Оптимизированные последовательности днк, кодирующие легкую и тяжелую цепи моноклонального антитела, связывающего фактор некроза опухоли альфа, предназначенные для биосинтеза антитела, способ получения антитела посредством рекомбинантной клеточной линии cho-s



Оптимизированные последовательности днк, кодирующие легкую и тяжелую цепи моноклонального антитела, связывающего фактор некроза опухоли альфа, предназначенные для биосинтеза антитела, способ получения антитела посредством рекомбинантной клеточной линии cho-s
Оптимизированные последовательности днк, кодирующие легкую и тяжелую цепи моноклонального антитела, связывающего фактор некроза опухоли альфа, предназначенные для биосинтеза антитела, способ получения антитела посредством рекомбинантной клеточной линии cho-s

 

C12N15/00 - Получение мутаций или генная инженерия; ДНК или РНК, связанные с генной инженерией, векторы, например плазмиды или их выделение, получение или очистка; использование их хозяев (мутанты или микроорганизмы, полученные генной инженерией C12N 1/00,C12N 5/00,C12N 7/00; новые виды растений A01H; разведение растений из тканевых культур A01H 4/00; новые виды животных A01K 67/00; использование лекарственных препаратов, содержащих генетический материал, который включен в клетки живого организма, для лечения генетических заболеваний, для генной терапии A61K 48/00 пептиды вообще C07K)

Владельцы патента RU 2537266:

Общество с ограниченной ответственностью "Промоген-МАТ" (RU)

Изобретение относится к биохимии, в частности к молекулярной биологии, биотехнологии, генной инженерии. Изобретение представляет собой оптимизированные последовательности ДНК, кодирующие легкую и тяжелую цепь моноклонального антитела, предназначенные для синтеза антитела в рекомбинантных CHO-S клетках, и способ получения данного антитела в указанных клетках. Изобретение позволяет максимизировать продуктивность клеток и оптимизировать пострансляционные модификаций антитела, в частности гликозилирования тяжелых цепей антитела. В результате проделанной работы были разработаны несколько условий, позволяющих получать моноклональное антитело с высокой продуктивностью. 3 н. п. ф-лы, 2 ил., 6 табл.

 

Изобретение относится к фармацевтической субстанции терапевтического моноклонального антитела, нейтрализующего активность ФНО-α человека. Представлены оптимизированная последовательность ДНК, способ биосинтеза антитела на основе рекомбинантной клеточной линии CHO-S с описанием важных параметров конечного продукта. Изобретение может быть использовано для создания фармацевтического препарата, применяемого при аутоиммунных заболеваниях, в частности ревматоидного артрита, болезни Крона, язвенного колита, анкилозирующего спондилита, псориатического артрита и др.

Антитела (иммуноглобулины) - класс биологических молекул, синтезируемых В-лимфоцитами иммунной системы. Они обладают свойством высокоспецифично связываться с чужеродными объектами, тем самым нейтрализуя и индуцируя их уничтожение клетками-киллерами. С развитием гибридомных клеточных технологий и молекулярно-биологических методов появилась возможность искусственно создавать и производить антитела, специфичные только к заданной молекулярной мишени (моноклональные антитела). В настоящее время это свойство моноклональных антител активно используется для лечения различных онкологических и аутоимунных заболеваний. Аутоиммунные заболевания, среди которых доминирует ревматоидный артрит, представляет собой тяжелую социальную и экономическую проблему. Золотым стандартом лечения ревматоидного артрита является использование рекомбинантных препаратов на основе моноклональных антител к фактору некроза опухоли (ФНО). Блокирование моноклональными антителами связывания ФНО с иммунокомпетентными клетками обеспечивает противовоспалительный эффект таких лекарств и стойкую ремиссию у больных.

С целью промышленной продукции белков, имеющих фармацевтическое значение, в частности моноклональных антител, широко используются клетки СНО. Важным свойством клеток СНО для использования в клеточной биотехнологии является их широкая приспособляемость к разнообразным условиям культивирования и высокая генетическая пластичность, что позволяет с относительной легкостью проводить с данными клетками различные генетические манипуляции. Кроме того, эти клетки способны к росту при очень высокой клеточной плотности в больших крупногабаритных ферментерах объемом до 10 тыс. литров. Более того, клетки СНО соответствуют принципам биологической безопасности, поскольку подавляющее большинство патогенных вирусов человека, включая вирусы иммунодефицита, полиомиелита, гриппа и герпеса, неспособно в них размножаться.

Вышеупомянутые качества сделали клетки СНО главной клеточной культурой в мировой биотехнологии. В настоящее время около 70% рекомбинантных фармацевтических биопрепаратов производится именно на основе клеток СНО.

Уже существующий на рынке препарат на основе моноклонального антитела к ФНО-α человека моноклональное антитело (Ремикейд®) до сих производится в клеточной линии мышиной меланомы SP2/0, разработанной около 20 лет назад, в то время как разработанный штамм-продуцент моноклонального антитела к ФНО-α человека производится в CHO-S клетках, являющихся на сегодня «золотым стандартом» по соотношению эффективности и безопасности в производстве биофармацевтических препаратов, и позволяет минимизировать риски загрязнения продукта эндогенными вирусами и белками клетки-продуцента в процессе производства. Очевидно, переход на принципиально новую клеточную систему экспрессии требует создания и отработки каждой стадии нового технологического процесса - от культивирования до стадий финальной очистки и получения ГЛФ.

Для эффективной экспрессии требуется оптимизация последовательности ДНК целевого белка. Показано, что на эффективную экспрессию влияют такие факторы, как процент содержания G-пар, вторичная структура РНК, наличие внутренних сигналов сплайсинга, наличие коротких рамок считывания, длинных гомополимерных последовательностей, использование кодонов и пар кодонов с разной степенью встречаемости. Было показано, что для антител оптимизация последовательности ДНК может значительно повысить уровень экспрессии. Таким образом, последовательности ДНК, кодирующие тяжелую и легкую цепи моноклонального антитела к ФНО, были оптимизированы для получения высокого уровня экспрессии.

Разработка клеточной линии-продуцента моноклонального антитела к ФНО-α человека включала в себя следующие этапы:

- оптимизация последовательностей ДНК, кодирующих легкую и тяжелую цепь антитела (фиг.1);

- создание двух экспрессионных конструкций, кодирующих тяжелую и легкую цепи рекомбинантного моноклонального антитела (фиг.2);

- проведение трансфекции клеток СНО полученными экспрессионными плазмидами;

- отбор клонов и создание клеточного банка штамма-продуцента.

Были сконструированы экспрессионные плазмиды v240 и v241, содержащие кДНК, кодирующие рекомбинантное моноклональное антитело к ФНО-α человека, под контролем цитомегаловирусного промотора. Экспрессионные плазмиды были синтезированы с использованием стандартных молекулярно-биологических методов.

Была проведена трансфекция клеточной линии CHO-S химическим методом. Успешно трансфецированные клетки были отобраны с применением антибиотиков: зеоцин и бластицидин. Для отбора клонов, имеющих максимальную продуктивность по антителу, был использован метод предельных (лимитирующих) разведений с последующей оценкой концентрации моноклонального антитела с помощью ИФА. Отобранные клоны амплифицировали в условиях нормального клеточного роста и создали клеточные банки.

Техническим результатом изобретения является максимизация продуктивности клеток и оптимизация пострансляционных модификаций антитела, в частности гликозилирования тяжелых цепей антитела. В результате проделанной работы были разработаны несколько условий, позволяющие получить моноклональное антитело с высокой продуктивностью и различным гликозилированием тяжелой цепи в зависимости от условий культивирования.

Примеры

В качестве основной среды для культивирования была выбрана среда ActiCHO P CD (GE Healthcare) с добавлением 6 мМ L-глутамин и 0,1% Pluronic F-68. В качестве добавок использованы UMG (300 мМ уридин, 1500 мМ галактоза, 0,6 mM MnCl2), ActiCHO FeedA CD (GE Healthcare) совместно с ActiCHO FeedB CD (GE Healthcare) (в объемном соотношении 10:1, добавляются по отдельности) глюкоза 250 г/л и FunctionMAX Titer Enhancer (Life Technologies). Разработанные схемы культивирования, описывающие порядок внесения различных компонентов, представлены в таблице 1. Клетки культивировали в шейкерных колбах на орбитальном шейкере при ~110 об/мин при 36,5°С, 5% CO2 в инкубаторе. Для культивирования использовали клетки, депонированные во Всероссийскую Коллекцию Промышленных Микроорганизмов под регистрационным номером Н-145.

Таблица 1
Схема внесения компонентов при культивировании
Компоненты День
0 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14
ActiCHO Feed-A+B 1,76% 1,7 6% 1,7 6% 1,7 6% 1,7 6% 1,7 6% 1,7 6% 1,7 6% 1,7 6% 1,7 6% 1,7 6% 1,7 6% 1,7 6%
FM 3,5% 3,5% 3,5% 3,5%
UMG

Было экспериментально выяснено, что добавление NaCl до концентрации 0,5 М и 1М увеличивает выход целевого антитела после первой стадии аффинной очистки. В качестве аффинного сорбента использовали Mab Select (GE Healthcare). Для оптимизации условий использовали 5 мл сорбента. Перед нанесением образцов колонну уравновешивали 4-5 объемами (относительно объема колонны) буфера Mab 1 (20 mM PhNa, 0,5 М NaCl, pH 7,0). Элюцию с колонны осуществляют 4-5 объемами буфера Mab 2 (100 mM Gly-HCl, pH 3,5). Выход оценивали по количеству белка, измеренным спектрофотометрически, после элюции. Было доказано, что внесение хлорида натрия перед стадией аффинной хроматографии в концентрации 0,5М и 1М увеличивает выход антитела (таблица 2). Было решено добавлять хлорид натрия к культуральной жидкости в концентрации 0,5М непосредственно до стадии фильтрации культуральной жидкости.

Таблица 2
Выход антитела к ФНО-α с MabSelect в зависимости от концентрации хлорида натрия в культуральной жидкости
Концентрация NaCl в культуральной жидкости, М Емкость сорбента MabSelect, мг/мл
0 17,7
0,5 26,28
1 26,3

Перед очисткой антитела культуральную жидкость размораживают, добавляют NaCl до конечной концентрации 0,5М и фильтруют. Первую стадию очистки проводят при температуре 2-8°С. Условия очистки такие же, как и описаны выше с учетом большего объема сорбента. В процессе элюции белковый раствор титруют до значений рН 5,5±0,2 раствором 1 М Трис-HCl рН 8,0. Вторую стадию очистки моноклонального антитела проводят на сорбенте Fractogel SO3 (Merck) при температуре 2-8°С. Колонну уравновешивают буфером Frac 1 (20 mM NaAc, рН 5,5). Раствор моноклонального антитела разводят уравновешивающим буфером Frac 1 (20 mM NaAc, рН 5,5) до значения проводимости не выше 5 mS/cm (кратность разведения 3-4 раза), доводят рН до значения 5,5±0,2 0,25 М уксусной кислотой, наносят на колонну. Колонну промывают 300 мл буфера Frac 1. Элюцию с колонны осуществляют ступенчатым градиентом 20% буфера Frac 2 (20 mM NaAc, 1 М NaCl, рН 5,5) в буфере Frac 1 (20 mM NaAc, рН 5,5). Начиная с оптической плотности 10 mAU (UV 280 нм), собирают фракции и анализируют методом ГФ-ВЭЖХ. По результатам анализа объединяют фракции с чистотой 98,5% и выше. Полученный раствор белка фильтруют через насадку фильтрующую на флакон Стеритоп 0,22 мкм. Затем раствор антитела концентрируют, используя мембраны для тангенциальной фильтрации с пределом отсечения 50 кДа, уравновешенную буфером ГЛФ (5 mM натрия гидрофосфат, 1,6 mM натрия дигидрофосфат, 142 mM сахарозы, 0,05% полисорбат-80). Далее раствор подвергается последней стадии - гель-фильтрующей хроматографии на сорбенте Sephadex G25 (GE Healthcare). Процесс проводят при температуре 2-8°С. На колонну, предварительно уравновешенную буфером ГЛФ, наносили раствор моноклонального антитела, элюцию с колонны проводили в буфере ГЛФ объемом. Полученный раствор антитела фильтруют через фильтр на 0,2 мкм и при -20°С.

Выявлен состав стабильной фармацевтической композиции в виде лифилизата, куда входят, мг: разработанное антитело против ФНО-α человека - 100; натрия гидрофосфат дигидрат - 6,1; натрия дигидрофосфат моногидрат - 2,2; сахароза - 500 и полисорбат - 80-0,5. Для получения данной композиции были использованы следующие условия сушки:

Замораживание - 2 часа при -30 - -40°С,

Сублимация при -20°С, 6 часа, 70-110 мТорр,

Ступенчатый переход на десорбцию - от -20 до +25°С в течение 2 часов при 70-110 мТорр,

Десорбция при +25°С, 5 часов, 70-110 мТорр.

Для оценки биологической активности были проведены in vitro и in vivo исследования. В частности, был проведен ряд исследований для комплексной оценки связывания антитела с антигеном: методом ИФА было изучено связывание с человеческим ФНО-α в растворимой мономерной и тримерной формах, методом сортировки флуоресцентно-активированных клеток было изучено связывание с трансмембранным нерастворимым ФНО-α на поверхности клеток и, более того, с помощью метода поверхностного плазменного резонанса были определены константы диссоциации (для комплекса антитела с мономерной и тримерной формой ФНО-α). Для оценки биологической активности было проведено исследование нейтрализующей активности по отношению к WEHI-164. Результаты представлены в таблице 3. Данные подтверждают наличие биологической активности полученного антитела in vitro.

Таблица 3
Результаты оценки биологической активности in vitro моноклонального антитела к ФНО-α человека
Исследование Значение Стандартное отклонение
Связывание с растворимым ФНО-а человека в мономерной форме, ЕС50 (нМ) 0.1335 0.0262
Связывание с растворимым ФНО-а человека в гомотримерной форме, ЕС50 (нМ) 0.0251 0.0037
Связывание с трансмембранным ФНО-а человека, ЕС50 (нМ) 5.632 0.5928
Нейтрализующая активность по отношению к клеткам WEHI-164, ЕС50 (нМ) 0.4854 0.0888

Эффективность разработанного моноклонального антитела к ФНО-α человека была доказана in vivo на трансгенных мышах Tg197 с гиперэкспрессией ФНО-α человека, приводящей к развитию полиартрита, начиная с 3-4-й недели жизни животного. Была проведена оценка терапевтической эффективности разработанного антитела в предотвращении проявления симптомов артрита у генетически модифицированных мышей Tg197. Для проведения данного исследования мыши (12 мышей в каждой группе, равное количество самцов и самок) получали исследуемое антитело болюсно, однократно (в дозировках 10 мг/кг и 30 мг/кг), внутрибрюшинно на четвертой неделе жизни после появления проявлений артрита, но до развития данных проявлений, а затем проводили оценку состояния данных мышей в возрасте более 5 недель до достижения 9-й недели жизни. Как показали результаты исследования, лечение исследуемым препаратом при дозировке 10 мг/кг оказывало подавляющее действие на развитие проявления полиартрита, однако не обеспечивало полную защиту от развития данного заболевания. В случае дозировки 30 мг/кг исследуемый препарат оказывал подавляющее действие на развитие проявления полиартрита и сохранял их статистически единообразными по сравнению с мышами в возрасте 3 недель из контрольной группы, не получавших препарат. В таблицах 4-6 приведены данные исследования эффективности разрабатываемого препарата на мышах Tg197.

Таблица 4
Средняя масса тела в группе
Средняя масса тела (г) Неделя 4 Неделя 5 Неделя 6 Неделя 7 Неделя 8 Неделя 9
Возраст 4 недели, контрольная группа, не получавшая препарат 10,93 - - - - -
G1-PRM-002 10 мг/кг 12,24 15,28 16,62 17,36 18,02 18,88
G2-PRM-002 30 мг/кг 12,27 15,75 17,51 18,21 19,78 20,86
G3-физиологический 12,26 14,34 15,23 15,58 15,71 16,40
Таблица 5
Средняя оценка артрита, in-vivo
Средняя оценка артрита в условиях in-vivo Неделя 4 Неделя 5 Неделя 6 Неделя 7 Неделя 8 Неделя 9
Возраст 4 недели, контрольная группа, не получавшая препарат 0,38 - - - - -
G1-PRM-002 10 мг/кг 0,40 0,43 0,66 0,71 0,82 0,91
G2-PRM-002 30 мг/кг 0,38 0,28 0,36 0,32 0,35 0,45
G3-физиологический раствор 0,29 0,70 0,88 0,99 1,27 1,25
Таблица 6
Средняя гистопатологическая оценка уровня развития артрита, ех-vivo
Средняя гистопатологическая оценка уровня развития артрита Неделя 4 Неделя 9
Возраст 4 недели, контрольная группа, не получавшая препарат 1,50 -
G1-PRM-002 10 мг/кг - 2,83
G2-PRM-002 30 мг/кг - 1,42
G3-физиологический раствор - 3,27

1. ДНК, кодирующая тяжелую цепь антитела, связывающего человеческий ФНО-α, представленная SEQ ID:1 и предназначенная для синтеза данного антитела в рекомбинантных CHO-S клетках.

2. ДНК, кодирующая легкую цепь антитела, связывающего человеческий ФНО-α, представленная SEQ ID:2 и предназначенная для синтеза данного антитела в рекомбинантных CHO-S клетках.

3. Способ получения моноклонального антитела, связывающего человеческий ФНО-α, включающий введение ДНК по пп.1 и 2 в рекомбинантные CHO-S клетки, их культивирование и последующую очистку антитела к ФНО-α.



 

Похожие патенты:

Настоящее изобретение относится к биотехнологии и представляет собой молекулярные конъюгаты, способные связываться с нуклеиновыми кислотами (ДНК или РНК) для доставки их в клетки млекопитающего, экспрессирующие рецепторы трансферрина.

Изобретение относится к области молекулярной биологии и генной инженерии. Предложена молекула RNAi для супрессии экспрессии тимидилатсинтазы за счет действия RNAi, содержащая домен двухцепочечной РНК, состоящий из смысловой цепи, состоящей из нуклеотидной последовательности, представленной SEQ ID NO: 1, гибридизованной с антисмысловой цепью, гибридизующейся в жестких условиях со смысловой цепью.

Изобретение относится к биотехнологии и генной инженерии и представляет собой рекомбинантный слитый белок формулы S-L-R, в том числе SR10, SR13, SR15, SdR10, SdR13 или SdR15, специфически узнающий меланомные клетки, в котором S - мономер стрептавидина, L - линкер, имеющий аминокислотную последовательность Ser-Arg-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys, содержащую сайт расщепления энтеропептидазой и обозначаемую как «d», или аминокислотную последовательность Ser-Arg-Ala-Gly-Ala,R - меланома-адресующий олигопептид, представляющий собой R10, имеющий аминокислотную последовательность Asp-Gly-Ala-Arg-Tyr-Cys-Arg-Gly-Asp-Cys-Phe-Asp-Gly, или R13, имеющий аминокислотную последовательность Leu-Ser-Gly-Cys-Arg-Gly-Asp-Cys-Phe-Glu-Glu, или R15, имеющий аминокислотную последовательность Asp-Gly-Phe-Pro-Gly-Cys-Arg-Gly-Asp-Cys-Ser-Gln-Glu.

Группа изобретений относится к области биотехнологии и направлена на молекулы нуклеиновых кислот, которые кодируют белок, проявляющий свойства биосенсора для детекции пероксида водорода в живых клетках, обладающий флуоресценцией в красной области спектра.

Изобретение относится к молекулярной биологии, в частности к коротким интерферирующим РНК (siRNA), и может быть использовано в противоопухолевой терапии. На основе геномного анализа сконструированы последовательности siRNA против гена HIF1A человека с SEQ ID NO:1-2, siRNA против гена HSP8A человека с SEQ ID NO:3-4, siRNA против гена APEX1 человека с SEQ ID NO:5-6 и siRNA против гена CCND3 человека с SEQ ID NO:7-8, ассоциированных с пролиферацией клеток аденокарциномы поджелудочной железы человека.
Изобретение относится к биотехнологии и микробиологии и представляет собой способ идентификации кластера генов, кодирующих стафилококковые белки, являющиеся экзотоксинами.

Изобретение относится к биотехнологии и представляет собой рекомбинантную плазмидную ДНК pET3.54, кодирующую полипептид FN3.54, взаимодействующий с фактором некроза опухолей человека.

Изобретение относится к биотехнологии и представляет собой рекомбинантный штамм бактерий Escherichia coli N41 (pBpuN4/MR), который получен путем трансформации штамма Escherichia coli ER2267 плазмидой pBpuN4/MR N41, полученной на основе плазмиды pUC19 и содержащей ген, кодирующий ДНК-метилтрансферазу M.BpuN4I, метилирующую один из цитозинов в положении С5 в последовательности 5'-GGNNCC-3', и ген рестриктазы BpuN4I.

Изобретение относится к области биоинженерии, молекулярной биологии и биотехнологии. Предложена дрожжевая клетка, предназначенная для детекции взаимодействия между белками и их доменами, котрансформированная двумя плазмидами, модифицированными для экспрессии в клетках дрожжей двух белков, где нуклеотидная последовательность, кодирующая первый белок, клонирована в одну плазмиду, а нуклеотидная последовательность, кодирующая второй белок, - в другую плазмиду, где нуклеотидные последовательности, кодирующие белки, слиты с нуклеотидными последовательностями, кодирующими активационный и ДНК-связывающий домены белка GAL4, при этом нуклеотидные последовательности, кодирующие исследуемые белки, отделены от нуклеотидных последовательностей, кодирующих активационный или ДНК-связывающий домен белка GAL4, при помощи нуклеотидной последовательности, кодирующей пептид, представляющий собой последовательность GluLeuGluAlaAlaAlaLysGluAlaAlaAlaLysGluAlaAlaAlaLysGluAlaAlaAla, который экспрессируется в виде белкового мостика между исследуемым белком и доменами белка GAL4.

Изобретение относится к области молекулярной биологии, биохимии и генной инженерии. Предложены нуклеиновая кислота, характеризующаяся нуклеотидной последовательностью, кодирующей белок, который состоит из аминокислотной последовательности с делецией, заменой или добавлением одной или более аминокислот в аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 2 или SEQ ID NO: 7 и обладает активностью фосфатазы фосфатидной кислоты, соответствующий белок, рекомбинантный вектор, клетка для экспрессии белка и способ получения композиции жирной кислоты.

Группа изобретений относится к генной инженерии, биохимии, биотехнологии и иммунологии и представляет собой рекомбинантную плазмиду pESAT6-CFP10-DBD, рекомбинантный штамм Escherichia coli M15 [pREP4, pESAT6-CFP10-DBD], способ получения, иммобилизации, концентрирования и очистки рекомбинантного белка ESAT6-CFP10-DBD на декстране, рекомбинантный белок ESAT6-CFP10-DBD с молекулярной массой 26,4 кДа, иммуногенную композицию, содержащую белок ESAT6-CFP10-DBD, иммобилизованный на декстране, специфически активирующую Т-лимфоциты, синтезирующие ИФН-гамма при стимуляции антигенами микобактерий. Изобретение позволяет получить высокий уровень экспрессии белка, который эффективно индуцирует иммунный ответ на антиген микобактерий. 5 н.п. ф-лы, 2 ил., 1 табл., 5 пр.

Изобретение относится к области биотехнологии, в частности к способам получения ферментных препаратов. Изобретение касается термостабильной двухдоменной лакказы бактерии Streptomyces griseoflavus Ac-993 со щелочным оптимумом активности, последовательности ДНК, кодирующей данный фермент, и способа получения фермента, включающий клонирование в клетках бактерии Escherichia coli гена фермента, продукцию фермента в клетках Escherichia coli, внесение ионов меди в среду для культивирования рекомбинантного штамма для образования активного фермента, получение ферментного препарата методами металлхелатной хроматографии и гельфильтрации. Изобретение позволяет расширить ассортимент ферментов, таких как лакказа. 3 н.п. ф-лы,3 ил.

Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к созданию конъюгатов магнитная частица - нуклеиновая кислота, и может быть использовано для молекулярно-генетической диагностики. Бионаноконъюгат включает наноразмерную суперпарамагнитную частицу кобальтовой феррошпинели CoxFe3-xO4, где 0.6≤x≤0.98, полученную механохимическим синтезом. Для выделения нуклеиновой кислоты, содержащей олиго- или поли-A/dA последовательность, используют синтетический одноцепочечный олигонуклеотид 5′-dGndTm, где n=5-30, m=10-35, один участок которого, состоящий из гуаниновых нуклеотидов, в присутствии фосфат-анионов в растворе специфически связан с поверхностью наночастицы, а другой - состоящий из тиминовых нуклеотидов, способен вступать в гибридизацию с олиго- или поли-A/dA нуклеотидными последовательностями. Для выделения из раствора в присутствии фосфат-анионов специфической гетеронуклеотидной последовательности дополнительно используют молекулу олигонуклеотида-адаптера, содержащую последовательность олиго-dAx на 3′-конце, гибридизованную с тиминовыми нуклеотидами комплекса комплекса 5′-dGndTm, где n=5-30, m=10-35, и участок на 5′-конце, комплементарный специфической гетеронуклеотидной последовательности в растворе. Изобретение позволяет эффективно обнаруживать и выделять одноцепочечные нуклеиновые кислоты. 2 н. и 1 з.п. ф-лы, 8 ил., 1 табл., 5 пр.

Заявленная группа изобретений относится к области биологии, в частности к оборудованию для автоматической очистки биологических образцов при выделении целевых веществ из множества биологических образцов, для автоматической очистки биологического образца, оснащенное элементом для приложения магнитного поля, в котором элемент для приложения магнитного поля для очистки биологических образцов и нагревательный элемент сформированы в виде единого компонента друг с другом так, чтобы быть подвижными вверх и вниз. Устройство для автоматической очистки содержит блок 100 пипеток, который размещен с возможностью вертикального и горизонтального перемещения, в который с возможностью удаления установлено множество пипеток 141, 142 для всасывания и выведения материала текучей среды, нагревательный элемент 810 для нагревания конкретного блока лунок многолуночного планшета 420, 420′, элемент 700 для приложения магнитного поля, установленный на опорной плите 400, содержащий элемент 710 для установки магнита. На элементе 700 смонтирован магнит 711, размещенный у нижней стороны конкретного блока лунок многолуночного планшета 420, 420′, и подъемный элемент 760 для подъема вверх и опускания вниз элемента 710 для установки магнита, с возможностью приложения магнитного поля к конкретному блоку лунок многолуночного планшета 420, 420′, размещенному у нижней стороны блока 100 пипеток, и удалять от него. В способе извлечения целевого вещества из биологического образца использовано устройство для автоматической очистки биологического образца, оснащенное элементом для приложения магнитного поля. Изобретения обеспечивают повышение эффективности и качества выделения и очистки. 6 н. и 20 з.п. ф-лы, 48 ил.

Группа изобретений относится к генной инженерии, биохимии, биотехнологии и иммунологии. Представлена рекомбинантная плазмида pCFP10-DBD, состоящая из искусственного бактериального оперона химерного белка, включающего промоторную область раннего промотора бактериофага Т5, ген химерного белка, состоящий из последовательности белкового антигена CFP10 из Mycobacterium tuberculosis, слитой с последовательностью декстрансвязывающего домена (DBD) декстрансукразы Leuconostoc citreum KM20, и терминатор транскрипции, бактериального оперона бета-лактамазы и бактериального участка инициации репликации типа ColE1. Также представлен штамм Escherichia coli - продуцента химерного белка CFP10-DBD. Описан способ иммобилизации, концентрирования и очистки полученного белка на целлюлозе. Описана иммуногенная композиция, содержащая рекомбинантный белок CFP10-DBD, направленная на индукцию иммунитета против туберкулезной инфекции. Изобретение расширяет арсенал средств, используемых для лечения туберкулеза. 4 н.п. ф-лы, 6 ил., 1 табл., 4 пр.

Изобретение относится к биохимии. Изобретение обеспечивает способ одновременной (мультиплексной) амплификации и флуоресцентного маркирования ДНК нескольких сегментов генома микобактерий туберкулезного комплекса (Mycobacterium tuberculosis, M. bovis, M. bovis BCG, M. africanum и M. microti). Далее проводится гибридизационный или электрофоретический анализ последовательностей данных сегментов. Мультиплексная ПЦР осуществляется в едином реакционном объеме с использованием специфичных и адаптерных праймеров, флуоресцентного субстрата, встраиваемого в растущую цепь ДНК в ходе ПЦР и геномной ДНК в качестве матрицы. Мультиплексная ПЦР включает два последовательных профиля амплификации, различающихся температурами отжига специфичных и адаптерных праймеров не менее чем на 10°С. Изобретение позволяет проводить анализ последовательностей данных генов на выявления мутаций, ассоциированных с устойчивостью к противотуберкулезным препаратам. Способ по изобретению сокращает число стадий амплификаций для получения одноцепочечных флуресцентно-меченных ПЦР-продуктов, исключает перенос ДНК-матрицы из одного реакционного объема в другой, что повышает устойчивость процедуры к контаминации ПЦР-продуктами и существенно снижает время и трудоемкость анализа. 4 ил., 1 табл., 1 пр.

Изобретение относится к области биотехнологии и может быть использовано для определения генотипа человека по полиморфизму в гене матриксной металлопротеиназы ММР9-1562 C>Т (rs3918242). Способ основан на снятии кривых плавления с флуоресцентно-мечеными аллель-специфичными олигонуклеотидными пробами. В способе используют общую для всех аллелей пару праймеров, отличающиеся для каждого аллеля флуоресцентно-меченые аллель-специфичные олигонуклеотидные пробы и универсальный олигонуклеотид, меченый гасителем флуоресценции следующего нуклеотидного состава: MMP9-1562s CGAAACCAGCCTGGTCAACG; ММР9-1562а TCTGCCTCCCGGGTTCAAGC; ММР9-1562р1 GGCGCACGCCTATAA-FAM; ММР9-1562р2 GGCGCATGCCTATAA-HEX; ММР9-1562pq BHQ1-ACCAGCTACTCGGGAGGC-3'-(P), где FAM - означает флуоресцентный краситель FAM, HEX - означает флуоресцентный краситель HEX, BHQ1 - означает присоединенный к 5'-концевому нуклеотиду темновой гаситель флуоресценции. Отнесение образца к гомозиготе или гетерозиготе по данному аллелю оценивается по форме кривых плавления ДНК - по максимуму первой производной графиков флуоресценции. Изобретение позволяет повысить надежность и доступность генотипирования. 1 ил.

Изобретение относится к области биотехнологии и медицины и касается РНК-аптамера. Предложенный РНК-аптамер представляет собой 57-звенный олигонуклеотид смешанного типа, имеющий нуклеотидную последовательность GGGAGGACGAUGCGGUGUUUUCUGAGUACAUCUCUGCCCCACCCUU GUUUACCCCCA, где A,G - рибонуклеотиды, U, С - 2'-дезокси-2'-фторрибонуклеотиды, обладает способностью узнавать характерные для рассеянного склероза аутоантитела. Охарактеризованное изобретение специфично и высокоафинно связывается с аутоантителами, характерными для рассеянного склероза и может быть использовано для диагностики рассеянного склероза. 3 ил., 2 пр.

Изобретение относится к биотехнологии и предоставляет собой способ получения полезных метаболитов с использованием бактерии семейства Enterobacteriaceae, в частности бактерии, принадлежащей к роду Escherichia, которая модифицирована таким образом, что она содержит генетическую экспрессионную систему, включающую транскрипционный аппарат, регулируемый белком типа LysR, и модифицированную таким образом, что самоиндуцируемая положительная регуляция по типу обратной связи указанной системы опосредована коиндуктором. Данный способ пригоден для продукции L-аминокислот с разветвленной цепью, в частности L-валина, L-изолейцина и L-лейцина, высших спиртов и D-пантотеновой кислоты. Изобретение позволяет получать L-аминокислоты с высокой степенью эффективности. 3 н. и 20 з.п. ф-лы, 2 ил., 5 табл., 6 пр.

Изобретение относится к олигопептидам, содержащим последовательность NLSSAEVVV (SEQ ID NO:6), в которой одна или две аминокислоты могут быть замещены, имеющим индуцибельность цитотоксических Т-клеток, их фармацевтическим композициям и применению для изготовления противораковых вакцин. 10 н. и 10 з.п. ф-лы, 6 ил., 1 табл., 1 пр.
Наверх