Рекомбинантный штамм бактерий rhodococcus rhodochrous, обладающий конститутивной ацилирующей активностью, и способ синтеза n-замещенных акриламидов с использованием этого штамма в качестве биокатализатора



Владельцы патента RU 2539033:

Федеральное государственное унитарное предприятие "Государственный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов" (ФГУП "ГосНИИгенетика") (RU)

Изобретение относится к области биохимии, в частности к рекомбинантному штамму бактерий Rhodococcus rhodochrous ВКПМ Ас1960, обладающему конститутивной ацилирующей активностью и полученному путем замещения в хромосоме штамма Rhodococcus rhodochrous ВКМ Ас-1515Д гена, кодирующего нитрилгидратазу на ген, кодирующий ациламидазу из штамма Rhodococcus erythropolis 37 ВКПМ Ас-1793, а также к способу синтеза N-замещенных акриламидов из акриламида и аминов с его использованием в качестве биокатализатора. Изобретение позволяет эффективно получать концентрированные растворы N-замещенных акриламидов. 2 н.п. ф-лы, 1 ил., 1 табл., 5 пр.

 

Заявляемая группа изобретений относится к биотехнологии и касается рекомбинантного штамма Rhodococcus rhodochrous, а также способа синтеза N-замещенных акриламидов, в частности N-изопропилакриламида или N-диметиламинопропилакриламида с использованием клеток этого штамма в качестве биокатализатора.

N-замещенные алифатические акриламиды являются производными акриламида - мономера для синтеза широкой гаммы полимеров, которые применяются практически во всех областях промышленности. Развитие технологии производства полимеров в последние годы привело к разработке новых видов полимеров, в состав которых наряду с основным мономером - акриламидом - входят также различные производные, в том числе N-замещенные акриламиды. Эти мономеры выполняют роль модификаторов физико-химических свойств полимеров, существенно расширяя круг их применения. Одной из значительных областей применения N-замещенных акриламидов является синтез водорастворимых полимеров, применяемых в качестве адсорбентов, флокулянтов и структурообразователей во многих отраслях промышленности и сельского хозяйства (Полиакриламид. - М., 1992).

На сегодняшний день промышленным путем N-замещенные акриламиды получают традиционным способом - путем химического синтеза, основанного на ацилировании алифатических аминов хлорангидридами акриловой и метакриловой кислот (MacWilliams D.S. Functional monomers. Their preparation, polymerization, and application. New York: M. Decker, 1973). Реагенты, используемые для такого синтеза, крайне ядовиты, и, с учетом возрастающих потребностей в N-замещенных акриламидах, производство по традиционной технологии становится все более опасным для окружающей среды и персонала.

Принципиально другим способом получения N-замещенных акриламидов является биокаталитический синтез, проводимый в водной среде.

Известен способ биокаталитического синтеза N-замещенных акриламидов с помощью биокатализатора - клеток штамма Rhodococcus erythropolis ВКПМ Ac-1793, обладающих ацилирующей активностью (RU2399672), обусловленной наличием в них фермента ациламидазы.

Штамм Rhodococcus erythropolis ВКПМ Ac-1793 (RU2399672) рассмотрим в качестве ближайшего аналога заявляемого штамма, а способ биокаталитического синтеза N-замещенных акриламидов с использованием в качестве биокатализатора клеток штамма Rhodococcus erythropolis ВКПМ Ac-1793 (RU2399672) - в качестве ближайшего аналога заявляемого способа.

Недостатком штамма Rhodococcus erythropolis ВКПМ Ac-1793 является то, что его ацилирующая активность является индуцибельной, то есть требует наличия в среде культивирования дорогостоящего индуктора - ацетанилида. Это повышает стоимость и снижает конкурентоспособность способа - ближайшего аналога, основанного на использовании штамма Rhodococcus erythropolis ВКПМ Ac-1793 в качестве биокатализатора.

Задачей заявляемой группы изобретений является расширение арсенала способов биокаталитического синтеза N-замещенных акриламидов.

Задача решена путем:

- конструирования рекомбинантного штамма бактерий Rhodococcus rhodochrous ВКПМ Ac-1960, обладающего конститутивной ацилирующей активностью и полученного путем замещения в хромосоме штамма Rhodococcus rhodochrous ВКМ АС-1515Д (RU 2053300) гена, кодирующего структурную часть фермента нитрилгидратазы на ген, кодирующий структурную часть фермента ациламидазы из штамма Rhodococcus erythropolis ВКПМ Ac-1793 при сохранении промотора гена нитрилгидратазы в качестве промотора гена ациламидазы у заявляемого штамма;

- разработки способа синтеза N-замещенных акриламидов с использованием в качестве биокатализатора заявляемого штамма бактерий Rhodococcus rhodochrous ВКПМ Ac-1960.

Штамм Rhodococcus rhodochrous ВКПМ Ac-1960, в хромосому которого интегрирован ген ациламидазы из Rhodococcus erythropolis ВКПМ Ac-1793, приобретает конститутивную ацилирующую активность и способность синтезировать N-замещенные алифатические акриламиды. При смешивании водных растворов акриламида и аминов в присутствии клеток Rhodococcus rhodochrous ВКПМ Ac-1960 (используемого в качестве биокатализатора) происходит синтез N-замещенных акриламидов, в частности, N-изопропилакриламида (или N-диметиламинопропилакриламида).

Характеристика заявляемого штамма Rhodococcus rhodochrous ВКПМ Ac-1960

Морфологические свойства. Клетки штамма неподвижны и окрашиваются по Граму. Спор не образуют, некислотоустойчивы. В возрасте 18-20 ч клетки образуют длинные (до 20 мкм) слабо ветвящиеся нити, которые через 48-72 ч распадаются на палочковидные и кокковидные элементы. В старых культурах наблюдаются плеоморфные клетки в виде колб, груш, булав. Деление клеток происходит по раскалывающемуся и сгибающему типам.

Культуральные свойства. На плотных питательных средах (МПА, Хоттингер) через 48 ч роста штамм образует круглые гладкие колонии диаметром 1 мм, окрашенные от палево-розового до розово-оранжевого цвета. При росте на мясо-пептонном бульоне образуются пленка и осадок. Лакмусовое молоко не изменяется.

Физиологические свойства. Облигатный аэроб. Редуцирует нитраты. Тест с метиловым красным, реакция Фогес-Проскауэра отрицательные. Образует сероводород. Штамм оксидазоотрицательный, каталазо- и фосфатазаположительный. Крахмал и целлюлозу не гидролизует, твин 60 и 80 гидролизует. Аденин не утилизирует. Клетки не выдерживают нагревания в снятом молоке при 72°C в течение 15 мин. Штамм растет при pH 6-9, температуре 5-45°C. Кислоту образует из следующих сахаров и спиртов: глюкозы, фруктозы, мальтозы, сахарозы, сорбита, манита и глицерина. Газообразования ни на одном сахаре не обнаружено. В качестве единственного источника азота используют соединения аммония, нитраты и мочевину. В качестве единственного источника углерода использует мальтозу, манит, сорбит, глюкозу, глицерин, лактат, пируват, бензоат, n- и m-гидроксибензоат, тирозин; не использует рамнозу, галактозу, инозит, a-кетоглутарат. В клеточной стенке штамма Rhodococcus rhodochrous ВКПМ Ac-1960 содержатся мезо-диаминопимелиновая кислота, арабиноза и галактоза, что характерно для коринеподобных бактерий с IV типом клеточной стенки. Клетки также содержат липид A(LCN), характерный для родококков.

Отличительная особенность заявляемого штамма состоит в высоком уровне стабильности ацилирующей активности в неселективных условиях, т.е. в отсутствии в среде антибиотиков. Уровень утраты гена ациламидазы после роста в неселективных условиях для штамма Rhodococcus rhodochrous ВКПМ Ас-1960 составляет менее 0.1%.

Получение биокатализатора.

Для получения клеток заявляемого штамма Rhodococcus rhodochrous ВКПМ Ac-1960 в больших количествах и с высокой активностью ациламидазы штамм выращивают при 25-30°C в течение 48-72 часов на синтетических средах, содержащих в качестве источника углерода сахара или спирты в концентрациях 0.1-4%, а в качестве источника азота соединения аммония, нитраты или мочевину в концентрациях 0.4-2%. Полученные клетки отделяют от культуральной жидкости центрифугированием при 5-16 тыс.об/мин, ресуспендируют в 10 мМ фосфатном буфере pH 7,0-8,0 до концентрации 20-40 г по сухой массе/л и хранят в таком виде при 4°C.

Ацилирующую активность штаммов определяют по скорости синтеза N-изопропилакриламида по следующей методике.

Смешивают 300 мкл 10% водного раствора акриламида, 250 мкл 10% водного раствора изопропиламина (pH 10), 450 мкл культуры. Инкубируют при 37°C 2 часа, отделяют клетки центрифугированием в течение 1 минуты при 10 тыс.об/мин, определяют содержание N-изопропилакриламида с помощью газовой хроматографии.

Активность культуры выражают в мМ ИПАА, синтезированного за 1 час на л культуры.

Способ синтеза N-замещенных акриламидов в общем виде

Синтез N-замещенных акриламидов, в частности N-изопропилакриламида или N-диметиламинопропилакриламида, осуществляют смешиванием водных растворов акриламида и алифатических первичных аминов, в частности изопропиламина и диметиламинопропиламина в концентрациях от 1% до 10% с суспензией биокатализатора (от 1 до 10 г клеток по сухой массе на 1 л реакционной смеси) в термостатируемом сосуде (при температуре от 20 до 40°C, предпочтительнее от 25 до 30°C) и последующим перемешиванием (от 100 до 250 об/мин) в течение 1-48 час. Значение pH варьирует от 8,5 до 11, предпочтительнее от 9 до 11.

Содержание конечного продукта - N-замещенного акриламида определяют с помощью газовой хроматографии

Заявляемый способ позволяет получать растворы, содержащие от 1 до 30 г/л N-замещенных акриламидов.

Изобретение проиллюстрировано следующими фигурами.

Фигура 1. Структура плазмиды pRY1-H1-aam-H2. H1 - фрагмент промоторной области кластера генов нитрилгидратазы из Rhodococcus rhodochrous ВКМ АС-1515Д; aam - ген, кодирующий ациламидазу из Rhodococcus erythropolis ВКПМ Ac-1793; H2 - фрагмент ДНК с геном nhmG из Rhodococcus rhodochrous ВКМ АС-1515Д; bla - ген, кодирующий бета-лактамазу (маркер устойчивости к ампициллину); tsr - ген, кодирующий 23 S рРНК метилтрансферазу (маркер устойчивости к тиострептону); oriR E. coli - область, ответственная за репликацию плазмиды pUC19 в E. coli; oriT - область, ответственная за конъюгативный перенос плазмиды.

Пример 1. Конструирование интеграционной касеты для замещения генов нитрилгидратазы в хромосоме Rhodococcus rhodochrous BKM АС-1515Д на ген ациламидазы Rhodococcus erythropolis ВКПМ Ac-1793

Интеграционная кассета состоит из гена ациламидазы из Rhodococcus erythropolis ВКПМ Ac-1793, фланкированного фрагментами хромосомы из штамма Rhodococcus rhodochrous BKM АС-1515Д, обозначенными H1 и Н2. Фрагмент H1 содержит участок ДНК, гомологичный регуляторной области нитрилгидратазы в хромосоме Rhodococcus rhodochrous BKM АС-1515Д. Фрагмент Н2 содержит участок ДНК, гомологичный гену nhmG в хромосоме Rhodococcus rhodochrous BKM АС-1515Д. Рекомбинантная плазмида для замещения генов нитрилгидратазы в хромосоме состоит из интеграционной кассеты, клонированной на плазмиде pRY1 (Рябченко Л.Е., Полякова И.Н., Яненко А.С. Мобилизуемые плазмидные векторы, способные к конъюгативному переносу между клетками Е. coli и Rhodococcus, и их использование для конструирования штаммов Rhodococcus. Биотехнология, 2005, N5, с.6-13). Эта плазмида не способна автономно поддерживаться в штамме Rhodococcus rhodochrous BKM АС-1515Д. При наличии в составе плазмиды участка, гомологичного хромосоме хозяина, плазмида способна интегрировать в хромосому по гомологичным участкам.

Ген ациламидазы и фрагменты H1 и Н2 наработаны с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР), с использованием соответствующих праймеров и ДНК-матриц, перечисленных в таблице 1.

Таблица 1
Список праймеров и ДНК-матриц, использованных для наработки фрагментов интеграционной кассеты H1, aam и Н2.
Фрагмент Название праймера Последовательность праймера ДНК-матрица
H1 Прямой 5'-GGGGGATCCCCGGAGTCTTCATCCTGTTTTGGGATGCG-3' Хромосомная ДНК из R. rhodochrous BKM АС-1515Д
Обратный 5'-GATCCATGGCCTCATTCCTTTCATCGGAGC
aam Прямой 5'-GTCCCATGGCCGAACAGAATCTGC Хромосомная ДНК из R. erythropolis ВКПМ Ас-1793
Обратный 5'-GGGGAGCTCGATTCAGACGTCATCACAC
    CAATCTAGCC-3'  
Н2 Прямой 5'-GGGGAGCTCGACTCGATGATCGGTGTCAGTAATGCG-3' Хромосомная ДНК из R. rhodochrous BKM АС-1515Д
Обратный 5'-GGGGAATTCAGTACCCACCGAGCCGAATTAGGAACCACCG-3'

В последовательности праймеров внесены сайты рестриктаз BamHI, Ncol, Sad, EcoRI, необходимые для соединения фрагментов друг с другом и введения кассеты в плазмиду pRY1. Схема плазмиды, содержащей интеграционную кассету, представлена на фиг.1.

Пример 2. Конструирование заявляемого штамма Rhodococcus rhodochrous ВКПМ Ас1960

Для конструирования заявляемого штамма плазмиду с интеграционной кассетой вводят в штамм R. rhodochrous BKM AC-1515 Ac помощью конъюгации. Для передачи плазмиды в R. rhodochrous BKM АС-1515Д используют вспомогательный штамм Е. coli S17-1, способный обеспечивать конъюгативный перенос производных плазмиды pRY1 в реципиентные штаммы Rhodococcus. Для осуществления конъюгативного переноса плазмиду pRY1-H1-aam-H2 вводят в штамм Е. coli S17-1 путем химической трансформации ДНК. Конъюгационные скрещивания между Е. coli S17-1 и R. rhodochrous BKM АС-1515Д проводят путем смешивания экспоненциально растущих культур обоих штаммов, инкубации их на твердой среде в отсутствие селектирующих агентов в течение ночи, а затем инкубации в течение 4 суток в присутствии антибиотиков тиострептона (селекция против клеток R. rhodochrous BKM АС-1515Д, не получивших плазмиду) и налидиксовой кислоты (селекция против клеток Е. coli S17-1). Устойчивые к тиострептону клоны R. rhodochrous BKM АС-1515Д содержат плазмиду pRY1-H1-aam-H2, интегрированную в хромосому. Исключение плазмиды из хромосомы в некоторых случаях приводит к замещению гена нитрилгидратазы на ген ациламидазы. При этом клетка приобретает чувствительность к тиострептону, но сохраняет ацилирующую активность. Так, получен штамм, содержащий в хромосоме ген ациламидазы, который депонирован во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов ФГУП «ГосНИИгенетика» как Rhodococcus rhodochrous ВКПМ Ac-1960.

Пример 3. Получение биокатализатора на основе заявляемого штамма Rhodococcus rhodochrous ВКПМ Ас1960

В колбу Эрленмейера (объемом 750 мл), содержащую 50 мл синтетической питательной среды MS следующего состава, мас.%: глюкоза - 2,5; мочевина - 0,06; MgSO4 - 0.05; CoCl2 - 0.004; FeSO4 - 0,0005; вода - остальное, добавляют 0,5 мл культуры (109 кл/мл) заявляемого штамма, предварительно выращенного на той же среде. Затем колбу инкубируют с перемешиванием (200 об/мин) при 30°C в течение 72 час. Полученная таким образом культура обладает ацилирующей активностью 25 мМ ИПАА/л*ч. Полученную биомассу штамма Rhodococcus rhodochrous ВКПМ Ас1960 отделяют центрифугированием при 5 тыс. об/мин и хранят при +4°C.

Пример 4. Синтез N-изопропилакриламида с использованием биокатализатора на основе заявляемого штамма Rhodococcus rhodochrous ВКПМ Ас1960

Водные растворы акриламида и изопропиламина (рН 10) смешивают, затем к реакционной смеси добавляют суспензию клеток штамма Rhodococcus rhodochrous Ac1960, полученную как в примере 3. Концентрации акриламида и изопропиламина в смеси составляют 6% и 3%, соответственно. Концентрация биокатализатора в смеси составляет 8 г по сухой массе/л. Реакционную смесь инкубируют при 37°C в течение 7 часов. Затем клетки отделяют центрифугированием (5 тыс. об/мин). Концентрацию N-изопропилакриламида в реакционной смеси определяют с помощью газовой хроматографии. Концентрация N-изопропилакриламида в полученном образце составляет 32 г/л.

Пример 5. Синтез N-диметиламинопропилакриламида с использованием биокатализатора на основе заявляемого штамма Rhodococcus rhodochrous ВКПМ Ас1960

Водные растворы акриламида и диметиламинопропиламина (рН 10) смешивают, затем к реакционной смеси в качестве биокатализатора добавляют суспензию клеток штамма Rhodococcus rhodochrous Ac1960, полученную как в примере 3. Концентрации акриламида и диметиламинопропиламина в смеси составляют 6% и 2.5%, соответственно. Концентрация клеток в смеси составляет 8 г сухого веса/л. Реакционную смесь инкубируют при 37°C в течение 24 часов. Затем клетки отделяют центрифугированием (5 тыс. об/мин) и количество конечного продукта определяют методом газовой хроматографии. Концентрация полученного раствора N-диметиламинопропилакриламида составляет 8 г/л.

Таким образом,

- сконструирован штамм Rhodococcus rhodochrous ВКПМ Ac1960, обладающий конститутивной ацилирующей активностью и, в отличие от штамма ближайшего аналога, не нуждающийся в индукторе ацилирующей активности и способный расти на минеральной синтетической среде;

- заявляемый способ синтеза N-замещенных акриламидов с использованием в качестве биокатализатора заявляемого штамма позволяет получать концентрированные (8-30 г/л) растворы N-замещенных акриламидов, что превосходит способ - ближайший аналог в 1,5 раза.

1. Рекомбинантный штамм бактерий Rhodococcus rhodochrous ВКПМ Ас1960, обладающий конститутивной ацилирующей активностью и полученный путем замещения в хромосоме штамма Rhodococcus rhodochrous ВКМ Ас-1515Д гена, кодирующего нитрилгидратазу на ген, кодирующий ациламидазу из штамма Rhodococcus erythropolis 37 ВКПМ Ас-1793.

2. Способ синтеза N-замещенных акриламидов из акриламида и аминов с использованием в качестве биокатализатора штамма бактерий по п.1.



 

Похожие патенты:

Группа изобретений относится к сельскому хозяйству и может быть использована при микробиологической защите растений. Средство для микробиологической защиты растений включает смесь культуральных жидкостей Trichoderma viride, Azotobacter chroococcum, Bacillus megaterium, Beauveria bassiana, Metarhizium anisopliae с необходимым количеством воды.
Группа изобретений относится к биохимии, в частности к получению аллергена туберкулопротеина - полуфабриката аллергена туберкулезного очищенного в стандартном разведении.
Изобретение относится к биотехнологии. Штамм Bacillus subtilis - И5-12/23 обладает антагонистической активностью в отношении фитопатогенных грибов и бактерий.

Способ повышения плодородия почвы включает предпосевную обработку семян люцерны жидким биопрепаратом, возделывание и скашивание зеленой массы люцерны. Для обработки семян используют жидкий бактериальный биопрепарат на основе штамма Sinorhizobium meliloti Якутский №2 ГНУ ВНИИСХМ RCAM00826.

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано для получения полисахаридов, а именно бактериальной целлюлозы. Способ предусматривает культивирование штамма бактерий Gluconacetobacter sucrofermentans H-110 (ВКПМ В-11267) в жидкой фазе послеспиртовой зерновой барды, полученной после механического отделения твердой фазы, в течение 3-5 суток при температуре 28±2°C и рН 3,9-4,4, а также отделение полученной бактериальной целлюлозы от культуральной среды и высушивание при 800С до постоянной массы.
Изобретение относится к области медицинской микробиологии и биотехнологии, в частности к микробиологической лабораторной диагностике инфекционных болезней. Питательная среда содержит триптон, дрожжевой экстракт, глюкозу, хлорид натрия, эритроциты человека 0(I) группы Rh(+), сульфат железа(II), агар «Дифко» и дистиллированную воду при заданных соотношениях компонентов.
Группа изобретений относится к биотехнологии. Предложена пробиотическая композиция, содержащая пробиотический компонент, в качестве которого используют Bifidobacterium longum R175 и один или два вида бактерий, выбранных из группы бактерий, состоящей из Lactobacillus rhamnosus R11, Lactobacillus helveticus R52 и Lactobacillus plantarum R1012, и композицию-носитель.

Изобретение относится к области микробиологического получения полисахаридов, а именно бактериальной целлюлозы, и может быть использовано в медицине, промышленности.
Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано в микробиологии. Питательная среда содержит дигидрофосфат калия, гидрофосфат калия, сульфат магния гептагидрат, хлорид натрия, сульфат кальция дигидрат, молибдат натрия, сульфат железа(II), сахарозу, бентонит и воду.
Изобретение относится к области медицинской микробиологии и касается способа длительного хранения прихотливых бактерий в консервированной крови. Способ включает замораживание в холодильнике при -20˚С культур прихотливых бактерий в консервированной донорской человеческой цельной крови, содержащей гемоконсервант ЦФДА-1.
Изобретение относится к области биотехнологии защиты окружающей среды, в частности к способам очистки почв от нефтяных загрязнений в сокращенные сроки в условиях низких положительных температур. Способ включает внесение в почву суспензии микробного препарата на основе суспензии психротолерантного штамма бактерий Pseudomonas sp. ИБ 1.1. с титром не менее 2,0·108 КОЕ/мл. Изобретение позволяет за 1 месяц провести биодеградацию нефти со степенью деструкции углеводородов свыше 90%. 1 табл.
Изобретение относится к биотехнологии, а именно к средствам защиты человека и сельскохозяйственных животных от кровососущих комаров. Штамм Bacillus thuringiensis var. israelensis № 7-1/23А обладает ларвицидными свойствами. Штамм Bacillus thuringiensis var. israelensis депонирован в коллекции ГНУ ВНИИСХМ Россельхозакадемии под регистрационным номером RCAM00626 в группе споровых микроорганизмов. Может быть использован при создании ларвицидного биопрепарата против кровососущих комаров. Изобретение позволяет повысить гибель кровососущих комаров. 5 табл., 1 пр.
Изобретение относится к сельскохозяйственной микробиологии. Штамм бактерий Paenibacillus sp. ИБ-1 обладает антагонистической активностью в отношении фитопатогенных грибов. Штамм депонирован во Всероссийской коллекции микроорганизмов под регистрационным номером ВКМ В-2823D и может быть использован для получения биопрепарата для защиты растений от болезней, вызываемых фитопатогенными грибами. Изобретение позволяет сократить сороки культивирования и повысить выход биомассы микроорганизма. 4 табл., 4 пр.

Группа изобретений относится к биотехнологии. Предложен штамм бактерий Bacillus subtilis ВКПМ В-11353, обладающий способностью к расщеплению широкого спектра моно- и дисахаров и широким спектром антагонистического действия в отношении патогенных и условно-патогенных бактерий и грибов, вызывающих заболевания у растений и сельскохозяйственных животных. Также предложены варианты применения штамма Bacillus subtilis ВКПМ В-11353 в качестве бактериального консерванта для силоса для создания средств, нормализующих микрофлору кишечника сельскохозяйственных животных, а также для создания средств защиты растений от болезней. Группа изобретений позволяет повысить качество силоса, повысить сохранность поголовья сельскохозяйственных животных и повысить эффективность против патогенных и условно патогенных микроорганизмов, вызывающих заболевания пшеницы. 4 н.п. ф-лы, 8 табл., 4 пр.

Группа изобретений относится к биотехнологии. Предложен штамм Lactobacillus delbrueckii подвид lactis CNCM I-3741, снижающий содержание холестерина в крови. Штамм используют для получения ферментированных молочных продуктов. Изобретения обеспечивают эффективное снижение содержания холестерина в крови. 3 н.п. ф-лы, 3 ил., 2 пр.

Изобретение относится к области биотехнологии и касается способа получения коклюшного компонента комплексных вакцин. Представленный способ включает выращивание культуры B. pertussis на плотных питательных средах Борде-Жангу и/или КУА, селекцию выросших колоний по морфологическим признакам, пересев отобранных колоний, наращивание их бактериальной массы, смыв культуры, доведение мутности полученных коклюшных суспензий до 10 международных оптических единиц, определение в них с помощью реакции агглютинации количественного содержания агглютиногенов 1, 2, 3 и отбор коклюшных суспензий, в которых содержание агглютиногенов выявляется при разведении типоспецифической сыворотки 1:3200 и выше. Выявленная культура B. pertussis, активно экспрессирующая агглютиногены 1, 2, 3, после лиофильного высушивания используется для производства коклюшного компонента комплексных вакцин. Охарактеризованное изобретение позволяет получить высокоиммуногенный коклюшный компонент комплексных вакцин. 1 ил., 5 табл., 1 пр.
Изобретение относится к способу приготовления закваски. Способ предусматривает приготовление субстрата из смеси ячменной муки и сухого молока, смешанной с водой при соотношении 1:3-1:4 с температурой 75-80°С, охлаждение субстрата, внесение смеси ферментных препаратов амилазы и ксиланазы, выдерживание при температуре 48-50°С в течение 90-120 мин, охлаждение ячменно-молочного гидролизата до 32-35°С, введение комбинированного препарата «Линекс» из расчета 1 капсула на 100 г ячменно-молочного гидролизата и 0,1% прессованных хлебопекарных дрожжей к общей массе ячменно-молочного субстрата, инкубацию ячменно-молочной закваски в течение 18-20 ч при температуре 32-35°С до титруемой кислотности 10-12 град. Способ позволяет оптимизировать аминокислотный и витаминный состав и интенсифицировать процесс приготовления ячменно-молочной закваски. 1 табл., 3 пр.

Изобретение относится к биотехнологии, пищевой и медицинской промышленности и может быть использовано при производстве бактериальных концентратов, биологически активных добавок к пище, ферментированных пищевых продуктов. Способ получения бактериального концентрата бифидобактерий в жидкой форме предусматривает приготовление питательной среды с добавлением ростовых компонентов на основе осветленной творожной сыворотки или на водной основе с добавлением до 1,5% глюкозы, или на соевой сыворотке с добавлением лактозы в количестве 1%. В приготовленную питательную среду вносят активизированный β-галактозидазой штамм бифидобактерий В. bifidum 83 в количестве 3-5% и наращивают биомассу, охлаждают, разливают. Изобретение позволяет повысить технологичность и интенсивность процесса, повысить биохимическую активность бифидобактерий и потребительские свойства получаемого продукта. 7 табл., 5 ил., 4 пр.

Питательная среда для культивирования штамма возбудителя рожи свиней Erysipelothrix rhuisipathie, относится к общей биотехнологии и ветеринарной микробиологии и может быть использована для приготовления микробиологических питательных сред для наращивания биомассы штамма возбудителя рожи свиней. В питательной среде в качестве источника азотного питания используют смесь рыбного автолизата и щелочного мидийного гидролизата при следующем соотношении компонентов: щелочной мидийный гидролизат 20-50% пептон ферментативний 1% калий фосфорнокислый 0,3% натрий фосфорнокислый 1,8% рыбный автолизат остальное.
Изобретение относится к пищевой промышленности, в частности к способам приготовления заквасок для напитков брожения. Способ включает приготовление осахаренной заварки путем смешивания муки пшеничной первого сорта и пшеничных отрубей в соотношении 1:1, заваривание полученной смеси водой с температурой 85-90°С, выдерживание в течение 45-60 мин, охлаждение смеси до температуры 65-67°С, осахаривание неферментированным ячменным или ржаным солодом в количестве 10% к массе смеси в течение 60-90 мин, внесение дрожжевого автолизата в количестве 0,1% к массе смеси для получения питательного субстрата. Затем осуществляют развешивание субстрата в три бродильных сосуда с четырехкратным увеличением навески 50 г:200 г:800 г соответственно, трехкратное автоклавирование с интервалом 24 часа при 1,5 атм. в течение 60 мин, размножение в приготовленном субстрате молочнокислых бактерий в трехфазном разводочном цикле до конечной кислотности 16-18 см3 раствора гидроокиси натрия концентрацией 1 моль/дм3 на 100 см3 заварки, при этом в качестве источника молочнокислых бактерий используют препараты-пробиотики «Лактобактерин», или «Бифидумбактерин», или «Эвиталия» или комплекс, состоящий их трех указанных препаратов, которые растворяют в 5 см3 стерильного физиологического раствора и каждый переносят в охлажденную стерильную осахаренную заварку из расчета 1 доза препарата, что составит 2×109, 107 и 1,5-2,0×109 КОЕ соответственно на 50 г субстрата. Инокулированную питательную среду инкубируют (первая фаза) в течение 24 часов при температуре 37°С, после чего выполняют вторую и третью фазы разводочного цикла путем разбавления зрелой закваски предыдущей фазы в четырехкратном количестве стерильной осахаренной заварки для последующей фазы. Инкубирование последующих фаз разводочного цикла проводят в течение 24 часов при 37°С до кислотности 16-18 см3 раствора гидроокиси натрия концентрацией 1 моль/дм3 на 100 см3 заварки. Затем выполняют смешивание фаз с равным к массе закваски количеством картофельного крахмала и прессованными хлебопекарными дрожжами Saccharomyces cerevisiae в дозе 5 г/100 дм3 квасного сусла, высушивание полученной массы в потоке стерильного воздуха при комнатной температуре до влажности 13-14%. Общее время заквашивания осахаренной заварки составляет 72 часа. 2 пр.
© Патентный поиск, поиск патентов на изобретения - FindPatent.RU 2012-2024
Политика конфиденциальности 2015-01-10 2015-01-10T14:59:25
Наверх