Рекомбинантный штамм дрожжей schizosaccharomyces pombe - продуцент молочной кислоты



Рекомбинантный штамм дрожжей schizosaccharomyces pombe - продуцент молочной кислоты
Рекомбинантный штамм дрожжей schizosaccharomyces pombe - продуцент молочной кислоты

 


Владельцы патента RU 2539092:

Федеральное государственное унитарное предприятие "Государственный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов" (ФГУП "ГосНИИгенетика") (RU)

Изобретение относится к биотехнологии. Предложен рекомбинантный штамм дрожжей Schizosaccharomyces pombe ВКПМ Y-4041, являющийся продуцентом молочной кислоты. Штамм получен путем трансформации штамма Schizosaccharomyces pombe ВКПМ Y-3106 интегративной плазмидой pcDNA-Km-leu1-pla, сконструированной на основе вектора pUC19 и содержащей ген лактатдегидрогеназы ldh1 молочнокислых бактерий Lactobacillus plantarum. Предложенный штамм при культивировании на среде YPD способен продуцировать молочную кислоту в количестве 50 г/л культуральной жидкости. 2 ил., 3 пр.

 

Изобретение относится к микробиологии и биотехнологии и касается штамма дрожжей Schizosaccharomyces pombe - продуцента молочной кислоты.

Молочная кислота (МК) широко используется в пищевой промышленности для консервирования и ароматизации и в производстве биодеградируемой пластмассы - полилактата. Другая сфера использования молочной кислоты - получение биодеградируемого растворителя этиллактата, который применяется при производстве электротехники, лаков и красок, текстиля, смазок, клеев и т.д. Предполагается, что нетоксичные эфиры молочной кислоты потенциально могут заменить более 80% растворителей, используемых в мире в настоящее время. В связи с этим актуальной становится задача разработки эффективных способов производства молочной кислоты.

Традиционно для получения МК используют микробиологические способы получения, основанные на культивировании бактериальных штаммов молочнокислых бактерий. Недостатком бактериальных штаммов-продуцентов молочной кислоты является их чувствительность к низким значениям pH и высоким концентрациям молочной кислоты, что приводит к замедлению роста культуры, снижению скорости синтеза молочной кислоты и, как следствие, преждевременному завершению процесса ферментации.

В связи с этим особый интерес для создания продуцентов молочной кислоты представляет конструирование штаммов микроорганизмов, в меньшей степени чувствительных к низким значениям pH и высоким концентрациям молочной кислоты.

Перспективным объектом для производства молочной кислоты являются, в частности, дрожжи, многие из которых способны расти и осуществлять брожение в условиях повышенной кислотности [1] и, в отличие от бактерий, не требуют для своего роста сложных по составу сред.

В норме дрожжи не продуцируют значимых количеств молочной кислоты, однако экспрессия гена лактатдегидрогеназы (ldh) в дрожжевых клетках позволяет получить штаммы, продуцирующие молочную кислоту в количествах, сравнимых с производственным уровнем [2]. При этом в качестве реципиента используют такие дрожжи, как Saccharomyces cerevisiae, Kluyveromyces sp., Pichia sp., Schizosaccharomyces sp. и Hansenula sp., а в качестве источника гена лактатдегидрогеназы - молочнокислые бактерии (Lactobacillus), грибы (Rhizopus oryzae) и ткани млекопитающих (ген ldh из клеток мышечной ткани быка, человека)

Так, дрожжи Pichia stipitis, несущие ген лактатдегидрогеназы из Lactobacillus helveticus, способны продуцировать молочную кислоту в количестве 41 г/л [3].

Продукция штамма Saccharomyces cerevisiae JnvScI, содержащего ген лактатдегидрогеназы из гриба Rhizopus oryzae (J. Ind. Microbiol. Biotechnol., 2003; 30; 22-27), составляет 35-40 г/л молочной кислоты, а его отличительной способностью является неизменная скорость образования молочной кислоты в интервале pH 3,5-6,0.

Известен [4] штамм Saccharomyces cerevisiae, несущий ген лактатдегидрогеназы из бактерий Lactobacillus plantarum, который продуцирует 58 г/л молочной кислоты при pH 3,6.

Основным недостатком дрожжей Saccharomyces cerevisiae является то, что процесс синтеза молочной кислоты ингибируется ее высокими концентрациями, что отрицательно влияет на эффективность процесса получения молочной кислоты.

В соответствии с [5] высокой устойчивостью к низким значениям pH среды и высоким концентрациям молочной кислоты обладают дрожжи Schizosaccharomyces pombe. Данные дрожжи хорошо генетически изучены, не требуют для своего роста сложных органических сред, удобны для промышленной ферментации и являются перспективным объектом для создания продуцентов молочной кислоты.

Так, дрожжи Schizosaccharomyces pombe, содержащие ген лактатдегидрогеназы из грибов Rhizopus oryzae [5], продуцируют 58 г/л молочной кислоты. Однако данный штамм не подходит для промышленного применения, т.к. культивирование осуществляется в две стадии и требует тщательной отмывки клеток, что неосуществимо в промышленных масштабах. Кроме того, время культивирования для достижения указанного количества молочной кислоты очень велико и составляет 8 суток.

В работе [6] показано, что Schizosaccharomyces pombe ATCC №2476, несущий ген лактатдегидрогеназы млекопитающих (Homo sapiens), продуцирует молочную кислоту в количестве 88 г/л. Однако для успешного культивирования ферментационная среда должна содержать экзотическую добавку - протеолипиды (белково-липидные соединения, экстрагируемые органическими растворителями из ткани мозга).

Задачей заявляемого изобретения является расширение арсенала рекомбинантных микроорганизмов, продуцирующих молочную кислоту.

Задача решена путем конструирования рекомбинантного штамма дрожжей Schizosaccharomyces pombe ВКПМ Y-4041 - продуцента молочной кислоты.

Штамм Schizosaccharomyces pombe ВКПМ Y-4041 получен путем трансформации штамма-реципиента Schizosaccharomyces pombe ВКПМ Y-3106 плазмидной ДНК pcDNA-Km-leu1-pla, полученной путем клонирования в полилинкер коммерческого вектора pUC19 гена лактатдегидрогеназы ldh1 молочнокислых бактерий Lactobacillus plantarum (pla), гена лейцина (leu1) - генетического локуса для эффективной интеграции гена лактатдегидрогеназы ldh1 в хромосому S. pombe и гена устойчивости к антибиотику канамицину (Km) - селективного маркера.

Полученный штамм депонирован во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов ФГУП «ГосНИИгенетика» (ВКПМ) по адресу: 117545 Москва, 1-ый Дорожный проезд, д.1 и имеет регистрационный номер ВКПМ Y-4041.

Штамм Schizosaccharomyces pombe ВКПМ Y-4041 характеризуется следующими признаками.

Культурально-морфологические признаки

Для описания культурально-морфологических признаков использовали среды “Malt extract”, “Malt agar” и картофельно-кукурузный агар [7].

После трех дней культивирования на среде “Malt extract” культура образует клетки округлые, эллипсоидальные и цилиндрические (3,0-5,0)×(5,0-15,0-24,0) мкм. Осадок формируется.

На среде “Malt agar” на 5 сутки образует некрупные колонии белого или слегка кремоватого оттенка. Поверхность колоний гладкая, край ровный. Вегетативное размножение - деление клетки пополам.

Аски со спорами формируются на картофельно-кукурузном агаре. Конъюгация вегетативных клеток предшествует образованию асков, содержащих от 2-х до 4-х эллипсоидальных аскоспор. Свободные аскоспоры могут объединяться в небольшие группы.

Физиолого-биохимические признаки

Культура способна сбраживать глюкозу, сахарозу, мальтозу и раффинозу. Не способна к брожению галактозы, лактозы и мелибиозы. Ассимилирует в качестве единственного источника углерода сахарозу, мальтозу, раффинозу. Не ассимилирует галактозу, целлобиозу, трегалозу, лактозу, ксилозу, арабинозу, рибозу, рамнозу, эритрит, рибитол, маннит, крахмал, янтарную, лимонную кислоты, инозит культура не ассимилирует нитраты, не способна расти на среде без витаминов.

Оптимальные условия для размножения штамма.

Температура 30°C, pH 6, полная дрожжевая среда [8].

Штамм хранится в лиофилизированном виде или в парах жидкого азота.

Полученный штамм Schizosaccharomyces pombe ВКПМ Y-4041 сохраняет способность к образованию молочной кислоты после 18 последовательных пересевов на полноценной среде.

Заявляемый штамм при выращивании в колбах способен продуцировать молочную кислоту в количестве 50 г/л культуральной жидкости.

Изобретение проиллюстрировано следующими фигурами графического изображения:

Фиг.1 Зависимость накопления молочной кислоты от времени культивирования

Фиг.2 Хроматограмма супернатанта культуральной жидкости штамма Schizosaccharomyces pombe ВКПМ Y-4041

Пример 1. Получение штамма Schizosaccharomyces pombe ВКПМ Y-4041

Трансформацию Schizosaccharomyces pombe осуществляют методом электропорации (http://www-bcf.usc.edu/~forsburg/tfmn.html).

Штамм Schizosaccharomyces pombe Y-3106, используемый для трансформации, предварительно выращивают в среде YPD (мас.%: дрожжевой экстракт - 1, пептон - 2, вода - остальное) до концентрации 1×108 клеток на 1 мл. Клетки центрифугируют, промывают в ледяной стерильной воде, а затем в ледяном растворе 1М сорбитола. Клетки инкубируют в 25 мМ растворе дитиотрейтола в течение 15 минут, затем промывают в ледяном растворе 1М сорбитола. Клетки ресуспендируют в ледяном растворе 1М сорбитола в концентрации 1-5×109 клеток на 1 мл. Аликвоту объемом 40 мкл клеточной суспензии, переносят в охлажденный эппендорф, добавляют 100 нг ДНК плазмиды pcDNA-Km-leu1-pla, линеаризованной рестриктазой BglII, и инкубируют во льду 5 минут. Смесь клеток и ДНК переносят в предварительно охлажденную кювету для электропорации. Электропорацию проводят при следующих условиях: 1,5 кВ, 400 Ом, 25uF. После порации добавляют 1 мл ледяного раствора 1М сорбитола.

Селекцию трансформантов ведут на агаризованной минимальной среде YNB (Himedia) с добавлением глюкозы (2 мас.%) в течение 5 суток при температуре 30°C. В качестве селективного агента добавляют генетицин в количестве 20 мг/мл.

Продукцию молочной кислоты трансформантами первоначально оценивают в чашечном тесте с добавлением мела по зонам гидролиза. В тесте используют агаризованную среду LA (мас.%: дрожжевой экстракт - 0,5, пептон - 1, агар - 2, вода - остальное) с добавлением глюкозы (2 мас.%) и мела (0,5 мас.%). В качестве контроля используют штамм Schizosaccharomyces pombe Y-3106.

Трансформанты, показавшие наибольшее соотношение диаметра зоны гидролиза к диаметру колонии на чашках с мелом, культивируют в жидкой среде в пробирке. Ферментацию проводят при 30°C на качалке с 150 об/мин в питательной среде YPD с добавлением глюкозы (2 мас.%) в пробирках (50 мл) с рабочим объемом 20 мл. Посев осуществляют бактериологической петлей. Ферментацию продолжают в течение 48 часов.

Концентрацию молочной кислоты в культуральной жидкости определяют методом ВЭЖХ [9].

По результатам ферментации отобран трансформант №24, который при культивировании в пробирках позволяет получить молочную кислоту в количестве 19 г/л культуральной жидкости.

Полученный штамм Schizosaccharomyces pombe (pcDNA-Km-leul-pla) депонирован во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов (ВКПМ) под регистрационным номером ВКПМ Y-4041.

Пример 2. Культивирование штамма Schizosaccharomyces pombe ВКПМ Y-4041

Посевную культуру выращивают при 30°C в течение 1 суток на чашках Петри на агаризованной среде YPD (мас.%: дрожжевой экстракт - 1, пептон - 2, агар - 2, вода - остальное) с добавлением глюкозы (2 мас.%).

Для получения инокулята пробирки (50 мл) с 10 мл жидкой питательной среды YPD засевают посевной культурой. Пробирки инкубируют на качалке (240 об/мин) при 30°C в течение 24 ч.

Колбу, объемом 750 мл, содержащую 95 мл среды YPD с добавлением глюкозы (15 мас.%) засевают 5 мл инокулята.

Культивирование осуществляют на качалке со скоростью 100 об/мин при температуре 30°C в течение 48 часов. Пробы отбирают каждые 12 часов стерильно по 1 мл для определения концентрации биомассы и молочной кислоты в культуральной жидкости, а также контроля стерильности. Штамм ВКПМ Y-4041 секретирует молочную кислоту в количестве 50 г/л культуральной жидкости (фиг.1).

Пример 3. Определение молочной кислоты в культуральной жидкости методом ВЭЖХ

После окончания ферментации биомассу осаждают цетрифугированием, при этом доля супернатанта в культуральной жидкости составляет 60-75%.

Супернатант разводят водой Super - Q в 10 раз, центрифугируют при 18000 об/мин в течение 2 мин и анализируют методом ВЭЖХ на хроматографе системы “alliance” (Separations Module Waters 2695, Photodiode Array detector Waters 2996).

Для проведения ВЭЖХ 5 мкл модельной смеси вводят в хроматограф, снабженный фотометрическим детектором с длинной волны 210 нм. Разделение ведут на колонке, ReproSil-Pur C18-AQ, 5 µm, длиной 250 мм и внутренним диаметром 4,6 мм. В качестве элюента используют систему с содержанием 0,5% метанола, 0,5% ацетонитрила, H3PO4 (85%) 1 мл/л. Температура хроматографической колонки - 30°C. Объемная скорость элюента 1,0 мл/мин. Разделение молочной кислоты от остальных органических кислот при выбранном режиме хроматографического анализа проходит полностью. Наложения пиков и пиков «всадников» не отмечается. Время выхода стандарта молочной кислоты составляет 7 минут.

Результаты хроматографического анализа содержания молочной кислоты в супернатанте представлены на фиг.2. Наличие в культуральной жидкости молочной кислоты подтверждается присутствием доминантного пика, время выхода которого составляет 7 минут, что соответствует времени выхода стандарта молочной кислоты.

Использованные источники информации

[1] Бабьева И.П., Чернов И.Ю. Биология дрожжей, Товарищество научных изданий КМК, М. 2004.

[2] Sauer M., Porro D., Mattanovich D., Branduardi P. 16 years research on lactic acid production with yeast - ready for the market? // Biotechnol Genet Eng Rev. - 2010. - V.27. - №1. - Р.229-256.

[3] Ilmen M., Koivuranta К., Ruohonen L., Suominen P., Penttila M. Efficient production of L-lactic acid from xylose by Pichia stipitis // Appl Environ Microbiol. - 2007. - V.73. - P.117-123.

[4] Colombie S., Dequin S., Sablayrolles J.M. Control of lactate production by Saccharomyces cerevisiae expressing a bacterial LDH gene // Enzyme Microbial Technology. - 2003. - V.33. - №1. - P.38-46.

[5] Синеокий С.П., Вустин М.М., Юзбашев Т.В. и др. Способ микробиологического синтеза молочной кислоты и рекомбинантный штамм дрожжей Schizosaccharomyces pombe для его осуществления // Патент RU 2268304, C12P 7/56, 2004.

[6] Futoshi H., Hideki Т., Yuko H., Chihiro H. Transformant And Process For Production Thereof, And Process For Production Of Lactic Acid // Patent US 20120214214, C12N 1/19, 2012.

[7] The yeasts of toponomic study. Ed. N.J.W. Kreger-van Rij, Amsterdam, Elsevier Sci. Publ. B.V., 1984, p.421.

[8] Захаров А. и др. Сборник методик по генетике дрожжей сахаромицетов. - Л., Наука, 1984, стр.144.

[9] П.Н. Нестеренко, П.А. Кебе Определение молочной кислоты методом ионоэксклюзионной хроматографии на сульфированном сверхсшитом полистироле // ВЕСТНИК МОСК. УН-ТА, сер. 2. химия. - 2002. - т.43 - №1 - стр.34-36.

Рекомбинантный штамм дрожжей Schizosaccharomyces pombe ВКПМ Y-4041 - продуцент молочной кислоты, полученный трансформацией штамма Schizosaccharomyces pombe ВКПМ Y-3106 интегративной плазмидой pcDNA-Km-leu1-pla, сконструированной на основе вектора pUC19 и содержащей ген лактатдегидрогеназы ldh1 молочнокислых бактерий Lactobacillus plantarum.



 

Похожие патенты:

Изобретение относится к биотехнологии пищевых продуктов и может быть использовано при переработке растворов брожения с получением молочной кислоты. Способ извлечения молочной кислоты из растворов брожения включает экстракцию молочной кислоты солью четвертичного аммониевого основания в разбавителе и реэкстракцию кислоты, причем экстракцию ведут солью четвертичного аммониевого основания в сульфатной форме [(R4N)2SO4], где R представляет собой алкильный или арильный радикал, в присутствии п-третичных алкилфенолов при молярном соотношении (R4N)2SO4 : п-третичные алкилфенолы, равном соответственно 1:2, при значении рН раствора 5,0-7,0, реэкстракцию кислоты проводят растворами гидроксида натрия, а регенерацию экстрагента осуществляют его обработкой стехиометрическим количеством серной кислоты.
Изобретение относится к биотехнологии и представляет собой способ получения высококонцентрированных очищенных лактатсодержащих растворов, в частности высококонцентрированных очищенных растворов молочной кислоты и ее солей, на основе культуральной жидкости, полученной в результате культивирования клеток микроорганизмов.
Изобретение относится к биотехнологии, а именно к способам получения молочной кислоты на основе микробиологического синтеза. .
Изобретение относится к биотехнологии, в частности для получения L(+)-лактата посредством микробиологического синтеза. .

Изобретение относится к биотехнологической промышленности, в частности к способам получения молочной кислоты. .
Изобретение относится к биотехнологии, конкретно к иммобилизованным биокатализаторам на основе клеток микроорганизмов, включенных в матрицу гелевого носителя, с помощью которых осуществляют микробиологическое получение молочной кислоты.

Изобретение относится к процессам и оборудованию для автоматизированной обработки городских твердых отходов (MSW) (со свалки или полученных прямо из городских служб), осадка сточных вод и шинных отходов с целью удаления и утилизации любых годных к употреблению материалов и для промышленного производства молочной кислоты.

Изобретение относится к технологии получения молочной кислоты на основе микробиологического синтеза. .

Изобретение относится к области биотехнологии. Представлены вариантные белки лизофосфолипид-ацилтрансферазы, катализирующие реакцию превращения 18:3(n-6)-PL в 18:3(n-6)-CoA и/или DGLA-CoA в DGLA-PL, имеющие аминокислотные последовательности, по меньшей мере на 95% идентичные SEQ ID NO:2 и 7, представленным в описании.

Изобретение относится к области молекулярной биологии, биохимии и генной инженерии. Предложены нуклеиновая кислота, характеризующаяся нуклеотидной последовательностью, кодирующей белок, который состоит из аминокислотной последовательности с делецией, заменой или добавлением одной или более аминокислот в аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 2 или SEQ ID NO: 7 и обладает активностью фосфатазы фосфатидной кислоты, соответствующий белок, рекомбинантный вектор, клетка для экспрессии белка и способ получения композиции жирной кислоты.
Изобретение относится к области биотехнологии. Способ получения механозависимого фактора роста человека предусматривает в процессе культивирования воздействие ультразвука с частотой 880 кГц и плотностью мощности в интервале 0,1-1,0 Вт/см3 на клетки Saccharomyces cerevisiae YBS618/pKX-MGF при передавливании в ферментер.

Изобретение относится к области биотехнологии и касается применения штамма дрожжей Komagataella pastoris ВКПМ Y-727. Охарактеризовано применение штамма дрожжей Komagataella pastoris ВКПМ Y-727 в качестве реципиента для конструирования продуцентов целевого белка, необязательно включающее введение в него мутаций, обеспечивающих использование ауксотрофных селективных маркеров.

Изобретение относится к области биотехнологии и может быть использовано для получения рекомбинантного интерферона альфа-2 человека. Гибридные белки GFN80 и GFN100 конструируют на основе рекомбинантныго интерферона альфа-2 человека, слитого с N-конца с аминокислотной последовательностью полипептида S(G4S)16 или S(G4S)20 соответственно.

Настоящее изобретение относится к области биотехнологии и может быть использовано в пищевой промышленности. Из Mortierella alpina получен новый ген, который кодирует фосфатазу фосфатидной кислоты (ЕС 3.1.3.4), определена открытая рамка считывания и выведена аминокислотная последовательность фермента, названного MaPAP1.

Настоящее изобретение относится к области молекулярной биологии и генетической инженерии и может быть использовано в пищевой промышленности. Из нитчатого гриба Mortierella alpina получены новые гены ацилтрансферазы лизофосфатидной кислоты (АТЛК).

Изобретение относится к области биотехнологии и касается штамма дрожжей Yarrowia lipolytica ВКПМ Y-3852 - продуцента фитазы. Рекомбинантный штамм получен путем трансформации штамма Yarrowia lipolytica Polf ATCC MYA-2613 и содержит ген фитазы PhyA Obesumbacterium proteus.

Изобретение относится к области биотехнологии и касается способа синтеза целевого секретируемого белка человека в клетках дрожжей Saccharomyces cerevisiae. Способ включает культивирование в подходящих условиях дрожжей Saccharomyces cerevisiae и секрецию целевого белка, причем секреция направлена лидерным полипептидом, имеющим аминокислотную последовательность SEQ ID NO1 и представляющим собой вариант про-области лидерного полипептида белка PpPIR1 Pichia pastoris.

Изобретение относится к биотехнологии, а именно генной инженерии. Предложены способ получения рекомбинантного капсидного белка вируса гепатита E (rtHEV-ORF2) и рекомбинантная вакцина для профилактики вирусного гепатита E.

Изобретение относится к биотехнологии и представляет способ получения сложных эфиров жирных кислот с использованием дрожжей, принадлежащих к роду Yarrowia, обладающих способностью внутриклеточно накапливать сложные эфиры жирных кислот в условиях лимита по азоту или фосфору при добавлении в среду культивирования спирта дополнительно к основному источнику углерода, характеризующихся отсутствием активности или сниженной активностью фермента глицерол-3-фосфат дегидрогеназы и экспрессией гена, кодирующего фермент неспецифичную СоА-зависимую ацилтрансферазу. Изобретение относится также к штамму дрожжей Yarrowia lipolytica ВКПМ Y-4042, способному внутриклеточно накапливать сложные эфиры жирных кислот. Изобретение позволяет эффективно получать сложные эфиры жирных кислот. 3 н. и 5 з.п. ф-лы, 4 ил., 4 табл.
Наверх