затем изготавливают соответствующий продольному сечению заготовки образца плоский шаблон, в центральной части которого выполнен участок меньшей ширины, с нанесенной посередине него поперечной риской. Размечают по шаблону расположение заготовок образцов по периметру торцовой поверхности кольца, последовательно совмещая риску шаблона со складками материала. После чего вырезают заготовки образцов и производят механическую обработку заготовок для получения образцов с утоненным рабочим участком в центральной части. Достигаемый при этом технический результат заключается в повышении эффективности контроля качества изготовления крупногабаритных деталей из композиционных материалов. 4 ил.

Группа изобретений относится к способу восстановления антигена в образце ткани, фиксированной формальдегидом, и к набору, использующемуся в данном способе. Способ включает инкубирование образца ткани, фиксированной формальдегидом, в первом растворе для восстановления антигена при температуре выше 90°C. Затем переносят образец ткани, фиксированной формальдегидом, во второй раствор для восстановления антигена, и осуществляют инкубирование образца ткани, фиксированной формальдегидом, во втором растворе для восстановления антигена при температуре выше 90°C. При этом первый раствор для восстановления антигена содержит буферный раствор, имеющий pH в диапазоне от приблизительно 5 до приблизительно 7, а второй раствор для восстановления антигена содержит буферный раствор, имеющий pH в диапазоне от приблизительно 7,5 до приблизительно 11. В качестве альтернативного варианта первый раствор для восстановления антигена может содержать буферный раствор, имеющий pH в диапазоне от приблизительно 7,5 до приблизительно 11, а второй раствор для восстановления антигена может содержать буферный раствор, имеющий pH в диапазоне от приблизительно 5 до приблизительно 7. Набор содержит первый раствор для восстановления антигена, который восстанавливает по меньшей мере часть невосстановленных антигенов в образце, и второй раствор для восстановления антигена, который восстанавливает по меньшей мере некоторые из другой части невосстановленных антигенов в образце. Причем первый раствор содержит лимонную кислоту, дигидрофосфат калия, борную кислоту, диэтилбарбитуровую кислоту, пиперазин-N,N′-бис(2-этансульфоновую кислоту), диметиларсиновую кислоту, 2-(N-морфолино)этансульфоновую кислоту или их комбинацию, а второй раствор содержит трис(гидроксиметил)метиламин (TRIS), 2-(N-морфолино)этансульфоновую кислоту (TAPS), N,N-бис(2-гидроксиэтил)глицин (Бицин), N-трис(гидроксиметил)метилглицин (Трицин), 4-2-гидроксиэтил-1-пиперазинэтансульфоновую кислоту (HEPES), 2-{[трис(гидроксиметил)метил]амино}этансульфоновую кислоту (TES) или их комбинацию. Указанные стадии использования первого и второго растворов для восстановления антигена улучшают восстановление антигена в ткани по сравнению с использованием первого раствора без второго раствора и наоборот. 2 н. и 15 з.п. ф-лы, 5 ил.

Изобретение относится к способу сбора и обработки данных геохимической разведки, представляющему собой градиентный способ геохимической разведки. Способ включает получение в каждой точке отбора набора проб поочередным отбором проб почвы и проб газа с интервалом 0,5-1 м вниз от поверхности земли. Затем осуществляют анализ отобранных проб почвы и газа на их геохимический индикатор или индикаторы и по результатам анализа для каждой точки отбора строят графики геохимического индикатора(-ов) и графики его градиента в зависимости от глубины. Осуществляют формирование профилей геохимического индикатора(-ов) и профилей его градиента для каждой глубины, причем профиль строят вдоль линии съемки. По полученным графикам строят изолинии геохимического индикатора(-ов) и изолинии его градиента для профиля, по которым формируют трехмерную визуализирующую диаграмму собранных данных области. После проводят определение по характеристикам изменений геохимического индикатора(-ов) в зависимости от глубины и аномалий его градиента на трехмерной визуализирующей диаграмме области, богатой металлическими рудами или месторождениями. Достигаемый технический результат заключается в получении большего количества информации, в особенности информации по продольным изменениям, чем в обычной геохимической разведке. 4 з.п. ф-лы, 5 ил.

Изобретение относится к механическим испытаниям на растяжение хрупких образцов из композиционных материалов и предназначено для авиастроения, судостроения, машиностроения, атомной энергетики. Сущность изобретения: накладки одинаковых с образцом размеров и формы, выполненные из материала, обеспечивающего суммарную жесткость обеих накладок, меньшую или равную жесткости исследуемого образца, наклеивают на двух противоположных поверхностях образца, в результате получают лабораторную сборку, которую размещают в цанговых захватах испытательной машины. Каждый захват устанавливают между краем торца и началом дуги галтели сборки. На поверхность сборки устанавливают экстензометр. Прикладывают нагрузку к сборке и по показаниям экстензометра получают кривую «деформация-напряжение» лабораторной сборки, из которой восстанавливают диаграмму деформирования образца. Напряжение в образце σo выражают через напряжения лабораторной сборки σлс и накладки σп, при условии равенства деформации, по формуле σо=3·σлс-2·σп. Технический результат: возможность выполнения принципа Сен-Венана и, соответственно, создание однородного напряженного состояния в рабочей части образца из хрупкого материала; создание одноосного растяжения в рабочей части образца из исследуемого материала, исключение изгиба; получение большего количества точек измерения усилия на одинаковой базе деформации. 1 з.п. ф-лы, 4 ил.
Изобретение относится к области ветеринарии, в частности к способу отбора биологического материала для диагностики лептоспироза у диких животных. Способ включает сбор мочи после естественного мочеиспускания животного в стерильную емкость. При этом пробы замороженной мочи отбирают вместе со снегом в зимний период при температуре наружного воздуха минус 10-50°C. Использование предлагаемого способа позволяет расширить круг исследуемых животных на носительство патогенных лептоспир, обеспечить наиболее длительное хранение отобранного биологического материала - мочи, а так же повысить точность определения очага лептоспироза.

Изобретение относится к способу идентификации живых и мертвых организмов мезозоопланктона в морских пробах, который включает отбор пробы, крашение организмов соответствующими красителями, визуальную оценку интенсивности окраски особей под микроскопом, которую выполняют одновременно с микрофотосъемкой организмов, используя настройки фотокамеры в ручном режиме, сохраняя эти настройки неизменными на протяжении фотосъемки по крайней мере одной пробы, после чего в полученных изображениях, применяя редактор растровой графики, например программный пакет Adobe Photoshop, измеряют средние для каждой особи цветовые и яркостные характеристики и относят особи к классу живых или мертвых, осуществляя дискриминантный анализ измеренных цифровых величин.
Наверх