Лечение нарушений, связанных с инсулинорезистентностью

Изобретение относится к медицине, а именно к лечению нарушений, связанных с инсулинорезистентностью. Способ лечения включает введение эффективного количества антагониста IL-17A и/или IL-17F, где указанный антагонист представляет собой антитело или его антигенсвязывающий фрагмент. Группа изобретений также относится к фармацевтической композиции, содержащей антагонист IL-17A и/или IL-17F с добавлением фармацевтически приемлемого вспомогательного вещества, и набору, содержащему вышеуказанный антагонист, и инструкцию по его введению. Использование данной группы изобретений позволяет снизить инсулинорезистентность у субъекта посредством введения антагонистов провоспалительных факторов IL-17A и/или IL-17F. 4 н. и 16 з.п. ф-лы, 3 пр., 14 ил.

 

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ

Изобретение относится к лечению нарушений, связанных с инсулинорезистентностью. В частности, настоящее изобретение относится к лечению нарушений, связанных с инсулинорезистентностью, введением антагонистов IL-17, например IL-17A и/или IL-17F, таких как антитела против IL-17A, и/или IL-17F, и/или IL-17Rc или фрагменты антител.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Семейство IL-17

Интерлейкин-17A (IL-17A) является производимой T-клетками провоспалительной молекулой, которая стимулирует эпителиальные, эндотелиальные клетки и фибробласты к образованию других возбуждающих (воспалительных) цитокинов и хемокинов, включая IL-6, IL-8, Г-КСФ и MCP-1 (см. Yao, Z. et al., J. Immunol., 122(12):5483-5486 (1995); Yao, Z. et al., Immunity, 3(6):811-821 (1995); Fossiez, F., et al., J. Exp. Med., 183(6):2593-2603 (1996); Kennedy, J., et al., J. Interferon Cytokine Res., 16(8):611-7 (1996); Cai, X. Y., et al., Immunol. Lett, 62(l):51-8 (1998); Jovanovic, D.V., et al., J. Immunol., 160(7):3513-21 (1998); Laan, M., et al., J. Immunol., 162(4):2347-52 (1999); Linden, A., et al., Eur Respir J, 15(5):973-7 (2000); и Aggarwal, S. and Gurney, A. L., J Leukoc Biol. 71(1):1-8 (2002)). IL-17 также оказывает синергичное действие с другими цитокинами, включая TNF-α и IL-1β, на дальнейшую индукцию экспрессии хемокинов (Chabaud, M., et al., J. Immunol. 161(1):409-14 (1998)). IL-17A обладает плейотропными биологическими активностями в отношении различных типов клеток. IL-17A также способен индуцировать экспрессию на поверхности клеток ICAM-1, пролиферацию T-клеток и рост и дифференцировку предшественников клеток CD34⁺ человека в нейтрофилы. Также показано участие IL-17A в метаболизме костей, и предполагается, что он играет важную роль в патологических состояниях, характеризуемых присутствием активированных T-клеток и продукцией TNF-α, таких как ревматоидный артрит и разрыхление костных имплантатов (Van Bezooijen et al., J. Bone Miner. Res., 14:1513-1521 (1999)). Обнаружено, что активированные T-клетки из синовиальной ткани, полученной от пациентов с ревматоидным артритом, секретируют более высокое количество IL-17A, чем клетки, полученные у здоровых индивидуумов или пациентов с остеоартритом (Chabaud et al., Arthritis Rheum., 42:963-970 (1999)). Было высказано предположение, что этот провоспалительный цитокин активно способствует воспалению синовиальной сумки при ревматоидном артрите. Помимо его провоспалительной роли, IL-17A, по-видимому, вносит вклад в патологию ревматоидного артрита с помощью еще одного механизма. Например, было показано, что IL-17A индуцирует экспрессию мРНК фактора дифференцировки остеокластов (ODF) в остеобластах (Kotake et al., J. Clin. Invest., 103:1345-1352 (1999)). ODF стимулирует дифференцировку клеток-предшественников в остеокласты, клетки, участвующие в резорбции костной ткани. Так как уровень IL-17A в синовиальной жидкости пациентов с ревматоидным артритом существенно повышен, полагают, что индуцированное IL-17A образование остеокластов играет критическую роль в резорбции костной ткани при ревматоидном артрите. Считается также, что IL-17A играет ключевую роль при некоторых других аутоиммунных нарушениях, таких как множественный склероз (Matusevicius et al., Mult. Scler., 5:101-104 (1999); Kurasawa, K., et al., Arthritis Rheu 43(11):2455-63 (2000)) и псориаз (Teunissen, M. B., et al., J Invest Dermatol 111(4):645-9 (1998); Albanesi, C., et al., J Invest Dermatol 115(1):81-7 (2000); и Homey, B., et al., J. Immunol. 164(12):6621-32 (2000)).

Кроме того, было показано, что IL-17A через внутриклеточную передачу сигнала стимулирует поступление в клетку Ca²⁺ и снижение концентрации цАМФ_неорг. в макрофагах человека (Jovanovic et al., J. Immunol., 160:3513 (1998)). Фибробласты, обработанные IL-17A, индуцируют активацию NFkB (Yao et al., Immunity, 3:811 (1995), Jovanovic et al., выше), в то время как обработанные им макрофаги активируют NF-kB и митоген-активируемые протеинкиназы (Shalom-Barek et al., J. Biol. Chem., 273:27467 (1998)). Кроме того, IL-17A также обладает сходством последовательности с цитокиноподобным фактором-7 млекопитающих, который участвует в росте костей и хрящей. Другими белками, с которыми полипептиды IL-17A обладают сходством последовательности, являются эмбриональный родственный интерлейкину фактор (EDIRF) и интерлейкин-20.

В соответствии с широким диапазоном эффектов IL-17A обнаружено, что рецепторы IL-17A на клеточной поверхности широко экспрессируются во многих тканях и типах клеток (Yao et al., Cytokine, 2:794 (1997)). Хотя аминокислотная последовательность рецептора IL-17A человека (IL-R) (866 аминокислот) предсказывает белок с одиночным трансмембранным доменом и длинным, содержащим 525 аминокислот, внутриклеточным доменом, последовательность рецептора является уникальной и не имеет сходства с какими-либо другими рецепторами из семейства рецепторов цитокинов/ростовых факторов. Этот факт, а также отсутствие сходства самого IL-17A с другими известными белками указывают на то, что IL-17A и его рецептор могут являться частью нового семейства сигнальных белков и рецепторов. Показано, что активность IL-17A опосредуется через его связывание с уникальным рецептором на поверхности клетки (обозначенным в этом документе как IL-17R человека), при этом предыдущие исследования показали, что контакт T-клеток с растворимой формой полипептида рецептора IL-17A ингибировал пролиферацию T-клеток и продукцию IL-2, индуцированные фитогемагглютинином, конканавалином А и моноклональными антителами против TCR (Yao et al., J. Immunol., 155:5483-5486 (1995)). По сути, имеется существенный интерес в идентификации и определении характеристик новых полипептидов, обладающих гомологией с известными рецепторами цитокинов, в частности рецепторами IL-17A.

В настоящее время интерлейкин 17A считается прототипным членом нового семейства цитокинов. Крупномасштабное секвенирование геномов человека и других позвоночных выявило наличие дополнительных генов, кодирующих белки, имеющие явное родство с IL-17A, установив, таким образом, новое семейство цитокинов. Имеется, по меньшей мере, 6 членов семейства IL-17 у человека и мыши, включая IL-17A, IL-17B, IL-17C, IL-17D, IL-17E и IL-17F, а также новые рецепторы IL-17RH1, IL-17RH2, IL-17RH3 и IL-17RH4 (см. WO01/46420, опубликованный 28 июня 2001 г.). Показано, что один такой член IL-17 (обозначенный как IL-17F) связывается с рецептором IL-17 человека (IL-17R) (Yao et al., Cytokine, 9(11):794-800 (1997)). Начальное определение характеристик свидетельствует, что, подобно IL-17A, некоторые из этих вновь обнаруженных молекул обладают способностью модулировать иммунную функцию. Сильное возбуждающее действие, обнаруженное для некоторых из этих факторов, и выявляемые ассоциации с серьезными заболеваниями человека указывают на то, что эти белки могут играть существенную роль в воспалительных процессах и могут предоставить возможность для терапевтического вмешательства.

Ген, кодирующий IL-17F человека, расположен рядом с геном IL-17A (Hymowitz, S. G., et al., Embo J, 20(19):5332-41 (2001)). IL-17A и IL-17F имеют примерно 44% идентичности по аминокислотной последовательности, при этом другие члены семейства IL-17 обладают более ограниченной идентичностью аминокислотных последовательностей в 15-27%, что указывает на образование IL-17A и IL-17F обособленной подгруппы в пределах семейства IL-17 (Starnes, T., et al., J Immunol. 167(8):4137-40 (2001); Aggarwal, S. и Gurney, A. L., J. Leukoc Biol, 71(1):1-8 (2002)). По-видимому, IL-17F обладает биологическим действием, схожим с таковым IL-17A, и способен стимулировать продукцию IL-6, IL-8 и Г-КСФ у большого разнообразия клеток. Подобно IL-17A, он способен индуцировать высвобождение хрящевого матрикса и ингибировать синтез нового хрящевого матрикса (см. патент США 2002-0177188-A1, опубликованный 28 ноября 2002 г.). Таким образом, как и IL-17A, IL-17F потенциально может участвовать в патологии воспалительных нарушений. Сообщалось, что как IL-17A, так и IL-17F индуцируются в T-клетках под действием интерлейкина 23 (IL-23) (Aggarwal, S., et al., J. Biol. Chem., 278(3):1910-4 (2003)). В частности, как IL-17A, так и IL-17F были выявлены как действующие факторы при прогрессировании и патологии различных воспалительных и аутоиммунных заболеваний у человека и в моделях заболеваний человека у мышей. Действительно, IL-17A и, в меньшей степени, IL-17F были выявлены как эффекторные цитокины, которые запускают воспалительные ответы и таким образом участвуют в ряде аутовоспалительных (аутоиммунных) заболеваний, включая множественный склероз (MS), ревматоидный артрит (RA) и воспалительные заболевания кишечника (IBD). Эта линия была обозначена как Th₁₇, и количество этих клеток четко коррелирует с прогрессированием и степенью тяжести заболевания в моделях аутоиммунных заболеваний человека у мышей. Хотя участие IL-17A и IL-17F в воспалительных заболеваниях кажется очевидным (см., например, Kolls, J. K., A. Linden. Immunity 21:467-476 (2004)), клетки-мишени этих цитокинов не были идентифицированы, в частности, из-за того, что не был идентифицирован рецептор IL-17F. IL-17A обладает аффинностью к IL-17RA. Аминокислотная последовательность IL-17RA человека имеется в NCBI GenBank под номером доступа NP_055154.3. К настоящему моменту, по меньшей мере, четыре дополнительных рецептора в семействе IL-17R были идентифицированы на основе гомологии последовательности в отношении IL-17RA (IL-17Rh1, IL-17Rc, IL-17RD и IL-17RE), и среди них, как было показано, IL-17Rc физически взаимодействует с IL-17RA, что указывает на то, что он может являться функциональным компонентом комплекса IL-17R (Toy, D. et al., J. Immunol. 177:36-39 (2006)). Недавно было сообщено, что IL-17Rc является рецептором как для IL-17A, так и для IL-17F (Presnell, et al., J. Immunol. 179(8):5462-73 (2007)).

Воспаление и ожирение

Важным новым вкладом в наше понимание ожирения является появление концепции о том, что воспаление и диабет характеризуются состоянием хронического слабого воспаления. Основанием для такой точки зрения является то, что при ожирении появляются повышенные циркулирующие концентрации некоторых маркеров воспаления как провоспалительных цитокинов, так и белков острой фазы; такие маркеры включают IL-6, систему TNFα, C-реактивный белок (CRP) и гаптоглобин. Однако не ясна вовлеченность в терминах области самого воспаления, является ли оно системным или местным.

Инсулинорезистентность, определяемая как более слабый, чем ожидаемый, биологический ответ на данную дозу инсулина, является обычным коррелятом ожирения. Действительно, полагают, что многие патологические последствия ожирения включают инсулинорезистентность. Сюда относятся гипертония, гиперлипидемия и, наиболее важно, инсулиннезависимый сахарный диабет (НИЗСД). Большинство пациентов с НИЗСД страдает ожирением, и наиболее важным и ранним компонентом развития НИЗСД является инсулинорезистентность (Moller et al., New Eng. J. Med., 325:938 (1991)). Показано, что при инсулинорезистентности развивается аномалия пост-рецепторных компонентов, в дополнение к подавлению функции рецепторов инсулина во время начальных стадий этого заболевания (Olefsky et al., in Diabetes Mellitus, Rifkin and Porte, Jr., Eds. (Elsevier Science Publishing Co., Inc., New York, ed. 4, 1990), pp. 121-153).

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение основано, по меньшей мере, частично, на том факте, что члены семейства IL-17 и, в частности, IL-17A и IL-17F играют роль в ожирении, инсулинорезистентности и других нарушениях, ассоциированных с ожирением, таких как гиперлипидемия и метаболический синдром, и что антагонисты IL-17, особенно антагонисты IL-17A и IL-17F, могут применяться для лечения этих состояний.

В одном аспекте настоящее изобретение относится к способу лечения у млекопитающего нарушения, связанного с инсулинорезистентностью, который включает введение нуждающемуся в этом млекопитающему эффективного количества антагониста IL-17A и/или IL-17F.

В другом аспекте настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции, содержащей антагонист IL-17A и/или IL-17F с добавлением фармацевтически приемлемого вспомогательного вещества, для лечения нарушения, связанного с инсулинорезистентностью.

В дополнительном аспекте настоящее изобретение относится к применению антагониста IL-17A и/или IL-17F для лечения нарушения, связанного с инсулинорезистентностью.

В другом аспекте настоящее изобретение относится к набору для лечения нарушения, связанного с инсулинорезистентностью, указанному набору, содержащему: (а) контейнер, содержащий антагонист IL-17A и/или IL-17F; и (б) этикетку или инструкцию по введению указанного антитела для лечения указанного нарушения.

Во всех аспектах, в одном из вариантов воплощения настоящего изобретения, нарушение выбрано из группы, состоящей из инсулиннезависимого сахарного диабета (НИЗСД), ожирения, гиперандрогении яичников и гипертонии. В другом варианте воплощения настоящего изобретения нарушение является НИЗСД или ожирением.

В дополнительном варианте воплощения млекопитающее является человеком, и введение является системным.

В другом дополнительном варианте воплощения антагонист IL-17A и/или IL-17F является антителом или его фрагментом, таким как антитело, выбранное из группы, содержащей антитела против IL-17A, против IL-17F, против IL-l7A/F, против IL-17Rc и против IL-17RA, или его фрагмент.

Предпочтительно, антитело является моноклональным антителом, включая химерные, гуманизированные антитела или антитела человека, биспецифичные, мультиспецифичные антитела или антитела с перекрестной реактивностью.

В другом варианте воплощения настоящего изобретения способ включает введение эффективного количества агента для лечения инсулинорезистентности, такого как инсулин, IGF-1 или сульфонилмочевина.

В дополнительном варианте способ включает введение эффективного количества дополнительного агента, способного лечить указанное нарушение, связанное с инсулинорезистентностью, такого как Dickkopf-5 (Dkk-5).

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ФИГУР

На фиг.1 показана нуклеотидная последовательность (ПОСЛ. ID №:1) кДНК нативной последовательности IL-17A человека.

На фиг.2 показана аминокислотная последовательность (ПОСЛ. ID №:2) нативной последовательности IL-17A человека, получаемой из кодирующей последовательности ПОСЛ. ID №:1, показанной на фиг.1.

На фиг.3 показана нуклеотидная последовательность (ПОСЛ. ID №:3) кДНК нативной последовательности IL-17F человека.

На фиг.4 показана аминокислотная последовательность (ПОСЛ. ID №: 4) нативной последовательности IL-17F человека, получаемой из кодирующей последовательности ПОСЛ. ID №:3, показанной на фиг.3.

На фиг.5 показана нуклеотидная последовательность (ПОСЛ. ID №:5), кодирующая нативную последовательность полипептида рецептора C IL-17 человека (IL-17Rc), которая также известна как клон, обозначенный "DNA164625-2890".

На фиг.6 показана аминокислотная последовательность (ПОСЛ. ID №:6) нативной последовательности полипептида IL-17Rc человека (также известного как рецептор IL-17RH2).

Фиг.7 - планирование эксперимента исследования модели диеты с высоким содержанием жиров (HFD) с использованием мышей IL-17Rc KO.

Фиг.8 - результаты на 8 неделе исследования модели диеты с высоким содержанием жиров (HFD) с использованием мышей IL-17Rc KO.

Фиг.9A и 9B - уровни глюкозы у мышей дикого типа и IL-17Rc KO в контрольной группе и группе с диетой с высоким содержанием жиров. Мыши IL-17Rc KO устойчивы к инсулинорезистентности, индуцированной диетой с высоким содержанием жиров (HFD).

Фиг.10 - площадь под фармакокинетической кривой на 10 неделе.

Фиг.11 - результаты по массе тела.

Фиг.12 - эффект моноклональных антител (mAb) против IL-17 и против IL-17F на модель инсулинорезистентности при диете с высоким содержанием жиров.

Фиг.13 - проба на переносимость глюкозы (GTT) в период после 9 недель введения доз.

Фиг.14 - эктопическая экспрессия IL-17A путем инъекции плазмидной ДНК с последующей пробой на переносимость глюкозы (GTT). Эффект сверхэкспрессии IL-17 на статус инсулинорезистентности, оцененный с применением GTT.

ДЕТАЛЬНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

A. Определения

Термин "IL-17" в основном применяется для обозначения членов семейства IL-17, включая IL-17A, IL-17, IL-17B, IL-17C, IL-17D, IL-17E, IL-17F и IL-17A/F. Предпочтительными IL-17 в этом документе являются IL-17A, IL-17F и IL-17A/F.

"Полипептид с нативной последовательностью IL-17" включает полипептид, имеющий ту же аминокислотную последовательность, что и соответствующий полипептид IL-17, полученный из природного источника. Такие полипептиды с нативной последовательностью IL-17 могут быть выделены из природных источников или могут быть получены рекомбинантным или синтетическим способами. Термин "полипептид с нативной последовательностью IL-17" явным образом включает естественного происхождения укороченные или секретируемые формы специфичного полипептида IL-17 (например, последовательность внеклеточного домена), естественного происхождения вариантные формы (например, формы, образующиеся в результате альтернативного сплайсинга) и естественного происхождения аллельные варианты полипептида. В различных воплощениях настоящего изобретения полипептиды с нативной последовательностью IL-17, описанные в этом документе, являются зрелыми или полноразмерными полипептидами с нативными последовательностями IL-17A, IL-17F и IL-17A/F человека, содержащими полноразмерные аминокислотные последовательности, приведенные на фиг.2 и 4 (ПОСЛ. ID №№:2 и 4). Стартовые и стоп-кодоны указаны на фигурах жирным шрифтом и подчеркиванием.

"Полипептид с нативной последовательностью IL-17Rc" или "нативная последовательность IL-17Rc" обозначает полипептид, имеющий ту же аминокислотную последовательность, что и соответствующий полипептид IL-17Rc, полученный из природного источника. Такие полипептиды с нативной последовательностью IL-17Rc могут быть выделены из природных источников или могут быть получены рекомбинантным или синтетическим способами. Термин "полипептид с нативной последовательностью IL-17Rc" явным образом включает естественного происхождения укороченные или секретируемые формы специфичного полипептида IL-17Rc, естественного происхождения вариантные формы (например, формы, образующиеся в результате альтернативного сплайсинга) и естественного происхождения аллельные варианты полипептида. В различных воплощениях настоящего изобретения полипептид с нативной последовательностью IL-17Rc, описанный в этом документе, является полноразмерным IL-17Rc человека с нативной последовательностью, содержащим полноразмерную аминокислоту, приведенную на фиг.6 (ПОСЛ. ID №:6).

"Изолированный", при использовании для описания различных полипептидов, раскрытых в этом документе, означает полипептид, который был идентифицирован и выделен и/или извлечен из компонента его природного окружения. Загрязняющими компонентами его природного окружения являются материалы, которые в типичном случае препятствовали бы диагностическим или терапевтическим применениям полипептида и которые могут включать ферменты, гормоны и другие растворенные вещества белковой или небелковой природы. В предпочтительном варианте полипептид будет очищен (1) до степени, достаточной для определения, по меньшей мере, 15 остатков N-концевой или внутренней аминокислотной последовательности с применением секвенатора с вращающимся стаканом, или (2) до гомогенности в ДСН-ПААГ в невосстанавливающих или восстанавливающих условиях с использованием окраски кумасси голубым или, предпочтительно, серебром. Изолированный полипептид включает полипептид in situ в рекомбинантных клетках с момента, когда, по меньшей мере, один компонент природного окружения полипептида IL-17 будет отсутствовать. Обычно, однако, изолированный полипептид будет приготовляться с помощью, по меньшей мере, одного этапа очистки.

При использовании в этом документе, "ожирение" обозначает состояние, при котором млекопитающее имеет индекс массы тела (BMI), вычисленный как масса (в кг) на рост² (в метрах), равный, по меньшей мере, 25,9. Принято считать, что индивидуумы с нормальной массой имеют BMI от 19,9 до менее чем 25,9. Ожирение, ассоциированное с инсулинорезистентностью, явным образом подпадает под это определение.

"Инсулинорезистентность" или "нарушение, связанное с инсулинорезистентностью", или "активность, связанная с инсулинорезистентностью" являются заболеванием, состоянием или нарушением, возникающим в результате нарушения нормального метаболического ответа периферических тканей (нечувствительности) на действие экзогенного инсулина, т.е. это состояние, при котором присутствие инсулина приводит к более слабому, чем в норме, биологическому ответу. В клинических терминах, инсулинорезистентность имеется, когда нормальный или повышенный уровни глюкозы в крови сохраняются в присутствии нормального или повышенного уровней инсулина. Она представляет собой, по существу, ингибирование синтеза гликогена, при котором либо базальный, либо стимулированный инсулином синтез гликогена, либо оба этих типа, уменьшены до уровней ниже нормы. Инсулинорезистентность играет основную роль при диабете 2 типа, как продемонстрировано тем фактом, что гипергликемия, присутствующая при диабете 2 типа, иногда может быть обращена с помощью диеты или снижения массы, достаточных, очевидно, для восстановления чувствительности периферических тканей к инсулину. Термин включает аномальную переносимость глюкозы, а также многие нарушения, при которых инсулинорезистентность играет ключевую роль, такие как ожирение, сахарный диабет, гиперандрогения яичников и гипертония.

"Сахарный диабет" обозначает состояние хронической гипергликемии, т.е. избытка сахара в крови, как следствие относительной или полной недостаточности действия инсулина. Выделяют три основных типа сахарного диабета, I тип или инсулинозависимый сахарный диабет (ИЗСД), II тип или инсулиннезависимый сахарный диабет (НИЗСД) и инсулинорезистентность типа A, хотя тип A встречается относительно редко. Пациенты с диабетом I типа или II типа могут приобрести нечувствительность к действию экзогенного инсулина путем различных механизмов. Инсулинорезистентность типа A возникает в результате либо мутаций в гене рецептора инсулина, либо нарушений в пост-рецепторных областях действия, критических для метаболизма глюкозы. Больные диабетом субъекты могут быть легко идентифицированы врачом, и для них характерны гипергликемия, нарушение толерантности к глюкозе, гликозилированный гемоглобин и, в некоторых случаях, кетоацидоз, ассоциированный с повреждением или заболеванием.

"Инсулиннезависимый сахарный диабет" или "НИЗСД" обозначает диабет II типа. Пациенты с НИЗСД имеют аномально высокую концентрацию глюкозы в крови натощак и замедленное поглощение глюкозы клетками после потребления пищи или после диагностического теста, известного как проба на переносимость глюкозы. НИЗСД диагностируют на основании признанных критериев (American Diabetes Association, Physician's Guide to Insulin-Dependent (Type I) Diabetes, 1988; American Diabetes Association, Physician's Guide to Non-Insulin-Dependent (Type II) Diabetes, 1988).

Симптомы и осложнения диабета, которые будут подвергаться лечению в качестве нарушения, при использовании в этом документе, включают гипергликемию, неудовлетворительный гликемический контроль, кетоацидоз, инсулинорезистентность, повышенные уровни гормона роста, повышенные уровни гликозилированного гемоглобина и повышенное содержание конечных продуктов гликозилирования (AGE), утреннюю гипергликемию, неудовлетворительный липидный профиль, заболевание сосудов (например, атеросклероз), заболевание капилляров, нарушения сетчатки (например, пролиферативную диабетическую ретинопатию), нарушения функции почек, нейропатию, осложнения при беременности (например, преждевременные роды и пороки развития) и тому подобное. В определение лечения включены такие конечные точки, как, например, повышение чувствительности к инсулину, снижение дозировки инсулина при сохранении гликемического контроля, снижение уровня HbAlc, улучшение гликемического контроля, ослабление сосудистых, почечных, невральных, ретинальных и других диабетических осложнений, предотвращение или снижение утренней гипергликемии, улучшенный липидный профиль, снижение осложнений при беременности и снижение кетоацидоза.

"Терапевтическая композиция" или "композиция", при использовании в этом документе, определяется как композиция, содержащая Dkk-5 и фармацевтически приемлемый носитель, такой как вода, неорганические соединения, белки и другие вспомогательные вещества, известные специалистам в данной области.

Термин "млекопитающее" для целей лечения относится к любому животному, классифицируемому как млекопитающее, включая, в качестве неограничивающих примеров, человека, грызунов, животных, используемых в спорте, содержащихся в зоопарках и домах, и одомашненных или сельскохозяйственных животных, таких как собаки, кошки, крупный рогатый скот, овцы, свиньи, лошади и не человекообразные приматы, такие как обезьяны. Предпочтительными грызунами являются мыши или крысы. Предпочтительно, млекопитающим является человек, также называемый в этом документе пациентом.

При использовании в этом документе, "лечение" обозначает терапию и уход за млекопитающим с целью борьбы с любым из заболеваний или состояний, к лечению которых относится настоящее изобретение, включая, в качестве неограничивающих примеров, инсулинорезистентность, сахарный диабет, гиперинсулинемию, гипоинсулинемию или ожирение, и включает введение лекарственного средства для профилактики возникновения симптомов или осложнений, смягчения симптомов или осложнений или устранения целевых заболеваний или состояний.

Для целей настоящего изобретения полезные или желательные клинические результаты "лечения" для снижения инсулинорезистентности включают, в качестве неограничивающих примеров, смягчение симптомов, ассоциированных с инсулинорезистентностью, уменьшение степени тяжести симптомов инсулинорезистентности, стабилизацию (т.е. отсутствие ухудшения) симптомов инсулинорезистентности (например, снижение потребности в инсулине), повышение чувствительности к инсулину и/или секреции инсулина для предотвращения повреждения клеток островков и задержку или замедление прогрессирования инсулинорезистентности, например, прогрессирования диабета.

В отношении ожирения, "лечение" обычно обозначает снижение BMI млекопитающего до менее чем примерно 25,9 и поддержание этой массы в течение, как минимум, 6 месяцев. Пригодность лечения приводит в результате к снижению потребления млекопитающим пищи или калорий. Кроме того, в этом контексте лечение относится к профилактике возникновения ожирения, если лечение проводится до появления состояния ожирения. Лечение включает ингибирование и/или полное подавление липогенеза у млекопитающих с ожирением, т.е. избыточного накопления липидов в жировых клетках, которое является одной из главных характеристик ожирения у человека и животных, а также снижение общей массы тела.

Те, кто "нуждается в лечении", являются млекопитающими, у которых уже имеется нарушение, а также теми, кто имеет склонность к приобретению нарушения, в том числе теми, у кого нарушение следует предотвратить.

"Агент для лечения инсулинорезистентности" - это агент, отличный от антагониста IL-17, который применяют для лечения инсулинорезистентности, такой как, например, Dickkopf-5 (Dkk-5) (см., например, публикацию заявки на патент США № 2005/0170440) и гипогликемические агенты. Примеры таких лекарственных агентов включают инсулин (один или несколько различных инсулинов); миметики инсулина, такие как низкомолекулярный инсулин, например, L-783,281; аналоги инсулина (например, инсулин HUMALOG® (Eli Lilly Co.), инсулин Lys_B28, инсулин Pro_B29 или инсулин Asp_B21, или таковые, описанные, например, в патентах США №№ 5149777 и 5514646), или их физиологически активные фрагменты; родственные инсулину пептиды (C-пептид, GLP-1, инсулиноподобный фактор роста-I (IGE-1) или комплекс IGF-1/IGFBP-3) или их аналоги или фрагменты; эргосет; прамлинтид; лептин; BAY-27-9955; T-1095; антагонисты ингибитора тирозинкиназы рецептора инсулина; антагонисты функции TNF-α; агент высвобождения гормона роста; амилин или антитела к амилину; сенсибилизирующий к инсулину агент, такой как соединения семейства глитазона, включая таковые, описанные в патенте США № 5753681, такие как троглитазон, пиоглитазон, энглитазон и родственные соединения; линалоол отдельно или с витамином E (патент США № 6187333); усилители секреции инсулина, такие как натеглинид (AY-4166), кальция (2S)-2-бензил-3-(цис-гексагидро-2-изоиндолинилкарбонил)пропионата дигидрат (митиглинид, KAD-1229) и репаглинид; лекарственные средства на основе сульфонилмочевины, например ацетогексамид, хлорпропамид, толазамид, толбутамид, гликлопирамид и его аммониевая соль, глибенкламид, глибомурид, гликлазид, 1-бутил-3-метанилилмочевина, карбутамид, глипизид, гликвидон, глизоксепид, глибутиазол, глибузол, глигексамид, глимидин, глипинамид, фенбутамид, толцикламид, глимепирид и т.д.; бигуаниды (такие как фенформин, метформин, буформин и т.д.); ингибиторы α-глюкозидазы (такие как акарбоза, воглибоза, миглитол, эмиглитат и т.д.) и такие нетипичные способы лечения, как трансплантация поджелудочной железы или аутоиммунные реагенты.

"Агент для снижения массы" обозначает молекулу, полезную для лечения или профилактики ожирения. Такие молекулы включают, например, гормоны (катехоламины, глюкагон, АКТГ и гормон роста в сочетании с IGF-1); белок Ob; клофибрат; галогенат; цинхокаин; хлорпромазин; подавляющие аппетит лекарственные средства, действующие на норадренергические нейротрансмиттеры, такие как мазиндол и производные фенэтиламина, например фенилпропаноламин, диэтилпропион, фентермин, фендиметразин, бензфетамин, амфетамин, метамфетамин и фенметразин; лекарственные средства, действующие на серотониновые нейротрансмиттеры, такие как фенфторамин, триптофан, 5-гидрокситриптофан, флуоксетин и сертралин; лекарственные средства центрального действия, такие как налоксон, нейропептид-Y, галанин, кортикотропин-высвобождающий гормон и холецистокинин; холинэргические агонисты, такие как пиридостигмин; сфинголипид, такой как лизосфинголипид или его производное; термогенные лекарственные средства, такие как тиреоидный гормон; эфедрин; бета-адренергические агонисты; лекарства, влияющие на желудочно-кишечный тракт, такие как ингибиторы ферментов, например, тетрагидролипостатин, неперевариваемые продукты питания, такие как полиэфир сахарозы, и ингибиторы опорожнения желудка, такие как треохлоролимонная кислота или ее производные; бета-адренергические агонисты, такие как изопротеренол и йохимбин; аминофиллин для усиления эффектов йохимбина, подобных бета-адренергическим, лекарство, блокирующее α₂-адренергическую передачу, такое как клонидин отдельно или в сочетании с пептидом, высвобождающим гормон роста; лекарства, препятствующие поглощению в кишечнике, такие как бигуанидины, например, метформин и фенформин; объемные наполнители, такие как метилцеллюлоза; лекарственные средства, блокирующие метаболизм, такие как гидроксицитрат; прогестерон; агонисты холецистокинина; малые молекулы, мимикрирующие под кетокислоты; агонисты кортикотропин-высвобождающего гормона; получаемое из спорыньи ингибирующее пролактин соединение для снижения жировых запасов тела (патент США № 4783469, выданный 8 ноября 1988 г.); бета-3-агонисты; бромокриптин; антагонисты опиоидных пептидов; антагонисты нейропептида Y; антагонисты рецепторов глюкокортикоидов; агонисты гормона роста; их комбинации и т.д.

При использовании в этом документе, "инсулин" относится к любой субстанции, обладающей действием инсулина и представленной, например, инсулином животного происхождения, экстрагированным из поджелудочной железы быка или свиньи, полусинтетическим инсулином человека, который синтезируется ферментативно из инсулина, экстрагированного из поджелудочной железы свиньи, и инсулином человека, синтезированным с применением методик генной инженерии, обычно с применением E. coli или дрожжей и т.д. Дополнительно, инсулин может включать комплекс инсулина с цинком, содержащий примерно от 0,45 до 0,9 масс.% цинка, протамин-инсулин-цинк, получаемый из цинка хлорида, комплекс протамина сульфата и инсулина и т.д. Инсулин может быть представлен в форме его фрагментов или производных, например, INS-1. Инсулин также может включать инсулиноподобные субстанции, такие как L83281 и агонисты инсулина. Так как инсулин доступен в разнообразных видах, таких как супернемедленного действия, немедленного действия, бимодального действия, промежуточного действия, длительного действия и т.д., эти виды могут быть должным образом выбраны в соответствии с состоянием пациента.

"Терапевтическая композиция" при использовании в этом документе определяется как композиция, содержащая антагонист IL-17 (включая антагонисты IL-17A и IL-17F) и фармацевтически приемлемый носитель, такой как вода, неорганические соединения, белки и другие вспомогательные вещества, известные специалистам в данной области.

Подразумевается, что выражения "антагонист", "антагонист по отношению к IL-17 (A и/или F)", "антагонист IL-17 (A и/или F)" и им подобные в рамках настоящего изобретения включают любую молекулу, которая препятствует функции IL-17, такого как IL-17A и/или IL-17F, или блокирует или нейтрализует соответствующую активность IL-17 (такого как IL-17A и/или F) любым способом, в зависимости от показаний к лечению. Она может предотвращать взаимодействие между IL-17 (включая IL-17 и IL-17F) и одним или несколькими его рецепторами. Такие агенты осуществляют это действие различными способами. Например, класс антагонистов, которые "нейтрализуют" активность IL-17, будет связываться с IL-17 или с рецептором IL-17 с достаточной аффинностью и специфичностью, создавая препятствие для действия IL-17, как описано ниже. Антитело, "которое связывается" с IL-17 или с рецептором IL-17 (например, IL-17Rc), - это антитело, которое способно связаться с этим антигеном с достаточной аффинностью таким образом, что антитело является полезным в качестве терапевтического агента для целевого воздействия на клетки, экспрессирующие IL-17 или рецептор IL-17. Термин "антагонист IL-17" применяется для обозначения любого из антагонистов IL-17A, IL-17F и IL-17A/F.

В состав этой группы антагонистов входят, например, антитела, выработанные против IL-17 или его частей, реактивные в отношении IL-17, или рецептора IL-17 или их частей, в том числе антитела против IL-17A и/или IL-17F и IL-17Rc. Термин также включает любой агент, который будет препятствовать сверхпродукции IL-17A и/или IL-17F или оказывать антагонистическое действие в отношении рецептора, по меньшей мере, одного IL-17 (например, IL-17A и/или IL-17F), такого как IL-17Rc. Такие антагонисты могут быть представлены в форме химерных гибридов, полезных для сочетания функции агента с белком-носителем для повышения периода полувыведения из сыворотки терапевтического агента или для обеспечения межвидовой переносимости. Следовательно, примеры таких антагонистов включают биоорганические молекулы (например, пептидомиметики), антитела, белки, пептиды, гликопротеины, гликопептиды, гликолипиды, полисахариды, олигосахариды, нуклеиновые кислоты, фармакологические агенты и их метаболиты, транскрипционные и трансляционные регуляторные последовательности и тому подобное. В предпочтительном варианте антагонист представлен антителом, имеющим требуемые свойства связывания с IL-17A и/или IL-17F и предотвращающим его взаимодействие с рецептором, предпочтительно с IL-17Rc.

Термин "антитело" используется в самом широком смысле и определенно включает, например, единичные моноклональные антитела против IL-17A/F или против IL-17A, или против IL-17F (включая агонисты, антагонисты и нейтрализующие антитела), композиции соответствующих антител с полиэпитопной специфичностью, поликлональные антитела, одноцепочечные антитела и фрагменты антител (см. ниже), если они проявляют требуемую биологическую или иммунологическую активность.

Основная единица 4-цепочечного антитела представляет собой гетеротетрамерный гликопротеин, состоящий из двух идентичных легких (L) цепей и двух идентичных тяжелых (H) цепей (антитело IgM состоит из 5 основных гетеротетрамерных единиц и дополнительного полипептида, называемого J-цепью, и, таким образом, содержит 10 антигенсвязывающих сайтов, в то же время секретируемые антитела IgA могут полимеризоваться с образованием поливалентных комплексов, состоящих из 2-5 основных 4-цепочечных единиц и J-цепи). В случае IgG, 4-цепочечная единица обычно имеет массу около 150000 дальтон. Каждая L-цепь соединена с H-цепью одной ковалентной дисульфидной связью, а две H-цепи соединены друг с другом одной или несколькими дисульфидными связями, в зависимости от изотипа H-цепи. Каждая H- и L-цепь также имеет равномерно расположенные внутрицепочечные дисульфидные мостики. У каждой H-цепи на N-конце имеется вариабельный домен (V_H), за которым следуют три консервативных домена (C_H) для каждой из α и γ цепей и четыре C_H домена в случае μ и ε изотипов. У каждой L-цепи на N-конце имеется вариабельный домен (V_L), за которым следует консервативный домен (C_L) на другом ее конце. V_L расположен рядом с V_H, а C_L расположен рядом с первым консервативным доменом тяжелой цепи (C_H1). Считается, что отдельные аминокислотные остатки образуют поверхность взаимодействия между вариабельными доменами легкой цепи и тяжелой цепи. Объединение в пару V_H и V_L приводит к формированию единичного антигенсвязывающего сайта. Структура и свойства различных классов антител представлены, например, в Basic and Clinical Immunology, 8th edition, Daniel P. Stites, Abba I. Terr and Tristram G. Parslow (eds.), Appleton & Lange, Norwalk, Conn., 1994, страница 71 и глава 6.

L-цепь любого вида позвоночных животных может быть отнесена к одному из двух четко различаемых типов, называемых каппа и лямбда, исходя из аминокислотных последовательностей их консервативных доменов. В зависимости от аминокислотной последовательности консервативного домена их тяжелых цепей (C_H), иммуноглобулины могут быть отнесены к различным классам или изотипам. Выделяют пять классов иммуноглобулинов: IgA, IgD, IgE, IgG и IgM, которые имеют тяжелые цепи, обозначенные α, δ, ε, γ и μ соответственно. Классы γ и α далее подразделяются на подклассы на основании относительно незначительных различий в последовательности C_H и функции; например, у человека экспрессируются следующие подклассы: IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 и IgA2.

Термин "вариабельный" обозначает тот факт, что определенные сегменты вариабельных доменов существенно различаются по последовательности между антителами. V-домен опосредует связывание антигена и определяет специфичность конкретного антитела к его конкретному антигену. Однако вариабельность распределена неравномерно по всей длине 110-аминокислотных вариабельных доменов. В противоположность этому, V-области состоят из относительно инвариантных участков, называемых каркасными областями (FR) длиной 15-30 аминокислот, разделенных более короткими участками с повышенной вариабельностью, называемыми "гипервариабельными областями", которые имеют длину 9-12 аминокислот каждый. Вариабельные домены нативных тяжелых и легких цепей состоят, каждый, из четырех FR, в основном имеющих конфигурацию бета-листа, соединенных тремя гипервариабельными областями, которые образуют петли, соединяющие и, в некоторых случаях, образующие часть структуры бета-листа. Гипервариабельные области в каждой цепи тесно сближены друг с другом с помощью FR и совместно с гипервариабельными областями другой цепи участвуют в формировании антигенсвязывающего сайта антител (см. Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991)). Консервативные домены не вовлечены непосредственно в связывание антитела с антигеном, но выполняют различные эффекторные функции, такие как участие антитела в антителозависимой клеточно-опосредованной цитотоксичности (АЗКЦ).

Термин "гипервариабельная область", при использовании в этом документе, относится к аминокислотным остаткам антитела, которые отвечают за связывание антигена. Гипервариабельная область обычно содержит аминокислотные остатки из "области, определяющей комплементарность" или "CDR" (например, примерно в районе остатков 24-34 (L1), 50-56 (L2) и 89-97 (L3) в составе V_L и примерно в районе 1-35 (H1), 50-65 (H2) и 95-102 (H3) в составе V_H; Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991)), и/или остатки из "гипервариабельной петли" (например, остатки 26-32 (L1), 50-52 (L2) и 91-96 (L3) в составе V_L и 26-32 (H1), 53-55 (H2) и 96-101 (H3) в составе V_H; Chothia and Lesk J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987)).

Термин "моноклональное антитело", при использовании в этом документе, означает антитело, полученное из популяции в существенной мере однородных антител, т.е. индивидуальные антитела, составляющие популяцию, являются идентичными, за исключением возможных мутаций естественного происхождения, которые могут присутствовать в небольших количествах. Моноклональные антитела высокоспецифичны, так как вырабатываются против единичного антигенного сайта. Дополнительно, в отличие от препаратов поликлональных антител, которые содержат различные антитела, выработанные против различных детерминант (эпитопов), каждое моноклональное антитело выработано против единичной детерминанты на антигене. В дополнение к их специфичности, моноклональные антитела имеют то преимущество, что они могут быть синтезированы без примеси других антител. Такое моноклональное антитело обычно включает антитело, содержащее вариабельную область, которая связывается с мишенью, при этом антитело было получено способом, включающим отбор антител из множества антител. Например, способ отбора может являться отбором уникального клона из множества клонов, таких как пул гибридомных клонов, фаговых клонов или клонов с рекомбинантной ДНК. При этом следует понимать, что отобранное антитело может далее изменяться, например, для улучшения аффинности к мишени, для гуманизирования антитела, для улучшения его продукции в культуре клеток, для снижения его иммуногенности in vivo, для создания мультиспецифичного антитела и т.д., и что антитело, содержащее измененную последовательность вариабельной области, также является моноклональным антителом по настоящему изобретению. В дополнение к их специфичности, препараты моноклональных антител имеют то преимущество, что они обычно не содержат примеси других иммуноглобулинов. Определение "моноклональный" указывает на то свойство антитела, что оно было получено из в существенной мере однородной популяции антител, и не должно истолковываться как требование к получению антитела каким-либо определенным способом. Например, моноклональные антитела, которые будут применяться в соответствии с настоящим изобретением, могут быть получены с помощью различных способов, включая гибридомный метод (например, Kohler et al., Nature, 256:495 (1975); Harlow et al., Antibodies: A Laboratory Manual, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2nd ed. 1988); Hammerling et al., в: Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas 563-681, (Elsevier, N.Y., 1981)), методы рекомбинантной ДНК (см., например, патент США № 4816567), методики фагового дисплея (см., например, Clackson et al., Nature, 352:624-628 (1991); Marks et al., J. Mol. Biol., 222:581-597 (1991); Sidhu et al., J. Mol. Biol. 338(2):299-310 (2004); Lee et al., J. Mol. Biol.340(5):1073-1093 (2004); Fellouse, Proc. Nat. Acad. Sci. USA 101(34):12467-12472 (2004); и Lee et al. J. Immunol. Methods 284(1-2):119-132 (2004)) и методики для получения антител человека или антител, подобных антителам человека, из животных, которые содержат части или целые иммуноглобулиновые локусы человека или гены, кодирующие последовательности иммуноглобулинов человека (см., например, WO98/24893, WO/9634096, WO/9633735 и WO/9110741, Jakobovits et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:2551 (1993); Jakobovits et al., Nature, 362:255-258 (1993); Bruggemann et al., Year in Immuno., 7:33 (1993); патенты США №№ 5545806, 5569825, 5591669 (все принадлежат GenPharm); 5545807; WO 97/17852, патенты США №№ 5545807; 5545806; 5569825; 5625126; 5633425; и 5661016, и Marks et al., Bio/Technology, 10:779-783 (1992); Lonberg et al., Nature, 368: 856-859 (1994); Morrison, Nature, 368:812-813 (1994); Fishwild et al., Nature Biotechnology, 14:845-851 (1996); Neuberger, Nature Biotechnology, 14:826 (1996); и Lonberg and Huszar, Intern. Rev. Immunol., 13:65-93 (1995).

Моноклональные антитела в этом документе включают "химерные" антитела, в которых часть тяжелой и/или легкой цепи идентична или гомологична соответствующим последовательностям в антителах, полученных от конкретного вида или принадлежащих к конкретному классу или подклассу антител, при этом остальная часть цепи(ей) идентична или гомологична соответствующим последовательностям в антителах, полученных от другого вида или принадлежащих к другому классу или подклассу антител, а также фрагменты таких антител, если они обладают требуемой биологической активностью (см. патент США № 4816567; и Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6851-6855 (1984)). Химерные антитела, рассматриваемые в этом документе, включают "приматизированные" антитела, которые содержат антигенсвязывающие последовательности вариабельных доменов, полученные из приматов, отличных от человека (например, обезьян старого света, человекообразных обезьян и т.д.), и последовательности консервативных областей человека.

"Интактным" антителом является антитело, которое содержит антигенсвязывающий сайт, а также C_L и, по меньшей мере, консервативные домены тяжелой цепи CH1, CH2 и CH3. Консервативные домены могут быть консервативными доменами с нативной последовательностью (например, консервативными доменами с нативной последовательностью человека) или их вариантами аминокислотной последовательности. Предпочтительно, интактное антитело обладает одной или несколькими эффекторными функциями.

"Фрагменты антитела" содержат часть интактного антитела, предпочтительно антигенсвязывающую или вариабельную область интактного антитела. Примеры фрагментов антител включают фрагменты Fab, Fab', F(ab')₂ и Fv; диатела; линейные антитела (см. патент США № 5641870, Пример 2; Zapata et al., Protein Eng. 8(10):1057-1062 [1995]); молекулы одноцепочечных антител; и мультиспецифичные антитела, образованные из фрагментов антител. В предпочтительном варианте воплощения фрагмент является "функциональным", т.е. качественно сохраняет способность соответствующего интактного антитела связываться с целевыми полипептидами IL-17A и IL-17F и, если интактное антитело также ингибирует биологическую активность или функцию IL-17A/F, также качественно сохраняет такое ингибиторное свойство. Качественное сохранение означает, что сохраняется та же активность, но степень аффинности связывания и/или активности может отличаться.

Расщепление антител папаином приводит к образованию двух идентичных антигенсвязывающих фрагментов, называемых "Fab"-фрагментами, и остаточного "Fc"-фрагмента, чье обозначение отражает его способность легко кристаллизоваться. Fab-фрагмент состоит из целой L-цепи, соединенной с доменом вариабельной области H-цепи (V_H), и первого консервативного домена одной тяжелой цепи (C_H1). Каждый Fab-фрагмент моновалентен по отношению к связыванию антигена, т.е. он имеет единичный антигенсвязывающий сайт. Обработка антитела пепсином дает одиночный крупный F(ab')₂-фрагмент, который приблизительно соответствует двум сшитым дисульфидной связью Fab-фрагментам, имеющим бивалентную антигенсвязывающую активность, и сохраняет способность поперечной сшивки антигена. Fab'-фрагменты отличаются от Fab-фрагментов наличием нескольких дополнительных остатков на карбоксильном конце домена C_H1, в том числе одного или нескольких цистеинов из шарнирной области антитела. Fab'-SH в этом документе обозначает Fab', в котором остаток (остатки) цистеина консервативных доменов несет свободную тиольную группу. Фрагменты антител F(ab')₂ первоначально получали как пары Fab'-фрагментов, которые соединены между собой цистеинами шарнирной области. Также известны другие способы химической сшивки фрагментов антител.

Fc-фрагмент содержит карбокси-концевые части обеих H-цепей, соединенные вместе дисульфидными связями. Эффекторные функции антител определяются последовательностями в области Fc, и эта область также является частью, узнаваемой рецепторами Fc (FcR), обнаруженными на определенных типах клеток.

"Fv" - это минимальный фрагмент антитела, который содержит полный сайт узнавания и связывания антигена. Этот фрагмент состоит из димера вариабельных областей доменов одной тяжелой и одной легкой цепей, находящихся в прочном нековалентном взаимодействии. В результате фолдинга этих двух доменов образуются шесть гипервариабельных петель (по 3 петли из H- и L-цепи), которые предоставляют аминокислотные остатки для связывания антигена и обеспечивают антителу специфичность связывания антигена. Однако даже единичный вариабельный домен (или половина Fv, содержащая только три CDR, специфичные к антигену) обладает способностью узнавать и связывать антиген, хотя и с более низкой аффинностью, чем полный сайт связывания.

"Одноцепочечные Fv", также сокращенно обозначаемые "sFv" или "scFv", - это фрагменты антител, которые содержат домены V_H и V_L антител, соединенные в одну полипептидную цепь. Предпочтительно, полипептид sFv дополнительно содержит полипептидный линкер между доменами V_H и V_L, который позволяет sFv образовывать необходимую для связывания антигена структуру. Обзор по sFv см. у Pluckthun in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds., Springer-Verlag, New York, pp. 269-315 (1994); Borrebaeck 1995, ниже.

Термин "диатела" обозначает малые фрагменты антитела, приготовленные путем конструирования sFv-фрагментов (см. предыдущий параграф) с короткими линкерами (около 5-10 остатков) между доменами V_H и V_L таким образом, что достигается межцепочечное, но не внутрицепочечное, спаривание V-доменов, что дает в результате бивалентный фрагмент, т.е. фрагмент с двумя антигенсвязывающими сайтами. Биспецифичные диатела являются гетеродимерами двух "перекрестных" sFv-фрагментов, у которых домены V_H и V_L двух антител присутствуют на разных полипептидных цепях. Диатела более подробно описаны, например, в EP 404097; WO 93/11161; и Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:6444-6448 (1993).

"Гуманизированные" формы антител, принадлежащих не человеку (например, грызунам), - это химерные антитела, которые содержат минимальную последовательность, имеющую происхождение из антител, не принадлежащих человеку. В большинстве случаев гуманизированные антитела являются иммуноглобулинами человека (реципиентное антитело), в которых остатки из гипервариабельной области реципиента заменены на остатки из гипервариабельной области вида, отличного от человека (донорное антитело), такого как мышь, крыса, кролик или отличные от человека приматы, имеющие требуемую специфичность, аффинность и способность антитела. В некоторых случаях остатки каркасной области (FR) иммуноглобулина человека заменяют соответствующими остатками из вида, отличного от человека. Дополнительно, гуманизированные антитела могут содержать остатки, которые не обнаружены в реципиентном антителе или в донорном антителе. Эти модификации производят для дополнительного улучшения рабочих характеристик антитела. В целом, гуманизированное антитело будет содержать, в существенной мере, все из, по меньшей мере, одного, а в типичном случае двух вариабельных доменов, в которых все или в существенной мере все гипервариабельные петли соответствуют таковым иммуноглобулина, не принадлежащего человеку, и все или в существенной мере все FR являются таковыми с последовательностью иммуноглобулина человека. Гуманизированное антитело необязательно также будет содержать, по меньшей мере, часть консервативной области иммуноглобулина (Fc), в типичном случае, таковой иммуноглобулина человека. Для более подробного описания см. Jones et al., Nature 321:522-525 (1986); Riechmann et al., Nature 332:323-329 (1988); и Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596 (1992).

Термин "мультиспецифичное антитело" используется в самом широком смысле и, в частности, включает антитело, содержащее вариабельный домен тяжелой цепи (V_H) и вариабельный домен легкой цепи (V_L), при этом единица V_HV_L обладает полиэпитопной специфичностью (т.е. способна связывать два разных эпитопа на одной биологической молекуле или каждый эпитоп на другой биологической молекуле). Такие мультиспецифичные антитела включают, в качестве неограничивающих примеров, полноразмерные антитела, антитела, имеющие два или более доменов V_L и V_H, фрагменты антител, такие как Fab, Fv, dsFv, scFv, диатела, биспецифичные диатела и триатела, фрагменты антител, ковалентно или нековалентно сшитые.

"Полиэпитопная специфичность" означает способность специфично связываться с двумя или более различными эпитопами на той же или другой(их) мишени(ях).

"Моноспецифичный" означает способность связываться только с одним эпитопом. Согласно одному из вариантов, мультиспецифичное антитело в форме IgG1 связывается с каждым эпитопом с аффинностью от 5 мкМ до 0,001 пМ, от 3 мкМ до 0,001 пМ, от 1 мкМ до 0,001 пМ, от 0,5 мкМ до 0,001 пМ или от 0,1 мкМ до 0,001 пМ.

"Антитело с перекрестной реактивностью" - это антитело, которое распознает идентичные или схожие эпитопы на более чем одном антигене. Таким образом, антитела с перекрестной реактивностью по настоящему изобретению распознают идентичные или схожие эпитопы, присутствующие как на IL-17A, так и на IL-17F. В одном из вариантов антитело с перекрестной реактивностью использует тот же или в существенной мере тот же паратоп для связывания как с IL-17A, так и с IL-17F. Предпочтительно, антитела с перекрестной реактивностью в этом документе также блокируют функцию (активность) как IL-17A, так и IL-17F.

Термин "паратоп" применяется в этом документе для обозначения части антитела, которая связывается с целевым антигеном.

"Видоспецифичное (зависимое) антитело", например антитело млекопитающего против IL-17A/F, это антитело, которое обладает более сильной аффинностью связывания к антигену из первого вида млекопитающих, чем к гомологу этого антигена из второго вида млекопитающих. Стандартно, видоспецифичное антитело "специфично связывается" с антигеном человека (т.е. имеет значение аффинности связывания (Kd) не более чем примерно 1×10^-7 M, предпочтительно, не более чем примерно 1×10^-8 M и наиболее предпочтительно, не более чем примерно 1×10^-9 M), но обладает аффинностью связывания с гомологом антигена из второго вида млекопитающего, отличного от человека, которая, по меньшей мере, примерно в 50 раз, или, по меньшей мере, примерно в 500 раз, или, по меньшей мере, примерно в 1000 раз слабее, чем его аффинность связывания с антигеном человека. Видоспецифичное антитело может принадлежать к любому из различных типов антител, указанных выше, но предпочтительно является гуманизированным антителом или антителом человека.

Антитело, "которое связывается" с рассматриваемым антигеном, - это антитело, которое связывается с антигеном с существенной аффинностью таким образом, что это антитело полезно в качестве диагностического и/или терапевтического агента при целевом воздействии на клетки или ткани, экспрессирующие антиген, и не обладает существенной перекрестной специфичностью в отношении других белков. В таких вариантах воплощения степень связывания антитела с "нецелевым" белком будет равна менее чем примерно 10% от связывания антитела с его конкретным целевым белком, согласно определению методом флуоресцентно-активированного клеточного сортинга (FACS) или радиоиммунопреципитацией (РИА). По отношению к связыванию антитела с целевой молекулой, термин "специфическое связывание" или "специфично связывается с" или является "специфичным к" конкретному полипептиду или эпитопу на конкретном целевом полипептиде означает связывание, которое измеримо отличается от неспецифичного взаимодействия. Специфичное связывание может быть измерено, например, путем определения связывания молекулы, в сравнении со связыванием контрольной молекулы, которой обычно является молекула со схожей структурой, которая не обладает связывающей активностью. Например, специфичное связывание может быть определено по конкуренции с контрольной молекулой, которая схожа с целевой, например, при избытке немеченой целевой молекулы. В этом случае, на специфичное связывание указывает тот факт, что связывание меченой целевой молекулы с зондом конкурентно ингибируется избытком немеченой целевой молекулы. Термин "специфическое связывание" или "специфично связывается с" или является "специфичным к" конкретному полипептиду или эпитопу на конкретном целевом полипептиде, при использовании в этом документе, может быть использован в отношении, например, молекулы, имеющей Kd в отношении целевой молекулы, по меньшей мере, примерно 10^-4 M, в качестве варианта, по меньшей мере, примерно 10^-5 M, в качестве варианта, по меньшей мере, примерно 10^-6 M, в качестве варианта, по меньшей мере, примерно 10^-7 M, в качестве варианта, по меньшей мере, примерно 10^-8 M, в качестве варианта, по меньшей мере, примерно 10^-9 M, в качестве варианта, по меньшей мере, примерно 10^-10 M, в качестве варианта, по меньшей мере, примерно 10^-11 M, в качестве варианта, по меньшей мере, примерно 10^-12 M или более. В одном из вариантов термин "специфичное связывание" обозначает связывание, при котором молекула связывается с конкретным полипептидом или эпитопом на конкретном полипептиде без существенного связывания с любым другим полипептидом или эпитопом на полипептиде. В предпочтительных вариантах воплощения аффинность специфичного связывания равна, по меньшей мере, примерно 10^-10 М.

"Эффекторные функции" антитела обозначают биологические активности, свойственные области Fc (области Fc с нативной последовательностью или области Fc с вариантом аминокислотной последовательности) антитела, и изменяются в зависимости от изотипа антитела. Примеры эффекта или функций антитела включают: связывание Clq и комплемент-зависимую цитотоксичность; связывание рецептора Fc; антителозависимую клеточно-опосредованную цитотоксичность (АЗКЦ); фагоцитоз; подавление активности рецепторов поверхности клеток (например, рецептора B-клеток); и активацию B-клеток.

"Антителозависимая клеточно-опосредованная цитотоксичность" или "АЗКЦ" означает форму цитотоксичности, при которой секретируемые иммуноглобулины, связанные с рецепторами Fc (FcR), присутствующими на определенных цитотоксических клетках (например, натуральных киллерных (NK) клетках, нейтрофилах и макрофагах), придают этим цитотоксическим эффекторным клеткам способность специфично связываться с несущими антиген целевыми клетками и в дальнейшем убивать целевую клетку посредством цитотоксинов. Антитела "вооружают" цитотоксичные клетки и являются абсолютно необходимыми для такого уничтожения. Первичные клетки для опосредования АЗКЦ, NK-клетки, экспрессируют только FcγRIII, в то время как моноциты экспрессируют FcγRI, FcγRII и FcγRIII. Экспрессия FcR на гематопоэтических клетках резюмирована в таблице 3 на странице 464 в Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol. 9:457-92 (1991). Для оценки активности в АЗКЦ исследуемой молекулы может быть проведен анализ АЗКЦ in vitro, такой как анализ, описанный в патентах США №№ 5500362 или 5821337. Полезные для таких анализов эффекторные клетки включают мононуклеарные клетки периферической крови (МКПК) и натуральные киллерные (NK) клетки. В соответствии с другим вариантом, или дополнительно, активность в АЗКЦ исследуемой молекулы может быть оценена in vivo, например, в животной модели, такой как описана в Clynes et al. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 95:652-656 (1998).

"Рецептор Fc" или "FcR" описывает рецептор, который связывается с областью Fc антитела. Предпочтительным FcR является FcR человека с нативной последовательностью. Более того, предпочтительным FcR является такой рецептор, который связывается с антителом IgG (гамма-рецептор) и включает рецепторы подклассов FcγRI, FcγRII и FcγRIII, в том числе аллельные варианты и формы этих рецепторов, возникшие в результате альтернативного сплайсинга. Рецепторы FcγRII включают FcγRIIA ("активирующий рецептор") и FcγRIIB ("ингибирующий рецептор"), которые обладают схожими аминокислотными последовательностями, различающимися в основном своими цитоплазматическими доменами. Активирующий рецептор FcγRIIA содержит иммунорецепторный, содержащий тирозин, активаторный мотив (ITAM) в своем цитоплазматическом домене. Ингибирующий рецептор FcγRIIB содержит иммунорецепторный, содержащий тирозин, ингибиторный мотив (ITIM) в своем цитоплазматическом домене (см. обзор M. in Daeron, Annu. Rev. Immunol. 15:203-234 (1997)). Обзор FcR дан в Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol. 9:457-492 (1991); Capel et al., Immunomethods 4:25-34 (1994); и de Haas et al., J. Lab. Clin. Med. 126:330-41 (1995). Другие FcR, включая те, которые будут идентифицированы в будущем, тоже включены в термин "FcR" в этом документе. Термин также включает неонатальный рецептор, FcRn, который отвечает за перенос материнских IgG к плоду (Guyer et al., J. Immunol. 117:587 (1976) и Kim et al., J. Immunol. 24:249 (1994)).

"Эффекторные клетки человека" являются лейкоцитами, которые экспрессируют один или несколько FcR и выполняют эффекторные функции. Предпочтительно, клетки экспрессируют, по меньшей мере, FcγRIII и выполняют эффекторную функцию в АЗКЦ. Примеры лейкоцитов человека, которые опосредуют АЗКЦ, включают мононуклеарные клетки периферической крови (МКПК), натуральные киллерные (NK) клетки, моноциты, цитотоксичные T-клетки и нейтрофилы; при этом предпочтительными являются МКПК и NK-клетки. Эффекторные клетки могут быть выделены из природного источника, например из крови.

"Комплемент-зависимая цитотоксичность" или "CDC" обозначает лизис целевой клетки в присутствии комплемента. Активация классического каскада комплемента начинается связыванием первого компонента системы комплемента (Clq) с антителами (соответствующего подкласса), которые связаны со своими соответствующими антигенами. Для оценки активации комплемента может быть проведен CDC-анализ, например, как описано в Gazzano-Santoro et al., Immunol. Methods 202:163 (1996).

Термины "нейтрализовать" и "нейтрализовать активность" применяются в этом документе для обозначения, например, блокировки, предотвращения, снижения, противодействия активности или превращения IL-17 (например, IL-17A и/или IL-17F) в неэффективную молекулу с помощью любого механизма. Следовательно, антагонист может предотвратить акт связывания, необходимый для активации IL-17.

Под "нейтрализующим антителом" понимают молекулу антитела, описанную в этом документе, которая способна блокировать или существенно снизить эффекторную функцию IL-17 (включая IL-17A и/или IL-17F). Например, нейтрализующее антитело может ингибировать или уменьшить способность IL-17 (например, IL-17A и/или IL-17F) взаимодействовать с рецептором IL-17, таким как IL-17Rc. В соответствии с другим вариантом нейтрализующее антитело может ингибировать или уменьшить способность IL-17 блокировать сигнальный путь рецептора IL-17. Нейтрализующее антитело также может иммуноспецифично связываться с IL-17 при иммуноанализе на активность IL-17. "Нейтрализующее антитело" по изобретению отличается тем, что оно сохраняет свою функциональную активность в ситуации как in vitro, так и in vivo.

B. Детальное описание изобретения

1. Терапевтические применения

Инсулинорезистентность - это состояние, при котором присутствие инсулина вызывает сниженный по сравнению с нормой биологический ответ. В клинических терминах, инсулинорезистентность имеется, когда нормальный или повышенный уровни глюкозы в крови сохраняются в присутствии нормального или повышенного уровней инсулина. Она представляет собой, по существу, ингибирование синтеза гликогена, при котором либо базальный, либо стимулированный инсулином синтез гликогена, либо оба этих типа уменьшены до уровней ниже нормы. Инсулинорезистентность играет основную роль при диабете 2 типа, как продемонстрировано тем фактом, что гипергликемия, присутствующая при диабете 2 типа, иногда может быть обращена с помощью диеты или снижения массы, достаточных, очевидно, для восстановления чувствительности периферических тканей к инсулину.

Настоящее изобретение относится к лечению инсулинорезистентности или диабета 2 типа путем введения антагонистов IL-17A и/или IL-17F. Как обсуждалось ранее, антагонист IL-17A и/или IL-17F может являться любой молекулой, которая препятствует функции IL-17A и/или IL-17F, или блокирует или нейтрализует соответствующую активность IL-17A и/или F любым способом, в зависимости от показаний к лечению. Он может предотвращать взаимодействие между IL-17A и/или IL-17F и одним или несколькими его рецепторами, в особенности IL-17Rc. Такие агенты осуществляют это действие различными способами. Например, класс антагонистов, которые нейтрализуют активность IL-17A и/или IL-17F, будет связываться с IL-17A и/или IL-17F, или с рецептором IL-17A и/или IL-17F, в особенности с IL-17Rc, с существенной аффинностью и специфичностью для мешающего воздействия на IL-17A и/или IL-17F.

2. Введение и рецептуры

Антагонист IL-17 может быть введен любым пригодным способом, включая парентеральный способ введения, такой как, в качестве неограничивающих примеров, внутривенный (IV), внутримышечный (IM), подкожный (SC) и интраперитонеальный (IP), а также трансдермальный, буккальный, подъязычный, интраректальный, интраназальный и ингаляционный способы. IV, IM, SC и IP введение могут осуществляться в виде ударной дозы или инфузии, а в случае SC введения может также применяться имплантируемое приспособление для постепенного высвобождения, включая, в качестве неограничивающих примеров, насосы, рецептуры с постепенным высвобождением и механические приспособления. Предпочтительно, введение является системным.

Одним особо предпочтительным способом введения антагониста IL-17 является подкожная инфузия, в частности, с применением дозирующего инфузионного приспособления, такого как насос. Такой насос может быть многоразового или одноразового использования и имплантируемым или наружно прикрепляемым. Насосы для инфузии лекарственных препаратов, успешно применяемые для этой цели, включают, например, насосы, описанные в патентах США №№ 5637095; 5569186; и 5527307. Композиции могут вводиться из такого приспособления постоянно или периодически.

Терапевтические рецептуры антагонистов IL-17, пригодные для хранения, включают смеси антагонистов, имеющих требуемую степень чистоты, с фармацевтически приемлемыми носителями, вспомогательными веществами или стабилизаторами (Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)), в форме лиофилизированных композиций или водных растворов. Приемлемые носители, вспомогательные вещества или стабилизаторы являются нетоксичными для реципиентов в используемых дозировках и концентрациях и включают буферы, такие как фосфатный, цитратный и других органических кислот; антиоксиданты, в том числе аскорбиновую кислоту и метионин; консерванты (такие как октадецилдиметилбензил аммония хлорид; гексаметониум хлорид; бензалкониум хлорид, бензетониум хлорид; фенол, бутиловый или бензиловый спирт; алкилпарабены, такие как метил- или пропилпарабен; катехол; резорцинол; циклогексанол; 3-пентанол и m-крезол); низкомолекулярные (менее чем примерно 10 остатков) полипептиды; белки, такие как сывороточный альбумин, желатин или иммуноглобулины; гидрофильные полимеры, такие как поливинилпирролидон; аминокислоты, такие как глицин, глутамин, аспарагин, гистидин, аргинин или лизин; моносахариды, дисахариды и другие углеводы, включая глюкозу, маннозу или декстрины; хелатирующие агенты, такие как ЭДТА; сахара, такие как сахароза, маннитол, трегалоза или сорбитол; солеобразующие противоионы, такие как натрий; комплексы с металлами (например, комплексы Zn с белками); и/или неионные поверхностно-активные вещества, такие как TWEENT™, PLURONICS™ или полиэтиленгликоль (ПЭГ). Предпочтительные рецептуры лиофилизированных антител против IL-17 описаны в WO 97/04801. Эти композиции содержат антагонист IL-17, включающий от примерно 0,1 до 90% по массе активного антагониста, предпочтительно в растворимой форме, и в основном от примерно 10 до 30%.

Активные ингредиенты также могут быть заключены в микрокапсулы, приготовленные, например, с помощью методики коацервации или путем полимеризации на границе фаз, например, гидроксиметилцеллюлозные или желатиновые микрокапсулы и поли-(метилметацетатные) микрокапсулы, соответственно, в коллоидные системы доставки лекарственного средства (например, липосомы, альбуминовые микросферы, микроэмульсии, наночастицы и нанокапсулы) или в макроэмульсии. Такие способы описаны в Remington's Pharmaceutical Sciences, выше.

Антагонисты IL-17A и/или IL-17F, такие как антитела против IL-17, описанные в этом документе, также могут быть приготовлены в виде иммунолипосом. Липосомы, содержащие антитело, приготавливают способами, известными в данной области, такими как описанные в Epstein et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82:3688 (1985); Hwang et al., Proc. Natl Acad. Sci. USA, 77:4030 (1980); патентах США №№ 4485045 и 4544545; и WO97/38731, опубликованном 23 октября 1997 г. Липосомы с увеличенным временем циркуляции описаны в патенте США № 5013556.

В частности, полезные липосомы могут быть получены способом обращенно-фазового выпаривания с липидной композицией, содержащей фосфатидилхолин, холестерин и модифицированный ПЭГ фосфатидилэтаноламин (PEG-PE). Липосомы продавливают сквозь фильтры с заданным размером пор для получения липосом с требуемым диаметром. Fab'-фрагменты антитела по настоящему изобретению могут быть конъюгированы с липосомами, как описано в Martin et al., J. Biol. Chem., 257:286-288 (1982), путем реакции дисульфидного обмена.

Могут быть приготовлены рецептуры пролонгированного действия. Пригодные примеры препаратов пролонгированного действия включают полупроницаемые матриксы прочных гидрофобных полимеров, содержащие антитело, и эти матриксы находятся в виде оформленных частиц, например пленок или микрокапсул. Примеры матриксов пролонгированного действия включают полиэфиры, гидрогели (например, поли(2-гидроксиэтилметакрилат) или поливиниловый спирт), полилактиды (патент США № 3773919), сополимеры L-глутаминовой кислоты и γ-этил-L-глутамата, недеградируемый этиленвинилацетат, деградируемые сополимеры молочной кислоты и гликолевой кислоты, такие как LUPRON DEPOT™ (инъекционные микросферы, состоящие из сополимера молочной кислоты и гликолевой кислоты и лейпролида ацетат), и поли-D-(-)-3-гидроксимасляная кислота.

Любой из специфичных антагонистов может быть соединен с белком-носителем для увеличения периода полувыведения из сыворотки терапевтического антагониста. Например, растворимые химеры иммуноглобулинов, такие как описаны в этом документе, могут быть получены для каждого специфичного антагониста IL-17 или его антагонистической части, как описано в патенте США № 5116964. Химеры иммуноглобулинов легко могут быть очищены с применением хроматографии на сефарозе с IgG-связывающим белком A. Химеры обладают способностью образовывать иммуноглобулиноподобные димеры с одновременным повышением авидности и периода полувыведения из сыворотки.

Рецептуры, которые будут применяться для введения in vivo, должны быть стерильными. Это легко достижимо путем фильтрации через стерильные мембранные фильтры.

Рецептура, описанная в этом документе, также может содержать более одного активного соединения, если это необходимо для конкретного показания к лечению, предпочтительно, таковые с комплементарными активностями, которые не оказывают друг на друга нежелательного влияния. Также, такое активное соединение может вводиться млекопитающему, подвергнутому лечению, отдельно.

Например, в случае таких показаний может быть желательно дополнительно обеспечить агент для лечения инсулинорезистентности. Кроме того, диабет 2 типа, при котором не происходит ответа на соблюдение диеты и снижение веса, может дать ответ на терапию с применением производных сульфонилмочевины совместно с антагонистом IL-17. Класс лекарственных средств на основе сульфонилмочевины включает ацетогексамид, хлорпропамид, толазамид, толбутамид, глибенкламид, глибомурид, гликлазид, глипизид, гликвидон и глимидин. Другие агенты, применяемые для этой цели, включают аутоиммунный реагент, сенсибилизирующий к инсулину агент, такой как соединения глитазонового семейства, в том числе таковые, описанные в патенте США № 5753681, такие как троглитазон, пиоглитазон, энглитазон и родственные соединения, антагонисты ингибитора тирозинкиназы инсулинового рецептора (патенты США №№ 5939269 и 5939269), комплекс IGF-1/IGFBP-3 (патент США № 6040292), антагонисты функции TNF-альфа (патент США № 6015558), агент высвобождения гормона роста (патент США № 5939387) и антитела к амилину (патент США № 5942227). Другие соединения, которые могут применяться, включают инсулин (один или несколько различных инсулинов), миметики инсулина, такие как низкомолекулярный инсулин, аналоги инсулина, указанные выше, или их физиологически активные фрагменты, родственные инсулину пептиды, как указано выше, или их аналоги или фрагменты. Агенты дополнительно описаны в определениях, приведенных выше.

Для лечения гипоинсулинемии, например, инсулин могут вводить вместе или по отдельности с антагонистом IL-17.

Такие дополнительные молекулы должным образом присутствуют или вводятся в сочетании в количествах, которые являются эффективными для намеченной цели, обычно в меньших количествах, чем применяются при их введении отдельно, без антагониста IL-17. Если они находятся в смеси, они могут входить в состав смеси в количествах, определенных в соответствии, например, с типом показания, субъектом, возрастом и массой тела субъекта, текущим клиническим статусом, временем введения, лекарственной формой, способом введения и т.д. Например, в этом документе сопутствующее лекарственное средство применяется предпочтительно в соотношении примерно от 0,0001 до 10000 массовых долей на одну массовую долю антагониста IL-17.

Применение антагониста IL-17 в сочетании с инсулином позволяет снизить дозу инсулина по сравнению с дозой при введении только одного инсулина. Следовательно, снижается риск осложнений на кровеносные сосуды и индукции гипогликемии, которые могут представлять собой проблему при введении больших количеств инсулина. Для введения инсулина взрослому пациенту с диабетом (с массой тела примерно 50 кг), например, ежедневная доза обычно составляет примерно от 10 до 100 Е (Единиц), предпочтительно от 10 до 80 Е, но может быть меньше, в соответствии с указаниями врача. Для введения усилителей секреции инсулина тому же типу пациента, например, ежедневная доза составляет предпочтительно примерно от 0,1 до 1000 мг, более предпочтительно примерно от 1 до 100 мг. Для введения бигуанидов тому же типу пациента, например, ежедневная доза составляет предпочтительно примерно от 10 до 2500 мг, более предпочтительно примерно от 100 до 1000 мг. Для введения ингибиторов α-глюкозидазы тому же типу пациента, например, ежедневная доза составляет предпочтительно примерно от 0,1 до 400 мг, более предпочтительно примерно от 0,6 до 300 мг. Введение эргосета, прамлинтида, лептина, BAY-27-9955 или T-1095 таким пациентам может быть эффективным при дозировке предпочтительно примерно от 0,1 до 2500 мг, более предпочтительно примерно от 0,5 до 1000 мг. Все вышеперечисленные дозы могут вводиться однократно или несколько раз в день.

Антагонист IL-17 также может вводиться совместно с пригодным немедикаментозным лечением инсулинорезистентности, таким как трансплантация поджелудочной железы.

Дозировки антагониста, вводимые млекопитающему с инсулинорезистентностью или гипоинсулинемией, будут определены врачом с учетом сопутствующих обстоятельств, включая состояние млекопитающего, тип антагониста, тип показания и выбранный способ введения. Дозировка предпочтительно находится на достаточно низком уровне, чтобы не вызвать прибавку массы тела в сколь либо существенной степени, и этот уровень может быть определен врачом. Глитазоны, утвержденные для лечения диабета 2 типа у человека (росиглитазон/Авандия и пиоглитазон/Актос), вызывают некоторую прибавку массы тела, тем не менее, их применяют, несмотря на побочные эффекты, так как доказано, что они полезны благодаря своему терапевтическому индексу. Диапазоны дозировок, представленные в этом документе, не имеют намерения ограничить рамки применения настоящего изобретения каким-либо образом. "Терапевтически эффективное" количество для целей, указанных в этом документе, в отношении гипоинсулинемии и инсулинорезистентности, определяется вышеуказанными факторами, но обычно составляет примерно от 0,01 до 100 мг/кг массы тела/день. Предпочтительная доза составляет примерно 0,1-50 мг/кг/день, более предпочтительно примерно от 0,1 до 25 мг/кг/день. Еще более предпочтительно, при введении антагониста IL-17 ежедневно, внутривенная или внутримышечная доза для человека составляет примерно от 0,3 до 10 мг/кг массы тела в день, более предпочтительно примерно от 0,5 до 5 мг/кг. Для подкожного введения доза, предпочтительно, выше, чем терапевтически эквивалентная доза, вводимая внутривенно или внутримышечно. Предпочтительно, ежедневная подкожная доза для человека составляет примерно от 0,3 до 20 мг/кг, более предпочтительно примерно от 0,5 до 5 мг/кг для обоих показаний.

Настоящее изобретение предполагает различные режимы дозирования. Настоящее изобретение включает непрерывный график введения доз, при котором антагонист IL-17 вводится регулярно (ежедневно, еженедельно или ежемесячно, в зависимости от дозы и лекарственной формы), без существенных перерывов. Предпочтительные непрерывные режимы дозирования включают ежедневную непрерывную инфузию, когда антагонист IL-17 вводят инфузией каждый день, и непрерывные режимы введения ударных доз, когда антагонист IL-17 вводят, по меньшей мере, один раз в день путем инъекции ударной дозы вещества или ингаляционным или интраназальным способами. Настоящее изобретение также включает прерывистые режимы дозирования. Точные параметры прерывистых режимов введения будут варьировать в соответствии с рецептурой, способом доставки и клиническими потребностями млекопитающего, получающего лечение. Например, если антагонист IL-17 вводят путем инфузии, режимы введения могут содержать первый период введения, за которым следует второй период введения, в ходе которого антагонист IL-17 не вводится, и этот период больше, равен или меньше, чем первый период.

При введении путем инъекции ударной дозы вещества, в особенности инъекции ударной дозы вещества в случае рецептуры с замедленным высвобождением, режимы дозирования могут также быть непрерывными в том смысле, что антагонист IL-17 вводят ежедневно, или могут быть прерывистыми, с первым и вторым периодами, как описано выше.

Непрерывные и прерывистые режимы введения любым способом также включают режимы дозирования, при которых доза изменяется в течение первого периода таким образом, что, например, в начале первого периода доза низкая и возрастает вплоть до конца первого периода, доза первоначально высокая и снижается в течение первого периода, доза изначально низкая, возрастает до пикового уровня, а затем снижается вплоть до конца первого периода, и любые комбинации этого.

Эффекты от введения антагониста IL-17 на инсулинорезистентность могут быть измерены с применением различных способов, известных в данной области. Наиболее часто смягчение эффектов диабета будет приводить к улучшенному гликемическому контролю (измеряемому путем серийных анализов уровня глюкозы в крови), снижению потребности в инсулине для поддержания хорошего гликемического контроля, снижению уровня гликозилированного гемоглобина, снижению уровня улучшенных конечных продуктов гликозилирования (AGE) в крови, снижению утренней гипергликемии, снижению кетоацидоза и улучшению липидного профиля. В качестве варианта, введение антагониста IL-17 может приводить к стабилизации симптомов диабета, о чем свидетельствуют снижение уровней глюкозы в крови, снижение потребности в инсулине, снижение содержания гликозилированного гемоглобина и AGE в крови, смягчение сосудистых, почечных, нейрональных и ретинальных осложнений, смягчение осложнений беременности и улучшение липидного профиля.

Эффект снижения содержания сахара в крови антагонистом IL-17 может быть оценен путем определения концентрации глюкозы или Hb (гемоглобина) A_1c в плазме венозной крови у субъекта до и после введения, с последующим сравнением полученной концентрации перед введением и после введения. HbA_1c обозначает гликозилированный гемоглобин, который постепенно образуется в ответ на концентрацию глюкозы в крови. Следовательно, как полагают, HbA_1c важен в качестве показателя контроля сахара в крови, который мало подвержен влиянию быстрых изменений содержания сахара в крови у пациентов с диабетом.

Доказательство лечения гипоинсулинемии демонстрируют, например, по увеличению циркулирующих уровней инсулина у пациентов.

Дозировка для исправления повреждений и регенерации мышц составляет обычно примерно от 0,01 до 100 мг/кг массы тела, более предпочтительно от 1 до 10 мг/кг, в зависимости от состояния пациента, того, какой специфичный тип исправления повреждения мышц необходим, и т.д. Режим дозирования соответствует стандартному режиму, применяемому клиницистами в этой области. Доказательство исправления повреждений и регенерации мышц продемонстрировано с помощью испытаний для определения различных показателей, хорошо известных в данной области, включая анализ пролиферации и дифференцировки мышечных клеток и испытание с полимеразной цепной реакцией (см., например, Best et al., J. Orthop. Res., 19:565-572 (2001), где приводится анализ изменений содержания мРНК продуктов генов в миобластах и фибробластах при лечении скелетной мышцы кролика с применением количественного метода обратной транскрипции с последующей полимеразной цепной реакцией).

3. Изделия и наборы

Настоящее изобретение также направлено на создание наборов для лечения инсулинорезистентности и гипоинсулинемии и для исправления повреждений и регенерации мышц. Наборы, согласно изобретению, содержат один или несколько контейнеров антагониста IL-17, предпочтительно антитела, в сочетании с набором инструкций, обычно письменных инструкций, относящихся к применению и дозировке антагониста IL-17 для лечения инсулинорезистентности или гипоинсулинемии, или любого другого целевого заболевания, ассоциированного с инсулинорезистентностью. Инструкции, включенные в набор, обычно содержат информацию о дозировке, режиме дозирования и способе введения с целью лечения целевого заболевания, такого как инсулинорезистентность или гипоинсулинемическое нарушение. Контейнеры антагониста IL-17 могут являться разовыми дозами, нерасфасованными упаковками (например, многодозовыми упаковками) или частичными дозами.

Изделие включает контейнер и этикетку или листовку-вкладыш в упаковке, на или вместе с контейнером. Пригодные контейнеры включают, например, флаконы, ампулы, шприцы и т.д. Контейнеры могут быть сделаны из различных материалов, таких как стекло или пластик. Контейнер содержит композицию, которая эффективна для лечения состояния, и может иметь входное отверстие для стерильного доступа (например, контейнер может являться пакетом с раствором для внутривенного вливания или флаконом с пробкой, которая может быть проткнута иглой для подкожных инъекций). По меньшей мере, один активный агент в композиции является антагонистом IL-17 по данному изобретению. Этикетка или листовка-вкладыш в упаковке указывает, что композиция применяется для лечения конкретного состояния. Этикетка или листовка-вкладыш в упаковке дополнительно будет содержать инструкции по введению композиции антител пациенту. Также предполагаются изделия и наборы, содержащие комбинированные лекарственные препараты, описанные в этом документе.

Листовка-вкладыш в упаковке относится к инструкциям, обычно включаемым в коммерческие упаковки терапевтических изделий, содержащим информацию о показаниях, применении, дозировке, введении, противопоказаниях и/или предостережениях, относящихся к применению таких терапевтических изделий.

Кроме того, изделие может дополнительно содержать второй контейнер с фармацевтически приемлемым буферным раствором, таким как бактериостатическая вода для инъекций (BWFI), фосфатно-солевой буфер, раствор Рингера и раствор декстрозы. Оно может дополнительно содержать другие материалы, необходимые с коммерческой или пользовательской точки зрения, в том числе другие буферные растворы, разбавители, фильтры, иглы и шприцы.

4. Приготовление антител

Моноклональные антитела

Моноклональные антитела могут быть приготовлены с применением гибридомного способа, впервые описанного в Kohler et al., Nature, 256:495 (1975), или могут быть приготовлены способами с применением рекомбинантных ДНК (патент США № 4816567). При гибридомном способе мышь или другое пригодное животное-хозяина, такое как хомяк или макак, иммунизируют, как описано выше, чтобы извлечь лимфоциты, продуцирующие или способные продуцировать антитела, которые будут специфично связываться с белком, примененным для иммунизации. В соответствии с другим вариантом лимфоциты могут быть иммунизированы in vitro. После этого лимфоциты сливают с миеломными клетками с применением пригодного агента, вызывающего слияние клеток, такого как полиэтиленгликоль, с образованием гибридомной клетки (Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, pp.59-103 (Academic Press, 1986)).

Приготовленные таким образом гибридомные клетки высеивают и выращивают в пригодной культуральной среде, которая предпочтительно содержит одну или несколько субстанций, ингибирующих рост или выживание неслитых, исходных миеломных клеток. Например, если в исходных миеломных клетках отсутствует фермент гипоксантин-гуанин-фосфорибозилтрансфераза (HGPRT или HPRT), культуральная среда для гибридом будет в типичном случае содержать гипоксантин, аминоптерин и тимидин (HAT-среда) - субстанции, которые предотвращают рост дефектных по HGPRT клеток.

Предпочтительными миеломными клетками являются клетки, которые эффективно сливаются, поддерживают стабильную высокую продукцию антитела отобранными клетками, продуцирующими антитела, и чувствительны к такой среде, как HAT-среда. Помимо этого, предпочтительными линиями миелоидных клеток являются линии миеломы мыши, такие как полученные из опухолей мышей MOPC-21 и MPC-11, доступные в Salk Institute Cell Distribution Center, Сан-Диего, Калифорния, США, и клетки SP-2 или X63-Ag8-653, доступные в American Type Culture Collection, Роквилл, Мэриленд, США. Также были описаны клеточные линии миеломы человека и гетеромиеломы мыши и человека для получения моноклональных антител человека (Kozbor, J. Immunol., 133:3001 (1984); Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp. 51-63 (Marcel Dekker, Inc., New York, 1987)).

В культуральной среде, в которой выращивают гибридомные клетки, проводят количественное определение продукции моноклональных антител, выработанных против антигена. Предпочтительно, специфичность связывания моноклональных антител, продуцированных гибридомными клетками, определяют путем иммунопреципитации или анализа связывания in vitro, такого как радиоиммуноанализ (РИА) или твердофазный иммуноферментный анализ (ELISA).

После идентификации гибридомных клеток, продуцирующих антитела с требуемой специфичностью, аффинностью и/или активностью, клоны могут быть подвергнуты субклонированию методами серийных разведений и выращены стандартными способами (Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, pp.59-103 (Academic Press, 1986)). Пригодные для этой цели культуральные среды включают, например, среду D-MEM или RPMI-1640. Кроме того, гибридомные клетки могут выращиваться in vivo в виде асцитных опухолей у животного.

Моноклональные антитела, секретируемые субклонами, соответствующим образом выделяют из культуральной среды, асцитной жидкости или сыворотки с применением стандартных способов очистки иммуноглобулинов, таких как, например, хроматография на белок A-сефарозе, гидроксиапатитах, гель-электрофорез, диализ или аффинная хроматография.

ДНК, кодирующая моноклональные антитела, может быть легко выделена и секвенирована с применением стандартных способов (например, с применением олигонуклеотидных зондов, способных специфично связываться с генами, кодирующими тяжелые и легкие цепи моноклональных антител). Гибридомные клетки служат предпочтительным источником такой ДНК. После выделения ДНК может быть помещена в экспрессионные векторы, которыми затем трансфецируют клетки-хозяева, такие как клетки E. coli, клетки COS обезьяны, клетки яичника китайского хомячка (CHO) или миеломные клетки, которые в ином случае не продуцируют иммуноглобулиновые белки, для обеспечения синтеза моноклональных антител в рекомбинантных клетках-хозяевах. Рекомбинантное получение антител будет более подробно описано далее.

В дополнительном варианте воплощения антитела или фрагменты антител могут быть изолированы из фаговых библиотек антител, полученных с применением способов, описанных в McCafferty et al., Nature, 348:552-554(1990).

Clackson et al., Nature, 352:624-628 (1991) и Marks et al., J. Mol. Biol., 222:581-597 (1991) описывают выделение антител мыши и человека, соответственно, с применением фаговых библиотек. Последующие публикации описывают получение высокоаффинных (в нМ диапазоне) антител человека с помощью комбинирования вариабельных доменов легкой и тяжелой цепей (Marks et al., Bio/Technology, 10:779-783 (1992)), а также комбинаторной инфекции и in vivo рекомбинации в качестве стратегии для конструирования очень больших фаговых библиотек (Waterhouse et al., Nuc. Acids. Res., 21:2265-2266 (1993)). Таким образом, эти способы являются пригодными альтернативами традиционным гибридомным способам получения моноклональных антител для выделения моноклональных антител.

ДНК также может быть модифицирована, например, путем замены гомологичных последовательностей мыши на кодирующую последовательность консервативных доменов тяжелой и легкой цепи человека (патент США № 4816567; Morrison, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6851 (1984)), или ковалентным присоединением к кодирующей иммуноглобулин последовательности всей или части последовательности, кодирующей неиммуноглобулиновый полипептид.

В типичном случае, такие неиммуноглобулиновые полипептиды замещают консервативные домены антитела, или они замещают вариабельные домены одного антигенсвязывающего сайта антитела для создания химерного бивалентного антитела, содержащего один антигенсвязывающий сайт со специфичностью к одному антигену и другой антигенсвязывающий сайт со специфичностью к другому антигену.

Гуманизированные антитела и антитела человека

Гуманизированное антитело содержит один или несколько аминокислотных остатков, внедренных в него из источника, отличного от клеток человека. Эти не принадлежащие человеку аминокислотные остатки часто называют "импортируемыми" остатками, которые обычно взяты из "импортируемого" вариабельного домена. Гуманизирование в существенной мере может быть проведено согласно способу Винтера с соавторами (Jones et al., Nature, 321:522-525 (1986); Riechmann et al., Nature, 332:323-327 (1988); Verhoeyen et al., Science, 239:1534-1536 (1988)) путем замены CDR или последовательностей CDR грызунов на соответствующие последовательности антитела человека. Соответственно, такие "гуманизированные" антитела являются химерными антителами (патент США № 4816567), при этом в существенной мере менее чем интактный вариабельный домен человека был заменен соответствующей последовательностью из вида, отличного от человека. Практически, гуманизированные антитела в типичном случае являются антителами человека, в которых остатки CDR и, возможно, некоторые остатки FR замещены остатками из аналогичных сайтов антител грызунов.

Выбор вариабельных доменов человека, как в легкой, так и в тяжелой цепи, который будет делаться при получении гуманизированных антител, очень важен для снижения антигенности. В соответствии с так называемым методом "наиболее соответствующего", проводят скрининг последовательности вариабельного домена антитела грызуна против полной библиотеки известных последовательностей вариабельных доменов человека. Последовательность человека, которая наиболее близка к таковой грызуна, затем принимают как каркасную область (FR) человека для гуманизированного антитела (Sims et al., J. Immunol., 151:2296 (1993); Chothia et al., J. Mol. Biol., 196:901 (1987)). При другом способе применяют особую каркасную область, происходящую от консенсусной последовательности всех антител человека с конкретной подгруппой легкой или тяжелой цепей. Одна и та же каркасная область может быть применена для нескольких различных гуманизированных антител (Carter et al., Proc. Natl. Acad Sci. USA, 89:4285 (1992); Presta et al., J. Immnol., 151:2623 (1993)).

Также важно, чтобы антитела были гуманизированы с сохранением высокой аффинности к антигену и других благоприятных биологических свойств. Для достижения этой цели, в соответствии с предпочтительным способом, гуманизированные антитела приготовляют путем анализа исходных последовательностей и различных умозрительных гуманизированных продуктов с применением пространственных моделей исходной и гуманизированной последовательностей. Пространственные модели иммуноглобулинов общедоступны и известны для специалиста в данной области. Доступны компьютерные программы, которые иллюстрируют и отображают вероятные пространственные конформационные структуры выбранных кандидатных иммуноглобулиновых последовательностей. Исследование этих отображений позволяет проводить анализ возможной роли остатков в функционировании кандидатной иммуноглобулиновой последовательности, т.е. анализ остатков, которые влияют на способность кандидатного иммуноглобулина связываться со своим антигеном. Таким образом, остатки FR могут быть выбраны и скомбинированы из реципиентной и импортируемой последовательностей так, что будут достигнуты необходимые характеристики антитела, такие как повышенная аффинность к целевому(ым) антигену(ам). В целом, остатки CDR напрямую и наиболее существенно вовлечены в воздействие на связывание антигена.

В соответствии с другим вариантом воплощения, в настоящее время возможно получение трансгенных животных (например, мышей), которые способны, после иммунизации, продуцировать полный набор антител человека в отсутствие продукции эндогенных иммуноглобулинов. Например, было описано, что гомозиготная делеция гена соединительной области тяжелой цепи антител (J.sub.H) у химерных и с мутациями в клетках зародышевой линии мышей приводит к полному ингибированию продукции эндогенных антител. Перенос набора иммуноглобулиновых генов из клеток зародышевой линии человека таким мышам с мутациями в клетках зародышевой линии приведет к продукции антител человека после введения антигена. См., например, Jakobovits et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:2551 (1993); Jakobovits et al., Nature, 362:255-258 (1993); Bruggermann et al., Year in Immuno., 7:33 (1993); и Duchosal et al. Nature 355:258 (1992). Антитела человека также могут происходить из библиотек на основе фагового дисплея (Hoogenboom et al., J. Mol. Biol., 227:381 (1991); Marks et al., J. Mol. Biol., 222:581-597 (1991); Vaughan et al. Nature Biotech 14:309 (1996)). Получение антител человека из библиотек антител на основе фагового дисплея более подробно описано далее.

Фрагменты антител

Различные способы были разработаны для получения фрагментов антител. Традиционно эти фрагменты получали протеолитическим расщеплением интактных антител (см., например, Morimoto et al., Journal of Biochemical and Biophysical Methods 24:107-117 (1992) и Brennan et al., Science, 229:81 (1985)). Однако сейчас эти фрагменты могут быть получены напрямую из рекомбинантных клеток-хозяев. Например, фрагменты антител могут быть выделены из фаговых библиотек антител, как обсуждалось выше. В соответствии с другим вариантом, фрагменты Fab'-SH могут быть напрямую извлечены из E. coli и химически соединены с образованием фрагментов F(ab')₂ (Carter et al., Bio/Technology 10:163-167 (1992)). В другом варианте, как описано в примере ниже, F(ab')₂ образуют с применением белка с лейциновой застежкой GCN4, способствующего сборке молекулы F(ab')₂. В соответствии с другим способом, фрагменты F(ab')₂ могут быть выделены напрямую из культуры рекомбинантных клеток-хозяев. Другие способы получения фрагментов антител будут очевидны для специалиста в данной области. В других вариантах воплощения выбранное антитело является одноцепочечным фрагментом Fv (scFv). См. WO 93/16185.

Мультиспецифичные антитела

Мультиспецифичные антитела обладают специфичностью связывания, по меньшей мере, с двумя различными эпитопами, при этом эпитопы обычно принадлежат разным антигенам. Хотя такие молекулы в норме будут связываться только с двумя различными эпитопами (т.е. являться биспецифичными антителами, BsAb), антитела с дополнительными специфичностями, такие как триспецифичные антитела, включены в это выражение при его использовании в этом документе. Способы получения биспецифичных антител известны в данной области. Традиционное получение полноразмерных биспецифичных антител основано на совместной экспрессии двух пар тяжелых и легких цепей иммуноглобулинов, при этом две цепи имеют разные специфичности (Millstein et al., Nature, 305:537-539 (1983)). Благодаря случайному комбинированию тяжелых и легких цепей иммуноглобулинов, такие гибридомы (квадромы) продуцируют потенциальную смесь из 10 различных молекул антител, из которых только одна имеет правильную биспецифичную структуру. Очистка правильной молекулы, которую обычно проводят с помощью этапов аффинной хроматографии, достаточно сложна, а выход продукта низкий. Подобные способы описаны в WO 93/08829 и в Traunecker et al., EMBO J., 10:3655-3659 (1991). В соответствии с другим способом вариабельные домены антител с требуемыми специфичностями связывания (сайтами связывания антитела с антигеном) сшивают с последовательностями консервативных доменов иммуноглобулина. Сшивку предпочтительно проводят с консервативным доменом тяжелой цепи иммуноглобулина, содержащим, по меньшей мере, часть шарнирной, CH2 и CH3 областей. Предпочтительно, чтобы первая консервативная область тяжелой цепи (CH1), содержащая сайт, необходимый для связывания легкой цепи, присутствовала, по меньшей мере, на одной из сшивок. ДНК, кодирующие сшивки тяжелых цепей иммуноглобулинов, и, если необходимо, легкую цепь иммуноглобулина, внедряют в отдельные экспрессионные вектора и совместно трансфецируют ими пригодный организм-хозяина. Это обеспечивает большую гибкость при корректировке соотношения относительно друг друга трех полипептидных фрагментов в вариантах воплощения, когда неравные доли трех полипептидных цепей, применяемых в конструкции, обеспечивают оптимальный выход. Возможно, однако, вставить кодирующие последовательности для двух или всех трех полипептидных цепей в один экспрессионный вектор, когда экспрессия, по меньшей мере, двух полипептидных цепей в равном соотношении приводит к высокому выходу или когда соотношения не играют существенной роли.

В предпочтительном варианте воплощения этого способа биспецифичные антитела состоят из гибридной тяжелой цепи иммуноглобулина с первой специфичностью связывания на одном плече и гибридной пары тяжелой цепи и легкой цепи иммуноглобулина (обеспечивающей вторую специфичность связывания) на другом плече. Было обнаружено, что эта асимметричная структура способствует отделению нужного биспецифичного соединения от нежелательных комбинаций иммуноглобулиновых цепей, так как присутствие легкой цепи иммуноглобулина только в одной половине биспецифичной молекулы обеспечивает легкий способ разделения. Этот способ описан в WO 94/04690. Для более подробного описания получения биспецифичных антител см., например, Suresh et al., Methods in Enzymology, 121:210 (1986).

В соответствии с другим способом, описанным в WO96/27011, область взаимодействия между парой молекул антитела может быть сконструирована таким образом, чтобы максимизировать процент гетеродимеров, которые извлекают из культуры рекомбинантных клеток. Предпочтительная область взаимодействия содержит, по меньшей мере, часть домена CH3 из консервативного домена антитела. При этом способе одна или несколько малых боковых цепей аминокислот на поверхности взаимодействия первой молекулы антитела замещены более крупными боковыми цепями (например, тирозином или триптофаном). Компенсирующие "полости" идентичного или схожего с большими боковыми цепями (цепью) размера создают на поверхности взаимодействия второй молекулы антитела путем замещения больших боковых цепей аминокислот на более мелкие (например, аланин или треонин). Это обеспечивает механизм для увеличения выхода гетеродимера по отношению к нежелательным конечным продуктам, таким как гомодимеры.

Биспецифичные антитела включают поперечно сшитые или "гетероконъюгированные" антитела. Например, одно из антител в гетероконъюгате может быть соединено с авидином, другое с биотином. Такие антитела были, например, предложены для нацеливания клеток иммунной системы на нежелательные клетки (патент США № 4676980) и для лечения ВИЧ-инфекции (WO 91/00360, WO 92/200373). Гетероконъюгированные антитела могут быть получены с применением любого стандартного способа поперечной сшивки. Пригодные агенты для поперечной сшивки хорошо известны в данной области и описаны в патенте США № 4676980, вместе с рядом способов поперечной сшивки.

Способы получения биспецифичных антител из фрагментов антител также были описаны в литературе. Например, биспецифичные антитела могут быть приготовлены с применением химической сшивки. Brennan et al., Science 229:81 (1985) описывают способ, при котором интактные антитела протеолитически расщепляют для получения фрагментов F(ab')₂. Эти фрагменты восстанавливают в присутствии дитиолового комплексообразующего агента арсенита натрия для стабилизации соседних дитиолов и предотвращения образования межмолекулярных дисульфидных связей. Образовавшиеся фрагменты Fab' после этого превращают в тионитробензойные (TNB) производные. Одно из производных Fab'-TNB после этого вновь превращают в Fab'-тиол путем восстановления меркаптоэтиламином и смешивают с эквимолярным количеством другого производного Fab'-TNB для образования биспецифичного антитела. Полученные биспецифичные антитела могут применяться в качестве агентов для селективной иммобилизации ферментов.

Фрагменты Fab'-SH также могут быть напрямую извлечены из E. coli и химически соединены с образованием биспецифичных антител. Shalaby et al., J. Exp. Med., 175:217-225 (1992) описывают получение молекулы F(ab')₂ полностью гуманизированного биспецифичного антитела. Каждый фрагмент Fab' по отдельности секретировался клетками E. coli и был подвергнут прямой химической сшивке in vitro с образованием биспецифичного антитела.

Также были описаны различные способы получения и выделения фрагментов биспецифичных антител непосредственно из культуры рекомбинантных клеток. Например, биспецифичные антитела получали с применением лейциновых застежек. Kostelny et al., J. Immunol., 148(5):1547-1553 (1992). Пептиды с лейциновыми застежками из белков Fos и Jun сшили с Fab'-частью двух разных антител с помощью слияния генов. Гомодимеры антител восстановили в шарнирной области для образования мономеров, а потом повторно окислили для образования гетеродимеров антител. Этот способ также может применяться для получения гомодимеров антител. Способ получения "диател", описанный в Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:6444-6448 (1993), обеспечил альтернативный способ приготовления фрагментов биспецифичного антитела. Фрагменты содержат вариабельный домен тяжелой цепи (VH), соединенный с вариабельным доменом легкой цепи (VL) линкером, который слишком короткий для того, чтобы было возможно образование пары между двумя доменами на одной и той же цепи. Соответственно, домены VH и VL одного фрагмента вынуждены образовывать пару с комплементарными доменами VL и VH другого фрагмента, тем самым образуя два антигенсвязывающих сайта. Сообщали также о другом способе получения фрагментов биспецифичного антитела с применением димеров одноцепочечных Fv (sFv). См. Gruber et al., J. Immunol. 152:5368 (1994).

Предполагаются антитела с более чем двумя валентностями. Например, могут быть приготовлены триспецифичные антитела. Tuft et al. J. Immunol. 147:60 (1991).

Конструирование эффекторной функции

Может быть желательно модифицировать антитело по изобретению в отношении эффекторной функции таким образом, чтобы усилить эффективность антитела. Например, в область Fc может быть внедрен цистеиновый остаток (остатки), что сделает возможным образование межцепочечной дисульфидной связи в этой области. Полученное таким образом гомодимерное антитело может обладать улучшенной способностью к интернализации и/или усиленной активностью в комплемент-опосредованной цитотоксичности и антителозависимой клеточно-опосредованной цитотоксичности (АЗКЦ). См. Caron et al., J. Exp Med. 176:1191-1195 (1992) и Shopes, B. J. Immunol. 148:2918-2922 (1992). Гомодимерные антитела с усиленной противоопухолевой активностью также могут быть получены с применением гетеробифункциональных поперечных сшивок, как описано в Wolff et al. Cancer Research 53:2560-2565 (1993). В соответствии с другим вариантом может быть сконструировано антитело, которое содержит две области Fc и благодаря этому может обладать усиленной активностью в лизисе комплемента и АЗКЦ. См. Stevenson et al. Anti-Cancer Drug Design 3:219-230 (1989).

Химеры антитела с эпитопом связывания с рецептором реутилизации

В некоторых вариантах воплощения настоящего изобретения может быть желательно применение фрагмента антитела, а не интактного антитела. В этом случае может быть желательно проведение модификации фрагмента антитела с целью увеличения его периода полувыведения из сыворотки. Это может быть достигнуто, например, путем внедрения эпитопа связывания с рецептором реутилизации во фрагмент антитела (например, путем мутации соответствующей области во фрагменте антитела или внедрения эпитопа в пептидную метку, которую потом сшивают с фрагментом антитела на любом конце или в середине, например, с применением синтеза ДНК или пептидного синтеза).

Эпитоп связывания с рецептором реутилизации предпочтительно содержит область, где любые один или несколько аминокислотных остатков из одной или двух петель домена Fc перенесены в аналогичную позицию фрагмента антитела. Даже более предпочтительно, перенесены три или несколько остатков из одной или двух петель домена Fc. Еще более предпочтительно, эпитоп взят из домена CH2 области Fc (например, из IgG) и перенесен в область CH1, CH3 или V.sub.H, или более чем одну такую область антитела. В соответствии с другим вариантом эпитоп взят из домена CH2 области Fc и перенесен в область CL или в область VL, или в обе области фрагмента антитела.

Другие ковалентные модификации антител

Ковалентные модификации антител находятся в пределах объема настоящего изобретения. Они могут быть осуществлены путем химического синтеза или ферментативного или химического расщепления антитела, если это применимо. Другие типы ковалентных модификаций антитела вводят в молекулу путем реакции целевых аминокислотных остатков антитела с органическим агентом для получения производных, который способен реагировать с выбранными боковыми цепями или N- или C-концевыми остатками. Примеры ковалентных модификаций описаны в патенте США № 5534615, специально включенном в этот документ в качестве ссылки. Предпочтительный тип ковалентной модификации антитела включает сшивку антитела с одним из множества небелковых полимеров, например полиэтиленгликолем, полипропиленгликолем или полиоксиалкиленами, способом, изложенным в патентах США №№ 4640835; 4496689; 4301144; 4670417; 4791192 или 4179337.

Получение антител из синтетических фаговых библиотек антител

В предпочтительном варианте воплощения настоящее изобретение направлено на создание способа получения и отбора новых антител с применением уникального способа фагового дисплея. Способ включает получение синтетических фаговых библиотек антител на основе одиночной матрицы каркасной области, дизайн достаточного разнообразия в пределах вариабельных доменов, получение дисплея полипептидов, имеющих различные вариабельные домены, выбор кандидатных антител с высокой аффинностью к целевому антигену и выделение выбранных антител.

Детальное описание методов фагового дисплея можно найти, например, в WO03/102157, опубликованном 11 декабря 2003 г., полное раскрытие которого специально включено в этот документ в качестве ссылки.

В одном из вариантов воплощения настоящего изобретения библиотеки антител, применяемых в изобретении, могут быть получены путем мутаций в доступных для растворителя и/или высоковариабельных позициях в, по меньшей мере, одной CDR вариабельного домена антитела. Некоторые или все CDR могут быть подвергнуты мутациям с применением способа, приведенного в этом документе. В некоторых вариантах воплощения может быть предпочтительным получение различных библиотек антител путем мутирования позиций в CDRH1, CDRH2 и CDRH3 с формированием единой библиотеки, или путем мутирования позиций в CDRL3 и CDRH3 с формированием единой библиотеки, или путем мутирования позиций в CDRL3 и CDRH1, CDRH2 и CDRH3 с формированием единой библиотеки.

Например, может быть получена библиотека вариабельных доменов антител, имеющих мутации в доступных для растворителя и/или высоковариабельных позициях CDRH1, CDRH2 и CDRH3. Может быть получена еще одна библиотека с мутациями в CDRLl, CDRL2 и CDRL3. Эти библиотеки также могут применяться совместно друг с другом для получения связывающих молекул с требуемой аффинностью. Например, после одного или нескольких раундов отбора библиотек тяжелых цепей на связывание с целевым антигеном библиотека легких цепей может быть перемещена в популяцию связывающих молекул на основе тяжелых цепей для дальнейших раундов отбора с целью увеличения аффинности связывающих молекул.

Предпочтительно, библиотеку создают путем замены исходных аминокислот вариантными аминокислотами в области CDRH3 вариабельного домена (региона, области) последовательности тяжелой цепи. Полученная в результате библиотека может содержать множество последовательностей антител, при этом разнообразие последовательностей наблюдается, в основном, в области CDRH3 последовательности тяжелой цепи.

В одном из вариантов воплощения настоящего изобретения библиотека создается в контексте последовательности гуманизированного антитела 4D5 или последовательности аминокислот каркаса последовательности гуманизированного антитела 4D5. Предпочтительно, библиотека создается путем замены, по меньшей мере, остатков 95-100a в тяжелой цепи аминокислотами, кодируемыми набором кодонов DVK, при этом набор кодонов DVK применяют для кодирования набора вариантных аминокислот для каждой из этих позиций. Пример набора олигонуклеотидов, полезного для осуществления этих замен, включает последовательность (DVK) ₇. В некоторых вариантах воплощения настоящего изобретения библиотеку создают путем замены остатков 95-100a аминокислотами, кодируемыми наборами кодонов как DVK, так и NNK. Пример набора олигонуклеотидов, полезного для осуществления этих замен, включает последовательность (DVK) ₆ (NNK). В другом варианте воплощения настоящего изобретения библиотеку создают путем замены, по меньшей мере, остатков 95-100a аминокислотами, кодируемыми наборами кодонов как DVK, так и NNK. Пример набора олигонуклеотидов, полезного для осуществления этих замен, включает последовательность (DVK) ₅ (NNK). Еще один пример набора олигонуклеотидов, полезного для осуществления этих замен, включает последовательность (NNK) ₆. Другие примеры пригодных олигонуклеотидных последовательностей могут быть определены специалистом в данной области в соответствии с критериями, описанными в этом документе.

В другом варианте воплощения настоящего изобретения различные конструкции CDRH3 применяют для выделения высокоаффинных связывающих молекул и выделения связывающих молекул для различных эпитопов. Диапазон длин CDRH3, полученных в этой библиотеке, составляет от 11 до 13 аминокислот, хотя могут быть получены и фрагменты с другими длинами. Разнообразие H3 может быть расширено с помощью наборов кодонов NNK, DVK и NVK, а также более ограниченного разнообразия на N- и/или C-конце.

Разнообразие также может быть получено в CDRH1 и CDRH2. При создании разнообразия в CDR-H1 и H2 следуют стратегии стремления к воссозданию сходства с набором природных антител, как описано в случае модификации, которая нацелена на разнообразие, более тесно соответствующее природному разнообразию, чем предыдущая конструкция.

Для разнообразия в CDRH3 может быть сконструировано по отдельности множество библиотек с различными длинами H3, которые после этого объединяют для отбора связывающих молекул для целевого антигена. Множество библиотек можно объединять и сортировать с применением способов отбора на твердой подложке и сортинга в растворе, как описано ранее и ниже в этом документе. Могут быть применены различные стратегии сортинга. Например, один вариант воплощения включает сортинг с помощью мишени, иммобилизованной на твердой подложке, после чего следует сортинг по метке, которая может присутствовать на химерном полипептиде (например, метка анти-gD), за которым следует еще один сортинг с помощью мишени, иммобилизованной на твердой подложке. В соответствии с другим вариантом библиотеки могут сначала сортировать с помощью мишени, иммобилизованной на твердой подложке, а элюированные связывающие молекулы потом сортируют с применением связывания растворимой фазы с понижающимися концентрациями целевого антигена. Применение комбинаций различных способов сортинга обеспечивает минимизацию отбора только в отношении последовательностей с высоким уровнем экспрессии и направлено на отбор ряда различных клонов с высокой аффинностью.

Высокоаффинные связывающие молекулы для целевого антигена могут быть выделены из библиотек. Ограничение разнообразия в области H1/H2 снижает вырожденность примерно в 10⁴-10⁵ раз, а разрешение большего разнообразия в H3 обеспечивает получение связывающих молекул с более высокой аффинностью. Применение библиотек с различными типами разнообразия в CDRH3 (например, с применением DVK или NVT) обеспечивает выделение связывающих молекул, которые могут связываться с различными эпитопами на целевом антигене.

Для связывающих молекул, выделенных из объединенных, как описано выше, библиотек, было обнаружено, что их аффинность может быть дополнительно улучшена путем обеспечения ограниченного разнообразия в легкой цепи. Разнообразие легкой цепи получают в этом варианте следующим образом: в CDRL1: позиция аминокислоты 28 кодируется RDT; позиция аминокислоты 29 кодируется RKT; позиция аминокислоты 30 кодируется RVW; позиция аминокислоты 31 кодируется ANW; позиция аминокислоты 32 кодируется THT; необязательно, позиция аминокислоты 33 кодируется CTG; в CDRL2: позиция аминокислоты 50 кодируется KBG; позиция аминокислоты 53 кодируется AVC; и, необязательно, позиция аминокислоты 55 кодируется GMA; в CDRL3: позиция аминокислоты 91 кодируется TMT или SRT, или обоими; позиция аминокислоты 92 кодируется DMC; позиция аминокислоты 93 кодируется RVT; позиция аминокислоты 94 кодируется NHT; и позиция аминокислоты 96 кодируется TWT или YKG, или обоими.

В другом варианте воплощения настоящего изобретения получают библиотеку или библиотеки с разнообразием в областях CDRH1, CDRH2 и CDRH3. В этом варианте разнообразие в CDRH3 получают с применением разнообразия длин областей H3 и с применением в основном наборов кодонов XYZ и NNK или NNS. Библиотеки могут быть сформированы с применением единичных олигонуклеотидов и объединены, или олигонуклеотиды могут быть объединены для формирования подтипов библиотек. Библиотеки в этом варианте могут быть отсортированы по отношению к мишени, иммобилизованной на твердой подложке. Клоны, выделенные из множества типов, могут быть повергнуты скринингу на специфичность и аффинность с помощью анализа ELISA. Для определения специфичности клоны могут быть подвергнуты скринингу в отношении требуемого целевого антигена, а также других, нецелевых, антигенов. После этого, те связывающие молекулы, которые связываются с целевым антигеном, могут быть подвергнуты скринингу на аффинность с применением анализа ELISA для конкурентного связывания в растворе или анализа конкурентного связывания в пятнах. Высокоаффинные связывающие молекулы могут быть выделены из библиотеки, использующей наборы кодонов XYZ, приготовленной как описано выше. Эти связывающие молекулы могут быть легко получены в виде антител или антигенсвязывающих фрагментов с высоким выходом в культуре клеток.

В некоторых вариантах воплощения настоящего изобретения может быть желательно получение библиотек с большим разнообразием длин области CDRH3. Например, может быть желательно получение библиотек с областями CDRH3 в диапазоне от примерно 7 до 19 аминокислот.

Высокоаффинные связывающие молекулы, выделенные из библиотек по этим воплощениям, легко получают в культуре бактериальных или эукариотических клеток с высоким выходом. Могут быть сконструированы векторы, в которых можно легко проводить удаление последовательностей, таких как метки gD, последовательность компонента белка вирусной оболочки, и/или вставку в последовательности консервативных областей для обеспечения продукции полноразмерных антител или антигенсвязывающих фрагментов с высоким выходом.

Библиотека с мутациями в CDRH3 может быть скомбинирована с библиотекой, содержащей вариантные версии других CDR, например CDRL1, CDRL2, CDRL3, CDRH1 и/или CDRH2. Таким образом, например, в одном из вариантов, библиотека CDRH3 скомбинирована с библиотекой CDRL3, созданной в контексте последовательности гуманизированного антитела 4D5 с вариантными аминокислотами в позициях 28, 29, 30, 31 и/или 32 с применением предустановленных наборов кодонов. В другом варианте библиотека с мутациями в CDRH3 может быть скомбинирована с библиотекой, содержащей вариантные CDRH1 и/или CDRH2 в вариабельных доменах тяжелой цепи. В одном из вариантов библиотека CDRH1 создана на основе последовательности гуманизированного антитела 4D5 с вариантными аминокислотами в позициях 28, 30, 31, 32 и 33. Библиотека CDRH2 может быть создана на основе последовательности гуманизированного антитела 4D5 с вариантными аминокислотами в позициях 50, 52, 53, 54, 56 и 58 с применением предустановленных наборов кодонов.

Предполагается, что вышеизложенное письменное описание является достаточным для того, чтобы специалист в данной области мог практически использовать настоящее изобретение. Последующие примеры приведены только в целях иллюстрации и не предназначены для ограничения объема настоящего изобретения каким-либо образом. Действительно, различные модификации изобретения, в дополнение к тем, что показаны и описаны в этом документе, будут очевидны для специалиста в данной области из вышеизложенного описания и попадают в объем прилагаемой формулы изобретения.

Доступные для приобретения реагенты, указанные в примерах, применяли в соответствии с инструкциями производителей, если не указано иначе. Источником клеток, идентифицированных в следующих примерах и в описании изобретения по номерам доступа ATCC, является American Type Culture Collection, Манассас, Вирджиния. Если не указано иначе, в настоящем изобретении применяют стандартные способы технологии рекомбинантных ДНК, такие как описаны выше в этом документе и в следующих руководствах: Sambrook et al., выше; Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology (Green Publishing Associates and Wiley Interscience, N.Y., 1989); Innis et al., PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications (Academic Press, Inc.: N.Y., 1990); Harlow et al., Antibodies: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Press: Cold Spring Harbor, 1988); Gait, Oligonucleotide Synthesis (IRL Press: Oxford, 1984); Freshney, Animal Cell Culture, 1987; Coligan et al., Current Protocols in Immunology, 1991.

Дополнительные детальные характеристики изобретения приведены в следующих неограничивающих примерах.

Все ссылки, процитированные в раскрытии изобретения, специально включены сюда в своей полноте в качестве ссылок.

Пример 1

Роль членов семейства IL-17 в диабете и инсулинорезистентности

Мыши IL-17Rc KO и исследование модели диеты с высоким содержанием жиров

8-недельные самцы IL-17Rc (UNQ6118.KO.lex) нокаутных и однопометных дикого типа (WT) контрольных мышей получали либо нормальную пищевую диету, либо 60%-ную диету с высоким содержанием жиров (HFD).

ГРУППА 1: IL-17Rc нокаутные (KO) мыши на диете с высоким содержанием жиров (5 животных)

ГРУППА 2: IL-17Rc дикого типа однопометные контрольные животные на диете с высоким содержанием жиров (5 животных)

ГРУППА 3: IL-17Rc KO мыши на нормальной диете (3 животных)

ГРУППА 4: IL-17Rc дикого типа однопометные контрольные животные на нормальной диете (3 животных).

Планирование эксперимента представлено на фиг.7.

Мышам проводили пробу на переносимость глюкозы (GTT) для оценки их статуса инсулинорезистентности.

GTT проводили с применением следующего способа.

Измерение содержания глюкозы и инсулина в крови: образцы крови получали взятием крови из подкожной вены и сразу же анализировали на концентрацию глюкозы с применением глюкометра (глюкометра OneTouch производства Lifescan, США). Содержание инсулина в сыворотке определяли с применением метода ELISA.

Проба на переносимость глюкозы (GTT): после ночного голодания (14 часов) проводили испытание на животных утром, в 9:00. Уровень глюкозы в крови измеряли в образцах, полученных при взятии крови из подкожной вены перед интраперитонеальной инъекцией глюкозы 1,5 мг/грамм массы тела каждого животного, а также через 30, 60, 120 и 150 минут после введения глюкозы. Значения вычисляли как содержание глюкозы в мг/дл.

GTT проводили для исходного уровня (до перехода на диету с высоким содержанием жиров), а также на неделе 8, неделе 10, неделе 12 и неделе 14 после начала участия в группе с диетой с высоким содержанием жиров. Мышей, получавших нормальную пищевую диету, использовали в качестве контрольных групп. Остальные условия были схожими для нокаутных и дикого типа (WT) однопометных контрольных мышей.

В дополнение к GTT еженедельно измеряли общую массу тела животного, а также содержание в сыворотке инсулина и глюкозы натощак.

Результаты представлены на фиг.8-11.

В то время как однопометные контрольные мыши с IL-17Rc дикого типа демонстрировали существенное увеличение массы и развитие фенотипа с инсулинорезистентностью, нокаутные по IL-17Rc мыши были существенно более худыми и выводили глюкозу намного лучше, чем их дикого типа однопометная контрольная группа. Даже после получения диеты с высоким содержанием жиров в течение более чем 12 недель нокаутные мыши не набирали массу тела. Обе группы продемонстрировали схожие уровни содержания циркулирующего инсулина натощак. Не наблюдалось существенного различия между нокаутными и дикого типа мышами в группах, получавших контрольную диету.

Помимо описанного выше эксперимента с IL-17Rc KO мышами были выполнены ДВЕ дополнительные линии исследований для выяснения роли провоспалительных цитокинов IL-17A и IL-17F в диабете и инсулинорезистентности.

Пример 2

Эффект моноклональных антител (mAb) против IL-17 и против IL-17F на мышей с моделью инсулинорезистентности, вызванной диетой с высоким содержанием жиров

Целью данного исследования было изучение эффективности mAb против IL-17 и против IL-17F в превентивной и установленной модели инсулинорезистентности и сравнение с терапевтическим эффектом muTNFRII-Fc.

Планирование эксперимента и группы:

Группа 1: Агглютинин амброзии, 6 мг/кг в 100 мкл раствора натрия хлорида IP 3 раза в неделю в течение 10 недель (n=10).

Группа 2: MuTNFRII-IgG2a, 4 мг/кг в 100 мкл раствора натрия хлорида 3 раза в неделю в течение 10 недель (n=10).

Группа 3: MuAnti-IL-17, 6 мг/кг в 100 мкл раствора натрия хлорида IP 3 раза в неделю в течение 10 недель (n=10).

Группа 4: MuAnti-IL-17+MuAnti-IL-17F mAb, 6 мг/кг в 100 мкл раствора натрия хлорида IP 3 раза в неделю в течение 10 недель (n=10).

Группа 5: MuTNFRII-Fc 4 мг/кг = MuAnti-IL-17 6 мг/кг+MuAnti-IL17F mAb 6 мг/кг в течение 18 недель и 24 недель (10 животных).

Все группы получали диету с высоким содержанием жиров. Для оценки статуса инсулинорезистентности мышей проводили пробу на переносимость глюкозы (GTT) каждые 2 недели после начала HFD (диеты с высоким содержанием жиров) и введения доз антител.

Протокол проиллюстрирован на фиг.12. Эффект моноклональных антител против IL-17A и против IL-17F на переносимость глюкозы через 9 недель введения доз показан на фиг.13.

Пример 3

Эффект сверхэкспрессии IL-17 на статус инсулинорезистентности, оцененный с применением GTT

Исследование основано на гидродинамической инъекции в хвостовую вену (HTV) плазмидной ДНК для экспрессии нативных белков мыши IL-17A и IL-17F у нормальных и получавших диету с высоким содержанием жиров мышей с целью экспрессии высокого уровня провоспалительных цитокинов мыши IL-17A и IL-17F в мышах для изучения их роли в инсулинорезистентности.

Группа 1: без плазмиды

Группа 2: только вектор pRK

Группа 3: pRK-IL-17A

Группа 4: pRK-IL-17F

В пределах каждой группы делали инъекции 5 подгруппам мышей для отбора крови в различных временных точках (0 ч, 2 ч, 6 ч, 24 ч и 72 ч после инъекции ДНК) с целью измерения уровней циркулирующих цитокинов в сыворотке. Когда этот параметр был установлен, осуществляли сверхэкспрессию IL-17A и IL-17F у мышей с диетой с высоким содержанием жиров (HFD) для оценки изменения статуса инсулинорезистентности.

Эксперименты по инъекции в хвостовую вену:

1) Конструкцию ДНК (вектор pRK или pRK-IL-17A и pRK-IL-17F) разбавляли в растворе натрия хлорида (предпочтительно, растворе Рингера) до концентрации, которая даст конечную дозу 50 мкг/мышь/инъекция.

2) Каждой мыши делали внутривенную инъекцию в хвостовую вену примерно 1,6 мл раствора, содержащего ДНК в растворе натрия хлорида или растворе Рингера.

3) Дозы вводили в виде внутривенной инъекции ударной дозы (в хвостовую вену) в течение периода 4-5 секунд (максимум - 8 секунд) для максимального поглощения ДНК.

Результаты представлены на фиг.14. A) Восьминедельным мышам c57BL/6 делали инъекции 50 мкг плазмидной ДНК (pRK-lL-17A) или только вектора pRK. Через 48 часов в обеих группах собирали сыворотку и измеряли уровень IL-17 в сыворотке с помощью ELISA. B) Три группы мышей после ночного голодания подвергли интраперитонеальной GTT, и результаты представлены в виде графика зависимости от времени, прошедшего после инъекции глюкозы (*p>0,05).

Хотя настоящее изобретение было описано со ссылками на конкретные примеры воплощения, при этом понимается, что настоящее изобретение не ограничено такими воплощениями. Наоборот, подразумевается, что настоящее изобретение охватывает различные модификации и эквиваленты, включенные в сущность и объем прилагаемой формулы изобретения.

1. Способ лечения инсулинорезистентности у млекопитающего, который включает введение нуждающемуся в этом млекопитающему эффективного количества антагониста IL-17A и/или IL-17F, где указанный антагонист представляет собой антитело или его антигенсвязывающий фрагмент.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что млекопитающее имеет нарушение, выбранное из группы, состоящей из инсулиннезависимого сахарного диабета (НИЗСД), ожирения, гиперандрогении яичников и гипертонии.

3. Способ по п.2, отличающийся тем, что нарушение является НИЗСД или ожирением.

4. Способ по п.1, отличающийся тем, что млекопитающее является человеком, и введение является системным.

5. Способ по п.1, отличающийся тем, что антитело является антителом, выбранным из группы, состоящей из антител против IL-17A, против IL-17F, против IL-17A/F, против IL-17Rc и против IL-17RA.

6. Способ по п.5, отличающийся тем, что антитело является моноклональным антителом.

7. Способ по п.6, отличающийся тем, что антитело является химерным, гуманизированным антителом или антителом человека.

8. Способ по п.7, отличающийся тем, что антитело является биспецифичным, мультиспецифичным или обладающим перекрестной реактивностью антителом.

9. Способ по п.8, отличающийся тем, что дополнительно включает введение эффективного количества агента для лечения инсулинорезистентности.

10. Способ по п.9, отличающийся тем, что агент для лечения инсулинорезистентности является инсулином, IGF-1 или сульфонилмочевиной.

11. Способ по п.9, отличающийся тем, что дополнительно включает введение эффективного количества дополнительного агента, приемлемого для лечения указанного нарушения, связанного с инсулинорезистентностью.

12. Способ по п.11, отличающийся тем, что дополнительный агент является Dickkopf-5 (Dkk-5).

13. Способ по п.1, отличающийся тем, что введение антагониста снижает уровень глюкозы в крови у указанного млекопитающего.

14. Фармацевтическая композиция, содержащая антагонист IL-17А и/или IL-17F с добавлением фармацевтически приемлемого вспомогательного вещества, для лечения инсулинорезистентности, где антагонист представляет собой антитело или его антигенсвязывающий фрагмент.

15. Фармацевтическая композиция по п.14, отличающаяся тем, что антитело является антителом, выбранным из группы, состоящей из антител против IL-17A, против IL-17F, против IL-17A/F, против IL-17RC и против IL-17RA.

16. Фармацевтическая композиция по п.15, отличающаяся тем, что антитело является моноклональным антителом.

17. Фармацевтическая композиция по п.16, отличающаяся тем, что антитело является химерным, гуманизированным антителом или антителом человека.

18. Фармацевтическая композиция по п.17, отличающаяся тем, что антитело является биспецифичным, мультиспецифичным или обладающим перекрестной реактивностью антителом.

19. Применение антагониста IL-17A и/или IL-17F для изготовления лекарственного препарата для лечения инсулинорезистентности, где антагонист представляет собой антитело или его антигенсвязывающий фрагмент.

20. Набор для лечения инсулинорезистентности, содержащий: (а) контейнер, содержащий антагонист IL-17A и/или IL-17F; и (б) этикетку или инструкцию по введению указанного антагониста для лечения указанной инсулинорезистентности, где антагонист представляет собой антитело или его антигенсвязывающий фрагмент.