Способ дифференциальной диагностики цервикальных дисплазий и рака шейки матки


 

G01N33/50 - химический анализ биологических материалов, например крови, мочи; испытания, основанные на способах связывания биоспецифических лигандов; иммунологические испытания (способы измерения или испытания с использованием ферментов или микроорганизмов иные, чем иммунологические, составы или индикаторная бумага для них, способы образования подобных составов, управление режимами микробиологических и ферментативных процессов C12Q)

Владельцы патента RU 2538618:

Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Петрозаводский государственный университет" (RU)

Изобретение относится к области медицины и предназначено для дифференциальной диагностики цервикальных дисплазий и рака шейки матки. Получают биопсию шейки матки. При наличии цервикальной дисплазии по цитологическому исследованию, из образца ткани выделяют РНК и проводят анализ экспрессии мРНК гена c-fos относительно ТАТА-связывающего белка (ТВР) с использованием количественной ПЦР. Если отношение уровня экспрессии мРНК гена c-fos к мРНК ТВР от 109 до 145 отн. ед., ставят диагноз тяжелая дисплазия, если значение данного соотношения от 18 до 35 отн. ед., ставят диагноз преинвазивный рак шейки матки (рак in situ), если значение соотношения от 148 до 208 отн. ед., ставят диагноз плоскоклеточный микроинвазивный рак шейки матки, если значение соотношения превышает 208 отн. ед., ставят диагноз плоскоклеточный инвазивный рак шейки матки. Предлагаемое изобретение позволяет повысить эффективность диагностики предраковых процессов шейки матки и дифференцировать ранние стадии плоскоклеточного рака. 1 табл., 4 пр.

 

Изобретение относится к области медицины, а именно к диагностике онкологических заболеваний. Изобретение может быть использовано для дифференциальной диагностики цервикальных дисплазий и рака шейки матки (РШМ).

В настоящее время в мире растет число пациенток со злокачественными новообразованиями органов репродуктивной системы, в частности рака шейки матки (РШМ). Рак шейки матки занимает первое место в структуре онкологической заболеваемости женщин 15-39 лет в Российской Федерации [1]. В силу определенных причин именно в молодом возрасте РШМ протекает более агрессивно, имеет склонность к раннему метастазированию и быстрому возникновению рецидивов. Эффективность диагностических и лечебных мероприятий РШМ не может быть признана удовлетворительной, поскольку пятилетняя выживаемость пациенток в зависимости от стадии заболевания составляет от 15% до 80%. В связи с этим возникает необходимость проведения широких мероприятий по выявлению предраковых состояний и начальных форм РШМ, при которых существующие методы лечения могут приводить к полному выздоровлению. Установлено, что этиологическим агентом развития РШМ являются вирусы папилломы человека группы «высокого риска заболевания» (ВПЧ 16, 18 и родственные им) [2, 3, 4]. На данный момент получены доказательства взаимного влияния генома ВПЧ и генов зараженных клеток (например, р16, Ki67, ProEx С, р53, bcl-2, c-fos, c-jun) на экспрессию друг друга, однако, механизм и физиологическое значение этого взаимодействия требует дальнейшего изучения. Развитие РШМ проходит через этапы дисплазий и внутриэпителиального рака. Сложность диагностики заболевания на ранних этапах заключается в том, что начальные формы неоплазии могут иметь фокальный характер, протекать клинически бессимптомно, маскироваться фоновыми заболеваниями.

Современная онкологическая наука располагает рядом методов скрининговой диагностики РШМ, позволяющих судить о наличии или отсутствии опухоли в момент обследования. В частности, широкое распространение получили метод цитологического скрининга злокачественных опухолей шейки матки [5], обнаружение мРНК ВПЧ Е6/Е7 (APTIMA), PreTect HPV-Proofer (NorChip), разработанный для определения полноразмерной мРНК генов Е6 и Е7 ВПЧ, тест CINtec p16INK4a и иммуноцитохимическое выявление экспрессии р16 (INK4a), представляющего собой маркер цервикального дискариоза. Считается, что сверхэкспрессия p16INK4a происходит вследствие инактивации гена ретинобластомы онкогенным белком вируса Е7. Кроме того, часто определяют ДНК ВПЧ (НС2) для выявления женщин с высоким риском неоплазий шейки матки. Однако использование известных методов скрининговой диагностики, особенно цитологических и иммуноцитохимических, часто приводит к ложноположительным результатам. В препаратах может наблюдаться спорадическое физиологическое окрашивание неизмененного железистого эпителия шейки матки [6].

Известен способ диагностики дисплазий и РШМ в слизистой шейки матки (US 7.455.973), основанный также на иммуноцитохимическом определении в образце цервикального эпителия ряда ядерных маркеров: белка p14ARF, белка 1, топоизомеразы Торо2А, циклина Е, белков, относящихся к группе МСМ. Экспрессия этих маркеров повышена при тяжелых патологических цервикальных нарушениях. Вследствие вариабельности их экспрессии наилучшие показатели специфичности и чувствительности теста в отношении диагностики интраэпителиальных нарушений, как указывают авторы, могут быть получены при использовании сочетания антител к трем различным маркерам. Недостатком этого способа является сильная вариабельность определяемых маркеров, которая выявляется при развитии патологических цервикальных нарушений, в том числе доброкачественных опухолей.

Известен способ ранней и доклинической диагностики цервикального рака (патент РФ №2251699, дата публикации 05.10.2005) [7], заключающийся в определении в биопсийной пробе онкобелка Е7 вируса папилломы человека (ВПЧ) с помощью пар моноклональных антител, относящихся к IgG2a и IgG2b группам, по которому судят о наличии злокачественного новообразования. Недостатком этого способа является невозможность полной дифференциальной диагностики дисплазий цервикального эпителия и РШМ, поскольку способ не позволяет четко определить раннюю и дальнейшие стадии цервикального рака.

Известен способ дифференциальной диагностики гиперплазии, интраэпителиальных неоплазий и рака шейки матки (патент РФ №2321859, дата публикации 04.10.2008) [8], основанный на цитологическом окрашивании мазков, полученных из канала шейки матки, ядерным красителем с последующим исследованием на компьютерном анализаторе площади ядер нормальных и опухолевых клеток. Недостатком данного способа является его трудоемкость, а также невозможность выявления ранней стадии злокачественного роста (диагностируется наличие РШМ, но не стадия онкопатологии).

Известен способ диагностики рака шейки матки (патент РФ №2343485, дата публикации 10.01.2009) [9], осуществляемый путем лектин-иммуноферментного анализа вагинального секрета, в котором определяют концентрацию лектин-связанных РЭА/РЭА-подобных антигенов (ЛСА). Однако повышение титра этого антигена не является специфичным для РШМ, так как может иметь место при воспалительных заболеваниях, доброкачественных новообразованиях, у курильщиков. Известен способ формирования группы риска неопластических нарушений в эпителии шейки матки (патент РФ №2437096, дата публикации 20.12.2011) [10], который может быть использован для цитологической диагностики дисплазии цервикального эпителия и РШМ. Способ включает иммунофлуоресцентное окрашивание мазка цервикального эпителия с применением моноклонального антитела, которое взаимодействует с высокомолекулярным гликопротеином MUC1 с последующим докрашиванием клеток хромогенным ядерным красителем. Результат теста позволяет выделить случаи с потенциально высоким риском наличия патологических нарушений, но не дает возможности полностью дифференцировать тяжелую цервикальную дисплазию, карциному in situ и РШМ.

Известен способ диагностики патологии шейки матки с помощью оптической когерентной томографии (ОКТ) (патент РФ 2463958, дата публикации 20.10.2012) [11], в результате которой регистрируют ОКТ-изображения в прямой поляризации и ортогональной поляризации. Недостатками способа являются выявление заболевания только на клинической стадии развития и использование специального оборудования, доступного только в специализированных клиниках.

В настоящее время предполагают, что наиболее перспективными для дифференциальной диагностики цервикальных интраэпителиальных неоплазий и РШМ являются методы, основанные на определении опухолевых биомаркеров в биологическом материале, взятом при биопсии (или крови). В частности, известен способ диагностики цервикальных неоплазий, основанный на иммуногистохимической идентификации белков р16, Вс1-2 и р53 [12]. Чувствительность предложенного метода достигала 83,3%, специфика умеренная 65,4%. Это связано с тем, что изменение профиля белков Вс1-2 и р53 не является типичным только для РШМ, данный факт имеет место при других злокачественных опухолях, воспалительных реакциях, других неопухолевых заболеваниях.

В качестве опухолевых маркеров с целью диагностики цервикальных неоплазий и РШМ используют и другие биомолекулы клетки: cyclin D1, Ki67, ProEx С [13]. Наиболее перспективной комбинацией маркеров авторы считают р16 плюс модель ProEx С. Однако в исследовании снова предложено использовать иммуногистохимический анализ, который часто приводит к ложноположительным результатам.

Известен также способ диагностики цервикальных интраэпителиальных неоплазий (патент РФ №2464570, дата публикации 20.10.2012) [14], заключающийся в заборе исследуемого материала из шейки матки путем соскоба с последующим анализом экспрессии мРНК p16INK4a как маркера потенциальной прогрессии диспластических процессов шейки матки с использованием количественной ПЦР, а также анализ концентрации мРНК гена гипоксантин-гуанин фосфорибозилтрансферазы (HPRT-1). При этом оценивают уровень относительной экспрессии мРНК гена p16INK4a к уровню экспрессии мРНК HPRT-1. Отношение уровня экспрессии мРНК гена p16INK4a к мРНК HPRT-1 свыше 93 отн. ед. соответствует CIN III (рак in situ), а его значение более 201 отн. ед. соответствует плоскоклеточному раку. Данный способ позволяет повысить эффективность диагностики предраковых процессов шейки матки.

Недостатком данного способа является то, что он позволяет разграничить цервикальные интраэпителиальные неоплазии и плоскоклеточный рак, не принимая во внимание начальные стадии злокачественного процесса, т.е. обладает низкой специфичностью к дифференциальной диагностике ранних стадий РШМ, в частности, преинвазивного рака (карциномы in situ) и микроинвазивного рака.

Наиболее близким по технической сути к заявляемому способу, который и принят в качестве прототипа, является способ определения мРНК гена c-fos при карциноме шейки матки, заключающийся в заборе исследуемого материала путем биопсии и далее определения экспрессии мРНК c-fos как одного из прогностических маркеров [15]. Недостатком данного способа является то, что с помощью него можно дифференцировать только цервикальные интраэпителиальные неоплазии и плоскоклеточный рак, а начальные стадии злокачественного процесса не представляется возможным диагностировать, т.е. способ также обладает низкой специфичностью к дифференциальной диагностике ранних стадий РШМ, в частности, преинвазивного рака (карциномы in situ) и микроинвазивного рака.

Из известных в настоящее время способов диагностики патологий шейки матки нет ни одного, который позволяет четко дифференцировать тяжелую дисплазию, карциному in situ и микроинвазивный рак РШМ.

Техническим результатом заявляемого способа является выявление и дифференциация с высокой степенью надежности цервикальных дисплазий и ранних стадий РШМ, в том числе карциномы in situ и микроинвазивного рака, при сохранении быстроты и универсальности метода диагностики данных патологий. Кроме того, данный способ диагностики будет способствовать более правильному выбору тактики лечения пациенток, сокращению сроков пребывания их в стационаре, а также формированию групп риска по развитию рака шейки матки.

Технический результат достигается тем, что в данном способе проводят анализ экспрессии мРНК гена c-fos и анализ экспрессии мРНК гена ТАТА-связывающего белка (ТВР) с использованием количественной ПЦР в диагностическом материале шейки матки при наличии цитологически установленной цервикальной дисплазии, затем сравнивают уровень экспрессии мРНК гена c-fos с уровнем экспрессии мРНК ТВР и, если отношение уровня экспрессии мРНК гена c-fos к мРНК ТВР от 109 до 145 отн. ед. - ставят диагноз тяжелая дисплазия, если значение данного соотношения от 18 до 35 отн. ед. - ставят диагноз преинвазивный рак шейки матки (рак in situ), если значение соотношения от 148 до 208 отн. ед. - ставят диагноз плоскоклеточный микроинвазивный рак шейки матки, если значение соотношения превышает 208 отн. ед. - ставят диагноз плоскоклеточный инвазивный рак шейки матки.

Способ включает забор исследуемого материала путем биопсии из шейки матки, выделение из образца ткани общей РНК, получение кДНК, амплифицирование мРНК гена c-fos и мРНК гена ТВР, расчет относительного содержания мРНК гена c-fos в исследуемом образце по отношению к содержанию мРНК референсного гена ТВР, сопоставление с результатами гистологического анализа и постановку диагноза.

Способ осуществляется следующим образом.

Выделение общей РНК.

Образцы ткани шейки матки вынимали из раствора для стабилизации РНК в биоматериале EverFresh RNA («Клоноген», Санкт-Петербург), удаляли остатки EverFresh с помощью стерильного фильтра, гомогенизировали в лизирующем буфере «РНК-Экстран» («Синтол», Москва) с помощью роторного гомогенизатора TissueRuptor («Qiagen», Германия). Далее выделение тотальной клеточной РНК проводили стандартным методом жидкофазной экстракции с помощью наборов «РНК-Экстран» согласно инструкции к набору («Синтол», Москва). Высушенный осадок РНК растворяли в 50 мкл деионизованной ddH2O, не содержащей РНКаз. Концентрацию и чистоту препарата РНК определяли по поглощению при 260, 280 и 320 нм с помощью сканирующего спектрофотометра BioWave II+ («Biochrom», Великобритания) (2 мкл исходного образца РНК разводили в 50 раз ddH2O, в дальнейшее исследование включали только те образцы, для которых А260/А280>1,8). Нативность РНК определяли методом капиллярного электрофореза на микрочипах RNA StdSens с помощью автоматической станции Experion («Bio-Rad», США) в соответствии с инструкцией производителя. Вывод о качестве препарата РНК делали по соотношению фракций 18S и 28S рРНК.

Проведение обратной транскрипции, получение кДНК.

Для удаления возможной примеси геномной ДНК образцы РНК предварительно обрабатывали ДНКазой I («Fermentas», Литва) в соответствии с протоколом, рекомендуемым производителем. Реакцию обратной транскрипции проводили в двукратном объеме с использованием набора «ОТ-1» фирмы «Синтол» (Москва). В реакцию брали 1 мкг образца РНК на один объем; количества остальных компонентов реакционной смеси соответствовали инструкции производителя. В качестве праймеров для обратной транскрипции использовали смесь гексануклеотидов («Силекс», Москва). Реакцию проводили в термостате «Гном» (ЗАО НПФ «ДНК-Технология») при температуре +37°С в течение 1 ч с последующей инактивацией обратной транскриптазы при +70°С в течение 10 мин. 2 мкл полученного образца кДНК разводили в 50 раз ddH2O и проводили спектрофотометрический анализ, как описано выше (соотношение степени поглощения варьировало в диапазоне 1,7<А260/А280<1,9). Образцы кДНК хранили при температуре -20°С или, в случае длительного хранения, при -70°С.

Проведение количественной ПЦР.

Амплификацию в режиме «реального времени» проводили в объеме 25 мкл с помощью прибора «iCycler Thermal Cycler» («BioRad», США) и программного обеспечения «iQ5 Optical System Software» версия 2.0 («BioRad», США), используя наборы реагентов для проведения ПЦР в режиме реального времени в присутствии интеркалирующего красителя SYBR Green («Синтол», Москва). Для повышения чувствительности и специфичности ПЦР был применен принцип «горячего старта», который обеспечивался фирмой-производителем за счет ингибирующих активность Taq-полимеразы антител. Синтез олигонуклеотидов был осуществлен компанией Синтол (Москва). При приготовлении реакционной смеси для ПЦР придерживались объемов компонентов, рекомендуемых фирмой-производителем: в расчете на одну пробирку смешивали 2,5 мкл дезоксинуклеозидтрифосфатов (2,5 мМ), 2,5 мкл 10-кратного ПЦР буфера, содержащего SYBR Green, 2,5 мкл MgCl2 (25 мМ), по 1 мкл прямого и обратного праймеров (10 пкмоль/мкл), 0,25 мкл SynTaq-ДНК-полимеразы (5 Е/мкл), 2 мкл образца кДНК, деионизованную воду - до 25 мкл. Амплификацию проводили по следующему протоколу: цикл №1 (1 повтор) - 95°С в течение 3 мин; цикл №2 (45 повторов) - 15 с при 95°С, 50 с при 62°С.

Детекция интенсивности флуоресцентного сигнала осуществлялась на этапе отжига/элонгации. Для определения специфичности отжига праймеров непосредственно после амплификации проводили процедуру плавления ПЦР фрагментов: 1 мин при 95°С, 1 мин при 60°С, 10 с при 60°С (80 циклов, повышая в каждом цикле температуру на 0,5°С). По полученным кривым плавления делали вывод о гомогенности ПЦР-продуктов. ПЦР-реакции для каждого образца проводили в двух независимых повторностях.

На этапе оптимизации протокола ПЦР, для дополнительного подтверждения специфичности праймеров и эффективности реакции, проводили разделение ПЦР-продуктов методом электрофореза в 8% полиакриламидном геле и трис-боратном буфере с использованием низкомолекулярных маркеров длин фрагментов pUC19/MspI («Силекс», Москва); визуализировали ампликоны по флуоресценции бромистого этидия в УФ свете, документировали с помощью автоматической аналитической системы GelDoc-It M-26XV («UVP», США). В работе использовали следующие праймеры: для гена c-fos (прямой 5′-CAGCGAGCAACTGAGAAGCC-3′ (экзон 1, позиция 62), обратный 5′-CGCTGTGAAGCAGAGCTGG-3′ (экзон 1, позиция 135)); для контрольного гена ТВР (прямой 5′-GTTCTGGGAAAATGGTGTGC-3′, обратный 5′-CCAGGAAATAACTCTGGCTCA-3′).

Эффективность амплификации («Е») определяли путем проведения ПЦР с последовательными 10-кратными разбавлениями произвольно выбранного образца и праймерами на GAPDH (прямой 5′-TGAAGGTCGGAGTCAACGGATTTGGT-3′, обратный 5′-CATGTGGGCCATGAGGTCCACCAC-3′). Значение «Е» определяли по графику зависимости порогового цикла от концентрации.

Статистический анализ проводился в программе Статистика 6.0. Для оценки относительного содержания мРНК гена c-fos в образцах использовали анализ содержания мРНК референсного гена ТВР в том же образце, характеризующемся низким и стабильным уровнем экспрессии мРНК в клетке. При отношении экспрессии мРНК гена c-fos к мРНК ТВР меньше 1 предполагалось, что экспрессия мРНК гена c-fos в образце практически отсутствует, а при отношении больше 1 - о наличии экспрессии гена c-fos в образце.

Расчет относительной экспрессии проводили на основании сравнительной оценки величин С(Т) Х (где Х - исследуемый ген), получаемых для каждого гена при проведении ПЦР в режиме «реального времени». Определение уровня экспрессии мРНК гена c-fos относительно мРНК ТВР считали методом ΔΔ С(Т)-2(-Delta Delta C(T)) [16].

[c-fos]/[ТВР]=Е-(СТ1-СТ2),

где [c-fos]/[ТВР] - нормированное по ТВР значение экспрессии гена c-fos, измеряется в относительных единицах, показывает, сколько копий мРНК с-fos приходится на 1 копию ТВР;

Е - эффективность амплификации показывает прирост матрицы на каждом цикле амплификации. Теоретически на каждом цикле происходит удвоение матрицы, поэтому Е=2;

СТ1 - значение порогового цикла в образце для гена c-fos;

СТ2 - значение порогового цикла в образце для ТВР.

Проанализировано 36 образцов ткани шейки матки пациенток, из которых с гистологически подтвержденными плоскоклеточным инвазивным раком шейки матки (6 случаев), микроинвазивным раком (5 случаев), раком in situ (6 случаев), тяжелой дисплазией CIN III (7 случаев), CIN II (4 случая), CIN I (5 случаев) и реактивными изменениями (3 случая). Материал получен путем биопсии с шейки матки при комплексном гинекологическом обследовании. В образцах был проведен анализ экспрессии мРНК гена c-fos. Было проведено также цитологическое исследование. Критерием достоверности цитологического и молекулярно-генетического методов явились результаты сопоставления с гистологическим исследованием биопсийного и/или операционного материала. Анализ исследуемого материала включал также количественное определение мРНК гена ТАТА-связывающего белка (ТВР). При этом сравнивали уровень экспрессии мРНК гена c-fos с уровнем экспрессии мРНК ТВР. Экспрессия гена ТВР осуществляется на достаточно постоянном уровне, что позволяет определять относительный уровень экспрессии функционально активных генов (в данном случае c-fos), опираясь на значения экспрессии ТВР. Подобный подход является общепринятым и позволяет обеспечить высокую воспроизводимость результатов.

В таблице 1 представлены полученные данные по количественному анализу мРНК гена c-fos для 36 образцов ткани шейки матки, а также данные цитологического и гистологического анализов.

Сопоставление результатов цитологического исследования и уровня экспрессии мРНК гена c-fos показало, что при реактивных изменениях эпителия шейки матки уровень экспрессии был незначительным и составил 5,0, 7,0 и 11,0 отн. ед. Повышенная экспрессия мРНК гена c-fos наблюдалась при CIN I - 46,8±12,5 отн. ед. (М±σ, где М - среднее, σ - стандартное отклонение), CIN II 78,5±19,5 отн. ед. и тяжелой дисплазии 123,6±11,9 отн. ед. В стадию преинвазивного рака (рак in situ) экспрессия мРНК гена c-fos резко снижалась и составила 25,3±6,9 отн. ед. В стадию микроинвазивного рака данный показатель вновь возрастал до 180,2±21,6 отн. ед. Максимальные значения относительного уровня экспрессии мРНК гена c-fos характерны для плоскоклеточного инвазивного рака - более 208,0 отн. ед. Полученные результаты показали, что заявляемый способ обладает высокой специфичностью и позволяет получать достаточно надежные и селективные результаты, что иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1.

Пациентке Г. 27 лет (образец 14) при цитологическом исследовании диагностирована CIN II. В образце ткани, взятом путем биопсии, соотношение между уровнем экспрессии мРНК гена c-fos и уровнем экспрессии мРНК ТВР составило 109 отн. ед. - установлен диагноз тяжелая дисплазия, который подтвержден при гистологическом исследовании.

Пример 2.

Пациентке Н. 34 года (образец 20) при цитологическом исследовании диагностирована CIN II. В материале биопсии соотношение между уровнем экспрессии мРНК гена c-fos и уровнем экспрессии мРНК ТВР составило 18 отн. ед. - установлен диагноз рак in situ, подтвержденный при гистологическом исследовании.

Пример 3.

Пациентке М. 38 лет (образец 28) при цитологическом исследовании диагностирована CIN III (рак in situ). В образце ткани после биопсии соотношение между уровнем экспрессии мРНК гена c-fos и уровнем экспрессии мРНК ТВР составило 148 отн. ед. - установлен диагноз плоскоклеточный микроинвазивный рак (IA1), подтвержденный при гистологическом исследовании.

Пример 4.

Пациентке В. 46 лет (образец 30) при цитологическом исследовании диагностирован плоскоклеточный рак. В материале биопсии соотношение между уровнем экспрессии мРНК гена c-fos и уровнем экспрессии мРНК ТВР составило 208 отн. ед. - установлен диагноз плоскоклеточный инвазивный рак, подтвержденный при гистологическом исследовании.

Приведенные выше экспериментальные данные свидетельствуют о том, что заявляемый способ может быть с высокой степенью надежности использован для выявления и дифференциальной диагностики цервикальных дисплазий и ранних стадий рака шейки матки, в том числе, карциномы in situ и микроинвазивного рака. Кроме того, данный способ диагностики будет способствовать более правильному выбору тактики лечения пациенток, сокращению сроков пребывания их в стационаре, а также формированию групп риска по развитию рака шейки матки.

Таблица 1.
Количество мРНК гена c-fos в образцах ткани шейки матки
Образец Цитологический анализ Отношение мРНК гена c-fos к мРНК ТВР (отн. ед.) Гистологический анализ
1 Реактивные изменения эпителия, воспаление 7 Реактивные изменения эпителия
2 CIN I 11 Реактивные изменения эпителия
3 Реактивные изменения эпителия, воспаление 5 Реактивные изменения эпителия
4 CIN I 47 CIN I
5 Выраженное воспаление 31 CIN I
6 CIN I 35 CIN I
7 CIN I 58 CIN I
8 CIN I 63 CIN I
9 CIN I 55 CIN II
10 CIN I 69 CIN II
11 CIN II-III 108 CIN II
12 CIN II 82 CIN II
13 CIN III (рак in situ) 145 Тяжелая дисплазия
14 CIN II 109 Тяжелая дисплазия
15 CIN III (рак in situ) 128 Тяжелая дисплазия
16 CIN III (рак in situ) 134 Тяжелая дисплазия
17 CIN III (рак in situ) 120 Тяжелая дисплазия
18 CIN II 117 Тяжелая дисплазия
19 CIN II 112 Тяжелая дисплазия
20 CIN II 18 Рак in situ
21 CIN III (рак in situ) 30 Рак in situ
22 CIN II 15 CIN III (рак in situ)
23 CIN III (рак in situ) 25 Рак in situ
24 CIN III (рак in situ) 29 Рак in situ
25 Плоскоклеточный рак 35 Рак in situ
26 CIN III (рак in situ) 165 Плоскоклеточный микроинвазивный рак
27 Плоскоклеточный рак 183 Плоскоклеточный микроинвазивный рак
28 CIN III (рак in situ) 148 Плоскоклеточный микроинвазивный рак
29 Плоскоклеточный рак 197 Плоскоклеточный микроинвазивный рак
30 Плоскоклеточный рак 208 Плоскоклеточный микроинвазивный рак
31 Плоскоклеточный рак 261 Плоскоклеточный инвазивный рак
32 Плоскоклеточный рак 202 Плоскоклеточный инвазивный рак
33 Плоскоклеточный рак 280 Плоскоклеточный инвазивный рак
34 Плоскоклеточный рак 293 Плоскоклеточный инвазивный рак
35 Плоскоклеточный рак 215 Плоскоклеточный инвазивный рак
36 Плоскоклеточный рак 230 Плоскоклеточный инвазивный рак

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Давыдов М.И., Аксель Е.М. Смертность населения России и стран СНГ от злокачественных образований в 2006 г. // Вестник РОНЦ им. Н.Н. Блохина РАМН, 2008. Т.19, №2 (прил. 1). С.91-119.

2. Zur Hausen Н. Papillomaviruses in anogenital cancer as a model to understand the role of viruses in human cancers // Cancer Res., 1989. Vol.1 (49). P.4677-4681.

3. Zur Hausen Н. Papillomaviruses and cancer: from basic studies to clinical application // Nat. Rev. Cancer, 2002. Vol.2 (5). P.342-350.

4. Doorbar J. Molecular biology of human papillomavirus infection and cervical cancer // Clinical Science, 2006. Vol.110. P.525-541.

5. Guzick D.S. Efficacy of screening for cervical cancer // A review. Am. J. Public Heath, 1978. Vol.68. P.125-134.

6. Samarawardana P., Dehn D.L., Singh M. et al. p16(INK4a) is superior to high-risk human papillomavirus testing in cervical cytology for the prediction of underlying high-grade dysplasia // Cancer Cytopathol., 2010. Vol.25, 118 (3). P. 146-156.

7. Пат. 2251699 РФ, МПК G01N 33/574, G01N 33/577. Способ ранней и доклинической диагностики цервикального рака / Киселев В.И., Свешников П.Г. - №2003128660/15; Заяв. 25.09.2003; Опубл. 05.10.2005, Бюл. 13.-11 с.: ил.

8. Пат. 2321859 РФ, МПК G01N 33/483. Способ дифференциальной диагностики гиперплазии, интраэпителиальных неоплазий и рака шейки матки / Автандилов Г.Г., Глухова Ю.К. - №2005110965/15; Заяв. 15.04.2005; Опубл. 04.10.2008, Бюл. 10-6 с.

9. Пат. 2343485 РФ, МПК G01N 33/53. Способ диагностики рака шейки матки / Булгаков А.А., Родионова О.М., Апанасевич В.И., Петрова И.Ю., Елисейкина М.Г. - №2007123039/15; Заяв. 14.06.2007; Опубл. 10.01.2009, Бюл. 1.-8 с.

10. Пат. 2437096 РФ, МПК G01N 33/483. Способ формирования группы риска неопластических нарушений в эпителии шейки матки / Якубовская Р.И., Кармакова Т.А., Волченко Н.Н., Новикова Е.Г., Трушина О.И. - №2010121228/15; Заяв. 27.05.2010; Опубл. 20.12.2011, Бюл. №35.-14 с.: ил.

11. Пат. 2463958 РФ, МПК А61В 6/00. Способ диагностики патологии шейки матки / Кузнецова И.А., Шахова Н.М., Качалина Т.С., Гладкова Н.Д., Киселева Е.Б., Карабут М.М. - №2011119422/14; Заяв. 13.05.2011; Опубл. 20.10.12, Бюл. 29.-20 с.: ил.

12. Adamopoulou M., Kalkani E., Charvalos E. et al. Comparison of cytology, colposcopy, HPV typing and biomarker analysis in cervical neoplasia // Anticancer Res., 2009. Vol.29 (8). P.3401-3409.

13. Conesa-Zamora P., Trujillo-Santos J., Orantes-Casado F.J. et al. Analysis of performance characteristics of five cell cycle-related immunohistochemical markers and human papillomavirus genotyping in the diagnosis of cervical squamous cell carcinoma precursor lesions // Anal. Quant Cytol. Histol., 2012. Vol.34 (1). P.49-55.

14. Пат. 2464570 РФ, МПК G01N 33/53. Метод диагностики цервикальных интраэпителиальных неоплазий / Боженко В.К., Кудинова Е.А., Близнюков О.П., Мельникова Н.В., Бурменская О.В. - №2010147074/15; Заяв. 19.11.2010; Опубл. 20.10.2012, Бюл. 29.-9 с.

15. Soh L.T., Heng D., Lee I.W., Ho Т.Н., Hui K.M. The relevance of oncogenes as prognostic markers in cervical cancer // Int. J. Gynecol. Cancer, 2002. Vol.12 (5). P.465-474.

16. Livak K.J., Schmittgen T.D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method // Methods, 2001. Vol.25 (4). P.402-408.

Способ дифференциальной диагностики цервикальных дисплазий и рака шейки матки на основе определения относительного содержания мРНК гена c-fos с использованием количественной ПЦР, который включает забор исследуемого материала путем биопсии из шейки матки, выделение из образца ткани общей РНК, получение кДНК и амплифицирование мРНК гена c-fos, отличающийся тем, что при наличии цервикальной дисплазии по цитологическому исследованию проводят анализ экспрессии мРНК гена ТАТА-связывающего белка (ТВР), затем сравнивают уровень экспрессии мРНК гена c-fos с уровнем экспрессии мРНК ТВР и, если отношение уровня экспрессии мРНК гена c-fos к мРНК ТВР от 109 до 145 отн. ед., ставят диагноз тяжелая дисплазия, если значение данного соотношения от 18 до 35 отн. ед., ставят диагноз преинвазивный рак шейки матки (рак in situ), если значение соотношения от 148 до 208 отн. ед., ставят диагноз плоскоклеточный микроинвазивный рак шейки матки, если значение соотношения превышает 208 отн. ед., ставят диагноз плоскоклеточный инвазивный рак шейки матки.



 

Похожие патенты:

Изобретение относится к области фармакологии, биофармации и фармацевтики и касается способа определения биологической неэквивалентности образцов наноалмазов путем сравнительного определения влияния образцов наноалмаза на мембранный потенциал митохондрий животных.
Изобретение относится к области судебной медицины. В долевой бронх предполагаемой поврежденной доли легкого вводят шланг от аппарата искусственной подачи воздуха.

Изобретение относится к биологии, токсикологической и аналитической химии, а именно к способам определения прокаина в плазме крови. В плазму крови, содержащую прокаин, вводят фторид натрия для создания концентрации 10 мг/мл, полученную смесь обрабатывают ацетоном, извлечение отделяют от выпавшего осадка путем фильтрования, ацетон из фильтрата испаряют в токе воздуха при комнатной температуре, водный остаток разбавляют путем прибавления воды, образующийся раствор насыщают сульфатом аммония, подщелачивают аммонийным буферным раствором до pH 9,0-9,5, экстрагируют двукратно порциями органического экстрагента, в качестве которого используется 30% раствор камфоры в метилацетате, при соотношении водной и органической фаз 1:1 по объему, органические экстракты отделяют, объединяют, растворитель из объединенного экстракта испаряют в токе воздуха при комнатной температуре, остаток хроматографируют в тонком слое силикагеля СТХ-1А на пластинах «Сорбфил» ПТСХ-АФ-А-УФ, применяя подвижную фазу дихлорметан-этанол в соотношении 6:4 по объему, хроматограмму проявляют в УФ-свете, анализируемое вещество элюируют из сорбента смесью ацетонитрил-метанол-0,025 М раствор дигидрофосфата калия с pH 3,0 в соотношении 10:10:90 по объему, хроматографируют методом ВЭЖХ с применением обращеннофазового сорбента «Nucleosil C18», полярной подвижной фазы ацетонитрил-метанол-0,025 М раствор дигидрофосфата калия с pH 3,0 в соотношении 10:10:90 по объему и УФ-детектора, регистрируют оптическую плотность при длине волны 298 нм и вычисляют количество анализируемого соединения по площади хроматографического пика.

Изобретение относится к области медицины, а именно к гепатологии, и описывает способ исследования состояния детоксикационной функции печени. Способ включает определение утром натощак в крови содержание МСМ (молекулы средней массы), АЛТ (аланинаминотрансферазы) и ACT (аспартатаминотрансферазы), определение этих же параметров накануне вечером перед сном, а также определение утром и вечером объема циркулирующей крови и гематокрит с последующей оценкой коэффициента состояния детоксикационной функции печени и при значениях коэффициента К≤0,6 детоксикационную функцию печени расценивают как удовлетворительную, а при К>0,6 - как снижение детоксикационной функции печени.
Изобретение относится к области медицины, а именно к медицинской бактериологии и медицинской микологии, и описывает способ количественной оценки адгезивных свойств условно-патогенных микроорганизмов, выделенных от человека и объектов окружающей среды.

Изобретение относится к биологии и токсикологической химии и может быть использовано в практике санэпидстанций, химико-токсикологических, экспертно-криминалистических и ветеринарных лабо-раторий.

Изобретение относится к биологии и токсикологической химии и может быть использовано в практике химико-токсикологических, экспертно-криминалистических и клинических лабораторий.

Изобретение относится к медицине, а именно к клинической, лабораторной диагностике, микробиологическим методам исследования, и направлено на стандартизацию исследования слюны методом клиновидной дегидратации/кристаллографии.

Изобретение относится к области медицины и предназначено для обоснования предельно допустимых концентраций (ПДК) тяжелых металлов в крови детей, проживающих в условиях загрязненной среды обитания, по критериям риска для здоровья при хронической многосредовой экспозиции.
Изобретение относится к области медицины и представляет собой способ экспресс-диагностики острых кишечных инфекций (ОКИ), включающий выявление маркеров-индикаторов этиологии ОКИ, с использованием иммунологического лабораторного исследования, отличается тем, что этиологию ОКИ устанавливают у детей ранней возрастной категории, предпочтительно у новорожденных, при этом определяют концентрацию в копрофильтрате цитокина - интерлейкина IL-10 и наличие хронической фетоплацентарной недостаточности (ХФПН), после чего рассчитывают вероятность (Р) бактериальной этиологии ОКИ, причем значение Р больше 50% свидетельствует о бактериальной этиологии ОКИ, а меньше 50% свидетельствует об отсутствии бактериальной этиологии ОКИ, и необходимости проведения второго этапа диагностики, на котором определяют концентрацию в копрофильтрате цитокина - интерлейкина IL-4, выявляют срок прикладывания к груди, а также вид вскармливания, при этом рассчитывают вероятность (Р) вирусной либо вирусно-бактериальной этиологии ОКИ, причем значение Р больше 50% свидетельствует о вирусной этиологии ОКИ, а меньше 50% свидетельствует о вирусно-бактериальной ОКИ.
Изобретение относится к медицине, а именно к способу диагностики инфекционной патологии почек, вызванной Chlamydia trachomatis. Сущность способа состоит в том, что определяют в моче газохроматографическим и масс-спектрометрическим методами 2-пропанамид, N-амино-оксиметиламид, 2-метил-5-(1-метил-этил)-фенол и 4-4-дигидроокси-дифенил-сульфон и при их количестве 0,002-0,06 ммоль/л; 0,002-0,06 ммоль/л; 0,003-0,11 ммоль/л и 0,002-0,05 ммоль/л соответственно диагностируют инфекционную патологию почек, вызванную Chlamydia trachomatis. Использование заявленного способа обеспечивает неинвазивную и информативную раннюю до манифестации клинических проявлений диагностику специфической инфекционной патологии почек, вызванной Chlamydia trachomatis. 5 пр.
Изобретение относится к медицине, а именно к детской кардиологии и детским инфекционным болезням, и может быть использовано для оценки показаний к кардиометаболической терапии при инфекционных поражениях миокарда у детей. Для этого выявляют и осуществляют количественную оценку клинических, электрокардиографических, биохимических и эхокардиографических показателей. При этом в качестве клинических показателей оценивают аускультативную симптоматику: звучность тонов, наличие шумов, показатели артериального давления. В качестве биохимических показателей оценивают активность кардиоспецифичных ферментов: МВ-фракции креатинфосфокиназы, α-гидрокисбутиратдегидрогеназы, аспарагиновой трансаминазы, аланиновой трансаминазы и кардиоспецифичного белка тропонина I. Эхокардиографическое исследование осуществляют с применением допплерографии для оценки диастолической функции желудочков. Каждый из показателей оценивают от 1 до 3 баллов. Баллы суммируют и по полученному результату осуществляют оценку показания к кардиометаболической терапии. При общей сумме меньше 3 баллов кардиометаболическая терапия не показана. При общей сумме от 3 баллов до 7 баллов включительно проводят пероральное введение кардиометаболических препаратов. При общей сумме от 8 баллов и выше осуществляют парентеральное введение кардиометаболических препаратов. Способ обеспечивает возможность в минимальные сроки объективно определить наличие показаний к назначению кардиометаболической терапии, в том числе и в ситуациях, когда часть результатов дополнительного обследования отсутствует по каким-либо причинам, и дифференцированно оценить ее эффективность. 1 табл., 4 пр.

Изобретение относится к медицине и описывает способ предварительной обработки желчи для диагностики описторхозной инвазии. Способ включает забор желчи, центрифугирование при 1500-2000 об/мин не менее 20 мин, удаление надосадочной части желчи, экстрагирование желчи с диэтиловым эфиром, нанесение полученного осадка на предметное стекло и последующую микроскопию. Для повышения точности диагностики центрифугированию подвергают исходную желчь, полученный концентрированный осадок желчи экстрагируют с 2 мл эфира в присутствии 3%-ной уксусной кислоты до 8 мл, центрифугируя в течение 2 мин, затем удаляют надосадочную жидкость, а полученные 200 мкл очищенного концентрированного осадка микроскопируют. Изобретение позволяет получить более прозрачный осадок, концентрированный до малых объемов, без потерь яиц трематод, что повышает качество диагностики описторхид из желчи. Вероятность ложноотрицательного ответа при наличии яиц в пробе практически отсутствует. Способ является менее трудозатратным, т.к. позволяет сократить в 3 раза время микроскопирования, при этом увеличивая в 3 раза результативность диагностики описторхоза, особенно при низком содержании яиц в желчи. 2 табл., 1 пр.
Изобретение относится к области медицины, а именно к способу определения степени тяжести симфизиопатии у беременных во II и III триместрах. Сущность способа состоит в том, что у беременных во II и III триместрах определяют диастаз лонного сочленения с помощью УЗИ, определяют в сыворотке крови магний общий в ммоль/л, суточную экскрецию кальция с мочой в ммоль/сутки, а также выявляют жалобы на боли в области лонного сочленения и пояснично-крестцовом отделе позвоночника, парестезии, судорожные подергивания и сведения икроножных мышц, болезненности при пальпации лонного и/или крестцово-подвздошного сочленения и при определенных значениях указанных параметров определяют легкую, среднюю и тяжелую степени симфизиопатии. Использование заявленного способа позволяет точно и эффективно определить степень тяжести симфизиопатии у беременных во II и III триместрах. 1 табл., 3 пр.

Изобретение относится к области медицины и описывает способ оценки нарушения импрегнации зародыша в слизистую оболочку матки на первых неделях беременности при обострении цитомегаловирусной инфекции, характеризующейся тем, что определяют титр антител к цитомегаловирусу, гистохимическим методом определяют активность 5β-прегнен-3,20-дион-дегидрогеназы, а также определяют содержание прогестерона, и при титре антител к цитомегаловирусу 1:1600, подавлении активности 5β-прегнен-3,20-дион-дегидрогеназы до 47,6±0,25 усл. ед., снижении содержания прогестерона до 90,5±2,0 нмоль/л, оценивают нарушение импрегнации зародыша в слизистую оболочку матки. 1 пр., 2 ил.

Изобретение относится к медицине, а именно к иммунотерапии, и может быть использовано для оценки эффективности лечения у пациента с раком. Для этого пациенту вводят иммуногенную композицию, которая содержит рекомбинантный вирусный вектор, экспрессирующий in vivo весь или часть MUC-1 антигена. При этом способ анализа включает получение биологического образца от пациента после введения указанной иммуногенной композиции и измерение уровней интерферона γ в образце. Уровни интерферона γ свыше приблизительно 4 пг/мл свидетельствуют о том, что пациент демонстрирует успешный клинический выход для лечения. Изобретение позволяет оценить клинический результат лечения рака у пациента.14 з.п. ф-лы., 3 ил., 1 пр.
Изобретение относится к области сельского хозяйства и предназначено для диагностики дисбаланса Cu, Mo и W у сельскохозяйственных копытных животных. Способ включает подготовку проб биоиндикаторов, определение в них содержания микроэлементов и оценку полученных результатов. В качестве биоиндикаторов используют образец пахты, выделенный из молока сельскохозяйственных копытных животных. Определяют в нем валовое содержание меди, молибдена и вольфрама. Находят отношение валовых содержаний Cu/Mo и Mo/W. При значениях отношения Cu/Mo, не превышающих 1, и отношения Mo/W, не превышающих 250, считают, что дисбаланс микроэлементов в организме животных и среде их обитания отсутствует. При превышении указанных значений диагностируют наличие микроэлементного дисбаланса. Заявленный способ позволяет быстро и точно диагностировать микроэлементоз дисбаланса Cu, Mo и W у сельскохозяйственных копытных животных. 4 з.п. ф-лы, 2 пр.

Изобретение относится к области лабораторной диагностики и может быть использовано в клинической практике для оценки эффективности антибактериальной терапии у больных с бактериальной инфекцией, в том числе с бактериальным сепсисом. Предложенный способ заключается в том, что в крови пациентов одновременно определяют концентрации пара-гидроксифенилуксусной, фенилмолочной и пара-гидроксифенилмолочной кислот. Если в течение 24-48 часов при повторном анализе крови суммарная концентрация трех измеряемых кислот снижается в 2 и более раз, а концентрации всех трех кислот раздельно имеют направленность к снижению, то антибактериальную терапию расценивают как эффективную. Способ может применяться для пациентов всех возрастных групп и позволяет уменьшить смертность от инфекционных заболеваний и осложнений. 4 ил., 4 табл., 4 пр.

Изобретение относится к медицине, а именно к кардиологии и касается прогнозирования ранней постинфарктной стенокардии (РПИС) у пациентов с острым инфарктом миокарда с подъемом сегмента ST в госпитальном периоде. Для этого осуществляют анализ клинических данных и параметров липидного профиля в первые сутки от начала заболевания. Риск развития РПИС прогнозируют по формуле:P=-3,238+0,01·КДО+0,049·ФВ-0,532·СЖК+0,002·анти омЛПНП+0,001·ПВ-1,129·ХС ЛПВП,где КДО - конечный диастолический объем, ФВ - фракция выброса левого желудочка, СЖК - свободные жирные кислоты, анти омЛПНП - антитела к окислительно-модифицированным липопротеинам низкой плотности, ПВ - пероксид водорода, ХС ЛПВП - холестерин липопротеинов высокой плотности. При значениях Р меньших 0,606 и максимально приближенных к центроиду - 0,080 у пациента прогнозируют РПИС. Способ обеспечивает повышение достоверности индивидуального прогнозирования РПИС в первые сутки от начала заболевания, что, в свою очередь, позволяет максимально рано проводить соответствующую корригирующую терапию. 2пр., 2 таб.
Изобретение относится к медицине, в частности к инфектологии, и может быть использовано для прогнозирования состояния тонуса артериальных и венозных сосудов мозга у больных гриппом. Для этого у больного определяют возрастную группу, срок наблюдения и значение ристомицин-агрегации тромбоцитов в сыворотке крови в секундах. Полученные данные подставляют в формулы: ППа=-28,64+А*7-В*3,1+С*5,2 и ППв=-5,37+А*6,87-В*2,7+С*4,02, где ППа - прогностический показатель состояния тонуса артериальных сосудов мозга; ППв - прогностический показатель состояния тонуса венозных сосудов мозга; 28,64 - константа математических расчетов для прогнозирования состояния тонуса артериальных сосудов мозга; 5,37 - константа математических расчетов для прогнозирования состояния тонуса венозных сосудов мозга; А - возрастная группа пациентов, где первая группа - если возраст пациентов колеблется от 21 до 35 лет, в формулу подставляют цифру 1, вторая группа - от 36 до 50 лет - цифру 2, третья группа - от 51 до 65 лет - цифру 3; В - срок наблюдения, где 1-й срок наблюдения - 1-3 дни болезни, в формулу подставляют цифру 1; 2-й срок - 4-5 дни болезни - цифру 2; 3-й срок - 6-8 дни - цифру 3; 4-й срок - 9-14 дни от начала заболевания - цифру 4; 5-й срок - один месяц от начала заболевания - цифру 5; С - значение ристомицин-агрегации тромбоцитов в сыворотке крови в секундах. При значении ППа и ППв больше 0, но меньше 5 включительно прогнозируют развитие атонии сосудов. Для артериальных сосудов мозга при значении ППа больше 5 и меньше 40 прогнозируют развитие гипотонии сосудов. При значении ППа от 40 и до 60 включительно прогнозируют развитие нормотонии сосудов. При значении ППа больше 60 - развитие повышенного тонуса. Для венозных сосудов мозга при значении ППв больше 5 и меньше 50 прогнозируют развитие гипотонии сосудов. При значении ППв от 50 включительно и до 70 включительно прогнозируют развитие нормотонии сосудов. При значении ППв больше 70 - развитие повышенного тонуса. Способ обеспечивает возможность своевременного выявления изменений тонуса сосудов мозга у больных гриппом и обоснованного проведения их коррекции. 1 пр.
Наверх