Способ изготовления аллергена для дифференциальной диагностики парааллергических реакций у крупного рогатого скота на ппд туберкулин для млекопитающих


 


Владельцы патента RU 2538690:

Государственное научное учреждение Всероссийский научно-исследовательский институт экспериментальной ветеринарии имени Я.Р. Коваленко (ВИЭВ) (RU)

Изобретение относится к области ветеринарной микробиологии и биологической промышленности, в частности к способам получения аллергенов для дифференциальной диагностики парааллергических реакций у крупного рогатого скота на ППД туберкулин для млекопитающих. Способ изготовления аллергена для дифференциальной диагностики парааллергических реакций на ППД туберкулин для млекопитающих заключается в том, что для раздельного осаждения белка из культурального фильтрата берут трихлоруксусную кислоту до конечной концентрации 6-8%, оставляют раствор белка на 12-20 часов при температуре 4-6°C, центрифугируют при 4-8 тыс. об/мин в течение 30 минут, растворяют в дистиллированной воде с pH 7,0-8,0 и полученный раствор белка ставят на диализ через целлофановую оболочку против обессоленной воды на 12-24 часа, после чего добавляют 0,2-0,3% фенола для стабилизации, стерилизуют и расфасовывают препарат в нативном состоянии. Изобретение обеспечивает сокращение сроков изготовления комплексного аллергена из атипичных микобактерий (КАМ), повышение качества дифференциальной диагностики на ППД туберкулин для млекопитающих и позволяет уменьшить экономический ущерб от вынужденного убоя реагирующих на ППД туберкулин животных. 2 табл.

 

Предлагаемое изобретение относится к области ветеринарной микробиологии, в частности к способу изготовления аллергена для диагностики парааллергических реакций на туберкулез в симультанной пробе с ППД туберкулином для млекопитающих.

Общепринятым способом диагностики туберкулеза крупного рогатого скота является внутрикожная проба с применением ППД туберкулина.

Одна из самых важных проблем при этой диагностике - появление неспецифических реакций на туберкулин.

Массовые выявления неспецифических реакций на туберкулин приводят к убою большого количества здоровых животных, что увеличивает размеры экономического ущерба и вызывает сомнения в правильности диагностики туберкулеза известным способом.

В связи с широким распространением неспецифических (парааллергических) реакций на туберкулин в разные годы многими авторами были предложены различные способы дифференциации этих реакций.

Многочисленными исследованиями отечественных и зарубежных авторов установлено, что основной причиной проявления неспецифических реакций у крупного рогатого скота на туберкулин является сенсибилизация микобактериями: М. avium, М. paratuberculosis и быстрорастущими атипичными микобактериями, широко распространенными в окружающей среде (1, 2, 4).

В нашей стране для дифференциации неспецифических реакций с 1978 года использовалась симультанная проба с применением ППД туберкулина для млекопитающих и комплексного аллергена из атипичных микобактерий (КАМ), а с 2002 года применяется и симультанная проба с ППД туберкулином для млекопитающих и ППД туберкулином для птиц.

Известен способ изготовления комплексного аллергена из атипичных микобактерий (КАМ), включающий выращивание микобактерий М. scrofulaceum №12-C и М. intracellulare №13-H на жидкой питательной среде при 37-38°C, инактивацию культур автоклавированием при температуре 120°C в течение 30 минут, осаждение белка из культурального фильтрата трихлоруксусной кислотой и переосаждение его сернокислым аммонием с последующим диализом через целлофановую оболочку для удаления сульфатов. Содержание единиц действия (ЕД) в 1 мл раствора белка каждого вида этих микобактерий определяли на морских свинках, сенсибилизированных гомологичными микобактериями в сравнении с референтными сериями этих препаратов с известной активностью. Полученные моноаллергены смешивали в равных количествах по содержанию единиц действия (1).

Известен также способ получения аллергена, заключающийся в следующем: выращивание культур атипичных микобактерий М. scrofulaceum, М. intracellulare, М. fortuitum и М. smegmatis проводили раздельно на жидкой питательной среде Сотона при температуре 37-38°C в течение 2-3 недель, далее инактивировали культуры автоклавированием при 120°C в течение 30 минут, осаждали белок из культурального фильтрата каждого штамма в отдельности трихлоруксусной кислотой до конечной 4% концентрации, переосаждали белок сернокислым аммонием при 50%-ном насыщении с последующим диализом раствора белка через целлофановую оболочку против обессоленной воды для удаления сульфатов, затем определяли концентрации белка в растворах каждого штамма и активности по содержанию единиц действия (ЕД) на сенсибилизированных различными видами микобактерий морских свинках и смешивали растворы белка в равных долях по содержанию ЕД, стерильно фильтровали, расфасовывали и лиофилизировали (Прототип).

В задачу наших исследований входило упрощение способа, сокращение времени на его проведение и получение препарата в нативном состоянии.

Этого удается достичь благодаря тому, что при изготовлении комплексного аллергена (КАМ) для раздельного осаждения белков из культурального фильтрата берут трихлоуксусную кислоту до конечной концентрации 6-8%, оставляют раствор белка на 12-20 часов при температуре +4-6°C, центрифугируют при 4-6 тыс.об/мин. в течение 30 минут, растворяют в дистиллированной воде с pH 7,0-8,0 и полученный раствор белка ставят на диализ через целлофановую пленку против обессоленной воды на 12-24 часа, после чего добавляют 0,2-0,3% фенола для стабилизации, фильтруют стерильно и расфасовывают препарат в нативном состоянии.

Предложенный способ получения аллергена заключается в следующем: выращивание культур атипичных микобактерий М. scrofulaceum, М. intracellular, М. fortuitum и М. smegmatis проводят раздельно на жидкой питательной среде Сотона при температуре 37-38°C в течение 4-6 недель, инактивируют культуры автоклавированием при 120°C в течение 40-60 минут, осаждают белок из культурального фильтрата в отдельности трихлоруксусной кислотой до конечной концентрации 6-8%, оставляют на 12-20 часов при температуре +4-6°C, центрифугируют при 4-6 тыс.об/мин в течение 30 мин, полученный белок растворяют в дистиллированной воде с pH 7,0-8,0, разливают в целлофановые трубки и ставят на диализ против обессоленной воды для удаления солей, остатков кислоты на 12-24 часа, проводят стерилизующую фильтрацию, определяют концентрацию белка, содержание единиц действия (ЕД) в 1 мл раствора белка, полученного из каждого штамма микобактерий с последующей подтитровкой концентрации на сенсибилизированных гомологичными видами микобактерий морских свинках в сравнении с референтными сериями этих препаратов с известной активностью, далее смешивают растворы белка в равных долях по содержанию ЕД, добавляют 0,2-0,3% фенола для стабилизации, стерильно фильтруют и расфасовывают в нативном состоянии.

Предложенный способ получения аллергена позволяет сократить длительность изготовления препарата за счет исключения переосаждения белков сернокислым аммонием (2 суток), сократить длительность диализа до одних суток, исключить процесс лиофилизации препарата, так как препарат расфасовывается в нативном состоянии.

Аллерген, полученный предложенным способом, апробирован нами с положительными результатами в лабораторных условиях на сенсибилизированных различными атипичными микобактериями, М. avium и БЦЖ морских свинках (65 гол.) и на крупном рогатом скоте благополучных по туберкулезу хозяйств Волгоградской, Ярославской, Рязанской областей (675 гол.).

Ниже приводятся конкретные примеры осуществления заявляемого способа.

Таблица 1
Результаты испытаний различных моноаллергенов на сенсибилизированных атипичными микобактериями морских свинках
Аллерген, кол-во белка в 0,1 мл испыт. раст-ра Интенсивность реакций животных на гомолог. моноаллергены (мм)
Сенсибилизация
M. intracellulare
Сенсибилизац.
М. scrofulaceum
Сенсибилизация
M. fortuitum
Сенсибилизация
М. smegmatis
Аллерген Intracellulare 14,3±1,22 4,8±0,42 8,5±0,95 8,1±0,94
Аллерген Scrofulaceum 7,1±0,65 19,3±1,45 6,3±0,34 7,4±0,96
Аллерген Fortuitum 7,6±1,23 5,2±0,96 15,7±1,53 9,5±1,65
Аллерген Smegmatis 6,3±0,67 5,8±0,96 12,4±2,3 21,2±2,14
КАМ производств. 3,4±0,95 3,2±0,66 5,8±0,96 6,2±0,97
Прототип 6,8±0,97 13±0,88 7,5±0,96 14,3±1,05
Таблица 2
Результаты испытаний различных аллергенов (контроля, прототипа и заявляемого) на сенсибилизированных атипичными микобактериями морских свинках
Аллерген Интенсивность реакций животных на гомолог. моноаллергены (мм)
Сенсибилизация
M. intracellulare
Сенсибилизац.
M. scrofulaceum
Сенсибилизация
M. fortuitum
Сенсибилизация
M. smegmatis
ППД туберкулин для млекопит. 4,1±0,76 3,8±0,33 2,5±0,46 4,1±0,43
Производственный КАМ 15,3±1,34 14,4±0,88 8,4±1,03 9,6±1,97
Прототип 17,0±2,05 15,1±1,74 16,4±2,05 16,2±1,86
Испытуемый аллерген 16,7±1,22 15,8±2,05 17,2±1,55 16,8±2,35

Примеры испытания в производственных условиях на КРС.

Пример 1. Исследовали 256 коров благополучного хозяйства по туберкулезу (СПК им. Кирова, Старополтавский р-н, Волгоградская обл.) внутрикожной пробой симультанно ППД туберкулина для млекопитающих, КАМ, прототип и заявляемый аллерген. Препараты вводили в дозе 0,2 мл каждого в область шеи (с правой стороны ППД и КАМ, а с левой - 2 последние). Учет и оценку реакций делали через 72 часа после введения препаратов. У 16 голов реакции были выражены сильнее на ППД туберкулин, на КАМ - 29, и с левой стороны шеи на оба препарата реакции были ярко выражены у 33 голов. Общее число реагирующих животных (16+33) равно 49 (показатель А). По таблице определения достоверности различий находили цифру 49, которая равна 34 (показатель Б), что указывает на достоверность различий в реакциях (94,5%), т.е. животные данных групп сенсибилизированы атипичными микобактериями, что в дальнейшем было подтверждено бактериологическими исследованиями.

Аналогичные испытания препаратов в той же последовательности были проведены на 250 головах КРС (ОАО ПЗ им. Дзержинского, Ярославского р-на, Ярославской обл.) и на 169 коровах (колхоз «Заветы Ильича», Касимовский р-н, Рязанская обл.) и везде подтверждена сенсибилизация животных атипичными микобактериями. Результаты симультанной пробы были подтверждены бактериологическими исследованиями, т.е. наличие туберкулеза у животных вышеперечисленных хозяйств исключено.

Анализ данных, полученных при сравнительном испытании заявляемого аллергена, прототипа и производственного КАМ показал, что заявляемый аллерген обладает большей чувствительностью, чем производственный КАМ, и одинаковой чувствительностью с прототипом как при испытании на сенсибилизированных морских свинках, так и в производственных условиях на крупном рогатом скоте.

Предложенный способ получения аллергена найдет применение в биологической промышленности и животноводческих хозяйствах, позволяя сократить сроки изготовления комплексного аллергена из атипичных микобактерий (КАМ), повысить качество дифференциальной диагностики на ППД туберкулин для млекопитающих и уменьшить экономический ущерб от вынужденного убоя реагирующих на ППД туберкулин животных.

Источники информации

1. Дис … док. вет. наук. Аллергическая диагностика туберкулеза у животных: повышение их эффективности / Шаров А.Н, Москва. - 1989. - С.75. (Аналог).

2. Патент на изобретение №2443428, Российской Федерации, A61K 39/04 (2012) и A61K 39/35 (2012). Способ изготовления аллергена для дифференциальной диагностики парааллергических реакций у крупного рогатого скота на ППД туберкулин для млекопитающих (Гулюкин М.И. и др.)

3. Ж. Ветеринария.- 1978 - №4. - С.35-38.

4. Сбор. науч. трудов ВГНКИ. - М., 1985, С.3-9

Способ изготовления аллергена для дифференциальной диагностики парааллергических реакций на ППД туберкулин для млекопитающих, отличающийся тем, что для раздельного осаждения белка из культурального фильтрата берут трихлоруксусную кислоту до конечной концентрации 6-8%, оставляют раствор белка на 12-20 часов при температуре 4-6°C, центрифугируют при 4-8 тыс. об/мин в течение 30 минут, растворяют в дистиллированной воде с pH 7,0-8,0 и полученный раствор белка ставят на диализ через целлофановую оболочку против обессоленной воды на 12-24 часа, после чего добавляют 0,2-0,3% фенола для стабилизации, стерилизуют и расфасовывают препарат в нативном состоянии.



 

Похожие патенты:
Группа изобретений относится к биохимии, в частности к получению аллергена туберкулопротеина - полуфабриката аллергена туберкулезного очищенного в стандартном разведении.
Изобретение относится к медицине, а именно к иммунологии, и может быть использовано для получения лекарственного средства для профилактического лечения туберкулеза.

Изобретение относится к области аллергологии и иммунологии и предназначено для оценки влияния иммунобиологических препаратов на кожную реакцию гиперчувствительности замедленного типа (ГЗТ).
Изобретение относится к области биотехнологии, а именно к способу определения антител к Mycobacterium leprae. Способ включает выявление в сыворотках крови антител к Mycobacterium leprae с помощью иммуноферментного метода.

Изобретение относится к области ветеринарной микробиологии и касается способа получения специфического иммуномодулятора. .

Изобретение относится к области биотехнологии, генной инженерии и вирусологии. .

Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к получению вакцинных микроорганизмов, и может быть использовано в медицине. .

Изобретение относится к области генетической инженерии, молекулярной биологии и вакцинологии. Предложена полиэпитопная противотуберкулезная вакцинная конструкция для формирования иммунного ответа, обеспечивающая индукцию иммунного ответа CD8+ Т-лимфоцитов, состоящая из универсального полиэпитопного иммуногена, содержащего ЦТЛ-эпитопы, выбранные из иммунодоминантных антигенов М. tuberculosis, слитого с N-конца с убиквитином, и имеющая аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1. Вакцинная конструкция обеспечивает достижение эффективного терапевтического Т-клеточного иммунного ответа не только за счет антигенспецифических цитотоксических СD8+ Т-лимфоцитов, но и интенсивный ответ CD4+ Т-лимфоцитов. 1 табл., 11 ил.
Настоящее изобретение относится к применению иммунотерапевтического средства, включающего фрагменты клеточной стенки вирулентного штамма Mycobacterium tuberculosis для получения лекарственного средства, предназначенного для первичной профилактики туберкулеза у индивидуумов, подвергшихся воздействию возбудителя инфекции, и у которых не выявлена положительная кожная проба на туберкулин (ТКП). Иммунотерапевтическое средство способно к стимуляции защитного ответа, более эффективного, чем у обыкновенной вакцины БЦЖ, и уменьшает количество жизнеспособных бактерий в легких и селезенке индивидуумов, недавно инфицированных M. tuberculosis. 13 з.п. ф-лы, 2 табл., 1 пр.

Изобретение относится к медицине, а именно к онкологии и онкохирургии, и может быть использовано для комплексного эндоуретрального лечения и профилактики рецидивов мышечно-неинвазивных форм рака мочевого пузыря. Для этого осуществляют биполярную трансуретральную резекцию опухоли мочевого пузыря в физиологическом растворе. После этого на 25-30-е сутки один раз в неделю проводят 1,5-2-месячный индукционный курс внутрипузырной иммунотерапии лекарственной композицией, которую готовят непосредственно перед введением в мочевой пузырь путём механического перемешивания вакцины БЦЖ Имурон 100-120 мг и геля Тизоль 10 г в 50 мл физиологического раствора. Время выдержки лекарственной композиции в мочевом пузыре составляет 30 минут. Через 1 месяц перерыва при отсутствии рецидива опухоли и удовлетворительной переносимости лечения проводят первый курс поддерживающей внутрипузырной терапии этой лекарственной композицией однократно ежемесячно продолжительностью 12 месяцев. По окончании первого курса делают перерыв в течение 1 месяца. При отсутствии рецидива опухоли и удовлетворительной переносимости лечения проводят второй курс поддерживающей внутрипузырной терапии однократно ежемесячно продолжительностью 12 месяцев. Способ обеспечивает увеличение длительности безрецидивного периода и улучшение качества жизни пациентов при уменьшении токсичности лечения и снижении осложнений проводимой лекарственной терапии. 2 ил., 5 табл., 2 пр.
Изобретение относится к ветеринарии и может быть использовано для специфической профилактики туберкулеза у крупного рогатого скота. Для этого проводят иммунизацию крупного рогатого скота с 10-20 суточного возраста специфическим иммуномодулятором КИМ-М2 подкожно в дозе 20 мкг белка на 1 кг массы животного. Затем молодняк иммунизируют через каждые 6 месяцев, а коров через 12 месяцев до оздоровления фермы (хозяйства). Исследования на туберкулез иммунизированных животных аллергической кожной реакцией проводят через 6 месяцев. Изобретение позволяет создать у животных иммунитет против туберкулеза. 8 табл., 3 пр.

Изобретение относится к области биохимии, в частности к антигенной композиции, способной стимулировать специфичный иммунный ответ против микобактерий, содержащей: первый микобактериальный антигенный полипептид и второй микобактериальный антигенный полипептид, а также к способу ее получения. Также раскрыто применение первого микобактериального антигена и второго микобактериального антигена для получения лекарственного средства для стимуляции специфичного иммунного ответа против микобактерий у индивидуума. Также изобретение относится к способу диагностики микобактериальной инфекции с использованием вышеуказанной композиции или с использованием первого микобактериального антигена и второго микобактериального антигена. Изобретение позволяет эффективно лечить или предотвращать микобактериальные инфекции. 6 н. и 19 з.п. ф-лы, 7 ил., 4 табл., 14 пр.

Настоящее изобретение относится к применению Mycobacterium w для лечения экспрессирующего десмоколлин-3 рака. Mycobacterium w вводят млекопитающим, страдающим экспрессирующими десмоколлин-3 типами рака. Технический результат: введение Mycobacterium w приводит к регулированию опухоли и к статистически достоверному повышению выживаемости, к длительной, более 15 месяцев ремиссии. Mycobacterium w можно также применять по необходимости вместе с другим терапевтическим агентом (терапевтическими агентами) и/или способами воздействия. 5 з.п. ф-лы, 3 ил., 4 табл., 6 пр.
Наверх