Способ получения инактивированной антирабической вакцины при безопорном выращивании клеток и репродукции в них вируса в укороченном цикле культивирования


 


Владельцы патента RU 2537183:

Открытое акционерное общество "Институт биотехнологий ветеринарной медицины" (RU)

Изобретение относится к ветеринарной биотехнологии, а именно к способу получения антирабической вакцины. Для этого используют сублинию клеток ″ВНК-21/13-02″, выращивая их безопорным методом в специальной среде для суспензионных условий, используя раствор Хенкса для суспензионного культивирования с добавлением сыворотки крови КРС, проверенной на отсутствие антител к вирусу бешенства и ростовые свойства, в концентрации 2,5%, D-глюкозу (1,0 г/л), D-фруктозу (1,0 г/л), l-глутамин (0,3 г/л), ферментативный мышечный гидролизат КРС (0,35% в пересчете на сухое вещество), l-аргинин, l-метионин, l-цистин, мио-инозитол и водорастворимые витамины согласно прописи среды Игла MEM, до концентрации (2,5-3,0)×106 кл./мл. Затем инфицируют выросшую культуру клеток штаммом ″Щелково-51″ вируса бешенства, адаптированным к данной системе, в дозе 0,1-1,0 МЛД50/кл., при этом инкубирование осуществляют при температуре 37°C в течение 48-72 часов безопорным методом. После чего добавляют стабилизирующий буфер, фиксируя pH в пределах 7,2-7,6, а затем инактивируют полученный вируссодержащий материал бета-пропиолактоном в конечной концентрации 0,025%, а затем приготавливают из него сорбированную или сухую вакцину. Использование данного способа позволяет повысить иммуногенность продукта за счет определенной плотности клеток к моменту заражения, оптимальной дозы заражения и времени репродукции вируса в инфицированных клетках. 4 з.п. ф-лы, 3 пр., 3 табл.

 

Изобретение относится к ветеринарной биотехнологии, а именно к культивированию клеток животных и вирусов и может быть использовано для оптимизации репродукции вирусов в культуре клеток и получения антирабических вакцин с применением суспензионно-реакторного безопорного метода культивирования перевиваемой сублинии «ВНК-21/13-02».

В мероприятиях по профилактике заболевания бешенством первостепенную роль играют вакцины, включающие антигены вируса бешенства. Для их изготовления необходимы биоматериалы с высоким удельным содержанием вирусных частиц, на поверхности которых тримеры молекул гликопротеина должны быть стабилизированы в напряженной нативной конформации, обеспечивающей протективные свойства этого антигена [A.P. Maillard, Y. Gaudin (2002). J. Gen. Virol. v.83, p.1465-1476].

Такое состояние вирусного гликопротеина необходимо для взаимодействия вирусных частиц с поверхностными рецепторами клеток и проникновения в них, в том числе для проникновения инактивированного вируса или его фрагментов в анитигенпредставляющие клетки иммунной системы организма.

В процессе производства антигенного материала и изготовления препаратов на его основе, вирусный гликопротеин подвержен влиянию сдвигов pH и ионного состава, нарушающих его нативную конформацию при выходе сформированных вирусных частиц во внеклеточную среду, при химической инактивации и лиофильном высушивании. В этой связи, для повышения выхода качественного вируса, требуется стабилизировать в ходе его производства нативную конформацию протективных антигенов.

В уровне техники известен способ получения антирабической вакцины, включающий: выращивание вируса бешенства в суспензионной культуре перевиваемых клеток ВНК-21 в течение 96-144 ч; внесение в вируссодержащую суспензию сначала полиакриловой кислоты или ее железной соли в концентрации 0,7-1,0% - в качестве стабилизатора белковых вирусных антигенов и стимулятора последующей инактивации вирусного генома, затем - внесение инактиванта-димераэтиленимина (ДЭИ) в концентрации 0,1-0,3%, с дальнейшим инкубированием при 37°C в течение 20-24 ч.

Полученный материал используют в качестве жидкой вакцины или (после сублимационного высушивания) хранят в сухом виде, растворяя непосредственно перед использованием (патент РФ №2134590).

Указанный способ получения инактивированной антирабической вакцины с применением полиакриловой кислоты или ее соли не обеспечивает достаточно выраженный эффект стабилизации протективных вирусных антигенов и требует большой продолжительности производственного цикла (5-7 дней).

Известен способ получения антирабической вакцины, при котором вирус бешенства репродуцируют в монослойной культуре перевиваемых клеток ВНК-21 в бутылях на роллерной установке; затем подвергают термической обработке, снижая инфекционную активность вируса до уровня, находящегося в пределах 0,001-0,0001% МЛД50/кл. (полулетальных интрацеребральных мышиных доз на 1 клетку); после чего вирусный материал с низкой удельной инфекционной активностью вновь культивируют в такой же клеточной системе. Полученную в результате вируссодержащую культуральную жидкость используют в качестве посевного материала для заражения производственной роллерной расплодки клеток ВНК-21. Инфицированные клетки этой расплодки рассевают в отношении 1:4 на свежей поддерживающей среде, используя дополнительные чистые бутыли в соответствующем количестве. В них зараженные клетки культивируют еще 5-6 суток, в течение которых трижды собирают вируссодержащую культуральную жидкость, доливая при этом в бутыли свежую среду в необходимом объеме.

Полученный в результате материал пригоден для изготовления сухих и жидких антирабических вакцин с характеристиками иммуногенности (определенными по методу Национального института здравоохранения Минздрава США, NIHUSA) на уровне 2,3-2,5 МЕ/мл (патент РФ 2191600).

Недостатком данного способа является то, что его осуществление сопровождается трудоемкими и многочисленными операциями, связанными с раздельным получением вирусного и клеточного производственного посевного материала в роллерных бутылях, а также с мойкой и подготовкой большого количества сосудов культивирования и индивидуальной боксовой работы с каждым из них. Многократное манипулирование с бутылями, содержащими нативные клетки и клетки, инфицированные вирусом бешенства, увеличивает вероятность загрязнения вакцинного сырья посторонними инфекционными агентами и обусловливает необходимость тщательного контроля каждого сбора вируса из каждого сосуда культивирования. Все это приводит к удорожанию конечного продукта и затрудняет производство препарата на должном качественном уровне, в необходимых для ветеринарной практики количествах.

Наиболее близким аналогом заявленного способа по совокупности существенных признаков является изобретение по патенту РФ №2287343, раскрывающее способ получения антирабической вакцины, включающий приготовление посевного материала на основе вируса бешенства штамма ″Щелково-51″ и культуры перевиваемых клеток ВНК-21, инфицирование клеток вирусом, их культивирование, сбор вируссодержащей культуральной жидкости, инактивацию вируса с последующим приготовлением целевого продукта в жидкой или лиофилизированной форме, при этом клетки ВНК-21 инфицируют производственным штаммом вируса из расчета 0,01-0,001 МЛД50/кл., размножают в течение 36-70 ч во взвешенном состоянии в биореакторе, а затем высевают на микроносители из расчета (1,2-2,5)×105 клеток и 0,3-0,6 мл питательной среды на каждый 1 см2 микроносителей, причем культивирование клеток на микроносителях осуществляют в биореакторе в течение 5-6 суток с проведением ежесуточных сборов вируссодержащей культуральной жидкости.

Указанный способ трудоемок в связи с необходимостью проведения сложных процедур подготовки микроносителей к посеву клеток, снятию клеток с микроносителей и последующему отделению клеточно-вирусной суспензии от осевших микроносителей. Эти технологические процедуры ухудшают воспроизводимость результатов, занимают много времени и не позволяют гарантировать качество целевого продукта.

Задачей, на решение которой направлено предлагаемое изобретение, являлось усовершенствование промышленной технологии производства антирабической вакцины из штамма ″Щелково-51″ и повышение выхода ее целевого продукта за счет увеличения накопления и стабилизации вирусных антигенов.

Указанная задача решается в соответствии со следующим способом получения инактивированной антирабической вакцины при безопорном выращивании клеток и репродукции в них вируса в укороченном цикле культивирования, включающим выращивание сублинии клеток ″ВНК-21/13-02″; ее инфицирование вирусом бешенства и последующее выращивание вируса бешенства, инактивацию вируссодержащей суспензии с последующим приготовлением вакцины, причем культивирование осуществляют безопорным методом в специальной среде для суспензионных условий в течение 48-72 часов до концентрации (2,5-3,0)×106 кл./мл; инфицируют выросшую культуру клеток штаммом ″Щелково-51″ вируса бешенства, адаптированным к данной системе, в дозе 0,1-1,0 МЛД50/кл, после чего выращивают вирус в течение 48-72 часов безопорным методом и добавляют стабилизирующий буфер, фиксируя pH в пределах 7,2-7,6, после чего инактивируют полученный вируссодержащий материал бета-пропиолактоном в конечной концентрации 0,025% с последующим приготовлением целевого продукта.

В качестве специальной среды используют раствор Хенкса для суспензионного культивирования с добавлением сыворотки крови КРС, проверенной на отсутствие антител к вирусу бешенства и ростовые свойства, в концентрации 2,5%, D-глюкозу (1,0 г/л), D-фруктозу (1,0 г/л), l-глутамин (0,3 г/л), ферментативный мышечный гидролизат КРС (0,35% в пересчете на сухое вещество), l-аргинин, l-метионин, l-цистин, myo-инозитол и водорастворимые витамины согласно прописи среды Игла (MEM).

В качестве стабилизирующего буфера используют TRIS-буфер в конечной концентрации 0,05М. Приготовление готового продукта осуществляют адсорбцией на гидроокиси алюминия, добавленной в количестве 10-25%, получая при этом продукт в жидкой форме.

Кроме того, в рамках предлагаемого способа вакцина может быть изготовлена сублимационным высушиванием. Перед высушиванием вируссодержащий материал смешивают в соотношении 1:1 с защитной средой, содержащей желатин, пептон и сахарозу в соотношении 0,3:1:1 соответственно, pH среды составляет 7,2-7,6.

Техническим результатом заявленного изобретения является упрощение технологии производства вакцины, повышение иммуногенности продукта за счет увеличенного накопления вируса и повышение выхода целевого продукта.

Технический результат достигается за счет определенной плотности клеток к моменту заражения, оптимальной дозы заражения и времени репродукции вируса в инфицированных клетках, условий репродукции, обеспечивающих повышенное накопление вирусных частиц и, соответственно гликопротеина, ответственного за выработку вируснейтрализующих антител.

Изобретение иллюстрируется следующими примерами

Пример 1

Изготовление сорбированной инактивированной вакцины

Сорбированную инактивированную вакцину изготавливают из антигенов производственного штамма вируса бешенства «Щелково-51» следующим образом:

- в биореактор вместимостью 2000 л, вносят 300 л культуры клеток «ВНК-21/13-02» с концентрацией (2,5-3,0)×106 кл./мл, температурой суспензии 37°C;

- затем в биореактор, не прерывая перемешивание, вносят 1500 л подогретой до 37°C среды на модифицированном солевом растворе Хенкса - с увеличенным до 0,15 г/л содержанием натрия фосфорнокислого двузамещенного 12-водного, содержащей:

- сыворотку крови КРС, проверенную на отсутствие антител к вирусу бешенства и ростовые свойства, в концентрации 2,5%;

- D-глюкозу (1,0 г/л), D-фруктозу (1,0 г/л), l-глутамин (0,3 г/л); ферментативный мышечный гидролизат КРС (0,35% в пересчете на сухое вещество); l-аргинин, l-метионин, l-цистин, myo-инозитол и водорастворимые витамины согласно прописи среды Игла (MEM);

- далее, в биореактор вносят вирус бешенства, штамм «Щелково-51», в дозе 0,1-1,0 МЛД50/кл (рассчитанной с учетом имеющейся в биореакторе концентрации клеток), выращенный ранее в аналогичной системе репродукции;

- суспензию зараженных клеток инкубируют при температуре 37°C при перемешивании (40 об/мин) в течение 48-72 часов, поддерживая pH в пределах 7,2-7,4, посредством регулируемой подачи воздуха и добавления 7,5% раствора бикарбоната натрия;

- завершая процесс накопления вируса, корректируют pH в содержимом биореактора до значения 7,6, медленно подавая при перемешивании необходимое количество 3% раствора гидроксида натрия или 2% раствора соляной кислоты, после чего вносят в биореактор, продолжая перемешивание, 80 л концентрата стабилизирующего буфера, приготовленного таким образом, чтобы в конечном объеме вируссодержащего материала в биореакторе была достигнута концентрация 0,05 М для трис-буфера;

- для инактивации вируса биореактор со стабилизированным вирусным материалом охлаждают до 4°C, вносят бета-пропиолактон в конечной концентрации 0,025% и выдерживают в течение 2 часов при непрерывном перемешивании;

- полученные инактивированные антигены вируса бешенства используют далее для приготовления готовой к применению вакцины в жидкой форме, для чего инактивированные антигены сорбируют на гидроокиси алюминия, добавленной в количестве 10-25%.

Пример 2

Получение инактивированной антирабической сухой вакцины

Культивирование клеток, их заражение производственным штаммом «Щелково-51» вируса бешенства, репродукцию вируса, стабилизацию его протективных антигенов и химическую инактивацию осуществляют способом, описанным выше в Примере 1. Далее, полученный антигенный материал в асептических условиях смешивают в объемном соотношении 1:1 с защитной средой для сублимационного высушивания, содержащей желатин, пептон и сахарозу в соотношении 0,3:1:1 соответственно, pH среды устанавливают в пределах 7,2-7,6 с помощью стерильных растворов гидроксида натрия и соляной кислоты. Затем полученную смесь фасуют во флаконы емкостью 10 или 20 мл и подвергают высушиванию в сублимационной машине.

Пример 3

Для оценки результатов, обеспечиваемых заявленным изобретением, сравнивали характеристики образцов продукта, полученного по Примеру 1, с характеристиками образцов, изготовленных из тех же материалов, но без добавления стабилизирующего буфера.

Результаты определения инфекционной активности вируса, полученного при одинаковой концентрации клеток и дозе вируса, стабилизированного и нестабилизированного буфером представлены в таблице 1.

Таблица 1
Инфекционная активность вируса бешенства без стабилизации и с добавлением стабилизирующего буфера (n=3)
Образцы вирусного материала Инфекционная активность вирусного материала (lgМЛД50/мл)
0 дней 14 дней 28 дней
Без добавления стабилизирующего буфера 7,3±0,2 6,3±0,2 3,5±0,2
С добавлением стабилизирующего буфера 7,5±0,2 7,5±0,25 7,25±0,25

Из данных таблицы 1 следует, что стабилизация вируса буфером обеспечила сохранность инфекционной активности вируса до 28 дней (срок наблюдения), в то время как инфекционная активность нестабилизированного вируса снизилась на 1,0 lgМЛД50/мл уже через 14 дней, и на 3,8 lgМЛД50/мл через 28 дней.

Поскольку нативная конформация молекул гликопротеина требуется для проявления инфекционной активности вируса бешенства, ее сохранение в стабилизированном препарате свидетельствует о том, что молекулы гликопротеина в нем остаются в нативном состоянии.

Ниже в таблице 2 представлены результаты определения иммуногенной активности образцов сухих вакцин, изготовленных из стабилизированных и нестабилизированных вирусных материалов (указанных в таблице 2) после их химической инактивации.

Таблица 2
Иммуногенная активность инактивированных сухих вакцин, изготовленных из стабилизированного и нестабилизированного материалов, взятых на разных сроках хранения при 4°C
Вакцины Иммуногенная активность на различных сроках хранения (МЕ/мл*)
0 дней 14 дней 28 дней
№1 4,0 4,0 4,0
№2 3,0 2,0 0,5
* - по методу Национального института здравоохранения Минздрава США (NIHUSA), рекомендованному ВОЗ;
№1 - сухая вакцина, изготовленная из стабилизированного антигена;
№2 - сухая вакцина, изготовленная из нестабилизированного антигена.

Из таблицы 2 следует:

- материал без стабилизирующего буфера (№2) потерял в ходе высушивания 1,0 ME иммуногенной активности, это означает, что буфер (в составе вакцины №1) стабилизировал протективные антигены вируса бешенства в нативной конформации;

- сухая вакцина, изготовленная из инактивированного материала без стабилизирующего буфера (№2), хранившегося в течение 14 дней, обнаруживает иммуногенную активность на 50% ниже, в сравнении с вакциной, приготовленной из стабилизированного материала, хранившегося в тех же условиях;

- хранение жидкого инактивированного стабилизированного вирусного материала (№1) до 28 дней (срок наблюдения) не повлияло на иммуногенность изготовленной из него сухой вакцины.

Ниже в таблице 3 представлены результаты определения иммуногенной активности образцов сорбированных ГОА-вакцин, изготовленных из указанных выше вирусных материалов №1 и №2 после их химической инактивации (№3 и №4) соответственно.

Таблица 3
Иммуногенная активность сорбированных ГОА-вакцин, изготовленных из стабилизированного и нестабилизированного материалов, взятых на разных сроках хранения при 4°C
Вакцины Иммуногенная активность на различных сроках хранения (МЕ/мл*)
0 дней 14 дней 28 дней
№3 4,5 4,25 4,5
№4 4,25 2,5 0,5

Из таблицы 3 следует:

- сорбированная вакцина №4, изготовленная из инактивированного материала, хранившегося в течение 14 дней без предварительной стабилизации буфером, показала иммуногенную активность на 40% ниже, в сравнении с вакциной №3, приготовленной из стабилизированного материала, из чего следует, что буфер стабилизирует протективные антигены вируса бешенства в нативной иммуногенной конформации;

- хранение жидкого инактивированного стабилизированного вирусного материала при 4°C в течение 28 дней (срок наблюдения) не повлияло на иммуногенность изготовленной из него сорбированной вакцины №3.

Из представленного выше следует, что предлагаемый способ получения инактивированной антирабической вакцины, включающий безопорное выращивание перевиваемой культуры клеток и репродукцию в них вируса - в укороченном, в сравнении с ближайшим аналогом, цикле инкубации, - обеспечивает упрощение технологии производства и способствует повышению иммуногенной активности антигенного материала, что позволяет увеличить количество доз изготавливаемого из него вакцинного препарата, причем этот технический результат достигнут благодаря стабилизации вирусного гликопротеина, обеспеченной на заключительном этапе репродукции вируса и в ходе его выделения, а также при выполнении сорбции вируса на гидроокиси алюминия или при сублимационном высушивании.

1. Способ получения антирабической вакцины, включающий культивирование линии клеток, инфицирование выросшей культуры клеток вирусом бешенства с последующим инкубированием, инактивацию вируссодержащей суспензии с последующим приготовлением вакцины, отличающийся тем, что в качестве линии клеток используют сублинию клеток ″ВНК-21/13-02″, выращивают их безопорным методом в специальной среде для суспензионных условий, используя раствор Хенкса для суспензионного культивирования с добавлением сыворотки крови КРС, проверенной на отсутствие антител к вирусу бешенства и ростовые свойства, в концентрации 2,5%, D-глюкозу (1,0 г/л), D-фруктозу (1,0 г/л), l-глутамин (0,3 г/л), ферментативный мышечный гидролизат КРС (0,35% в пересчете на сухое вещество), l-аргинин, l-метионин, l-цистин, мио-инозитол и водорастворимые витамины согласно прописи среды Игла MEM, до концентрации (2,5-3,0)×106 кл./мл., инфицируют выросшую культуру клеток штаммом ″Щелково-51″ вируса бешенства, адаптированным к данной системе, в дозе 0,1-1,0 МЛД50/кл, инкубирование осуществляют при температуре 37°C в течение 48-72 часов безопорным методом, после чего добавляют стабилизирующий буфер, фиксируя pH в пределах 7,2-7,6, а затем инактивируют полученный вируссодержащий материал бета-пропиолактоном в конечной концентрации 0,025%, а затем приготавливают из него сорбированную или сухую вакцину.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что сорбированную вакцину приготавливают с помощью адсорбции инактивированного антигенного материала на гидроокиси алюминия, добавленной в количестве 10-25%.

3. Способ по п.1, отличающийся тем, что приготовление вакцины осуществляют сублимационным высушиванием с применением защитной среды, получая сухой продукт с увеличенным сроком хранения.

4. Способ по п.1, отличающийся тем, что в качестве стабилизирующего буфера используют TRIS-буфер в конечной концентрации 0,05М.

5. Способ по п.4, отличающийся тем, что инактивированный вируссодержащий материал перед высушиванием смешивают в соотношении 1:1 с защитной средой, содержащей желатин, пептон и сахарозу в соотношении 0,3:1:1 соответственно, pH среды составляет 7,2-7,6.



 

Похожие патенты:

Изобретение относится к химико-фармацевтической промышленности и представляет собой лекарственно средство для лечения гриппа и респираторных вирусных инфекций, содержащее 3,3-дииндолилметан, рыбий жир типа А и полисорбат 80 при соотношении компонентов, мас.%: 3,3-дииндолилметан 9-20, рыбий жир типа А 1-10, полисорбат 80 - остальное.
Изобретение относится к области медицины, а именно к фармакологии, и касается создания лекарственных средств, обладающих антиретровирусной активностью. В качестве такого средства предложена фармацевтическая композиция, содержащая активированную потенцированную форму антител к белку или пептиду иммунной системы, который взаимодействует с ВИЧ или содержание и/или функциональная активность которого изменяется в связи с инфицированием ВИЧ.

Изобретение относится к новым соединениям общей формулы 1 или их стереоизомерам или фармацевтически приемлемым солям, обладающим свойствами ингибитора РНК полимеразы HCV NS5B, и к способам их получения.
Изобретение относится к медицине, а именно к неврологии, и касается лечения неврологических осложнений при ветряной оспе у детей. Для этого осуществляют введение ацикловира, интерферона и внутривенных иммуноглобулинов.

Изобретение относится к медицине, а именно к применению поликарбоксильного производного фуллерена С60 в качестве микробицидного противовирусного средства для ингибирования вирусов простого герпеса (ВПГ) и цитомегаловируса (ЦМВ).
Изобретение относится к ветеринарной иммунологии. Способ вакцинопрофилактики респираторных болезней телят включает иммунизацию клинически здоровых телят 20-30-дневного возраста трехкратно с интервалом в 10-12 дней подкожными инъекциями гипериммунной сыворотки животных-доноров, содержащей антигемагглютинины к вирусу парагриппа-3 в титре не ниже 1:1280, к вирусу инфекционного ринотрахеита в титре 1:256, к вирусу вирусной диареи-болезни слизистых в титре 1:1024, к респираторно-синцитиальному вирусу в титре 1:128, к ротавирусу и коронавирусу в титре 1:128, в дозе 1 мл/кг живой массы, а через 15 дней после последней инъекции вакцинируют двукратным введением инактивированной комбинированной вакцины «Комбовак» против инфекционного ринотрахеита, парагриппа-3, вирусной диареи-болезни слизистых, респираторно-синцитиальной, рота- и коронавирусных болезней согласно наставлению.

Изобретение относится к средству против передачи ВИЧ/СПИД половым путем и к способу профилактики ВИЧ-инфекции путем введения указанного средства. Средство выполнено в виде суппозитория, который включает активную субстанцию и фармакологически приемлемую основу.

Группа изобретений относится к медицине, а именно к биофармацевтике, и может быть использована для сохранения иммуногенной композиции в пригодном состоянии для введения животному.

Изобретение относится к способу получения алкилбензилдиметиламмонийфторидов, обладающих противовирусным и антибактериальным действием. Заявленный способ заключается во взаимодействии смеси 1,5 М алкилиодида формулы RJ, где R представляет собой алкил C8H17-C18H37, в абсолютном спирте с диметилбензиламином при кипении, с последующей последовательной отгонкой этанола в вакууме, растворением остатка в этилацетате, высушиванием в диэтиловом эфире, отделением осевшего в виде масла полученного промежуточного продукта с отгонкой оставшегося эфира.
Изобретение относится к ветеринарной микробиологии и биотехнологии, может быть использовано при разработке средств специфической профилактики и, в частности, для получения вакцины против бешенства животных.
Изобретение относится к области ветеринарной вирусологии и касается способа определения полноты инактивации антирабической инактивированной вакцины. .

Изобретение относится к ветеринарной вирусологии и биотехнологии и касается штамма вируса эфемерной лихорадки крупного рогатого скота (ВЭЛ КРС). .
Изобретение относится к ветеринарной микробиологии и биотехнологии, может быть использовано при разработке средств специфической профилактики и, в частности, для получения вакцины против бешенства животных.

Изобретение относится к области биотехнологии ветеринарных препаратов. .
Изобретение относится к области экспериментальной медицины и касается средств для повышения противоопухолевой резистентности организма. .

Изобретение относится к области биотехнологии. .

Изобретение относится к области биотехнологии. .
Изобретение относится к биотехнологии, а именно к производству медицинских биологических препаратов. .
Изобретение относится к области ветеринарной вирусологии и биотехнологии. .
Изобретение относится к ветеринарии, а именно к биотехнологии, и может быть использовано для получения антирабической вакцины. Для этого культивирование культуры перевиваемых клеток ВНК осуществляют в течение 48-72 часов до концентрации (2,5-3,0)×106 кл./мл с последующим инфицированием клеток вирусом бешенства в дозе 0,01-0,1 ММЛД50/кл. Выдерживают при температуре 38,5-39,5°C в течение 60-90 минут с последующим разбавлением ростовой средой до концентрации сублинии клеток (0,5-0,6)×106 кл./мл и продолжением культивирования полученной суспензии в течение 48-72 часов при температуре 37-38°C и pH 7,1-7,3. После чего вируссодержащую суспензию охлаждают до температуры 4-8°C при pH 7,8-8,0 и добавляют трис(гидроксиметил)аминометан и динатриевая соль этилендиаминтетрауксусной кислоты, взятых в конечных концентрациях 0,7-0,9% и 0,006-0,01% соответственно. Для инактивации вируса в биореактор вносят β-пропиолактон. Использование данного способа позволяет повысить качество целевого продукта за счет увеличения выхода вирусного антигена, т.е. накопления вирусных частиц, гликопротеина, ответственного за выработку вируснейтрализующих антител, а также позволяет повысить стабилизацию антигенных свойств вирусного гликопротеина. 3 з.п. ф-лы, 1 табл., 9 пр.
Наверх