Способ активации сухой формы биопрепарата для очистки нефтезагрязненных грунтов

Изобретение относится к экологии и биотехнологии. Для активации сухой формы биопрепарата для очистки нефтезагрязненных грунтов готовят водную суспензию с индуктором ферментных систем. В качестве водного раствора для приготовления рабочей суспензии активированного биопрепарата с концентрацией микроорганизмов не менее 5×10⁷ КОЕ/мл используют раствор, содержащий 1 г/л триптона, 2,5 г/л глюкозы, 1 г/л дрожжевого экстракта и 1,5 г/л сульфата аммония. В качестве индуктора ферментных систем используют 5 мл/л дизельного топлива. Раствор барботируют при аэрации воздухом 1 л/мин на 1 л раствора в течение 14-18 ч без термостатирования. Изобретение обеспечивает повышение концентрации микроорганизмов в водной суспензии и повышение эффективности деструкции нефти. 1 табл.

 

Изобретение относится к экологии и биотехнологии, а именно к технологическому использованию сухой формы биопрепарата для очистки грунтов, загрязненных нефтью и нефтепродуктами.

Распространенная форма бактериальных биопрепаратов - сухая биомасса, обезвоженная с использованием различных способов сушки. При высушивании численность микроорганизмов в биопрепарате обычно снижается. Кроме того, экспериментальные данные показывают, что в процессе лиофилизации возможно появление мутаций и нарушение генетической стабильности многих видов микроорганизмов. Первым необходимым этапом подготовки сухого биопрепарата перед его применением является регидратация клеток микроорганизмов-нефтедеструкторов, находящихся в неактивной, обезвоженной форме, для восстановления их физиологической активности.

Известны способы подготовки препаратов для биоремедиации почвы, с использованием регидратации и стимулирования метаболической активности (активации) микроорганизмов-нефтедеструкторов. Наиболее распространенными способами регидратации сухой формы биопрепарата являются методы аэрации (барботирования) или механического перемешивания его водной суспензии. При этом возможно стимулирование микробных систем биодеградации углеводородов путем внесения в водную суспензию органических соединений, являющихся индукторами ферментных систем. После внесения активированной суспензии биопрепарата в грунт повышение эффективности деградации нефти возможно за счет внесения минеральных и органических питательных веществ, а также сорбентов.

Известен способ подготовки сухих культур нефтеразрушающих микроорганизмов, входящих в бактериальные препараты, деградирующие углеводороды нефти и нефтепродуктов в загрязненной почве, например, бактериальных препаратов: «Путидойл» (ТУ 64.14.110-86), «Деворойл» (ТУ 9291-023-45181233-03), «Дестройл» (ТУ 9291-006-05803071-96). В соответствие с описанными способами подготовки питательной среды, в нее вносят бактериальный препарат из расчета не более 0.7 кг каждого из вышеуказанных препаратов на 1 м³ питательного раствора азотно-фосфорного удобрения, затем приготовленную смесь аэрируют в течении 4-18 часов при температуре 25-30°C при перемешивании всего объема. Недостатком указанного способа является отсутствие нефтяного субстрата, который способствует активации ферментных систем углеводородокисляющих микроорганизмов.

Известен способ очистки почв и грунтов, описанный в патенте «СПОСОБ БИОРЕМЕДИАЦИИ ПОЧВ И ГРУНТОВ, ЗАГРЯЗНЕННЫХ НЕФТЬЮ И НЕФТЕПРОДУКТАМИ» [1] с использованием олеофильного биопрепарата на основе ассоциации нефтеокисляющих микроорганизмов: Rhodococcus erythropolis ИЭГМ 708 и Rhodococcus ruber ИЭГМ 327 и Rhodococcus-биосурфактанта, отличающийся тем, что производят первоначальную обработку сильнозагрязненной почвы/грунта до достижения уровня остаточных нефтепродуктов 5-10% вес. и последующее добавление органического разрыхлителя, олеофильный биопрепарат вносят в количестве не менее 10 л на 0.5-1.0 м³ почвы/грунта по меньшей мере один раз в неделю в течение первого месяца и в дальнейшем по меньшей мере один раз в месяц до окончания цикла биоремедиации в сочетании с периодическим рыхлением и увлажнением и дополнительно производят фиторемедиацию - засев многолетними травами.

Однако вышеописанный способ предполагает использование твердо-жидкофазного биореактора и/или аэрируемых почвенных площадок для первоначальной обработки сильнозагрязненной почвы. Такой метод снижения уровня загрязнения трудоемок и не применим при масштабных авариях и разливах нефти и нефтепродуктов. Кроме того, внесение биопрепарата количестве не менее 10 л на 0.5-1.0 м³ почвы/грунта, а также его повторное внесение один раз в неделю в течение первого месяца и в дальнейшем по меньшей мере один раз в месяц, может привести к излишнему заводнению грунта, что препятствует доступу кислорода воздуха и снижает эффективность биодеградации.

Известен патент «СПОСОБ ОЧИСТКИ ВОДОЕМОВ И ПОЧВ ОТ НЕФТЯНЫХ ЗАГРЯЗНЕНИЙ» [2]. Способ предусматривает нанесение препарата углеводородокисляющих микроорганизмов на нефтесубстрат загрязненного участка. Перед нанесением микроорганизмы препарата культивируют в среде, содержащей нефтесубстрат загрязненного участка. Причем нефтесубстрат берут в количестве, которое обеспечивает симбиотический рост углеводородокисляющих микроорганизмов препарата, а также аборигенных бактерий-нефтедеструкторов, присутствующих в нефтесубстрате. Наличие симбиотического роста легко определяется в процессе культивирования общеизвестными экспресс-методами. Культивирование осуществляют глубинным методом в течение 2-24 ч при доле нефтесубстрата в массе культивационной среды 1-50%. Такой способ культивирования предназначен для подготовки микроорганизмов вне загрязненного участка и осуществляется, как правило, в емкостях с использованием мешалок и/или барботирования в течение 1-4 суток. Недостатком вышеописанного способа является то, что использование высоких концентраций нефтесубстрата (до 50%), как и использование тяжелых фракций нефти (мазута) в качестве нефтесубстрата может значительно ингибировать рост микроорганизмов. Кроме того, отсутствует информация о составе культивационной среды.

Задача настоящего изобретения состоит в создании нового способа активации сухой формы биопрепарата для очистки нефтезагрязненных грунтов, который обеспечивает в рабочей суспензии высокую концентрацию микроорганизмов с активированными ферментными системами биодеградации.

Технический результат, который может быть достигнут при использовании предлагаемого изобретения, состоит в том, что при активации сухой формы биопрепарата концентрация микроорганизмов в водной суспензии увеличивается не менее, чем в 10 раз, и составляет не менее 5×10⁷ КОЕ/мл, при этом за счет индукции углеводородным субстратом ферментных системам биодеградации эффективность деструкции нефти достигает 50%.

Согласно изобретению данная задача решается за счет того, что сухую форму биопрепарата активируют путем приготовления его водной суспензии с дополнительным внесением минеральных и органических питательных веществ и индуктора ферментных систем биодеградации и последующим барботированием в технологической емкости достаточного объема.

Достижению технического результата способствует то, что в качестве индуктора ферментных систем биодеградации используют дизельное топливо, являющееся распространенным нефтепродуктом и состоящее из углеводородов, наиболее часто встречающихся в составе нефтезагрязнений. Кроме этого, в качестве биологической основы препарата используют штаммы микроорганизмов-нефтедеструкторов родов Pseudomonas и Rhodococcus. Эти микроорганизмы обладают высокими удельными скоростями роста, за счет чего достигается увеличение их концентрации в водной суспензии биопрепарата в процессе его активации. Применяемые микроорганизмы входят в запатентованную ассоциацию микроорганизмов [3] и являются высокоэффективными нефтедеструкторами. Они обладают способностью утилизировать нефть при низких температурах (до 2°C) и в присутствии солей до 5%. Важно, что предлагаемые представители рода Pseudomonas несут в своем составе катаболические плазмиды, горизонтальный перенос которых путем конъюгации в аборигенные микроорганизмы в природе приводит к увеличению пула бактерий, способных к деградации углеводородов. Также эти штаммы являются продуцентами поверхностно-активных веществ, повышающих биодоступность гидрофобных субстратов, в число которых входит нефть и нефтепродукты. Использование в биопрепарате микроорганизмов, обладающих данными свойствами, делает его перспективным продуктом для применения в очистке территорий, загрязненных нефтью и нефтепродуктами.

Пример 1. Активация сухой формы биопрепарата.

Готовят рабочий раствор следующего состава (на 1 л воды): триптон - 1 г; глюкоза - 2.5 г; дрожжевой экстракт - 1 г; сульфат аммония - 1.5 г; в качестве индуктора ферментных систем используют дизельное топливо (летнее, ТУ 0251-001-33683428-98) - 5 мл. В полученный раствор добавляют сухую форму биопрепарата в количестве 3 г биопрепарата на 1 л раствора. Рабочую суспензию с концентрацией микроорганизмов в водной суспензии не менее 5×10⁷ КОЕ/мл (активированный биопрепарат) получают барботированием приготовленного раствора в течение 14-18 часов током воздуха 1 л/мин на 1 литр раствора. Приготовление суспензии осуществляется без термостатирования. Контроль численности микроорганизмов осуществляют визуально по стандарту мутности.

Полученной рабочей суспензией обрабатывают нефтезагрязненный грунт с уровнем загрязнения до 10% методом дождевания исходя из расхода 1 л суспензии на 60 кв.м. и проводят рыхление грунта.

Через 20 суток проводят аналогичную обработку нефтезагрязненного грунта с использованием свежеприготовленной суспензии.

Пример 2. Моделирование процесса биодеструкции нефти в лабораторных условиях с использованием активированного сухого биопрепарата.

Готовят три лабораторные системы (микрокосмы №1, №2 и №3) путем внесения в образцы нестерильной почвы массой 1 кг нефти в количестве 2% по массе. Микрокосм №1 оставляли в качестве контроля. В микрокосмы №2 и №3 вносили комплексное удобрение «Нитроаммофоска» в количестве 2 г. Микрокосм №3 обрабатывали активированным биопрепаратом, как описано в Примере 1. Через 20 суток после начала эксперимента в микрокосмы №2 и №3 повторно вносили удобрение.

Измерение остаточной концентрации нефти проводили методом гравиметрии [4].

Эффективность деструкции нефти с использованием активированного биопрепарата составила 51% (табл.1), что на 20% выше, чем в микрокосме №2, не обработанном биопрепаратом.

Таблица 1
Убыль нефти в модельных системах с 2% нефти через 42 дня
Микрокосмы	Убыль нефти, %
№1	Контроль (без внесения биопрепарата и удобрения)	23±4
№2	С внесением удобрения	31±3
№3	С внесением активированного биопрепарата и удобрения	51±5

Таким образом, создан новый способ активации сухой формы биопрепарата для очистки нефтезагрязненных грунтов, который обеспечивает в рабочей суспензии высокую концентрацию микроорганизмов с активированными ферментными системами биодеградации.

Список используемой литературы:

1. Патент 2104248 РФ. Способ очистки водоемов и почв от нефтяных загрязнений / Наливайчук А.В, Дуброва О.А. Опубл. 10.02.1998.

2. Патент 2193464 РФ. Способ биоремедиации почв и грунтов, загрязненных нефтью и нефтепродуктами / Ившина И.Б., Костарев С.М., Куюкина М.С., Закшевская Л.В. Опубл. 27.11.2002.

3. Патент 2312891 РФ. Ассоциация штаммов бактерий, продуцирующих биоэмульгаторы, для деградации нефти и нефтепродуктов в почвах, пресной и морской воде / Филонов А.Е, Кошелева И.А., Шкидченко А.Н., Пырченкова И.А., Пунтус И.Ф., Гафаров А.Б., Боронин А.М. Опубл. 20.12.2007

4. Другов Ю.С., Родин А.А. Экологические анализы при разливах нефти и нефтепродуктов // Практическое руководство. М: БИНОМ. Лаборатория знаний, 2007. 270 с.

Способ активации сухой формы биопрепарата для очистки нефтезагрязненных грунтов, включающий приготовление водной суспензии с индуктором ферментных систем и отличающийся тем, что для приготовления рабочей суспензии активированного биопрепарата с концентрацией микроорганизмов не менее 5×10⁷ КОЕ/мл используют водный раствор, содержащий 1 г/л триптона, 2.5 г/л глюкозы, 1 г/л дрожжевого экстракта, 1.5 г/л сульфата аммония, а в качестве индуктора ферментных систем используют 5 мл/л дизельного топлива, при этом барботирование раствора проводят при аэрации воздухом 1 л/мин на 1 л раствора в течение 14-18 часов без термостатирования.