Способ прогнозирования исхода мышечно-инвазивного рака мочевого пузыря после комбинированного лечения



Способ прогнозирования исхода мышечно-инвазивного рака мочевого пузыря после комбинированного лечения
Способ прогнозирования исхода мышечно-инвазивного рака мочевого пузыря после комбинированного лечения

 


Владельцы патента RU 2538632:

Федеральное государственное бюджетное учреждение "Научно-исследовательский институт онкологии" Сибирского отделения Российской академии медицинских наук (ФГБУ "НИИ онкологии" СО РАМН) (RU)

Изобретение относится к области медицины, конкретно к онкологии, и касается способа прогнозирования исходов мышечно-инвазивного рака мочевого пузыря. Способ включает проведение исследования активности 26S протеасом и содержания NF-кВ р65 и р50 в опухолевой ткани. При активности 26S протеасом более 18-1000 Ед/мг белка и при коэффициенте NF-кВ р65/р50 более 1,0 прогнозируют низкую вероятность развития рецидива; при активности 26S протеасом менее 18-1000 Ед/мг белка и при коэффициенте NF-кВ р65/р50 менее 1,0 прогнозируют высокую вероятность развития рецидива опухоли. Изобретение может быть использовано для определения прогрессирования заболевания в виде появления рецидивов опухоли после проведения трансуретральной резекции опухоли и полихимиотерапии по схеме M-VAC. Применение изобретения обеспечивает повышение точности и информативности прогнозирования исхода рака мочевого пузыря. 2 пр., 2 ил.

 

Изобретение относится к области медицины, конкретно к онкологии, касается способов прогнозирования исходов мышечно-инвазивного рака мочевого пузыря и может быть использовано для определения прогрессирования заболевания в виде появления рецидивов опухоли после проведения трансуретральной резекции опухоли и полихимиотерапии по схеме M-VAC.

Используемые в настоящее время традиционные способы прогнозирования течения заболевания, в первую очередь, предполагают анализ параметров, характеризующих клинические особенности заболевания, а именно размеры новообразования, характер и степень распространенности процесса. По данным литературы имеются сведения о прогностической значимости таких параметров, как наличие микросателлитных последовательностей ДНК, мутаций проонкогенов, онкосупрессоров, регуляторов клеточного цикла, ангиогенных факторов [3, 4, 7] и молекул адгезии [5] относительно риска развития рецидивов заболевания. Однако эти данные носят противоречивый характер.

Наиболее близким к заявляемому является способ прогнозирования, включающий определение полиморфизма гена GSTP1 (глютатина S-трансферазы), который связан с метаболизмом ксенобиотиков (Патент РФ №2393772, опубл 23.03.2009). Полиморфные варианты гена ассоциированы с изменением активности фермента, что может влиять на риск развития рецидивов злокачественных новообразований. Из лимфоцитов периферической венозной крови выделяют ДНК, проводят ПЦР-анализ с последующей рестрикцией амплифицированных фрагментов полиморфного локуса Ile105Val гена GSTP1. При обнаружении у больных с поверхностными формами РМП гомозиготного генотипа Val/Val прогнозируют высокий риск развития рецидива рака мочевого пузыря (РМП). Гомозиготный генотип Ile/Ile связан с минимальным риском в отношении развития рецидивов РМП.

Недостатками данного способа являются низкая чувствительность, точность и информативность, а также ограниченная область применения способа, обусловленная - отсутствием связи полиморфных вариантов генов с активностью фермента, которая связана не только с ними, но и может быть изменена за счет посттрансляционных модификаций полипептидной цепочки, а также не учитывается биологическое поведение самой опухоли, которая может оказывать выраженное влияние на канцерогенез.

Новая техническая задача - повышение точности и информативности прогнозирования прогрессирования заболевания в отношении риска развития рецидивов.

Для решения поставленной задачи в способе прогнозирования исхода мышечно-инвазивного рака мочевого пузыря после комбинированного лечения путем исследования ферментов метаболизма определяют активность 26S протеасом и содержание NF-kВ p65 и p50 в ткани опухоли и при активности 26S протеасом более 18-1000 Ед /мг белка и при коэффициенте NF-kB p65/p50 более 1,0 прогнозируют низкую вероятность развития рецидива; при активности 26S протеасом менее 18-1000 Ед /мг белка и коэффициенте NF-kВ p65/p50 менее 1,0 прогнозируют высокую вероятность развития рецидива опухоли.

Способ осуществляют следующим образом.

Проводят флуорометрическое определение активности 26S протеасом, а также иммуноферментное определение экспрессии NF-kB (nuclear factor kappa-light-chain-enhancer of activated B cells - ядерный транскрипционный фактор kB) p65 и p50 в опухолевой ткани. Для этого из операционного материала берут образцы опухолевой ткани в течение 2-3 часов после операции, очищают от участков некроза, кровоизлияний и помещают в жидкий азот. Образцы тканей до определения активности ферментов хранят при температуре -70°C и размораживают не более 1 раза для исследования активности и содержания маркеров. Перед определением активности исследуемых ферментов замороженную опухолевую ткань гомогенизируют до порошкообразного состояния в жидком азоте. 26S протеасомы выделяют методом высаливания с помощью сульфата аммония до 40% насыщения [12]. Химотрипсинподобную активность 26S протеасом, осуществляющуюся химотрипсинподобными центрами протеасом, оценивают по гидролизу флуорогенного олигопептида Suc-LLVY-AMC (Sigma, США) [1]. Образовавшийся продукт регистрируют на флуориметре «Hitachi-850» (Япония) при длине волны возбуждения 380 нм и эмиссии 440 нм. Для оценки активности примесных протеаз в образцах применяют специфический ингибитор протеасом - MG132. За единицу активности протеасом принимают количество фермента, при котором гидролизуется 1 нмоль Suc-LLVY-AMC в течение 1 мин. Удельную активность протеасом выражают в единицах активности на 1 мг белка. Содержание белка определяют по методу Лоури.

Приготовление ядерных экстрактов для определения NF-kB (p50 и p65 форм) проводят в соответствии с рекомендациями фирмы производителя Caymanchem (США). Замороженную ткань (100 мг) гомогенизируют в жидком азоте, затем ресуспендируют. Гомогенат центрифугируют при 2400g и 4°C для получения осадка, который ресуспендируют в 50 мкл 50 mM Трис-HCl буфера (pH 7,5) и затем центрифугируют при 14000g и 4°C. Полученный супернатант используют для определения экспрессии транскрипционных факторов. Экспрессию активированных форм NF-kB p50, р65 определяют в ядерных экстрактах иммуноферментным методом. Результаты определения содержания транскрипционных факторов выражают в условных единицах на мг белка в лунке. И при активности 26S протеасом более 18-1000 Ед /мг белка и при коэффициенте NF-kВ p65/p50 более 1,0 прогнозируют низкую вероятность развития рецидива; при активности 26S протеасом менее 18-1000 Ед /мг белка и коэффициенте NF-kВ p65/p50 менее 1,0 прогнозируют высокую вероятность развития рецидива опухоли.

Такой подход к прогнозированию риска возникновения рецидивов при раке мочевого пузыря обусловлен рядом предпосылок.

Одним из патогенетических механизмов, лежащих в основе развития и прогрессирования рака мочевого пузыря, является изменение активности протеасомной системы и экспрессии регулируемых ими субстратов, в том числе NF-kB. Необходимо отметить, что регуляторным этапом многих физиологических и патологических процессов является внутриклеточная деградация белков в протеасомах. 26 протеасомы способны активировать NF-kB за счет быстрой деградации его собственного ингибитора IkB, что способствуют выработке p105 - предшественника p50 субъединицы NF-kB [5; 10]. Известно, что посттрансляционная модификация p105 - предшественника NF-kB p50 осуществляется с помощью 20S протеасом без процесса убиквитинирования [9]. Показано, что экспрессия NF-kB и продуктов его регуляции высока в случае переходно-клеточного рака мочевого пузыря. При этом уровень фактора связан с лимфогенным метастазированием опухоли [8; 11]. При этом большое значение придается соотношению NF-kB p65/p50 [2], что связано с наличием активных форм фактора.

Информативность отобранных критериев обоснована наличием связи активности 26S протеасом и экспрессии NF-kB p50 и p65 с возникновением рецидивов рака мочевого пузыря, которое проводилось у 54 больных РМП T2-3N0M0 (средний возраст 61,8±1,5 лет), проходивших лечение в отделении общей онкологии ФГБУ НИИ онкологии СО РАМН с 2006 по 2012 год. У всех больных диагноз был морфологически верифицирован. Лечение включало в себя проведение 2 курсов системной полихимиотерапии в неоадъювантном режиме по стандартной схеме MVAC (метотрексат - 30 мг/м2 внутривенно в 1-й, 15-й и 22-й день, винбластин - 4 мг/м2 в 1-й, 15-й и 22-й день, внутривенно цисплатин - 70 мг/м2 во 2-й день внутривенно, доксорубицин 30 мг/м2 внутривенно во 2-й день), перерыв между курсами составил 4-6 недель. В последующем этим пациентам выполнялась трансуретральная резекция (ТУР) мочевого пузыря и еще 2 курса адъювантной химиотерапии по вышеуказанной схеме.

Опухолевая ткань забиралась из операционного материала не позднее чем через 2-3 часа после операции, замораживалась в жидком азоте. Затем в опухолевой ткани определялась активность 26S протеасом и экспрессия NF-kB p50 и p65.

Средний срок наблюдения за больными, включенными в исследование, составил 22 месяца. Прогрессирование процесса было отмечено у 19 больных (35%) за счет развития рецидивов опухоли.

Для оценки прогностической значимости активности 26S протеасом и экспрессии NF-kB р50 и р65 в опухолевой ткани при раке мочевого пузыря использовали однофакторный анализ прогностической значимости признаков (Survival Analysis, Statistica 6.0). Показатели 2-летней безрецидивной выживаемости анализировали с помощью построения кривых выживаемости по методу Каплана-Майера. Сравнение показателей выживаемости в группах проводили по критерию Гехана-Вилкоксона [13].

При оценке прогностической значимости активности ферментов систем внутриклеточного протеолиза в ткани опухоли при раке мочевого пузыря было выявлено, что статистически значимыми факторами в отношении безрецидивной выживаемости, являются активность 26S протеасом и экспрессии NF-kB p50 и p65. На фиг.1 представлены показатели 2-летней безрецидивной выживаемости в зависимости от активности 26S протеасом в опухоли, на фиг.2 - в зависимости от коэффициента NF-kB p65/р50 в опухоли, которые подтверждают высокую вероятность появления рецидивов заболевания в группе больных с активностью 26S протеасом более 18-1000 Ед /мг белка и при коэффициенте NF-kB p65/p50 более 1,0.

При активности 26S протеасом в опухоли более 18*1000 Ед/мг белка у 3 (13%) пациентов из 23 было выявлено рецидивирование процесса. Тогда, как при активности фермента менее 18*1000 Ед/мг белка, у 16 (51%) больных из 31 были диагностированы рецидивы. Безрецидивная выживаемость в первом случае составила 86,9%, что было значимо выше по сравнению со второй группой больных, где данный показатель был равен 49% (p<0,05). Чувствительность метода определения активности 26S протеасом для оценки риска возникновения рецидивов опухоли составила 84%, специфичность - 57%, прогностическая ценность положительного результата - 51%.

При соотношении NF-kB p65/p50 выше 1,0 у 3 (15%) пациентов из 20 были выявлены рецидивы рака мочевого пузыря, безрецидивная выживаемость была равна 84%. У 12 (60%) больных из 20 при коэффициенте NF-kB p65/p50 менее 1,0 были выявлены рецидивы опухоли после проведенного лечения. Безрецидивная выживаемость в этом случае составила 40%. При сравнении безрецидивной выживаемости в группах больных с разным пороговым уровнем соотношения NF-kB p65/p50 было выявлено статистически значимое различие по данному показателю (p<0,05). Чувствительность определения соотношения NF-kB p65/p50 относительно риска возникновения рецидивов опухоли составила 80%, специфичность - 68%, прогностическая ценность положительного результата - 60%.

Клинические примеры:

Пример 1. Больной Ж., 60 лет, обратился в ФГБУ НИИ онкологии СО РАМН, где по результатам комплексного обследования был поставлен диагноз: рак мочевого пузыря T2N0M0. Проведено 2 курса системной полихимиотерапии в неоадъювантном режиме по стандартной схеме MVAC. В последующем этому пациенту выполнялась ТУР мочевого пузыря и еще 2 курса адъювантной химиотерапии по вышеуказанной схеме. При гистологическом исследовании операционного материала диагностирован переходно-клеточный рак мочевого пузыря умеренной степени дифференцировки. Активность 26S протеасом в опухолевой ткани составила 17-1000 МЕ/мг белка, коэффициент NF-kB p65/p50 был равен 0,9 единицы, что соответствовало неблагоприятному прогнозу в отношении риска развития рецидива опухоли. При динамическом наблюдении за больным через 14 месяцев после проведения лечения был выявлен рецидив, по поводу чего проводилось дальнейшее лечение. А через 20 месяцев после проведенного лечения был выявлен повторный рецидив заболевания, и больному была проведена цистэктомия. Общий срок наблюдения за больным составил 3 года.

Пример 2.

Больной И., 55 лет, обратился в ФГБУ НИИ онкологии СО РАМН, где по результатам комплексного обследования был поставлен диагноз: рак мочевого пузыря T3N0M0. Проведено 2 курса системной полихимиотерапии в неоадъювантном режиме по стандартной схеме MVAC. Дальнейшее лечение заключалось в проведении ТУР мочевого пузыря и еще 2 курсов адъювантной химиотерапии по вышеуказанной схеме. При гистологическом исследовании операционного материала диагностирован переходно-клеточный рак мочевого пузыря умеренной степени дифференцировки. Активность 26S протеасом в опухолевой ткани составила 28-1000 МЕ/мг белка, коэффициент NF-kB р65/р50 был равен 1,2 единицы, что соответствовало благоприятному прогнозу в отношении риска развития рецидива опухоли. Период динамического наблюдения за больным составил 36 месяцев. Данных за прогрессирование заболевания не выявлено.

Таким образом, предлагаемый способ прогнозирования исхода мышечно-инвазивного рака мочевого пузыря совместно с основными клинико-морфологическими параметрами позволяет с большей точностью и информативностью предсказать появление рецидивов заболевания, что дает возможность скорректировать тактику ведения пациентов.

Источники информации

1. Ben-Shahar S., Komlosh A., Nadav E. et al. 26 S proteasome-mediated production of an authentic major histocompatibility class I-restricted epitope from an inlact protein substrate // The J of Biol. Chem. - 1999. - Vol.274. - No.31. - P.21963-21972.

2. Conner J.R., Smirnova I.I., Moseman A.P., Poltorak A. IRAK1BP1 inhibits inflammation by promoting nuclear translocation of NF-kappaB p50 // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. - 2010. - V.107(25). - P.11477-11482.

3. Garcia-Closas M., Malats N., Real F.X. et al. Large-scale evaluation of candidate genes identifies association between VEGF polymorphism and bladder cancer risk // PloS. Genet. 2007. Vol.3. P.287-293.

4. Goddard.J.C., Sutton C.D., Furness P.N. et al. Microvessel density at presentation predicts subsequent muscle invasion in superficial bladder cancer // Clin Cancer Res. 2003. Vol.9. P.2583-2586.

5. Goldberg A.L. Functions of the proteasome: from protein degradation and immune surveillance to cancer therapy // Biochemical Society Transactions 2007 Vol.35. - P.12-17.

6. Habuchi Т., Marberger M., Droller M.J., Hemstreet G.P. et al. Prognostic markers for bladder cancer: International Consensus Panel on bladder tumor markers. // Urology. - 2005. Vol.66(6). P.64-74.

7. Inoue К., Kamada M., Slaton J.W. et al. The prognostic value of angiogenesis and metastasis-related genes for progression oftarnsitional cell carcinoma of the renal pelvis and ureter // Clin. Cancer. Res. 2002. Vol.8. P.1863-1870.

8. Karashima T, Sweeney P, Kamat A, Huang S, Kim SJ, Bar-Eli M, McConkey DJ, Dmney CP. Nuclear factor-kappaB mediates angiogenesis and metastasis of human bladder cancer through the regulation of interleukin-8. // Clin Cancer Res. 2003. Vol.9(7). P.2786-2797.

9. Moorthy А.К., Savinova O.V., Ho J.Q., Wang V.Y., Vu D., Ghosh G. The 20S proteasome processes NF-kappaB1 p105 into p50 in a translation-independent manner. // EMBOJ. 2006. Vol.25(9). P.1945-56.

10. Shah S.A., Potter M.W., McDade T.P., Ricciardi R., Perugini R.A., Elliot P.J., Adams J., Gallery M.P. 26S proteasome inhibition induces apoptosis and limits growth of human pancreatic cancer. // J. Cell Biochem. - 2001. - Vol.82(1). P.110-122.

11. Xie DH. Tang XD. Xia SJ, Tan JM, Wang XH, Cai Y. Expression of NF-kappa В in human bladder cancer and its clinical significance // Ai Zheng. - 2002. - Vol.21(6). P.663-667.

12. Абрамова Е.Б., Астахова Т.М., Ерохов П.А., Шарова Н.П. Множественность форм протеасомы и некоторые подходы к их разделению // Изв. РАИ Сер. биол. - 2006. - №2. С.150-156.

13. Боровиков, В.П. STATISTICA - статистический анализ и обработка данных в среде Windows / В.П.Боровиков. П.П.Боровиков. - М.: Филин, 1998. - 608 с.

Способ прогнозирования исхода рака мочевого пузыря при исследовании ферментов метаболизма в опухоли, отличающийся тем, что исследуют активность 26S протеасом и содержание NF-kB p65 и p50; при активности 26S протеасом более 18-1000 Ед/мг белка и при коэффициенте NF-kB p65/p50 более 1,0 прогнозируют низкую вероятность развития рецидива; при активности 26S протеасом менее 18-1000 Ед /мг белка и при коэффициенте NF-kB p65/p50 менее 1,0 прогнозируют высокую вероятность развития рецидива опухоли.



 

Похожие патенты:

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к определению содержания микроорганизмов в различных объектах и средах. Способ предусматривает конъюгацию бактерий с электрохимической меткой, в качестве которой используют Fe0, MgFe2O4 или Fe3O4, осуществляемую в водной среде при заданных параметрах.

Изобретение относится к медицине, экспериментальной и клинической фармакологии. Суть способа: окисленный декстран растворяют в трис-ацетатном буферном растворе с рН 5,0-5,5, добавляют к полученному раствору гидразид биотина в соотношении к окисленному декстрану, равном 1:(20-25), после чего полученный раствор нагревают до 80-90°С и выдерживают в течение 30-60 минут.
Изобретение относится к области медицины, а именно к акушерству, предназначено для прогнозирования патологии в родах, в частности дискоординации родовой деятельности (дистоции шейки матки).

Изобретение относится к медицине, а именно к диагностике, и может быть использовано для оценки угрозы формирования гемической гипоксии у беременных при обострении цитомегаловирусной инфекции.
Изобретение относится к области медицины и может быть использовано для оценки устойчивости мембран эритроцитов периферической крови у беременных с цитомегаловирусной инфекцией на третьем триместре гестации.
Изобретение относится к медицине, в частности к вопросу изучения антиадгезивной активности противохолерных иммуноглобулинов и усиления ее для совершенствования специфической профилактики холеры.

Группа изобретений относится к способу обнаружения множественных цитокинов из отдельно взятых клеток и предназначено для создания набора иммунологических характеристик заболеваний.
Изобретение относится к области медицины и представляет собой способ экспресс-диагностики острых кишечных инфекций (ОКИ), включающий выявление маркеров-индикаторов этиологии ОКИ, с использованием иммунологического лабораторного исследования, отличается тем, что этиологию ОКИ устанавливают у детей ранней возрастной категории, предпочтительно у новорожденных, при этом определяют концентрацию в копрофильтрате цитокина - интерлейкина IL-10 и наличие хронической фетоплацентарной недостаточности (ХФПН), после чего рассчитывают вероятность (Р) бактериальной этиологии ОКИ, причем значение Р больше 50% свидетельствует о бактериальной этиологии ОКИ, а меньше 50% свидетельствует об отсутствии бактериальной этиологии ОКИ, и необходимости проведения второго этапа диагностики, на котором определяют концентрацию в копрофильтрате цитокина - интерлейкина IL-4, выявляют срок прикладывания к груди, а также вид вскармливания, при этом рассчитывают вероятность (Р) вирусной либо вирусно-бактериальной этиологии ОКИ, причем значение Р больше 50% свидетельствует о вирусной этиологии ОКИ, а меньше 50% свидетельствует о вирусно-бактериальной ОКИ.
Изобретение относится к области медицины, а именно к медицинской диагностике, и описывает способ качественной дифференциальной диагностики доброкачественных и злокачественных новообразований слизистой оболочки губы по содержанию биомаркеров в ротовой жидкости пациента.
Изобретение относится к медицине, в частности к элюированию сконцентрированного на магнитной матрице патогена. Способ элюции осуществляется следующим образом: 0,1 мл 10% взвеси магнитно-иммунного сорбента (МИС) туляремийного, чумного или бруцеллезного инкубируют с микробными взвесями возбудителей туляремии, бруцеллеза или чумы в течение 30 мин, удаляют надосадок, далее МИС инкубируют с 0,5 мл элюирующего раствора в течение 10 мин, pH элюата возвращают к физиологическому значению, проводят постановку реакции непрямой гемагглютинации или реакции агглютинации латекса.

Изобретение относится к области медицины и может быть использовано для определения антиоксидантной защиты организма человека при диагностике и лечении различных заболеваний, сопровождающихся нарушением антиоксидантной защиты.

Изобретение относится к медицинской диагностике в области гематологии и может быть использовано для одновременного определения всех производных гемоглобина в крови.

Изобретение относится к медицине и касается способа проведения иммунохроматографического анализа с диссоциирующей флуоресцентной меткой, в котором на мембранной тест-полоске формируют комплексы, в состав которых входят молекулы антигена или антигенов, специфичные к ним антитела и молекулы метки.
Изобретение относится к области медицины и может быть использовано для оценки угрозы формирования гипоксии в третьем триместре гестации. Способ включает: определение в периферической крови титра антител к цитомегаловирусу, уровня рН крови и содержания оксигемоглобина на биохимическом анализаторе, и при нарастании титра антител к цитомегаловирусу до 1:1600, уменьшении рН крови до 7,25±0,03, а оксигемоглобина до 90,15±0,35% при контроле 95,20% оценивают угрозу формирования гемической гипоксии.

Изобретение относится к области медицины и предназначено для прогнозирования эффекта терапии инфликсимабом у детей с болезнью Крона. Проводят определение сывороточной концентрации фактора некроза опухоли альфа (TNF-α), оценку относительного содержания Th17-лимфоцитов (%CD3+CD4+CD161+ от CD3+CD4+) и активности сукцинатдегидрогеназы в популяции регуляторных Т-клеток (CD3+CD4+CD127low) (SDH-Treg) до и на следующие сутки после введения инфликсимаба.

Изобретение относится к аналитической химии, в частности к аспектам, относящимся к способам неферментативного определения присутствия или количества углеводов в образце, и описывает способ, устройство и набор для анализа образца для определения присутствия или количества анализируемого вещества, в частности углеводорода, более конкретно сахара, в образце при использовании ткани.

Изобретение относится к медицине, а именно к способу определения выраженности воспалительного процесса при остеоартрозе. Сущность способа состоит в том, что проводят люминолзависимую железоиндуцированную хемилюминесценцию модельной системы, которая имеет следующий состав: 2,72 г KH2PO4, 7,82 г KCl, 1,5 г цитрата натрия C6H8O7Na3*5,5H2O на 1 литр дистиллированной воды, pH 7,45 с 0,2 мл 10-5 М раствора люминола, затем в присутствии синовиальной жидкости определяют интенсивность свечения модельной системы до и после добавления синовиальной жидкости.

Изобретение относится к способу обнаружения аналита в пробе жидкости тела путем использования диагностического тестового элемента. Диагностический тестовый элемент (110) для обнаружения аналита в пробе (126) жидкости тела, в частности цельной крови объемом менее 2 микролитров, содержит по меньшей мере одно тестовое поле (116) с по меньшей мере одним реагентом-индикатором, где реагент-индикатор способен при наличии аналита испытывать по меньшей мере одно обнаруживаемое изменение, в частности оптическое изменение.

Изобретение относится к иммунологии и медицинской диагностике и представляет собой способ проведения иммунохроматографического анализа для серодиагностики. Предложенное изобретение предназначено для иммунохроматографического определения в жидких пробах антител к возбудителям инфекционных заболеваний или другим антигенам, например, таким как аллергены.
Изобретение относится к медицине и представляет собой способ ускоренной окраски гистологических препаратов для выявления микобактерий туберкулеза, включающий приготовление гистологических препаратов по общепринятой методике, окрашивание их по Циль-Нильсону, отличающийся тем, что после стандартной подготовки препаратов к окраске срезы проходят процедуру депарафинизации путем последовательного помещения их в ксилол и спирты нисходящей концентрации по 5 минут в термостат при температуре 54°C с последующим помещением их в воду, затем в 1% раствор йодной кислоты на 2 минуты и промыванием в проточной воде в течение 10 секунд, после чего на срез, покрытый фильтровальной бумагой, наливают карбол-фуксин Циля и подогревают над пламенем спиртовки до появления паров в течение 2 минут, оставляют краску на срезе после прекращения подогревания на 3-5 минут, убирают фильтровальную бумагу и ополаскивают срезы в воде, дифференцируют их 1% кислотным буфером, ополаскивают в водопроводной воде в течение 1 минуты, после чего на срез помещают раствор метиленового синего по Лефлеру и подогревают над пламенем спиртовки до появления паров, промывают в воде, дифференцируют в 1% кислотном буфере и хорошо промывают водой, обезвоживают в спиртах восходящей крепости в течение 1 минуты, помещают в ксилол и заключают в бальзам.

Изобретение относится к медицине и может быть использовано для прогнозирования ранней стадии апоптоза лимфоцитов. Для этого выделяют клетки, инкубируют их 48 часов при температуре 37°C и 5% содержании CO2 с добавлением индуктора апоптоза дексаметазона в концентрации 10-4 моль/мл. Жизнеспособность лимфоцитов определяют количественно по включению трипанового синего с последующим определением концентрации восстановленного и окисленного глутатионов в лизате лимфоцитов после предварительной инкубации в течение 30 минут с 10 мМ 2-винилпиридина. Раннюю стадию апоптоза лимфоцитов прогнозируют при одновременном комплексном снижении концентрации восстановленного глутатиона на 17% и более и увеличении концентрации окисленного глутатиона на 19% и более по сравнению с контролем. Использование предлагаемого способа в медицинской практике позволяет прогнозировать статус антиоксидантной системы организма при различных заболеваниях по оценке ранней стадии апоптоза лимфоцитов. 1 табл.
Наверх