Пептид glp-1 с присоединенной олигосахаридной цепью

Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к пептиду GLP-1 с присоединенной олигосахаридной цепью, и может быть использовано в медицине. Указанный пептид GLP-1, обладающий активностью GLP-1, имеет (а1) одну аминокислоту, дополнительно присоединенную к С-концу (позиция 37), в котором указанная присоединенная аминокислота заменена аминокислотой с присоединенной олигосахаридной цепью; или (а2) одну или две аминокислоты, замененные аминокислотой с присоединенной олигосахаридной цепью, где сайт замены выбирают из позиций 18, 20, 22, 30 и 36, а также может дополнительно включать от 1 до 5 делеций, замен или вставок аминокислот, где указанная олигосахаридная цепь содержит пять или более сахаров и представлена Формулой 1. Изобретение также относится к фармацевтической композиции и способу лечения или предупреждения заболевания, поддающегося лечению или предупреждаемого введением GLP-1, например диабета, предусматривающим использование вышеуказанного пептида GLP-1 с присоединенной олигосахаридной цепью. Изобретение позволяет получить пептид GLP-1 с присоединенной олигосахаридной цепью, обладающий улучшенной стабильностью и более высокой активностью в контролировании уровня сахара в крови по сравнению с GLP-1. 3 н. и 11 з.п. ф-лы, 22 ил., 10 табл., 49 пр.

 

Область техники, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение имеет отношение к пептиду GLP-1 с присоединенной олигосахаридной цепью.

Уровень техники

GLP-1 (глюкагон-подобный пептид-1) представляет собой пептид кишечника, который глубоко вовлечен в регуляцию гомеостаза глюкозы. GLP-1 синтезируют кишечные L-клетки путем тканеспецифического посттрансляционного процессинга препроглюкагона, который представляет собой предшественник глюкагона и выходит в кровоток в ответ на прием пищи. Эти пептиды служат в качестве основных медиаторов оси, ведущей от кишечника к панкреатическим островкам, и действуют через связывание с определенными рецепторами.

Известно, что GLP-1 влияет в основном на поджелудочную железу и стимулирует выход инсулина из β-клеток зависимым от концентрации глюкозы способом. Также считается, что вероятно GLP-1 подавляет секрецию глюкагона, задерживает опорожнение желудка и усиливает удаление периферической глюкозы.

Введение GLP-1 пациентам с инсулиннезависимым сахарным диабетом может нормализовать уровень глюкозы, возникающий после приема пищи, следовательно, можно предположить, что GLP-1 может быть использован в качестве терапевтического лекарственного средства. GLP-1 также улучшает гликемический контроль у пациентов с инсулинозависимым сахарным диабетом. Поскольку влияние GLP-1 на стимуляцию высвобождения инсулина зависит от концентрации глюкозы в плазме, GLP-1 опосредует снижение высвобождения инсулина при низкой концентрации глюкозы в плазме и, следовательно, преимущественно не вызывает серьезной гипогликемии. Таким образом, при необходимости высокобезопасное лечение диабета может быть достигнуто с помощью контроля количества GLP-1 в крови. Однако время полужизни GLP-1 в крови чрезвычайно коротко, от 2 до 6 минут, что ограничивает его возможности и создает проблемы при его применении в качестве терапевтического средства.

Для решения этой проблемы были предприняты попытки модифицировать GLP-1. Например, патентный документ 1 раскрывает пегилированное соединение GLP-1, включающее соединение GLP-1, конъюгированное по меньшей мере с 1-й молекулой полиэтиленгликоля (ПЭГ), в котором каждый ПЭГ связан с соединением GLP-1 через аминокислоты Cys или Lys или через С-концевую аминокислоту, и пегилированное соединение GLP-1 имеет период полувыведения, равный по меньшей мере 1-му часу.

Согласно патентному документу 1 полученный биологически активный пептид имеет более продолжительное время полужизни и сильно замедленный клиренс по сравнению с непегилированными пептидами. Было также показано, что пегилированное соединение и композиция, включающие GLP-1, полезны при лечении таких состояний здоровья, как диабет, ожирение и синдром раздраженной кишки, а также для снижения уровня сахара в крови, подавления перистальтики желудка и/или кишечника, подавления опорожнения желудка и/или кишечника, и контролирования приема пищи (например, непатентный документ 1).

Однако ПЭГ представляет собой соединение, которое не метаболизируется in vivo. Следовательно, при непрерывном введении пегилированного соединения GLP-1 ПЭГ будет накапливаться in vivo и может вызвать побочную реакцию в живых организмах (непатентный документ 1).

В США в продаже появился эксендин-4, обнаруженный в слюне ящериц (Heloderma), который представляет собой соединение, структурно похожее на GLP-1 и имеющее похожую активность и высокую стабильность в крови (непатентный документ 2). Однако эксендин-4 имеет последовательность, отличную от последовательности человека, и может индуцировать образование нейтрализующих антител вследствие долговременного введения, что приведет к ослаблению эффективности (непатентные документы 3-5).

С другой стороны, стало очевидно, что цепи олигосахаридов имеют разнообразные функции in vivo. Они менее хорошо изучены из-за их сложных и разнотипных структур, хотя важность таких исследований была осознана. Была предпринята попытка разработать способ получения гликопептида, имеющего постоянный состав (патентный документ 2). Однако этот способ получения по-прежнему малоудовлетворителен с точки зрения удобства или широкомасштабного производства и не представляет собой практический способ, в особенности, для длинноцепочечных олигосахаридов, существующих in vivo.

[Патентный документ 1] Национальная публикация Международной патентной заявки No. 2006-520818

[Патентный документ 2] WO 2005-095331

[Непатентный документ 1] Toxicological Science, 42, 152-157 (1998)

[Непатентный документ 2] J Biol Chem. 267, 402-5 (1992)

[Непатентный документ 3] Vascular Health and Risk Management 2, 69-77 (2006)

[Непатентный документ 4] JAMA. 298, 194-206 (2007)

[Непатентный документ 5] Endocrine Reviews 28, 187-218 (2007)

Раскрытие изобретения

Проблема, которая будет решена с помощью изобретения

Цель настоящего изобретения заключается в обеспечении пептида GLP-1 с присоединенной олигосахаридной цепью, который имеет более высокую стабильность в крови по сравнению с GLP-1 и, более предпочтительно, проявляет более высокую активность в контролировании уровня сахара в крови по сравнению с GLP-1.

Средства решения проблемы

Настоящее изобретение может иметь следующие характеристики для решения проблемы.

В особенности, настоящее изобретение обеспечивает пептид GLP-1 с присоединенной олигосахаридной цепью, имеющий активность GLP-1, в котором по меньшей мере одна аминокислота заменена аминокислотой с присоединенной олигосахаридной цепью, в

(a) GLP-1;

(b) пептиде, который имеет аминокислотную последовательность GLP-1 с делецией, заменой или вставкой одной или более аминокислот; или

(c) аналоге GLP-1.

Настоящее изобретение также обеспечивает пептид GLP-1 с присоединенной олигосахаридной цепью, имеющий активность GLP-1, в котором по меньшей мере одна аминокислота заменена аминокислотой с присоединенной олигосахаридной цепью в

(a) GLP-1; или

(b) пептиде, который имеет аминокислотную последовательность GLP-1 с делецией, заменой или вставкой одной или более аминокислот и, который имеет активность GLP-1.

Настоящее изобретение также обеспечивает пептид GLP-1 с присоединенной олигосахаридной цепью, имеющий активность GLP-1, в котором пептид GLP-1 с присоединенной олигосахаридной цепью представляет собой

(a) пептид GLP-1 с присоединенной олигосахаридной цепью, имеющий одну или более аминокислот, дополнительно присоединенных к С-концу (позиция 37) GLP-1, в котором по меньшей мере одна из присоединенных аминокислот заменена аминокислотой с присоединенной олигосахаридной цепью; или

(b) пептид GLP-1 с присоединенной олигосахаридной цепью, имеющий аминокислотную последовательность пептид GLP-1 с присоединенной олигосахаридной цепью по пункту (а), с делецией, заменой или вставкой одной или более аминокислот, за исключением аминокислоты (аминокислот) с присоединенной олигосахаридной цепью.

Настоящее изобретение также обеспечивает пептид GLP-1 с присоединенной олигосахаридной цепью, имеющий активность GLP-1, в котором пептид GLP-1 с присоединенной олигосахаридной цепью представляет собой

(a) пептид GLP-1 с присоединенной олигосахаридной цепью, имеющий одну или более аминокислот, дополнительно присоединенных к N-концу (позиция 7) GLP-1, в котором по меньшей мере одна из присоединенных аминокислот заменена аминокислотой с присоединенной олигосахаридной цепью; или

(b) пептид GLP-1 с присоединенной олигосахаридной цепью, имеющий аминокислотную последовательность пептида GLP-1 с присоединенной олигосахаридной цепью по пункту (а) с делецией, заменой или вставкой одной или более аминокислот за исключением аминокислоты (аминокислот) с присоединенной олигосахаридной цепью.

Настоящее изобретение также обеспечивает пептид GLP-1 с присоединенной олигосахаридной цепью, имеющий активность GLP-1, в котором пептид GLP-1 с присоединенной олигосахаридной цепью представляет собой

(a) пептид GLP-1 с присоединенной олигосахаридной цепью, в котором аминокислота по меньшей мере в одном сайте, который выбирают из позиций 18, 20, 22, 26, 30, 34 и 36 GLP-1, заменена аминокислотой с присоединенной олигосахаридной цепью; или

(b) пептид GLP-1 с присоединенной олигосахаридной цепью, имеющий аминокислотную последовательность пептида GLP-1 с присоединенной олигосахаридной цепью по пункту (а) с делецией, заменой или вставкой одной или более аминокислот за исключением аминокислоты (аминокислот) с присоединенной олигосахаридной цепью.

Кроме того, настоящее изобретение обеспечивает пептид GLP-1 с присоединенной олигосахаридной цепью, имеющий активность GLP-1, в котором по меньшей мере две аминокислоты замещены аминокислотами с присоединенной олигосахаридной цепью в

(a) GLP-1;

(b) пептиде, который имеет аминокислотную последовательность GLP-1 с делецией, заменой или вставкой одной или более аминокислот; или

(c) аналоге GLP-1.

Настоящее изобретение также обеспечивает пептид GLP-1 с присоединенной олигосахаридной цепью, имеющий активность GLP-1, в котором по меньшей мере две аминокислоты замещены аминокислотами с присоединенной олигосахаридной цепью в

(а) GLP-1; или

(b) пептиде, который имеет аминокислотную последовательность GLP-1 с делецией, заменой или вставкой одной или более аминокислот.

Настоящее изобретение также обеспечивает пептид GLP-1 с присоединенной олигосахаридной цепью, имеющий активность GLP-1, в котором по меньшей мере две аминокислоты замещены аминокислотами с присоединенной олигосахаридной цепью в

(a) GLP-1; или

(b) пептиде, который имеет аминокислотную последовательность GLP-1 с делецией, заменой или вставкой одной или более аминокислот и который имеет активность GLP-1.

В настоящем изобретении аминокислота с присоединенной олигосахаридной цепью может быть предпочтительно, но, не ограничиваясь, Asn с присоединенной олигосахаридной цепью или Cys с присоединенной олигосахаридной цепью, в зависимости от воплощений.

В настоящем изобретении в аминокислоте с присоединенной олигосахаридной цепью, олигосахаридная цепь может быть присоединена к аминокислоте с помощью линкера или без помощи линкера. Предпочтительно, олигосахаридная цепь присоединена к аминокислоте без помощи линкера (т.е., непосредственно), в зависимости от воплощений.

В настоящем изобретении олигосахаридная цепь обычно, предпочтительно, представляет собой олигосахаридную цепь, состоящую из четырех или более сахаров. Однако олигосахаридная цепь, состоящая из от пяти до одиннадцати сахаров, может быть предпочтительна, в зависимости от воплощений.

В настоящем изобретении олигосахаридная цепь может быть предпочтительно, но, не ограничиваясь, олигосахаридной цепью, которую выбирают из группы, состоящей из дисиало-, моносиало-, асиало-, диGlcNAc- и диманнозных цепей олигосахаридов, в зависимости от воплощений.

В настоящем изобретении олигосахаридная цепь может представлять собой предпочтительно, но, не ограничиваясь, олигосахаридную цепь, представленную следующей формулой, в зависимости от воплощений:

[Формула 1]

в которой

R¹ и R² одинаковые или различные группы и каждая представляет собой следующее

[Формула 2]

, ,

, или

и

Ас представляет собой ацетильную группу.

В настоящем изобретении олигосахаридная цепь, предпочтительно, представляет собой существенным образом однородную цепь. В настоящем изобретении цепи олигосахаридов могут быть подобраны так, чтобы иметь такую структуру. Согласно раскрытию настоящего изобретения может быть достигнуто, например по меньшей мере 90% или по меньшей мере 99% однородности.

Пептид GLP-1 с присоединенной олигосахаридной цепью настоящего изобретения, предпочтительно, имеет более высокую стабильность в крови по сравнению с GLP-1.

Пептид GLP-1 с присоединенной олигосахаридной цепью настоящего изобретения может иметь активность в контролировании уровня сахара в крови предпочтительно по меньшей мере в 5 раз, более предпочтительно по меньшей мере в 10 раз, еще более предпочтительно по меньшей мере в 20 раз больше таковой в GLP-1 в OGTT (пероральный тест на толерантность к глюкозе).

Пептид GLP-1 с присоединенной олигосахаридной цепью настоящего изобретения может иметь предпочтительно по меньшей мере в 30 раз, более предпочтительно по меньшей мере в 50 раз более высокую устойчивость к DPP-IV по сравнению с GLP-1.

Пептид GLP-1 с присоединенной олигосахаридной цепью настоящего изобретения может быть применен в качестве нового активного ингредиента в медицинских применениях. Такие медицинские применения охватывают лечение или предупреждение заболеваний, связанных с GLP-1. Например, диабет представляет собой такое типичное заболевания.

Конечно, одно или более сочетаний описанных выше характеристик настоящего изобретения также включены в пептид GLP-1 с присоединенной олигосахаридной цепью настоящего изобретения.

Результат изобретения

Пептид GLP-1 с присоединенной олигосахаридной цепью настоящего изобретения имеет более высокую стабильность в крови по сравнению с GLP-1. В одном из аспектов настоящего изобретения пептид GLP-1 с присоединенной олигосахаридной цепью настоящего изобретения имеет более высокую активность в контролировании уровня сахара в крови по сравнению с GLP-1. Соответственно, пептид GLP-1 с присоединенной олигосахаридной цепью настоящего изобретения может быть введен в сниженной дозе и в меньшем числе доз по сравнению с GLP-1.

Олигосахаридная цепь, присоединенная к пептиду GLP-1 с присоединенной олигосахаридной цепью настоящего изобретения, легко деградирует in vivo и, следовательно, не вызывает побочную реакцию, связанную с его накоплением в живых организмах.

Некоторые или все цепи олигосахаридов, присоединенные к пептиду GLP-1 с присоединенной олигосахаридной цепью настоящего изобретения, существуют in vivo в млекопитающих, включая человека, в птицах и т.п. При введении живым организмам они не проявляют ни побочных эффектов, ни антигенности. Следовательно, они не вызывают проблем, связанных с аллергическими реакциями или с потерей эффективности вследствие образования антител.

До настоящего времени цепи олигосахаридов, в особенности, длинноцепочечные олигосахариды, пептиды с присоединенными олигосахаридными цепями (или белки), имеющие однородную структуру олигосахаридной цепи, трудно было получить в больших количествах с неизменным качеством. Однако в соответствии со способом получения настоящего изобретения соединение настоящего изобретения, которое представляет собой пептид с присоединенной олигосахаридной цепью, может быть обеспечен стабильным и легким способом в больших количествах и также представляется очень полезным с точки зрения фармацевтического производства.

Краткое описание чертежей

Фиг.1 представляет собой один из примеров ВЭЖХ-хроматограммы по примеру 43 и демонстрирует пики 18Asn-асиало-GLP-1 и 18Asn-дисиало-GLP-1;

фиг.2 представляет собой один из примеров ВЭЖХ-хроматограммы по примеру 44 и демонстрирует пики 22Asn-асиало-GLP-1 и 22Asn-дисиало-GLP-1;

фиг.3 представляет собой один из примеров ВЭЖХ-хроматограммы по примеру 45 и демонстрирует пики 30Asn-асиало-GLP-1 и 30Asn-дисиало-GLP-1;

фиг.4 представляет собой один из примеров ВЭЖХ-хроматограммы по примеру 47 и демонстрирует пики 36Asn-асиало-GLP-1 и 36Asn-дисиало-GLP-1;

фиг.5 представляет собой график, на котором приведены результаты ВЭЖХ-анализа пептида GLP-1 с присоединенной олигосахаридной цепью по примеру 7 в тестовом примере 1 (Тест на стабильность в плазме);

фиг.6 представляет собой график, на котором приведены результаты ВЭЖХ-анализа GLP-1 по сравнительному примеру 1 в тестовом примере 1 (Тест на стабильность в плазме);

фиг.7 представляет собой график, демонстрирующий изменение уровня сахара в крови после введения пептида GLP-1 с присоединенными олигосахаридными цепями по примерам 1-5 и GLP-1 соединения по сравнительному примеру 1 в тестовом примере 2 (Тест на влияние на снижение уровня сахара в крови у db/db мышей);

фиг.8 представляет собой график, демонстрирующий изменение уровня сахара в крови после введения пептида GLP-1 с присоединенными олигосахаридными цепями по примеру 5 и GLP-1 по сравнительному примеру 1 в тестовом примере 3 (Тест на влияние на снижение уровня сахара в крови у db/db мышей);

фиг.9 представляет собой график, демонстрирующий изменение уровня сахара в крови после добавления пептида GLP-1 с присоединенными олигосахаридными цепями по примерам и GLP-1 по сравнительному примеру 1 в тестовом примере 7-1, который представляет собой пероральный тест на толерантность к глюкозе (OGTT), проводимый для исследования влияния на подавление роста уровня сахара в крови с помощью пептида GLP-1 с присоединенными олигосахаридными цепями;

фиг.10 представляет собой график, демонстрирующий изменение уровня сахара в крови после добавления пептида GLP-1 с присоединенными олигосахаридными цепями по примерам и GLP-1 по сравнительному примеру 1 в тестовом примере 7-1, который представляет собой пероральный тест на толерантность к глюкозе (OGTT), проводимый для исследования влияния на подавление роста уровня сахара в крови с помощью пептида GLP-1 с присоединенными олигосахаридными цепями;

фиг.11 представляет собой график, демонстрирующий изменение уровня сахара в крови после добавления пептида GLP-1 с присоединенными олигосахаридными цепями по примерам и GLP-1 по сравнительному примеру 1 в тестовом примере 7-1, который представляет собой пероральный тест на толерантность к глюкозе (OGTT), проводимый для исследования влияния на подавление роста уровня сахара в крови с помощью пептида GLP-1 с присоединенными олигосахаридными цепями;

фиг.12 представляет собой график, демонстрирующий изменение уровня сахара в крови после добавления пептида GLP-1 с присоединенными олигосахаридными цепями по примерам и GLP-1 по сравнительному примеру 1 в тестовом примере 7-2, который представляет собой пероральный тест на толерантность к глюкозе (OGTT), проводимый для исследования влияния структуры олигосахаридных цепей пептидов на подавление роста уровня сахара в крови с помощью пептида GLP-1 с присоединенными олигосахаридными цепями;

фиг.13 представляет собой график, демонстрирующий изменение уровня сахара в крови после добавления пептида GLP-1 с присоединенными олигосахаридными цепями по примерам и GLP-1 по сравнительному примеру 1 в тестовом примере 7-2, который представляет собой пероральный тест на толерантность к глюкозе (OGTT), проводимый для исследования влияния структуры олигосахаридных цепей пептидов на подавление роста уровня сахара в крови с помощью пептида GLP-1 с присоединенными олигосахаридными цепями;

фиг.14 представляет собой график, демонстрирующий изменение уровня сахара в крови после добавления пептида GLP-1 с присоединенными олигосахаридными цепями по примерам и GLP-1 по сравнительному примеру 1 в тестовом примере 7-2, который представляет собой пероральный тест на толерантность к глюкозе (OGTT), проводимый для исследования влияния структуры олигосахаридных цепей пептидов на подавление роста уровня сахара в крови с помощью пептида GLP-1 с присоединенными олигосахаридными цепями;

фиг.15 представляет собой график, демонстрирующий изменение уровня сахара в крови после добавления пептида GLP-1 с присоединенными олигосахаридными цепями по примерам и GLP-1 по сравнительному примеру 1 в тестовом примере 7-3, который представляет собой пероральный тест на толерантность к глюкозе (OGTT), проводимый для исследования влияния структуры олигосахаридных цепей пептидов на подавление роста уровня сахара в крови с помощью пептида GLP-1 с присоединенными олигосахаридными цепями;

фиг.16 представляет собой график, демонстрирующий изменение уровня сахара в крови после добавления пептида GLP-1 с присоединенными олигосахаридными цепями по примерам и GLP-1 по сравнительному примеру 1 в тестовом примере 7-3, который представляет собой пероральный тест на толерантность к глюкозе (OGTT), проводимый для исследования влияния структуры олигосахаридных цепей пептидов на подавление роста уровня сахара в крови с помощью пептида GLP-1 с присоединенными олигосахаридными цепями;

фиг.17 представляет собой график, демонстрирующий изменение уровня сахара в крови после добавления пептида GLP-1 с присоединенными олигосахаридными цепями по примерам и GLP-1 по сравнительному примеру 1 в тестовом примере 7-3, который представляет собой пероральный тест на толерантность к глюкозе (OGTT), проводимый для исследования влияния доз пептидов на подавление роста уровня сахара в крови с помощью пептида GLP-1 с присоединенными олигосахаридными цепями;

фиг.18 представляет собой график, демонстрирующий изменение уровня сахара в крови после добавления пептида GLP-1 с присоединенными олигосахаридными цепями по примерам и GLP-1 по сравнительному примеру 1 в тестовом примере 7-3, который представляет собой пероральный тест на толерантность к глюкозе (OGTT), проводимый для исследования влияния доз пептидов на подавление роста уровня сахара в крови с помощью пептида GLP-1 с присоединенными олигосахаридными цепями;

фиг.19 представляет собой график, демонстрирующий изменение уровня сахара в крови после добавления пептида GLP-1 с присоединенными олигосахаридными цепями по примерам и GLP-1 по сравнительному примеру 1 в тестовом примере 7-4, который представляет собой пероральный тест на толерантность к глюкозе (OGTT), проводимый для исследования влияния на подавление роста уровня сахара в крови с помощью пептида GLP-1 с присоединенными Asn олигосахаридными цепями;

фиг.20 представляет собой график, демонстрирующий изменение уровня сахара в крови после добавления пептида GLP-1 с присоединенными олигосахаридными цепями по примерам и GLP-1 по сравнительному примеру 1 в тестовом примере 7-5, который представляет собой пероральный тест на толерантность к глюкозе (OGTT), проводимый для исследования влияния числа цепей олигосахаридов, присоединенных к пептидам, на подавление роста уровня сахара в крови с помощью пептида GLP-1 с присоединенными олигосахаридными цепями;

фиг.21 представляет собой график, демонстрирующий изменение уровня сахара в крови после добавления пептида GLP-1 с присоединенной олигосахаридной цепью по примеру и GLP-1 по сравнительному примеру 1 в тестовом примере 7-5, который представляет собой пероральный тест на толерантность к глюкозе (OGTT), проводимый для исследования влияния числа цепей олигосахаридов, присоединенных к пептидам, на подавление роста уровня сахара в крови с помощью пептида GLP-1 с присоединенными олигосахаридными цепями; и

фиг.22 представляет собой график, демонстрирующий изменение уровня сахара в крови после добавления пептида GLP-1 с присоединенными олигосахаридными цепями по примерам и GLP-1 по сравнительному примеру 1 в тестовом примере 8, проводимый для исследования влияния на подавление роста уровня сахара в крови у мышей с моделью диабета с помощью пептида GLP-1 с присоединенными олигосахаридными цепями.

Осуществление изобретения

Термин «GLP-1», примененный в этом документе, означает глюкагон-подобный пептид-1 и имеет отношение к GLP-1 (7-37).

GLP-1 (7-37) имеет следующую аминокислотную последовательность

His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-Gly (SEQ ID NO: 2).

В настоящем изобретении «аналог GLP-1» представляет собой пептид, структурно похожий на GLP-1, и/или пептид, структурно перекрывающийся с GLP-1. Примеры таких пептидов включают: пептид, который имеет аминокислотную последовательность GLP-1 с делецией, заменой или вставкой одной или более аминокислот; пептид, который имеет аминокислотную последовательность GLP-1 с консервативной заменой одной или более аминокислот; модифицированный GLP-1; фрагмент GLP-1, имеющий активность GLP-1; удлиненный GLP-1, имеющий активность GLP-1; и эксендин-4 и его аналог (Curr. Opin. Investig. Drugs 8, 842-8 (2007), J. Pharmacol. Exp. Ther. 307, 490-496 (2003), Diabetes 50, 2530-9 (2001), и т.п.).

Термин «аминокислота», примененный в этом документе, применяют в широком смысле, и он охватывает не только природные аминокислоты, но также неприродные аминокислоты, такие как варианты и производные аминокислот. Принимая во внимание это широкое определение, специалисты в этой области техники могут понять, что примеры аминокислоты, примененные в этом документе, включают: природные протеогенные L-аминокислоты; D-аминокислоты; химически модифицированные аминокислоты, такие как варианты и производные аминокислот; природные непротеогенные аминокислоты, такие как норлейцин, β-аланин и орнитин; и химически синтезированные соединения, имеющие свойства, характерные для аминокислот, известных в этой области техники. Примеры неприродных аминокислот включают α-метиламинокислоты (α-метилаланин и т.п.), D-аминокислоты, гистидин-подобные аминокислоты (2-амино-гистидин, β-гидрокси-гистидин, гомогистидин, α-фторметил-гистидин и α-метил-гистидин, и т.п.), аминокислоты, имеющего дополнительный метилен в боковой цепи («гомо»аминокислоты) и аминокислоты, имеющие карбоксильную функциональную группу в боковой цепи, замещенную группой сульфоновой кислоты (цистеиновой кислоты и т.п.). Известно, что некоторые аналоги GLP-1, имеющие активность GLP-1, содержат неприродные аминокислоты. В предпочтительном аспекте аминокислоты, которые содержатся в соединении настоящего изобретения, состоят только из природных аминокислот.

Во фразе «делеция, замена или вставка одной или более аминокислот», примененной в этом документе, число аминокислот, замененных и т.п., в особенности, не ограничено, до тех пор, пока сохраняется активность GLP-1. Число аминокислот, замененных и т.п., равно от 1 до примерно 9, предпочтительно от 1 до примерно 5, более предпочтительно от 1 до примерно 3 или соответствует не более 20%, предпочтительно, не более 10% от общей длины. Аминокислоты, замененные или вставленные, могут быть природными аминокислотами, неприродными аминокислотами или аналогами аминокислот и, предпочтительно, представляют собой природные аминокислоты.

Термин «консервативная замена одной или более аминокислот», примененный в этом документе, имеет отношение к замене аминокислоты, которая заменяет исходную аминокислоту аминокислотой, имеющей показатели гидрофильности и/или гидрофобности, похожие на показатели исходной кислоты и не вызывает явного снижения или потери активности GLP-1 после замены.

Термин «модифицированный GLP-1», примененный в этом документе, представляет собой соединение, в котором GLP-1 представляет собой природный или искусственно модифицированный GLP-1. Примеры таких модификаций включают алкилирование, ацилирование (например, ацетилирование), амидирование, карбоксилирование, этерификацию, образование дисульфидной связи, гликозилирование, липидирование, фосфорилирование, гидроксилирование и мечение одного или более аминокислотных остатков GLP-1.

Термин «фрагмент GLP-1, имеющий активность GLP-1», примененный в этом документе, представляет собой пептид, который имеет делецию по одной или более аминокислотам с N-конца и/или С-конца GLP-1 и сохраняет активность GLP-1.

Термин «удлиненный GLP-1, имеющий активность GLP-1», примененный в этом документе, представляет собой пептид, который имеет вставку одной или более аминокислот на N-конце и/или С-конце в GLP-1 и сохраняет активность GLP-1 (смотри, например, Endocrinology, 125, 3109-14 (1989)).

Во фразе «пептид, имеющий одну или более аминокислот, дополнительно присоединенных к С-концу (позиция 37) GLP-1», примененной в этом документе, аминокислоты, присоединенные к С-концу GLP-1, последовательно означают аминокислоту в позиции 38, аминокислоту в позиции 39,… и т.п. Во фразе «пептид, имеющий одну или более аминокислот, дополнительно присоединенных к N-концу (позиция 7) GLP-1», аминокислоты, присоединенные к N-концу GLP-1 последовательно, означают аминокислоту в позиции 6, аминокислоту в позиции 5,… и т.п. Примеры «пептида, имеющего одну аминокислоту, дополнительно присоединенную к С-концу (позиция 37) GLP-1» включают пептид, в котором Asn или Cys добавлены к 37Gly в GLP-1.

Термин «пептид GLP-1 с присоединенной олигосахаридной цепью (гликозилированный пептид GLP-1, пептид GLP-1 с присоединенной цепью сахаров)» настоящего изобретения характеризуется тем, что по меньшей мере одна аминокислота заменена аминокислотой с присоединенной олигосахаридной цепью.

Термин «пептид GLP-1 с присоединенной олигосахаридной цепью», примененный в этом документе, охватывает пептид, в котором по меньшей мере одна аминокислота GLP-1 заменена аминокислотой с присоединенной олигосахаридной цепью, и пептид, в котором по меньшей мере одна аминокислота аналога GLP-1 заменена аминокислотой с присоединенной олигосахаридной цепью. Эти пептиды включены в пептид GLP-1 с присоединенной олигосахаридной цепью, даже если они дополнительно имеют делецию, замену или вставку одной или более аминокислот, помимо аминокислот с присоединенными олигосахаридными цепями. Пептид, в котором С-конец любого из этих пептидов амидирован (например, GLP-1(7-36)NH₂, имеющий следующую аминокислотную последовательность His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Tip-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-NH₂ (SEQ ID NO: 3), в которой по меньшей мере одна аминокислота заменена аминокислотой с присоединенной олигосахаридной цепью) также включен в пептид GLP-1 с присоединенной олигосахаридной цепью. Соли этих пептидов также включены в пептид GLP-1 с присоединенной олигосахаридной цепью.

Термин «соли», примененный в этом документе, означает соли, известные специалистам в этой области техники и которые могут быть любыми кислотно-аддитивными или основно-аддитивными солями. Кислоты, обычно применяемые для образования кислотно-аддитивных солей, представляют собой неорганические кислоты, такие как соляная кислота, бромоводородная кислота, йодистоводородная кислота, серная кислота и фосфорная кислота, и органические кислоты, такие как п-толуолсульфоновая кислота, метансульфоновая кислота, щавелевая кислота, п-бромфенилсульфоновая кислота, карбоновая кислота, янтарная кислота, лимонная кислота, бензойная кислота и уксусная кислота. Примеры основно-аддитивных солей включают соли, полученные в результате добавления гидроксида аммония или гидроксидов щелочных или щелочноземельных металлов, и соли, производные от неорганических оснований, таких как карбонаты и бикарбонаты. В особенности предпочтительны фармацевтически приемлемые соли.

Термин «аминокислота с присоединенной олигосахаридной цепью», примененный в этом документе, представляет собой аминокислоту, присоединенную к олигосахаридной цепи. В этом контексте, олигосахаридная цепь может быть присоединена к аминокислоте через линкер. Место олигосахаридной цепи, к которой присоединена аминокислота, в особенности, не ограничено. Предпочтительно, аминокислота присоединена к редуцирующему концу олигосахаридной цепи.

Тип аминокислоты, присоединенной к олигосахаридной цепи, в особенности, не ограничен, и могут быть применены как природные, так и неприродные аминокислоты. С той точки зрения, что аминокислота с присоединенной олигосахаридной цепью представляет собой структурно то же самое или сходна с таковой для существующей в форме гликопептида (гликопротеина) in vivo, аминокислота с присоединенной олигосахаридной цепью представляет собой предпочтительно Asn с присоединенной олигосахаридной цепью, такой как N-связанная олигосахаридная цепь, или Ser с присоединенной олигосахаридной цепью, и Thr с присоединенной олигосахаридной цепью, такие как O-связанная олигосахаридная цепь, в особенности, предпочтительно Asn с присоединенной олигосахаридной цепью.

Если олигосахаридная цепь присоединена к аминокислоте через линкер, то аминокислота в аминокислоте с присоединенной олигосахаридной цепью предпочтительно представляет собой: аминокислоту, имеющую две или более карбоксильных групп в молекуле, такую как аспарагиновая кислота или глутаминовая кислота; аминокислоту, имеющую две или более аминогрупп в молекуле, такую как лизин, аргинин, гистидин или триптофан; аминокислоту, имеющую гидроксильную группу в молекуле, такую как серии, треонин или тирозин; аминокислоту, имеющую тиоловую группу в молекуле, такую как цистеин; или аминокислоту, имеющую амидную группу в молекуле, такую как аспарагин или глутамин, с точки зрения легкости связывания с линкером. В особенности, с точки зрения реакционноспособности предпочтительны аспарагиновая кислота, глутаминовая кислота, лизин, аргинин, серин, треонин, цистеин, аспарагин или глутамин.

В приведенном ниже тестовом примере 7-4 пептид GLP-1 с присоединенными олигосахаридными цепями настоящего изобретения не демонстрирует существенной разницы в подавлении роста уровня сахара в крови между случаями Asn с присоединенной олигосахаридной цепью (без помощи линкера) и Cys с присоединенной олигосахаридной цепью (через линкер) в качестве аминокислоты с присоединенной олигосахаридной цепью, если они имеют одинаковую структуру олигосахаридных цепей, одну и ту же структуру, за исключением структуры олигосахаридных цепей, одни и те же места присоединения олигосахаридной цепи и одно и то же число присоединенных цепей олигосахаридов.

Если олигосахаридная цепь присоединена к аминокислоте через линкер, то может быть применено множество разных линкеров, применяемых в этой области техники. Примеры линкеров могут включать группировку -NH-(CO)-(CH₂)_a-CH₂-, в которой:

«а» представляет собой целое число, предпочтительно целое число, равное от 0 до 4, но не ограничиваясь этими числами, пока представляющие интерес функции линкера не будут ингибироваться; и

C_1-10-полиметилен и -CH₂-R-, в котором R представляет собой группу, сформированную путем удаления одного атома водорода из заместителя, который выбирают из группы, состоящей из алкила, замещенного алкила, алкенила, замещенного алкенила, алкинила, замещенного алкинила, арила, замещенного арила, карбоциклической группы, замещенной карбоциклической группы, гетероциклической группы и замещенной гетероциклической группы.

Пептид GLP-1 с присоединенной олигосахаридной цепью, имеющий аминокислоту с присоединенной олигосахаридной цепью, в которой олигосахаридная цепь присоединена к аминокислоте без помощи линкера, может иметь сниженную антигенность по сравнению с пептидом GLP-1 с присоединенной олигосахаридной цепью, в котором олигосахаридная цепь присоединена к аминокислоте через линкер. Пептид GLP-1 с присоединенной олигосахаридной цепью, имеющий аминокислоту с присоединенной олигосахаридной цепью, в которой олигосахаридная цепь присоединена к аминокислоте через линкер, может иметь повышенную стабильность в крови по сравнению с пептидом GLP-1 с присоединенной олигосахаридной цепью, в которой олигосахаридная цепь присоединена к аминокислоте без помощи линкера.

Способ получения пептида GLP-1 с присоединенной олигосахаридной цепью настоящего изобретения не ограничен никаким образом описанием (например, описанием, которое начинается словами «пептид GLP-1 с присоединенной олигосахаридной цепью, в котором аминокислота заменена аминокислотой с присоединенной олигосахаридной цепью»). Пептид GLP-1 с присоединенной олигосахаридной цепью, который получают с помощью любого из способов А и В, включен в «пептид GLP-1 с присоединенной олигосахаридной цепью, в котором аминокислота заменена аминокислотой с присоединенной олигосахаридной цепью». Кроме того, например: пептид GLP-1 с присоединенной олигосахаридной цепью, в котором несвязанная с аминокислотой олигосахаридная цепь присоединена непосредственно или через линкер к аминокислоте в пептиде; пептид GLP-1 с присоединенной олигосахаридной цепью, в котором олигосахаридную цепь уже добавлена, дополнительно удлинен путем присоединения сахара или олигосахаридной цепи к нему; и пептид GLP-1 с присоединенной олигосахаридной цепью, в котором одну или более аминокислот, связанных с амино- и/или карбоксильными группами аминокислоты с присоединенной олигосахаридной цепью дополнительно присоединяют к одному или более фрагментам GLP-1, также включены в пептид GLP-1 с присоединенной олигосахаридной цепью настоящего изобретения до тех пор пока их конечные структуры находятся в соответствии с вышеизложенным.

Число замен, при которых аминокислоту GLP-1 заменяют аминокислотой с присоединенной олигосахаридной цепью, может быть подобрано соответствующим образом в зависимости от стабильности в крови, биологических активностей (например, способность контролировать уровень сахара в крови), числа аминокислот, присутствующих в конечном пептиде GLP-1 с присоединенной олигосахаридной цепью, молекулярных масс пептидов GLP-1 с присоединенной олигосахаридной цепью до и после добавления олигосахаридной цепи и т.п. Например, от 1-й до 5-ти замен предпочтительно, и от 1-й до 3-х замен более предпочтительно. Предпочтительно одна замена может быть выбрана с точки зрения удобства до тех пор, пока эта одна замена приводит к желаемой активности. В целом, пептид GLP-1 с присоединенной олигосахаридной цепью, в котором одна аминокислота GLP-1 заменена аминокислотой с присоединенной олигосахаридной цепью, проявляет повышенную стабильность в крови и сниженную активность в контролировании уровня сахара в крови, если одна или более аминокислот, за исключением аминокислоты с присоединенными олигосахаридными цепями дополнительно заменены аминокислотой с присоединенной олигосахаридной цепью (однако сниженная активность в контролировании уровня сахара в крови может быть скомпенсирована увеличенной стабильностью в крови).

В пептиде GLP-1 с присоединенной олигосахаридной цепью настоящего изобретения, сайт замены аминокислоты аминокислотой с присоединенной олигосахаридной цепью может быть подобран соответствующим образом в зависимости от стабильности в крови или от активности в контролировании уровня сахара в крови.

В одном из аспектов настоящего изобретения, сайт замены аминокислоты GLP-1 аминокислотой с присоединенной олигосахаридной цепью может быть выбран из сайтов GLP-1 в зависимости от желаемой активности и существует, например, по меньшей мере один сайт, который выбирают из позиций 8, 9, 12, 18, 19, 20, 22, 26, 30, 34, 36 и 38 (=присоединение аминокислоты с присоединенной олигосахаридной цепью к аминокислоте в позиции 37) GLP-1, предпочтительно по меньшей мере один сайт, который выбирают из позиций 18, 20, 22, 26, 30, 34, 36 и 38, например по меньшей мере один сайт, который выбирают из позиций 26, 30, 34 и 36, и в особенности по меньшей мере один сайт, который выбирают из позиций 30 и 36.

В одном из аспектов настоящего изобретения, с точки зрения стабильности пептида GLP-1 с присоединенной олигосахаридной цепью в крови, сайт замены аминокислоты аминокислотой с присоединенной олигосахаридной цепью может быть выбран из любого участка GLP-1 и представляет собой, например, по меньшей мере один сайт, который выбирают из позиций 9, 10, 11, 12, 14, 16, 18, 19, 20, 22, 24, 25, 26, 27, 28, 30, 32, 34, 36 и 38 (=присоединение аминокислоты с присоединенной олигосахаридной цепью к аминокислоте в позиции 37) GLP-1, предпочтительно по меньшей мере один сайт, который выбирают из позиций 9, 10, 11, 12, 14 и 28, и в особенности, предпочтительно по меньшей мере один сайт, который выбирают из позиций 9, 10, 11 и 12. В особенности, также предпочтительно замена аминокислоты в участке, близком к N-концу GLP-1. В особенности, примеры сайтов замены двух аминокислот GLP-1 аминокислотами с присоединенной олигосахаридной цепью могут включать замены в позициях 18 и 36 и замещению в позициях 26 и 34 пептида GLP-1.

В одном из аспектов настоящего изобретения с точки зрения влияния на контролирование уровня сахара в крови с помощью пептид GLP-1 с присоединенной олигосахаридной цепью, сайт замены аминокислоты аминокислотой с присоединенной олигосахаридной цепью представляет собой, например, по меньшей мере один сайт, который выбирают из позиций 18, 20, 22, 26, 30, 34, 36 и 38 (=присоединение аминокислоты с присоединенной олигосахаридной цепью к аминокислоте в позиции 37) GLP-1, предпочтительно по меньшей мере один сайт, который выбирают из позиций 26, 30, 34 и 36, и в особенности по меньшей мере один сайт, который выбирают из позиций 30 и 36. В особенности, примеры сайтов замены двух аминокислот GLP-1 аминокислотами с присоединенной олигосахаридной цепью могут включать замены в позициях 18 и 36 и замены в позициях 26 и 34 пептида GLP-1, с точки зрения влияние на контролирование уровня сахара в крови с помощью пептида GLP-1 с присоединенной олигосахаридной цепью.

В одном из аспектов настоящего изобретения с точки зрения сохранения активности GLP-1 в отношении синтеза сАМР пептидом GLP-1 с присоединенной олигосахаридной цепью, сайт замены аминокислоты аминокислотой с присоединенной олигосахаридной цепью представляет собой предпочтительно по меньшей мере один сайт, который выбирают из позиций 22, 26, 27, 30, 34, 36 и 38 (=присоединение аминокислоты с присоединенной олигосахаридной цепью к аминокислоте в позиции 37), и более предпочтительно по меньшей мере один сайт, который выбирают из позиций 22, 26, 30, 34, 36 и 38.

В одном из аспектов настоящего изобретения, сайт замены аминокислоты аминокислотой с присоединенной олигосахаридной цепью представляет собой по меньшей мере один сайт, который выбирают из сайтов, за исключением позиций 8, 9 и 12 GLP-1.

В одном из аспектов настоящего изобретения сайт замены аминокислоты аминокислотой с присоединенной олигосахаридной цепью представляет собой по меньшей мере один сайт, который выбирают из сайтов за исключением позиций 7, 10, 13, 15, 19, 21, 28 и 29 пептида GLP-1, и в особенности по меньшей мере один сайт который выбирают из сайтов, за исключением позиций 7, 10, 15 и 28.

В одном из аспектов настоящего изобретения, сайт замены аминокислоты аминокислотой с присоединенной олигосахаридной цепью может быть определен из сайтов связывание GLP-1 с рецептором GLP-1.

В одном из аспектов настоящего изобретения, если две или более аминокислот замещены аминокислотами с присоединенной олигосахаридной цепью, то участки замещения аминокислот аминокислотами с присоединенной олигосахаридной цепью могут быть выбраны из, но, не ограничиваясь, любой комбинации участков, описанных выше. Например, комбинация, в которой один сайт представляет собой сайт, который выбирают из предпочтительных участков, а другие участки представляют собой участки, которые выбирают из любого участка GLP-1, и комбинация, в которой один сайт представляет собой сайт, который выбирают из предпочтительных участков, а другие участки представляют собой участки, которые выбирают из любых участков одной или более аминокислот, дополнительно присоединенных к С-концу (позиция 37) GLP-1 также включены в предпочтительный аспект настоящего изобретения.

В одном из аспектов настоящего изобретения, предпочтительные примеры делеции, замены или вставок одной или более аминокислот, за исключением аминокислоты(аминокислот) с присоединенной олигосахаридной цепью в GLP-1, могут включать, но не ограничиваются:

замену 8Ala аминокислотой, которую выбирают из группы, состоящей из Gly, Ser, Thr, Leu, lie, Val, Glu, Asp и Lys;

замену 9Glu аминокислотой, которую выбирают из группы, состоящей из Asp и Lys;

замену 11Thr аминокислотой, которую выбирают из группы, состоящей из Ala, Gly, Ser, Leu, He, Val, Glu, Asp и Lys;

замену 12Phe аминокислотой, которую выбирают из группы, состоящей из Trp и Tyr;

замену 13Thr Ser;

замену 14Ser аминокислотой, которую выбирают из группы, состоящей из Ala, Gly, Thr, Leu, He, Val, Glu, Asp и Lys;

замену 15Asp Glu;

замену 16Val аминокислотой, которую выбирают из группы, состоящей из Phe, Ala, Gly, Ser, Thr, Leu, Ile, Tyr, Glu, Asp и Lys;

замену 17Ser аминокислотой, которую выбирают из группы, состоящей из Ala, Gly, Thr, Leu, Ile, Val, Glu, Asp и Lys;

замену 18Ser аминокислотой, которую выбирают из группы, состоящей из Ala, Gly, Thr, Leu, Ile, Val, Glu, Asp и Lys;

замену 19Tyr аминокислотой, которую выбирают из группы, состоящей из Phe, Trp, Glu, Asp и Lys;

замену 20Leu аминокислотой, которую выбирают из группы, состоящей из Ala, Gly, Ser, Thr, Leu, Ile, Val, Glu, Asp и Lys

замену 21Glu аминокислотой, которую выбирают из группы, состоящей из Asp и Lys;

замену 22Gly аминокислотой, которую выбирают из группы, состоящей из Ala, Ser, Thr, Leu, Ile, Val, Glu, Asp и Lys;

замену 23Gln аминокислотой, которую выбирают из группы, состоящей из Asn, Arg, Glu, Asp и Lys;

замену 24Ala аминокислотой, которую выбирают из группы, состоящей из Gly, Ser, Thr, Leu, Ile, Val, Arg, Glu, Asp и Lys;

замену 25Ala аминокислотой, которую выбирают из группы, состоящей из Gly, Ser, Thr, Leu, Ile, Val, Glu, Asp и Lys;

замену 26Lys аминокислотой, которую выбирают из группы, состоящей из Arg, Gln, Glu, Asp и His;

замену 27Glu аминокислотой, которую выбирают из группы, состоящей из Asp, Ile и Lys;

замену 28Phe Trp;

замену 29Ile аминокислотой, которую выбирают из группы, состоящей из Leu, Val и Ala;

замену 30Ala аминокислотой, которую выбирают из группы, состоящей из Gly, Ser, Thr, Leu, Ile, Val, Glu, Asp и Lys;

замену 31Trp аминокислотой, которую выбирают из группы, состоящей из Phe, Tyr, Glu, Asp и Lys;

замену 32Leu аминокислотой, которую выбирают из группы, состоящей из Gly, Ala, Ser, Thr, Ile, Val, Glu, Asp и Lys;

замену 33Val аминокислотой, которую выбирают из группы, состоящей из Gly, Ala, Ser, Thr, Leu, Ile, Glu, Asp и Lys;

замену 34Lys аминокислотой, которую выбирают из группы, состоящей из Arg, Glu, Asp и His;

замену 35Gly аминокислотой, которую выбирают из группы, состоящей из Ala, Ser, Thr, Leu, Ile, Val, Glu, Asp и Lys;

замену 36Arg аминокислотой, которую выбирают из группы, состоящей из Lys, Glu, Asp и His; и/или

замену 37Gly аминокислотой, которую выбирают из группы, состоящей из Ala, Ser, Thr, Leu, Ile, Val, Glu, Asp и Lys.

В одном из аспектов настоящего изобретения сайт делеции, замены или вставки аминокислот, за исключением аминокислоты с присоединенными олигосахаридными цепями, предпочтительно представляет собой по меньшей мере один сайт, который выбирают из сайтов, за исключением позиций 7, 10, 13, 15, 19, 21, 28 и 29 пептида GLP-1, например по меньшей мере один сайт, который выбирают из сайтов, за исключением позиций 7, 10, 15 и 28 (Structure-Activity Studies of Glucagon-like Peptide-1, THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY Vol.269, No. 9, Issue of March 4, pp.6276-6278. 1994).

Примеры пептида GLP-1 с присоединенной олигосахаридной цепью настоящего изобретения включают пептид GLP-1 с присоединенной олигосахаридной цепью, представленный общей формулой (1):

в которой:

Xaa₁₈ представляет собой Ser, Cys с присоединенной олигосахаридной цепью или Asn с присоединенной олигосахаридной цепью;

Xaa₁₉ представляет собой Tyr, Cys с присоединенной олигосахаридной цепью или Asn с присоединенной олигосахаридной цепью;

Хаа₂₂ представляет собой Gly, Cys с присоединенной олигосахаридной цепью или Asn с присоединенной олигосахаридной цепью;

Хаа₂₆ представляет собой Lys, Cys с присоединенной олигосахаридной цепью или Asn с присоединенной олигосахаридной цепью;

Хаа₃₆ представляет собой Arg, Cys с присоединенной олигосахаридной цепью или Asn с присоединенной олигосахаридной цепью,

Хаа₃₇ представляет собой Gly, NH₂, Gly-Cys с присоединенной олигосахаридной цепью или Gly-Asn с присоединенной олигосахаридной цепью, and

если Xaa₁₈ - это Ser, Хаа₁₉ - это Tyr, Хаа₂₂ - это Gly, Хаа₂₆ - это Lys и Хаа₃₆ - это Arg, то Хаа₃₇ представляет собой Gly-Cys с присоединенной олигосахаридной цепью или Gly-Asn с присоединенной олигосахаридной цепью. Пептид, представленный общей формулой (1), представлен в этом документа последовательностью SEQ ID NO: 1.

Особые примеры пептида GLP-1 с присоединенной олигосахаридной цепью настоящего изобретения могут включать:

(а1) пептид, представленный общей формулой (1), в котором Xaa₁₈ представляет собой Cys с присоединенной олигосахаридной цепью, Xaa₁₉ представляет собой Tyr, Хаа₂₂ представляет собой Gly, Хаа₂₆ представляет собой Lys, Хаа₃₆ представляет собой Arg и Хаа₃₇ представляет собой Gly (SEQ ID NO: 4);

(а2) пептид, представленный общей формулой (1), в которой Xaa₁₈ представляет собой Ser, Xaa₁₉ представляет собой Tyr, Хаа₂₂ представляет собой Cys с присоединенной олигосахаридной цепью, Хаа₂₆ представляет собой Lys, Хаа₃₆ представляет собой Arg и Хаа₃₇ представляет собой Gly (SEQ ID NO: 5);

(а3) пептид, представленный общей формулой (1), в которой Xaa₁₈ представляет собой Ser, Xaa₁₉ представляет собой Tyr, Хаа₂₂ представляет собой Gly, Хаа₂₆ представляет собой Cys с присоединенной олигосахаридной цепью, Хаа₃₆ представляет собой Arg и Хаа₃₇ представляет собой Gly (SEQ ID NO: 6);

(a4) пептид, представленный общей формулой (1), в которой Xaa₁₈ представляет собой Ser, Xaa₁₉ представляет собой Tyr, Xaa₂₂ представляет собой Gly, Xaa₂₆ представляет собой Lys, Xaa₃₆ представляет собой Cys с присоединенной олигосахаридной цепью, и Xaa₃₇ представляет собой Gly (SEQ ID NO: 7);

(a5) пептид, представленный общей формулой (1), в которой Xaa₁₈ представляет собой Ser, Xaa₁₉ представляет собой Tyr, Xaa₂₂ представляет собой Gly, Xaa₂₆ представляет собой Lys, Xaa₃₆ представляет собой Arg и Xaa₃₇ представляет собой Cys с присоединенной олигосахаридной цепью (SEQ ID NO: 8);

(a6) пептид, представленный общей формулой (1), в которой Xaa₁₈ представляет собой Ser, Xaa₁₉ представляет собой Cys с присоединенной олигосахаридной цепью, Xaa₂₂ представляет собой Gly, Xaa₂₆ представляет собой Lys, Xaa₃₆ представляет собой Arg и Xaa₃₇ представляет собой Gly (SEQ ID NO: 9);

(a7) пептид, представленный общей формулой (1), в которой Xaa₁₈ Asn с присоединенной олигосахаридной цепью, Xaa₁₉ представляет собой Tyr, Xaa₂₂ представляет собой Gly, Xaa₂₆ представляет собой Lys, Xaa₃₆ представляет собой Arg и Xaa₃₇ представляет собой Gly (SEQ ID NO: 10);

(a8) пептид, представленный общей формулой (1), в которой Xaa₁₈ представляет собой Ser, Xaa₁₉ представляет собой Tyr, Xaa₂₂ представляет собой Asn с присоединенной олигосахаридной цепью, Xaa₂₆ представляет собой Lys, Xaa₃₆ представляет собой Arg и Xaa₃₇ представляет собой Gly (SEQ ID NO: 11);

(a9) пептид, представленный общей формулой (1), в которой Xaa₁₈ представляет собой Ser, Xaa₁₉ представляет собой Tyr, Xaa₂₂ представляет собой Gly, Xaa₂₆ представляет собой Asn с присоединенной олигосахаридной цепью, Xaa₃₆ представляет собой Arg и Xaa₃₇ представляет собой Gly (SEQ ID NO: 12);

(a10) пептид, представленный общей формулой (1), в которой Xaa₁₈ представляет собой Ser, Xaa₁₉ представляет собой Tyr, Xaa₂₂ представляет собой Gly, Xaa₂₆ представляет собой Lys, Xaa₃₆ представляет собой Asn с присоединенной олигосахаридной цепью и Xaa₃₇ представляет собой Gly (SEQ ID NO: 13);

(a11) пептид, представленный общей формулой (1), в которой Xaa₁₈ представляет собой Ser, Xaa₁₉ представляет собой Tyr, Xaa₂₂ представляет собой Gly, Xaa₂₆ представляет собой Lys, Xaa₃₆ представляет собой Arg и Xaa₃₇ представляет собой Gly-Asn с присоединенной олигосахаридной цепью (SEQ ID NO: 14);

(a12) пептид, представленный общей формулой (1), в которой Xaa₁₈ представляет собой Ser, Xaa₁₉ представляет собой Asn с присоединенной олигосахаридной цепью, Xaa₂₂ представляет собой Gly, Xaa₂₆ представляет собой Lys, Xaa₃₆ представляет собой Arg и Хаа₃₇ представляет собой Gly (SEQ ID NO:15);

(a13) пептид, представленный общей формулой (1), в которой Хаа₁₈ представляет собой Cys с присоединенной олигосахаридной цепью, Xaa₁₉ представляет собой Tyr, Хаа₂₂ представляет собой Gly, Хаа₂₆ представляет собой Lys, Хаа₃₆ представляет собой Arg и Хаа₃₇ представляет собой NH₂ (SEQ ID NO:16);

(а14) пептид, представленный общей формулой (1), в которой Xaa₁₈ представляет собой Ser, Xaa₁₉ представляет собой Tyr, Хаа₂₂ представляет собой Cys с присоединенной олигосахаридной цепью, Хаа₂₆ представляет собой Lys, Хаа₃₆ представляет собой Arg и Хаа₃₇ представляет собой NH₂ (SEQ ID NO:17);

(а15) пептид, представленный общей формулой (1), в которой Хаа₁₈ представляет собой Ser, Xaa₁₉ представляет собой Tyr, Хаа₂₂ представляет собой Gly, Хаа₂₆ представляет собой Cys с присоединенной олигосахаридной цепью, Хаа₃₆ представляет собой Arg и Хаа₃₇ представляет собой NH₂ (SEQ ID NO:18);

(а16) пептид, представленный общей формулой (1), в которой Xaa₁₈ представляет собой Ser, Xaa₁₉ представляет собой Tyr, Хаа₂₂ представляет собой Gly, Хаа₂₆ представляет собой Lys, Хаа₃₆ представляет собой Cys с присоединенной олигосахаридной цепью и Хааз7 представляет собой NH₂ (SEQ ID NO:19);

(а17) пептид, представленный общей формулой (1), в которой Xaa₁₈ представляет собой Ser, Xaa₁₉ представляет собой Cys с присоединенной олигосахаридной цепью, Хаа₂₂ представляет собой Gly, Хаа₂₆ представляет собой Lys, Хаа₃₆ представляет собой Arg и Хаа₃₇ представляет собой NH₂ (SEQ ID NO:20);

(а18) пептид, представленный общей формулой (1), в которой Xaa₁₈ представляет собой Asn с присоединенной олигосахаридной цепью, Xaa₁₉ представляет собой Tyr, Хаа₂₂ представляет собой Gly, Хаа₂₆ представляет собой Lys, Хаа₃₆ представляет собой Arg и Хаа₃₇ представляет собой NH₂ (SEQ ID NO:21);

(а19) пептид, представленный общей формулой (1), в которой Xaa₁₈ представляет собой Ser, Xaa₁₉ представляет собой Tyr, Хаа₂₂ представляет собой Asn с присоединенной олигосахаридной цепью, Хаа₂₆ представляет собой Lys, Хаа₃₆ представляет собой Arg и Хаа₃₇ представляет собой NH₂ (SEQ ID NO:22);

(а20) пептид, представленный общей формулой (1), в которой Xaa₁₈ представляет собой Ser, Xaa₁₉ представляет собой Tyr, Хаа₂₂ представляет собой Gly, Хаа₂₆ представляет собой Asn с присоединенной олигосахаридной цепью, Хаа₃₆ представляет собой Arg и Хаа₃₇ представляет собой NH₂ (SEQ ID NO:23);

(а21) пептид, представленный общей формулой (1), в которой Хаа₁₈ представляет собой Ser, Xaa₁₉ представляет собой Tyr, Хаа₂₂ представляет собой Gly, Хаа₂₆ представляет собой Lys, Хаа₃₆ представляет собой Asn с присоединенной олигосахаридной цепью и Хаа₃₇ представляет собой NH₂ (SEQ ID NO:24);

(а22) пептид, представленный общей формулой (1), в которой Xaa₁₈ представляет собой Ser, Xaa₁₉ представляет собой Asn с присоединенной олигосахаридной цепью, Хаа₂₂ представляет собой Gly, Хаа2б представляет собой Lys, Хаа₃₆ представляет собой Arg и Хаа₃₇ представляет собой NH₂ (SEQ ID NO:25);

(а23) пептид, представленный общей формулой (1), в которой Xaa₁₈ представляет собой Cys с присоединенной олигосахаридной цепью, Xaa₁₉ представляет собой Tyr, Хаа₂₂ представляет собой Cys с присоединенной олигосахаридной цепью, Хаа₂₆ представляет собой Lys, Хаа₃₆ представляет собой Arg и Хаа₃₇ представляет собой Gly-Cys с присоединенной олигосахаридной цепью (SEQ ID NO:26);

(а24) пептид, представленный общей формулой (1), в которой Xaa₁₈ представляет собой Cys с присоединенной олигосахаридной цепью, Xaa₁₉ представляет собой Tyr, Хаа₂₂ представляет собой Cys с присоединенной олигосахаридной цепью, Хаа₂₆ представляет собой Cys с присоединенной олигосахаридной цепью, Хаа₃₆ представляет собой Arg и Хаа₃₇ представляет собой Gly (SEQ ID NO:27);

(а25) пептид, представленный общей формулой (1), в которой Xaa₁₈ представляет собой Ser, Xaa₁₉ представляет собой Tyr, Хаа₂₂ представляет собой Gly, Хаа₂₆ представляет собой Asn с присоединенной олигосахаридной цепью, Хаа₃₆ представляет собой Asn с присоединенной олигосахаридной цепью и Хаа₃₇ представляет собой Gly-Asn с присоединенной олигосахаридной цепью (SEQ ID NO:28); и

(а26) пептид, представленный общей формулой (1), в которой Xaa₁₈ представляет собой Asn с присоединенной олигосахаридной цепью, Xaa₁₉ представляет собой Tyr, Хаа₂₂ представляет собой Asn с присоединенной олигосахаридной цепью, Хаа₂₆ представляет собой Asn с присоединенной олигосахаридной цепью, Хаа₃₆ представляет собой Arg и Хаа₃₇ представляет собой NH₂ (SEQ ID NO:29).

Термин «олигосахаридная цепь», примененный в этом документе, имеет отношение к соединению, которое состоит по меньшей мере из одного звена сахара (моносахарида и/или его производных). Если присоединены два или более звеньев сахара, то эти звенья сахара связаны между собой через гликозидную связь в результате конденсирования, произведенного с помощью дегидратации. Примеры таких олигосахаридных цепей включают, но не ограничиваются, моносахариды и полисахариды (глюкозу, галактозу, маннозу, фукозу, ксилозу, N-ацетилглюкозамин, N-ацетилгалактозамин, сиаловую кислоту и их комплексы и производные), которые содержатся в живых организмах, а также в широком диапазоне цепи олигосахаридов, такие как деградированные полисахариды, и те полисахариды, которые образовались в результате деградации или представляют собой производные комплексов биологических молекул, таких как гликопротеины, протеогликаны, глюкозаминогликаны и гликолипиды. Олигосахаридная цепь может быть линейной или разветвленной.

Термин «олигосахаридная цепь», примененный в этом документе, также охватывают цепи производных олигосахаридов. Примеры цепей производных олигосахаридов включают, но не ограничиваются, цепи олигосахаридов, которые состоят из сахара, имеющего карбоксильную группу (например, альдоновая кислота, которая представляет собой карбоновую кислоту, образованную путем окисления в позиции С-1 (например, D-глюконовая кислота, образованная путем окисления D-глюкозы) и уроновую кислоту, у котором концевой атом углерода окислен до карбоксильной группы (D-глюкуроновая кислота, образованная путем окисления D-глюкозы)); сахар, имеющий аминогруппу или производное аминогруппы (например, ацетилированную аминогруппу) (например, N-ацетил-D-глюкозамин и N-ацетил-D-галактозамин); сахар, имеющий как амино-, так и карбоксильные группы (например, N-ацетилнейраминовая кислота (сиаловая кислота) и N-ацетилмураминовая кислота); дезоксисахар (например, 2-дезокси-D-рибоза); сульфатированный сахар, содержащий сернокислую группу; и фосфорилированный сахар, содержащий фосфорнокислую группу.

В настоящем изобретении предпочтительные цепи олигосахаридов увеличивают стабильность в крови и, более предпочтительно, не уничтожают активность в отношении контролирования уровня сахара в крови, при добавлении к GLP-1 (т.е., если аминокислота о GLP-1 заменена аминокислотой с присоединенной олигосахаридной цепью). В одном из аспектов настоящего изобретения предпочтительные цепи олигосахаридов увеличивают активность в отношении контролировании уровня сахара в крови, при добавлении к GLP-1 (т.е., если аминокислота GLP-1 заменена аминокислотой с присоединенной олигосахаридной цепью).

С той точки зрения, что пептид GLP-1 с присоединенной олигосахаридной цепью настоящего изобретения вводят живым организмам, олигосахаридная цепь в пептиде GLP-1 с присоединенной олигосахаридной цепью настоящего изобретения существует in vivo в форме комплекса с углеводом (гликопептидом (или гликопротеином), протеогликаном, гликолипидом, и т.п.) и, предпочтительно, представляет собой присоединенную через атом N олигосахаридную цепь, присоединенную через атом О олигосахаридную цепь, и т.п., которая in vivo связана с пептидом (или белком) с образованием гликопептида (или гликопротеина).

Предпочтительно, олигосахаридная цепь, примененная в настоящем изобретение, представляет собой присоединенную через атом N олигосахаридную цепь. Примеры присоединенных через атом N олигосахаридных цепей могут включать высоко-маннозный тип, комплексный тип и гибридный тип. Комплексный тип, в особенности, предпочтителен.

В одном из аспектов настоящего изобретения, олигосахаридная цепь в пептиде GLP-1 с присоединенной олигосахаридной цепью настоящего изобретения предпочтительно представляет собой олигосахаридную цепь, состоящую из четырех или более сахаров, например, пяти или более, семи или более, девяти или более или одиннадцати или более сахаров.

В предпочтительном аспекте настоящего изобретения олигосахаридная цепь в пептиде GLP-1 с присоединенной олигосахаридной цепью настоящего изобретения состоит из от пяти до одиннадцати, от девяти до одиннадцати или двенадцати сахаров.

В предпочтительном аспекте настоящего изобретения олигосахаридная цепь в пептиде GLP-1 с присоединенной олигосахаридной цепью настоящего изобретения представляет собой олигосахаридную цепь, которую выбирают из группы, состоящей из дисиало-, моносиало-, асиало- (дигалактозных), диGlcnAc- (ди-N-ацетилглюкозаминных) и диманнозных цепей олигосахаридов и более предпочтительно дисиало-олигосахаридных цепей.

Примеры предпочтительных цепей олигосахаридов, применяемых в настоящем изобретении, включают олигосахаридную цепь, представленную следующей общей формулой:

[Формула 3]

в которой R¹ и R² одинаковые или различные группы и каждая представляет собой следующее

[Формула 4]

, ,

, или

Ас представляет собой ацетильную группу.

В настоящем изобретении примеры предпочтительных олигосахаридных цепей могут включать олигосахаридную цепь, структурно похожую (цепи олигосахаридов, имеющие звенья сахаров сходных типов и связи между сахарами одинакового типа) на олигосахаридную цепь, которая в организме человека связывается с белком с образованием гликопротеина (например, цепи олигосахаридов, описанные в «FEBS LETTERS Vol.50, No. 3, Feb. 1975»), и олигосахаридную цепь, утратившую один или более сахаров со своего нередуцирующего конца, приведенные ниже в таблицах 1-4.

[Таблица 1]

[Таблица 2]

[Таблица 3]

[Таблица 4]

В предпочтительном аспекте настоящего изобретения пептид GLP-1 с присоединенной олигосахаридной цепью настоящего изобретения имеет однородную структуру олигосахаридной цепи. Термин «однородная структура олигосахаридной цепи», примененный в этом документе, означает, что все звенья сахара в олигосахаридной цепи представляют собой звенья одинакового типа, сахара присоединены в одинаковом порядке, и тип связей между сахарами одинаковый, и означает, что по меньшей мере 90%, предпочтительно по меньшей мере 95%, более предпочтительно по меньшей мере 99% пептида GLP-1 с присоединенными олигосахаридными цепями имеет однородную структуру олигосахаридной цепи. Пептид GLP-1 с присоединенными олигосахаридными цепями, имеющий однородную структуру олигосахаридной цепи, имеет постоянное качество и, в особенности, предпочтителен в такой области, как фармакологическое производство.

В настоящем изобретении примеры предпочтительные пептиды GLP-1 с присоединенной олигосахаридной цепью могут включать пептид GLP-1 с присоединенными олигосахаридными цепями (SEQ ID NO: от 103 до 151), которые получают в следующих примерах от 1 до 49. А именно, пептид GLP-1 с присоединенными олигосахаридными цепями, имеющий следующую последовательность: His7-Ala8-Glu9-Gly10-Thr11-Phe12-Thr13-Ser14-Asp15-Va16-Ser17-Ser18-Tyr19-Leu20-Glu21-Gly22-Gln23-Ala24-Ala25-Lys26-Glu27-Phe28-Ile29-Ala30-Trp31-Leu32-Val33-Lys34-Gly35-Arg36-Gly37 (SEQ ID NO:2, GLP-1) в которой:

(b1) 18Ser заменен дисиало-Cys с присоединенной олигосахаридной цепью (пример 1) (SEQ ID NO:103);

(b2) 22Gly заменен дисиало-Cys с присоединенной олигосахаридной цепью (пример 2) (SEQ ID NO:104);

(b3) 26Lys заменен дисиало-Cys с присоединенной олигосахаридной цепью (пример 3) (SEQ ID NO:105);

(b4) 36Arg заменен дисиало-Cys с присоединенной олигосахаридной цепью (пример 4) (SEQ ID NO:106);

(b5) 37Gly заменен дисиало-Cys с присоединенной олигосахаридной цепью (пример 5) (SEQ ID NO:107);

(b6) 37Gly заменен асиало-Asn с присоединенной олигосахаридной цепью (пример 6) (SEQ ID NO:108);

(b7) 19Tyr заменен асиало-Asn с присоединенной олигосахаридной цепью (пример 7) (SEQ ID NO:109);

(b8) 7His заменен дисиало-Cys с присоединенной олигосахаридной цепью (пример 8)(SEQ ID NO:110);

(b9) 8Ala заменен дисиало-Cys с присоединенной олигосахаридной цепью (пример 9)(SEQ ID NO:111);

(b10) 9Glu заменен дисиало-Cys с присоединенной олигосахаридной цепью (пример 10) (SEQ ID NO:112);

(b11) 10Gly заменен дисиало-Cys с присоединенной олигосахаридной цепью (пример 11) (SEQ ID NO:113);

(b12) 11Thr заменен дисиало-Cys с присоединенной олигосахаридной цепью (пример 12) (SEQ ID NO:114);

(b13) 12Phe заменен дисиало-Cys с присоединенной олигосахаридной цепью (пример 13) (SEQ ID NO:115);

(b14) 14Ser заменен дисиало-Cys с присоединенной олигосахаридной цепью (пример 14) (SEQ ID NO:116);

(b15) 16Val заменен дисиало-Cys с присоединенной олигосахаридной цепью (пример 15) (SEQ ID NO:117);

(b16) 20Leu заменен дисиало-Cys с присоединенной олигосахаридной цепью (пример 16) (SEQ ID NO:118);

(b17) 24Ala заменен дисиало-Cys с присоединенной олигосахаридной цепью (пример 17) (SEQ ID NO:119);

(b18) 25Ala заменен дисиало-Cys с присоединенной олигосахаридной цепью (пример 18) (SEQ ID NO:120);

(b19) 27Glu заменен дисиало-Cys с присоединенной олигосахаридной цепью (пример 19) (SEQ ID NO:121);

(b20) 28Phe заменен дисиало-Cys с присоединенной олигосахаридной цепью (пример 20) (SEQ ID NO:122);

(b21) 30Ala заменен дисиало-Cys с присоединенной олигосахаридной цепью (пример 21) (SEQ ID NO:123);

(b22) 32Leu заменен дисиало-Cys с присоединенной олигосахаридной цепью (пример 22) (SEQ ID NO:124);

(b23) 34Lys заменен дисиало-Cys с присоединенной олигосахаридной цепью (пример 23) (SEQ ID NO:125);

(b24) 22Gly заменен асиало-Cys с присоединенной олигосахаридной цепью (пример 24) (SEQ ID NO:126);

(b25) 26Lys заменен асиало-Cys с присоединенной олигосахаридной цепью (пример 25) (SEQ ID NO:127);

(b26) 30Ala заменен асиало-Cys с присоединенной олигосахаридной цепью (пример 26) (SEQID NO:128);

(b27) 34Lys заменен асиало-Cys с присоединенной олигосахаридной цепью (пример 27) (SEQID NO:129);

(b28) 36Arg заменен асиало-Cys с присоединенной олигосахаридной цепью (пример 28) (SEQ ID NO:130);

(b29) 22Gly заменен диGlucnAc-Cys с присоединенной олигосахаридной цепью (пример 29) (SEQ ID NO:131);

(b30) 30Ala заменен диGlucNAc-Cys с присоединенной олигосахаридной цепью (пример 30) (SEQ ID NO:132);

(b31) 34Lys заменен диGlucNAc-Cys с присоединенной олигосахаридной цепью (пример 31) (SEQ ID NO:133);

(b32) 22Gly заменен диманнозо-Cys с присоединенной олигосахаридной цепью (пример 32) (SEQ ID NO:134);

(b33) 30Ala заменен диманнозо-Cys с присоединенной олигосахаридной цепью (пример 33) (SEQ ID NO:135);

(b34) 34Lys заменен диманнозо-Cys с присоединенной олигосахаридной цепью (пример 34) (SEQ ID NO:136);

(b35) 12Phe заменен асиало-Asn с присоединенной олигосахаридной цепью (пример 35) (SEQ ID NO:137);

(b36) 18Ser заменен асиало-Asn с присоединенной олигосахаридной цепью (пример 36) (SEQ ID NO:138);

(b37) 22Gly заменен асиало-Asn с присоединенной олигосахаридной цепью (пример 37) (SEQ ID NO:139);

(b38) 26Lys заменен асиало-Asn с присоединенной олигосахаридной цепью (пример 38) (SEQ ID NO:140);

(b39) 27Glu заменен асиало-Asn с присоединенной олигосахаридной цепью (пример 39) (SEQ ID NO:141);

(b40) 28Phe заменен асиало-Asn с присоединенной олигосахаридной цепью (пример 40) (SEQ ID NO:142);

(b41) 30Ala заменен асиало-Asn с присоединенной олигосахаридной цепью (пример 41) (SEQ ID NO:143);

(b42) 36Arg заменен асиало-Asn с присоединенной олигосахаридной цепью (пример 42) (SEQ ID NO:144);

(b43) 18Ser заменен дисиало-Asn с присоединенной олигосахаридной цепью (пример 43) (SEQ ID NO:145);

(b44) 22Gly заменен дисиало-Asn с присоединенной олигосахаридной цепью (пример 44) (SEQ ID NO:146);

(b45) 30Ala заменен дисиало-Asn с присоединенной олигосахаридной цепью (пример 45) (SEQ ID NO:147);

(b46) 30Ala заменен дисиало-Asn с присоединенной олигосахаридной цепью (пример 46) (SEQ ID NO:148);

(b47) 36Arg заменен дисиало-Asn с присоединенной олигосахаридной цепью (пример 47) (SEQ ID NO:149);

(b48) 26Lys и 34Lys оба заменены дисиало-Cys с присоединенной олигосахаридной цепью (пример 48) (SEQ ID NO:150); и

(b49) 18Ser и 36Arg оба заменены дисиало-Cys с присоединенной олигосахаридной цепью (пример 49) (SEQ ID NO:151).

Пептид GLP-1 с присоединенной олигосахаридной цепью настоящего изобретения может быть получен путем включения стадии присоединения олигосахаридной цепи (стадия гликозилирования) в способ синтеза пептидов, известный специалистам в этой области техники. Для присоединения олигосахаридной цепи подходит способ с применением обратной реакции обычно в присутствии такого фермента как трансглутаминаза. Однако при применении этого способа сталкиваются с такими проблемами, как большое количество требующихся цепей олигосахаридов, которые необходимо добавить, сложная очистка после конечной стадии, ограниченные участки, по которым присоединяют олигосахаридную цепь, и ограниченные типы цепи олигосахаридов, которые могут быть присоединены. Следовательно, способ не имеет практического значения для широкомасштабного производства, такого как фармакологическое производство, хотя он может быть применен для синтеза небольших количеств, например, для исследовательских целей.

Способ простого получения пептида GLP-1 с присоединенной олигосахаридной цепью настоящего изобретения и стабильного получения пептида GLP-1 с присоединенными олигосахаридными цепями, имеющего однородную структуру олигосахаридной цепи, в особенности, представленный ниже в виде примеров способ получения пептид GLP-1 с присоединенной олигосахаридной цепью с применением Asn с присоединенной олигосахаридной цепью в качестве аминокислоты с присоединенной олигосахаридной цепью и с применением способа синтеза пептидов, известного в этой области техники, такого как твердофазный синтез или жидкофазный синтез (Способ А), и способ получения Пептид GLP-1а с присоединенной олигосахаридной цепью, который включает получение пептида, в котором любую из аминокислот GLP-1 заменяют Cys, в соответствии со способом синтеза пептидов, известных в этой области техники, и затем добавления олигосахаридной цепи к Cys с помощью химического синтеза (Способ В). Специалисты в этой области техники могут получать различные пептиды GLP-1 с присоединенными олигосахаридными цепями с отсылкой к этим способам получения. Пептид GLP-1 с присоединенными олигосахаридными цепями, полученный таким образом, и способы их получения очень полезны, в особенности, в области фармацевтического производства. Эти Способы А и В могут быть скомбинированы. Для синтеза в небольших количествах, например, для исследовательских целей, эти способы могут также быть скомбинированы с реакцией удлинения олигосахаридной цепи, катализируемой трансферазой. Для Способов А и В можно сослаться на описания в патентах WO 2004/005330 и WO 2005/010053, соответственно. Для цепей олигосахаридов, примененных в каждом способе, можно сослаться на патенты WO 03/008431, WO 2004/058984, WO 2004/058824, WO 2004/070046, WO 2007/011055 и т.п. Эти документы включены в настоящий документ путем отсылок.

Способ получения пептида GLP-1 с присоединенной олигосахаридной цепью (способ А)

Во-первых, (1) гидроксильную группу смолы, которая имеет гидроксильную группу, и карбоксильную группу аминокислоты, у которой азот аминогруппы защищен жирорастворимой защитной группой, подвергают реакции этерификации. Поскольку азот аминогруппы аминокислоты защищен жирорастворимой защитной группой, то гидроксильная группа смолы реагирует с карбоксильной группой аминокислоты, тогда как самоконденсация аминокислоты предотвращена.

Затем, (2) жирорастворимую защитную группу удаляют из полученного эфира и получают свободную аминогруппу,

(3) свободную аминогруппу амидируют карбоксильной группой желаемой аминокислоты, у которой азот аминогруппы защищен жирорастворимой защитной группой,

(4) жирорастворимую защитную группу удаляют для образования свободной аминогруппы, и

(5) стадии (3) и (4) повторяют по меньшей мере один раз и получают, таким образом, пептид, имеющий желаемое число желаемых аминокислот в связанном виде, имеющий смолу, прикрепленную к одному его концу, и свободную аминогруппу на другом его конце.

(6) Затем, свободную аминогруппу амидируют карбоксильной группой аспарагиновой части связанного с аспарагином олигосахарида (аспарагин с присоединенной олигосахаридной цепью), которая имеет азот аминогруппы, защищенный жирорастворимой защитной группой,

(7) жирорастворимую защитную группу удаляют для образования свободной аминогруппы,

(8) свободную аминогруппу амидируют карбоксильной группой желаемой аминокислоты, у которой азот аминогруппы защищен жирорастворимой защитной группой,

(9) стадии (7) и (8) повторяют по меньшей мере один раз, и

(10) жирорастворимую защитную группу удаляют для образования свободной аминогруппы и получают, таким образом, гликопептид, имеющий желаемое число желаемых аминокислот в виде присоединенных аминокислот и, имеющий смолу, прикрепленную к одному его концу, свободную аминогруппу на другом его конце и аспарагин с присоединенной олигосахаридной цепью в промежуточной позиции.

(11) Смолу отделяют кислотой, в результате чего может быть получен гликопептид, который имеет аспарагин с присоединенной олигосахаридной цепью в желаемой позиции его пептидной цепи.

Кроме того, гликопептид, имеющий по меньшей мере два аспарагина с присоединенной олигосахаридной цепью в желаемой позиции его пептидной цепи может быть получен соответствующим добавлением стадии (6) амидирования свободной аминогруппы и карбоксильной группы аспарагиновой части аспарагина с присоединенной олигосахаридной цепью, у которой азот аминогруппы защищен жирорастворимой защитной группой. В этот момент, применяя аспарагины с различными присоединенными олигосахаридными цепями можно получить гликопептид, имеющий по меньшей мере два типа аспарагинов с присоединенной олигосахаридной цепью в желаемой позиции его пептидной цепи.

Альтернативно, аспарагин с присоединенной олигосахаридной цепью может быть введен в концевую часть пептидной цепи.

Смола, имеющая гидроксильную группу, обычно может представлять собой смолу, имеющую гидроксильную группу, подходящую для твердофазного синтеза. Примеры применяемых смол представляют собой смолу Амино-PEGA (продукт фирмы «Merck»), смолу Wang (продукт фирмы «Merck»), смолу HMPA-PEGA (продукт фирмы «Merck») и т.п.

Все аминокислоты применяют как таковые. Примеры подходящих аминокислот представляют собой природные аминокислоты, такие как серии (Ser), аспарагин (Asn), валин (Val), лейцин (Leu), изолейцин (Ile), аланин (Ala), тирозин (Tyr), глицин (Gly), лизин (Lys), аргинин (Arg), гистидин (His), аспарагиновая кислота (Asp), глутаминовая кислота (Glu), глутамин (Gln), треонин (Thr), цистеин (Cys), метионин (Met), фенилаланин (Phe) триптофан (Trp) и пролин (Pro).

Примеры жирорастворимых защитных групп представляют собой 9-флуоренилметоксикарбонильную группу (Fmoc), трет-бутилоксикарбонильную группу (Boc), бензильную группу, аллильную группу, аллилоксикарбонильную группу, ацетильную группу и им подобные, которые представляют собой защитные группы карбонатного типа или амидного типа. Жирорастворимая защитная группа, например Fmoc-группа, может быть введена путем добавления 9-флуоренилметил-N-сукцинимидилкарбоната и гидрокарбоната натрия для реакции с намеченным соединением. Предпочтительно, реакцию проводят при температуре от 0 до 50 DEG С, предпочтительно, при комнатной температуре, в течение от примерно 1 до примерно 5 часов.

Вышеупомянутая аминокислота может быть защищена жирорастворимой защитной группой с помощью способа, описанного выше. Вышеупомянутая защищенная аминокислота может представлять собой коммерчески доступную аминокислоту. В качестве примеры можно привести Fmoc-Ser, Fmoc-Asn, Fmoc-Val, Fmoc-Leu, Fmoc-Ile, Fmoc-Ala, Fmoc-Tyr, Fmoc-Gly, Fmoc-Lys, Fmoc-Arg, Fmoc-His, Fmoc-Asp, Fmoc-Glu, Fmoc-Gln, Fmoc-Thr, Fmoc-Cys, Fmoc-Met, Fmoc-Phe, Fmoc-Trp и Fmoc-Pro.

Применяемые для этерификации катализаторы представляют собой дегидратирующие средства, участвующие в процессе конденсации, такие как 1-мезитиленсульфонил-3-нитро-1,2,4-триазол (MSNT), дициклогексилкарбодиимид (DCC) и диизопропилкарбодиимид (DIPCDI). Средство для конденсации с помощью дегидратации применяют в количестве, равном от 1 до 10% (по масс.), предпочтительно от 2 до 5% (по масс.), на основании 1% (по масс.) аминокислоты.

Реакцию этерификации проводят предпочтительно путем помещения смолы, например, в твердофазную колонку, промывания смолу растворителем и затем добавления раствора аминокислоты в растворителе к смоле. Примеры растворителей для промывания представляют собой диметилформамид (DMF), 2-пропанол, метиленхлорид и т.п. Примеры растворителей для растворения аминокислот представляют собой диметилсульфоксид (DMSO), DMF, метиленхлорид и т.п. Реакцию проводят при от 0 до 50 DEG С, предпочтительно, при комнатной температуре, в течение от примерно 10 до примерно 30 часов, предпочтительно, от примерно 15 минут до примерно 24 часов.

Предпочтительно, непрореагировавшую гидроксильную группу, оставшуюся к этому момент на твердой фазе, ацетилируют, например, с помощью ангидрида уксусной кислоты для того, чтобы закрыть ее.

Жирорастворимая защитная группа может быть удалена, например, с помощью обработки основанием. Примеры применяемых оснований представляют собой пиперидин, морфолин и т.п. Эту обработку проводят предпочтительно в присутствии растворителя. Примеры применяемых растворителей представляют собой DMSO, DMF, метанол и т.п.

Реакцию амидирования свободной аминогруппы с помощью карбоксильной группы желаемой аминокислоты, у которой азот аминогруппы защищен жирорастворимой группой, проводят, предпочтительно, в присутствии активатора и растворителя.

Примеры подходящих активаторов представляют собой дициклогексилкарбодиимид (DCC), 1-этил-3-(3-диметиламинопропил)карбодиимид/ гидрохлорид (WSC/HCl), дифенилфосфорилазид (DPPA), карбонилдиимидазол (CDI), диэтилцианофосфонат (DEPC), бензотриазол-1-илокси-триспирролидинофосфониум (DIPCI), бензотриазол-1-илокси-триспирролидинофосфониум гексафторфосфат (PyBOP), 1-гидроксибензотриазол (HOBt), гидроксисукцинимид (HOSu), диметиламинопиридин (DMAP), 1-гидрокси-7-азабензотриазол (HOAt), гидроксифталимид (HOPht), пентафторфенол (Pfp-OH), 2-(1Н-бензотриазол-1-ил)-1,1,3,3-тетрамстилурония гексафторфосфат (HBTU), O-(7-азабензотриазол-1-ил)-1,1,3,3-тетраметилурония гексафторфосфонат (HATU), O-бензотриазол-1-ил-1,1,3,3-тетраметилурония тетрафторборат (TBTU), 3,4-дигидро-3-гидро-ди-4-окса-1,2,3-бензотриазин (Dhbt).

Активатор применяют в количестве, равном от 1 до 20 эквивалентов, предпочтительно от 1 до 10 эквивалентов, более предпочтительно, 1-5 эквивалентов, на основе аминокислоты, у которой азот аминогруппы защищен жирорастворимой защитной группой.

Примеры подходящих растворителей представляют собой DMSO, DMF, метиленхлорид и т.п. Желательно проводить реакцию при температуре от 0 до 50 DEG С, предпочтительно, при комнатной температуре, в течение от примерно от 10 до примерно 30 часов, предпочтительно, примерно от 15 минут до примерно 24 часов. Жирорастворимая защитная группа может быть удалена тем же способом, который описан выше.

Пептидную цепь отделяют от смолы, предпочтительно, путем обработки кислотой. Примеры кислот, которые могут быть применены, представляют собой трифторуксусную кислоту (TFA), фтороводородную кислоту(НР) и т.п.

Гликопептид, имеющий по меньшей мере два аспарагина с присоединенной олигосахаридной цепью в желаемой позиции его пептидной цепи, может быть получен с помощью подходящей дополнительно проведенной стадии (6) амидирования свободной аминогруппы и карбоксильной группы аспарагиновой части аспарагина с присоединенной олигосахаридной цепью, у которой азот аминогруппы защищен жирорастворимой защитной группой, и (7) удаления жирорастворимой защитной группы от свободной аминогруппы.

Дополнительно, гликопептид, имеющий по меньшей мере один аспарагин с присоединенной олигосахаридной цепью в желаемой позиции его пептидной цепи может быть получен путем проведения в качестве заключительной стадии (6) амидирования свободной аминогруппы и карбоксильной группы аспарагиновой части аспарагина с присоединенной олигосахаридной цепью, у которой азот аминогруппы защищен жирорастворимой защитной группой, и (7) удаления жирорастворимой защитной группу от свободной аминогруппы.

Дополнительно, гликопептид, имеющий аспарагин с присоединенной олигосахаридной цепью в концевой позиции, может быть получен путем проведения стадии (1) этерификации гидроксильной группы смолы, которая имеет гидроксильную группу, и карбоксильной группы аминокислоты, у которой азот аминогруппы защищен жирорастворимой защитной группой, вместо стадии (6) или в дополнении к стадии (6).

Таким способом может быть получен пептид GLP-1 с присоединенной олигосахаридной цепью, в котором произвели замену на Asn с присоединенной олигосахаридной цепью.

Способ получения пептида GLP-1 с присоединенной олигосахаридной цепью (Способ В)

Во-первых, пептид, содержащий Cys, получают с помощью такого способа, как твердофазный синтез, жидкофазный синтез, синтез в клетках и выделение и экстракция таких пептидов, существующих в природе.

Затем, проводят реакцию галогенацетамидного производного олигосахаридной цепи комплексного типа с полученным таким образом пептидом, который содержит Cys. Реакцию можно проводить обычно при от 0 до 80°С, предпочтительно, от 10 до 60°С, более предпочтительно, от 15 до 35°С. Продолжительность реакции обычно равна предпочтительно от примерно 30 минут до примерно 5 часов. После завершения реакции, продукт реакции может быть очищен соответствующим образом с помощью способа, известного в этой области техники [например, с помощью колоночной высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ)].

Галогенацетамидное производное олигосахаридной цепи комплексного типа представляет собой, например, соединение, в котором гидроксильная группа, связанная с углеродом в позиции 1 олигосахаридной цепи комплексного типа, соединенной с аспарагином, заменена -NH-(CO)-(CH₂)_a-CH₂X, в котором Х представляет собой атом галогена, и a представляет собой целое число, предпочтительно целое число, равное от 0 до 4, но, не ограничиваясь этими числами, до тех пор пока представляющие интерес функции линкера не будут заингибированы.

Обычно проводят реакцию галогенацетамидного производного олигосахаридной цепи комплексного типа с пептидом, содержащим Cys, в фосфатном буфере при комнатной температуре. После завершения реакции, пептид GLP-1 с присоединенной олигосахаридной цепью, в котором была произведена замена на Cys с присоединенной олигосахаридной цепью, может быть получен путем очистки с помощью ВЭЖХ.

Пептид GLP-1 с присоединенной олигосахаридной цепью настоящего изобретения имеет активность GLP-1.

Термин «активность GLP-1», примененный в этом документе, имеет отношение к некоторым или ко всем биологическим активностям, известным в этой области техники, принадлежащим GLP-1. Известно, что GLP-1 дополнительно влияет, например, на контролирование уровня сахара в крови, на секрецию инсулина, индукцию сАМР-зависимого синтеза, защиту островков поджелудочной железы (подавление апоптоза) и рост панкреатических островков, в результате воздействия на панкреатические островки, а также подавление аппетита, подавление моторики желудочно-кишечного тракта, в качестве внепанкреатических эффектов усиливает секрецию кальцитонина и обладает кардиозащитным действием при ишемии. Таким образом, активность GLP-1 имеет отношение ко всем или к некоторым из биологических активностей, связанных с этими эффектами, и эти активности могут быть измерены соответственно с применением подходов, известных специалистам в этой области техники.

Активности GLP-1, например, активность в отношении контролирования уровня сахара в крови может быть измерена путем определения влияния на снижение уровня сахара в крови у мышей с модельным диабетом (db/db мышей) или путем определения влияния на подавление роста уровня сахара в крови в пероральном тесте на толерантность к глюкозе (OGTT). Фраза «контролирование уровня сахара в крови», примененная в этом документе, охватывает как понятие подавления роста уровня сахара в крови, так и снижение уровня сахара в крови. В частности, под влиянием на контролирование уровня сахара в крови у db/db мышей в этом документе понимают «влияние на снижение уровня сахара в крови», а под влиянием на контролирование уровня сахара в крови в OGTT в этом документе понимают «влияние на подавления роста уровня сахара в крови».

Активность в контролировании уровня сахара в крови в OGTT может быть определена с помощью измерения подавление роста уровня сахара в крови у мышей, которых принуждают потреблять сахар с питьем. Если применяют, например, такой подход как в приведенном ниже тестовом примере 7, то тестируемое соединение изначально вводят мышам, голодавшим в течение ночи. Через 30 минут после введения, мышам перорально вводят раствор глюкозы. Вследствие введения глюкозы уровень сахара в крови мышей увеличивается, достигает максимума примерно через 30 минут после введения, и постепенно снижается. Уровень сахара в крови измеряют через 30 минут после введения глюкозы и сравнивают с уровнями, полученными после введения GLP-1, определяя, таким образом, влияние на контролирование уровня сахара в крови под действием пептида GLP-1 с присоединенной олигосахаридной цепью. Если уровень сахара в крови, измеренный через 30 минут после этого, сравнивают с уровнями, полученными после введения GLP-1, то пептид GLP-1 с присоединенной олигосахаридной цепью настоящего изобретения проявляет предпочтительно 80% или менее, более предпочтительно 60% или менее, еще более предпочтительно 40% или менее, в особенности, предпочтительно 20% или менее от контрольного уровня сахара в крови. Эффективность в контролировании уровня сахара в крови с помощью пептида GLP-1 с присоединенной олигосахаридной цепью настоящего изобретения может быть определена путем сравнения доз, подтвержденных в OGTT, которые производят примерно одинаковые эффекты на подавление роста уровня сахара в крови. Если, например, 10 доз GLP-1 и 1 доза пептида GLP-1 с присоединенной олигосахаридной цепью производят одинаковые эффекты в контролировании уровня сахара в крови, то активность в контролировании уровня сахара в крови с помощью пептида GLP-1 с присоединенной олигосахаридной цепью в 10 раз больше активности GLP-1. Пептид GLP-1 с присоединенной олигосахаридной цепью настоящего изобретения имеет активность в контролировании уровня сахара в крови предпочтительно по меньшей мере в 5 раз больше, более предпочтительно по меньшей мере в 10 раз больше, еще более предпочтительно по меньшей мере в 20 раз больше, в особенности, предпочтительно по меньшей мере в 50 раз больше активности GLP-1.

Активность в контролировании уровня сахара в крови у db/db мышей может быть определена с помощью измерения уровня сахара в крови мышей с модельным диабетом после введения тестируемого соединения. Если применяют, например, подход, описанный в приведенном ниже тестовом примере 8, то уровень сахара в крови после введения тестируемого соединения измеряют во времени. Влияние на снижение уровня сахара в крови может быть подтверждено, если уровень сахара в крови, измеренный, например, через 120 минут после введения, был ниже, чем тот же параметр, измеренный в момент введения. Альтернативно, продолжительность влияния на снижение уровня сахара в крови может быть определена с помощью измерения уровня сахара в крови, например, через 300 минут после введения. Если уровень сахара в крови, измеренный через 120 минут после введения, сравнивают с уровнем, полученным путем введение GLP-1 с применением подхода, примененного в тестовом примере 8, пептид GLP-1 с присоединенной олигосахаридной цепью настоящего изобретения проявляет предпочтительно 80% или менее, более предпочтительно 70% или менее, в особенности, предпочтительно 60% или менее от контроля уровня сахара в крови. Альтернативно, если уровень сахара в крови, измеренный через 120 минут после введения, сравнивают с уровнем, измеренным в момент введения, то пептид GLP-1 с присоединенной олигосахаридной цепью настоящего изобретения проявляет предпочтительно 70% или менее, более предпочтительно 60% или менее, в особенности, предпочтительно 50% или менее (например, 45% или менее) от контроля уровня сахара в крови. Если уровень сахара в крови, измеренный через 300 минут, после введения сравнивают с уровнем, измеренным в момент введения GLP-1, то пептид GLP-1 с присоединенной олигосахаридной цепью настоящего изобретения демонстрирует предпочтительно 70% или менее, более предпочтительно 50% или менее от уровня сахара в крови в контроле. Если уровень сахара в крови, измеренный через 300 минут после введения, сравнивают с уровнем, измеренным в момент введения, то пептид GLP-1 с присоединенной олигосахаридной цепью настоящего изобретения проявляет предпочтительно 70% или менее, более предпочтительно 50% или менее от уровня сахара в крови в контроле.

Даже если активность в контролировании уровня сахара в крови с помощью пептида GLP-1 с присоединенной олигосахаридной цепью настоящего изобретения ниже по сравнению с GLP-1, эта низкая активность может быть скомпенсирована путем увеличения стабильности в крови.

Из всех активностей GLP-1, например, активность в отношении секреции инсулина может быть измерена с помощью анализа способности синтезировать сАМР in vitro. GLP-1 увеличивает внутриклеточную концентрацию сАМР путем связывания со своим рецептором и стимулирует секрецию инсулина. Так, например, пептидом GLP-1 с присоединенной олигосахаридной цепью стимулируют мышиные СНО-К1 клетки, экспрессирующие рецептор GLP-1, и затем измеряют количество сАМР, синтезированного в клетках. Величину его ЕС50 можно сравнить с тем же параметром, полученным при использовании GLP-1, и таким образом измеряют активность пептида GLP-1 с присоединенной олигосахаридной цепью в отношении секреции инсулина.

Пептид GLP-1 с присоединенной олигосахаридной цепью настоящего изобретения имеет более высокую стабильность в крови по сравнению с GLP-1. Стабильность в крови может быть измерена с помощью подхода, известного специалистам в этой области техники, и может быть определена с помощью измерения, например, стабильности в плазме или устойчивости к DPP-IV (дипептидилпептидазе IV), и путем определения времени полужизни, AUC (площади под кривой зависимости концентрации в крови от времени), и т.п., в качестве критерия. Увеличенный почечный клиренс также вносит вклад в увеличение стабильность в крови.

Стабильность в плазме может быть определена, например, с помощью подхода, описанного в приведенном ниже тестовом примере 1. Пептид GLP-1 с присоединенной олигосахаридной цепью настоящего изобретения имеет более высокую стабильность в плазме по сравнению с GLP-1.

Устойчивость к DPP-IV может быть определена путем измерения времени полужизни в растворе DPP-IV, как показано, например, в приведенном ниже тестовом примере 4. Пептид GLP-1 с присоединенной олигосахаридной цепью настоящего изобретения имеет более высокую устойчивость к DPP-IV по сравнению с GLP-1 и имеет время полужизни по меньшей мере в 1,2 раза больше (например, по меньшей мере в 2 раза больше), предпочтительно по меньшей мере в 5 раз больше, более предпочтительно по меньшей мере в 10 раз больше, в особенности, предпочтительно по меньшей мере в 20 раз больше по сравнению с GLP-1, если устойчивость к DPP-IV измеряют, применяя, например, подход, примененный в приведенном ниже тестовом примере 4.

Пептид GLP-1 с присоединенной олигосахаридной цепью настоящего изобретения также имеет время полужизни в крови, равное предпочтительно по меньшей мере 1 часу, более предпочтительно по меньшей мере 3, 5, 7, 10, 15 и 20 часам, еще более предпочтительно по меньшей мере 24 часам.

Затем будет описана фармацевтическая композиция, включающая в качестве активного ингредиента пептид GLP-1 с присоединенной олигосахаридной цепью настоящего изобретения.

Фармацевтическая композиция, включающая пептид GLP-1 с присоединенной олигосахаридной цепью настоящего изобретения в качестве активного ингредиента, эффективна для лечения или предупреждения заболеваний, связанных с GLP-1. Известно, что GLP-1 обладает различными эффектами, такими как описаны выше, и эти эффекты связаны с различными заболеваниями. Было обнаружено, например, что GLP-1 стимулирует высвобождение инсулина и таким путем вызывает поглощение глюкозы клетками и снижение уровня сахара в крови. Было также обнаружено, что GLP-1 подавляет моторику желудка и/или кишечника, опорожнение желудка и/или кишечника, и снижает аппетит. Таким образом, заболевания, связанные с GLP-1, охватывают, например, инсулиннезависимый сахарный диабет (NIDDM), инсулинозависимый сахарный диабет, инсульт (смотри WO 00/16797, заявитель Efendic), инфаркт миокарда (смотри WO 98/08531, заявитель Efendic), ожирение (смотри WO 98/19698, заявитель Efendic), функциональную диспепсию, синдром раздраженной кишки (смотри WO 99/64060, заявитель Efendic) и трансплантацию панкреатических островков. Фармацевтическая композиция, включающая пептид GLP-1 с присоединенной олигосахаридной цепью настоящего изобретения в качестве активного ингредиента, особенно эффективна для лечения или предупреждение диабета, еще более особенно, для предупреждения диабета 1-го типа и лечения диабета 2-го типа.

Фармацевтическая композиция может быть составлена в форме обычной фармацевтической композиция, с применением разбавителей или эксципиентов, таких как обычно применяемые наполнители, разбавители, связующие средства, увлажняющие средства, разрыхлители, поверхностно-активные вещества и вещества, способствующие скольжению.

Примеры таких фармацевтических композиций включают таблетки, пилюли, порошки, жидкие составы, суспензии, эмульсии, гранулы, капсулы, суппозитории и инъекции.

Количество пептида GLP-1 с присоединенной олигосахаридной цепью настоящего изобретения, которое содержится в фармацевтической композиции, особенно не ограничено и может быть выбрано соответствующим образом из широкого диапазона. Пептид GLP-1 с присоединенной олигосахаридной цепью настоящего изобретения обычно содержится в фармацевтической композиции в количестве, равном предпочтительно от 1 до 70% (по масс.).

Фармацевтическая композиция, включающая пептид GLP-1 с присоединенной олигосахаридной цепью настоящего изобретения в качестве активного ингредиента, может дополнительно содержать дополнительный активный ингредиент или также может быть применена в комбинации с фармацевтической композицией, содержащей дополнительный активный ингредиент. Кроме того, фармацевтическая композиция, включающая пептид GLP-1 с присоединенной олигосахаридной цепью настоящего изобретения в качестве активного ингредиента, может дополнительно включать по меньшей мере один иной пептид GLP-1 с присоединенной олигосахаридной цепью настоящего изобретения в качестве активного ингредиента или также может быть применена в комбинации с фармацевтической композицией, включающей, по меньшей мере, один иной пептид GLP-1 с присоединенной олигосахаридной цепью настоящего изобретения в качестве активного ингредиента.

Способ введения фармацевтической композиции в соответствии с настоящим изобретением особо не ограничен. Фармацевтическую композицию в соответствии с настоящим изобретением вводят с помощью способа, подходящего для различных лекарственных форм, возраста и пола пациента, тяжести заболевания и других условий. Примеры способов введения таблеток, пилюль, жидких составов, суспензии, эмульсий, гранул и капсул включают пероральное введение. Инъекции могут быть введены внутривенно, внутримышечно, внутрикожно, подкожно или внутрибрюшинно, как по отдельности, так и в виде смеси с обычной инфузией глюкозы или аминокислоты. Суппозитории вводят ректально.

Доза фармацевтической композиции может быть выбрана соответствующим образом в зависимости от применения, возраста и пола пациента, тяжести заболевания и других условий. Фармацевтическую композицию обычно вводят в дозе, равной от 0,1 до 900 нмоль, предпочтительно от 1 до 90 нмоль, в терминах пептида GLP-1 с присоединенной олигосахаридной цепью настоящего изобретения на кг массы тела. Пептид GLP-1 с присоединенной олигосахаридной цепью настоящего изобретения имеет значительно более высокую стабильность в крови по сравнению с GLP-1. В одном из аспектов, пептид GLP-1 с присоединенной олигосахаридной цепью настоящего изобретения имеет значительно более высокую активность в контролировании уровня сахара в крови по сравнению с GLP-1. Следовательно, его доза может быть с успехом уменьшена.

Число доз фармацевтической композиции может быть выбрано соответствующим образом в зависимости от применения, возраста и пола пациента, тяжести заболевания и других условий и равно, например, 3 дозы/день, 2 дозы/день или 1 доза/день. Альтернативно, можно вводить фармацевтическую композицию с меньшей частотой (например, 1 доза/неделю или 1 доза/месяц) в зависимости от се стабильности в крови. Число доз фармацевтической композиции предпочтительно представляет собой 1 доза или менее/день. Пептид GLP-1 с присоединенной олигосахаридной цепью настоящего изобретения обладает значительно более высокой стабильностью в крови по сравнению с GLP-1. Следовательно, число доз можно с успехом уменьшить.

Олигосахаридная цепь, присоединенная к пептиду GLP-1 с присоединенной олигосахаридной цепью настоящего изобретения, легко деградирует в системе метаболизма in vivo. В одном из аспектов настоящего изобретения олигосахаридная цепь имеет такую структуру, которая связана в форме гликопептида (или гликопротеина) in vivo. Таким образом, пептид GLP-1 с присоединенной олигосахаридной цепью настоящего изобретения и фармацевтическая композиция, включающая этот пептид в качестве активного ингредиента, не проявляют ни побочных эффектов, ни антигенности, даже при введении живым организмам. Следовательно, они преимущественно не вызывают ни аллергических реакций, ни потери эффективности, связанной с образованием антител.

Кроме того, пептид GLP-1 с присоединенной олигосахаридной цепью настоящего изобретения может быть легко получен в стабильной форме и в больших количествах и также очень полезен с точки зрения обеспечения высококачественного лекарственного средства, имеющего стабильное качество.

Настоящее изобретение также обеспечивает способ лечения или предупреждения заболевания, связанного с GLP-1, который включает введение эффективного количества пептида GLP-1 с присоединенной олигосахаридной цепью настоящего изобретения.

ПРИМЕРЫ

Далее в этом документе, настоящее изобретение будет описано конкретно с отсылкой к примерам. Однако настоящее изобретение не предназначено быть ограничено ими никоим образом. На фиг.7-22, например, «22Cys-дисиало-GLP-1», который представляет собой пептид GLP-1 с присоединенной олигосахаридной цепью, в котором аминокислота в позиции 22 GLP-1 заменена дисиало-Cys с присоединенной олигосахаридной цепью, обозначен как «22Cys-дисиало-GLP-1», «С22» или «С22-дисиало-». То же самое применимо к другим цепям олигосахаридов и сайтам аминокислоты.

Пример 1

Синтез пептида GLP-1а с присоединенной олигосахаридной цепью 18Cys-дисиало

Колонку для твердофазного синтеза заполняют смолой Амино-PEGA (100 мкмоль) (продукт фирмы «Merck»), тщательно промывают дихлорметаном (DCM) и DMF и дают смоле полностью набухнуть в DMF. 4-гидроксиметил-3-метоксифеноксимасляную кислоту (НМРВ) (0,25 ммоль), TBTU (0,25 ммоль) и N-этилморфолина (0,25 ммоль) растворяют в DMF (2 мл), загружают в колонку и перемешивают при комнатной температуре в течение 4 часов. Смолу тщательно промывают DMF и DCM и получают HMPB-PEG смолу, которую применяют в качестве твердой фазы для твердофазного синтеза.

Fmoc-Gly (0,50 ммоль), MSNT (0,50 ммоль) и N-метилимидазол (0.375 ммоль) растворяют в DCM (2 мл), загружают в колонку для твердофазного синтеза и перемешивают при 25°С в течение 3-х часов.

После перемешивания смолу промывают DCM и DMF. Fmoc-группу удаляют с помощью 20%-ного раствора пиперидина/DMF (2 мл) в течение 15 минут. После промывания DMF, аминокислоты последовательно конденсируют в соответствии с приведенным ниже способом удлинения пептидной цепи.

Аминокислоту, имеющую аминогруппу, защищенную Fmoc-группой, растворяют в N-метилпирролидоне (NMP) (1 мл). После добавления 0,45 М HCTU·HOBT/NMP (0,4 ммоль), полученную смесь загружают в колонку для твердофазного синтеза. Потом, 0,9 М DIPEA/NMP (0.8 ммоль) добавляют к колонке для твердофазного синтеза. После перемешивания при комнатной температуре в течение 20 минут, смолу промывают DCM и DMF, и Fmoc-группу удаляют с помощью 20%-ного раствора пиперидина/DMF (2 мл) в течение 15 минут. Эту операцию проводят повторно, применяя аминокислоту, защищенную Fmoc-группой (0,5 ммоль) для последовательной конденсации аминокислот.

Fmoc-Gly, Fmoc-Arg(Pbf), Fmoc-Gly, Fmoc-Lys(Boc), Fmoc-Val, Fmoc-Leu, Fmoc-Trp(Boc), Fmoc-Ala, Fmoc-Ile, Fmoc-Phe, Fmoc-Glu(OtBu), Fmoc-Lys(Boc), Fmoc-Ala, Fmoc-Ala, Fmoc-Gln(Trt), Fmoc-Gly, Fmoc-Glu(OtBu), Fmoc-Leu, Fmoc-Tyr(tBu), Fmoc-Cys(Trt)-OH, Fmoc-Ser(tBu), Fmoc-Val, Fmoc-Asp(OtBu), Fmoc-Ser(tBu), Fmoc-Thr(tBu), Fmoc-Phe, Fmoc-Thr(tBu), Fmoc-Gly, Fmoc-Glu(OtBu), Fmoc-Ala и Fmoc-His(Trt) применяют, в качестве аминокислот, защищенных Fmoc-группой, для получения на смоле, которая представляет собой твердую фазу, пептида, состоящего из 31-го аминокислотного остатка, следующего вида Gly-Arg(Pbf)-Gly-Lys(Boc)-Val-Leu-Trp(Boc)-Ala-Ile-Phe-Glu(OtBu)-Lys(Boc)-Ala-Ala-Gln(Trt)-Gly-Glu(OtBu)-Leu-Tyr(tBu)-Cys(Trt)-Ser(tBu)-Val-Asp(OtBu)-Ser(tBu)-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Gly-Glu(OtBu)-Ala-His(Trt) (SEQ ID NO:30). В соответствии с принципом Fmoc-метода, описание последовательности начинают с С-конца и ведут в направлении 37→7.

После промывания DCM и DMF, эквивалент смолы, равный 5 мкмоль пептида, состоящего из 31-го аминокислотного остатка, переносят в пробирку Eppendorf.

Полученную смолу с образовавшимся на ней пептидом частично переносят на колонку для твердофазного синтеза. Добавляют смесь трифторуксусная кислота: вода: TIPS (=95:2,5:2,5) так, чтобы смола была полностью погружена в жидкость, и перемешивают при комнатной температуре в течение 3-х часов. Смолу удаляют фильтрованием, и реакционный раствор концентрируют при пониженном давлении. Полученный остаток очищают с помощью ВЭЖХ [колонка: SHISEIDO UG-120 (C18 5 мкм), ϕ 20×250 мм, градиент: раствор А: 0,1% TFA вода, раствор В: 0,09% TFA/10% вода/90% AN 8,0 мл/мин; 35→60%В, 20 мин, линейный градиент] и получают пептид, в котором 18Ser GLP-1 замещен Cys.

Бромацетамидил-дисиало-олигосахарид (а) (продукт компании OTSUKA Chemical Co., Ltd.) (3 мг)

[Формула 5]

и пептидную цепь, синтезированную выше, (1 мг) растворяют в 100 мМ фосфатном буфере (рН 7,5, 170 мкл) и оставляют для протекания реакции при 37°С в течение 4 часов. После того как исходные вещества будут полностью израсходованы и это будет подтверждено с помощью ВЭЖХ, реакционный раствор непосредственно подвергают очистке с помощью ВЭЖХ [колонка: SHISEIDO UG-120 (C18, 5 мкм), ϕ 4,6×250 мм, градиент: раствор А: 0,1% TFA вода, раствор В: 0,09% TFA/10% вода/90% AN 0,7 мл/мин; 35→60%В, 20 мин, линейный градиент] и получают 1 мг пептида GLP-1 с присоединенной олигосахаридной цепью (1), в котором 18Ser GLP-1 замещен Cys с присоединенной олигосахаридной цепью (18Cys GLP-1-дисиало-).

Примеры 2-5

Пептид GLP-1 с присоединенной олигосахаридной цепью (2), в котором 22Gly GLP-1 замещен Cys с присоединенной олигосахаридной цепью (22Cys GLP-1-дисиало-), пептид GLP-1 с присоединенной олигосахаридной цепью (3), в котором 26Lys GLP-1 замещен Cys с присоединенной олигосахаридной цепью (26Cys GLP-1-дисиало-), пептид GLP-1 с присоединенной олигосахаридной цепью (4), в котором 36Arg GLP-1 замещен Cys с присоединенной олигосахаридной цепью (36Cys GLP-1-дисиало-) и пептид GLP-1 с присоединенной олигосахаридной цепью (5), в котором Cys с присоединенной олигосахаридной цепью был дополнительно добавлен к 37Gly GLP-1 (38Cys GLP-1-дисиало-), были получены таким же способом, как описан в примере 1, за исключением того, что порядок, в котором аминокислоты конденсируют, был изменен. Результаты приведены в таблице 5.

Сравнительный пример 1

Колонку для твердофазного синтеза заполняют смолой Амино-PEGA (100 мкмоль), тщательно промывают с помощью DCM и DMF, и дают полностью набухнуть в DMF. 4-гидроксиметил-3-мстоксифеноксимасляную кислоту (НМРВ) (0,25 ммоль), TBTU (0,25 ммоль) и N-этилморфолин (0,25 ммоль) растворяют в DMF (2 мл), загружают в колонку и перемешивают при комнатной температуре в течение 4 часов. Смолу тщательно промывают с помощью DMF и DCM и получают смолу HMPB-PEG, которую применяют в качестве твердой фазы для твердофазного синтеза.

Fmoc-Gly (0,50 ммоль), MSNT (0,50 ммоль) и N-метилимидазол (0,375 ммоль) растворяют в DCM (2 мл), загружают в колонку для твердофазного синтеза и перемешивают при 25°С в течение 3-х часов.

После перемешивания смолу промывают с помощью DCM и DMF. Fmoc-группу удаляют с помощью 20%-ного раствора пиперидин/DMF (2 мл) в течение 15 минут. После промывания с помощью DMF, аминокислоты последовательно конденсируют в соответствии с приведенным ниже способом удлинения пептидной цепи.

Аминокислоту, имеющую аминогруппу, защищенную Fmoc-группой, растворяют в NMP (1 мл). После добавления 0,45 М HCTU-HOBT/NMP (0,4 ммоль), полученную смесь загружают в колонку для твердофазного синтеза. Потом, к колонке для твердофазного синтеза добавляют 0,9 М DIPEA/NMP (0,8 ммоль). После перемешивания смеси при комнатной температуре в течение 20 минут, смолу промывают с помощью DCM и DMF, и Fmoc-группу удаляют с помощью 20%-ного раствора пиперидин/DMF (2 мл) в течение 15 минут. Эту операцию проводят повторно, применяя аминокислоту, защищенную Fmoc-группой (0,5 ммоль) для последовательной конденсации аминокислот.

Fmoc-Gly, Fmoc-Arg (Pbf), Fmoc-Gly, Fmoc-Lys (Boc), Fmoc-Val, Fmoc-Leu, Fmoc-Trp (Boc), Fmoc-Ala, Fmoc-Ile, Fmoc-Phe, Fmoc-Glu (OtBu), Fmoc-Lys (Boc), Fmoc-Ala, Fmoc-Ala, Fmoc-Gln (Trt), Fmoc-Gly, Fmoc-Glu (OtBu), Fmoc-Leu, Fmoc-Tyr (tBu), Fmoc-Ser (tBu), Fmoc-Ser (tBu), Fmoc-Val, Fmoc-Asp (OtBu), Fmoc-Ser (tBu), Fmoc-Thr (tBu), Fmoc-Phe, Fmoc-Thr (tBu), Fmoc-Gly, Fmoc-Glu (OtBu), Fmoc-Ala и Fmoc-His (Trt) применяют, в качестве аминокислот, защищенных Fmoc-группой, для получения на смоле, которая представляет собой твердую фазу, пептида, состоящего из 31-го аминокислотного остатка, следующего вида Gly-Arg(Pbf)-Gly-Lys(Boc)-Val-Leu-Trp(Boc)-Ala-Ile-Phe-Glu(OtBu)-Lys(Boc)-Ala-Ala-Gln(Trt)-Gly-Glu(OtBu)-Leu-Tyr(tBu)-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Val-Asp(OtBu)-Ser(tBu)-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Gly-Glu(OtBu)-Ala-His(Trt) (SEQ ID NO: 31).

После промывания с помощью DCM и DMF, эквивалент смолы, равный 5 мкмоль пептида, состоящего из 31 -го аминокислотного остатка, переносят в пробирку Eppendorf.

Полученную смолу с образовавшимся на ней пептидом частично переносят на колонку для твердофазного синтеза. Смесь трифторуксусная кислота: вода: TIPS (=95:2,5:2,5) добавляют так, чтобы смола была полностью погружена в жидкость, и перемешивают при комнатной температуре в течение 3-х часов. Смолу удаляют фильтрованием, и реакционный раствор концентрируют при пониженном давлении. Полученный остаток очищают с помощью ВЭЖХ (колонка Cadenza: С18 100×10 мм, система растворителей А: 0,1% водный TF раствор. В: 0,1% TFA ацетонитрил: вода=90:10, градиент А:В=95:5→5:95, 15 мин, скорость элюции: 3,0 мл/мин) и получают GLP-1. Результаты приведены в таблице 5.

[Таблица 5]
		Масса, определенная методом MALDI-TOF (Bluker Daltonics, AutoFLEX)
Пример 1	18Cys GLP-1-дисиало	Рассчитанная для C237H367N47O108S [M+H] 5631,47 найденная 5632,0
Пример 2	22Cys GLP-1-дисиало	Рассчитанная для C238H369N47O109S [M+H] 5661,44 найденная 5662,1
Пример 3	26Cys GLP-1-дисиало	Рассчитанная для C234H360N46O109S [M+H] 5590,38 найденная 5591,7
Пример 4	36Cys GLP-1-дисиало	Рассчитанная для C234H360N44O109S [M+H] 5562,37 найденная 5562,9
Пример 5	38Cys GLP-1-дисиало	Рассчитанная для C240H347N43O110S [M+H] 5718,47 найденная 5719,1
Сравнительный пример 1	GLP-1

Пример 6

Синтез пептида GLP-1 с присоединенной олигосахаридной цепью 38Asn-асиало

Колонку для твердофазного синтеза заполняют смолой Амино-РЕОА (100 мкмоль), которую тщательно промывают с помощью DCM и DMF, и дают ей полностью набухнуть в DMF. 4-гидроксиметил-3-метоксифеноксимасляную кислоту (НМРВ) (0,25 ммоль), TBTU (0,25 ммоль) и N-этилморфолин (0,25 ммоль) растворяют в DMF (2 мл), загружают в колонку и перемешивают при комнатной температуре в течение 4 часов. Смолу тщательно промывают с помощью DMF и DCM и получают смолу HMPB-PEG, которую применяют в качестве твердой фазы для твердофазного синтеза.

Fmoc-Gly (0,50 ммоль), MSNT (0,50 ммоль) и N-метилимидазол (0,375 ммоль) растворяют в DCM (2 мл), загружают в колонку для твердофазного синтеза и перемешивают при 25°С в течение 3-х часов.

После перемешивания, смолу промывают с помощью DCM и DMF. Fmoc-группу удаляют с помощью 20%-ного раствора пиперидина/DMF (2 мл) в течение 15 минут. После промывания с помощью DMF, аминокислоты последовательно конденсируют в соответствии с приведенным ниже способом удлинения пептидной цепи.

Аминокислоту, имеющую аминогруппу, защищенную Fmoc-группой,, растворяют в NMP (1 мл). После добавления 0,45 М HCTU-HOBT/NMP (0,4 ммоль), полученную смесь загружают в колонку для твердофазного синтеза. Потом, к колонке для твердофазного синтеза добавляют 0,9 М DIPEA/NMP (0,8 ммоль). После перемешивания смеси при комнатной температуре в течение 20 минут смолу промывают с помощью DCM и DMF, и Fmoc-группу удаляют с помощью 20%-ного раствора пиперидина/DMF (2 мл) в течение 15 минут. Эту операцию проводят повторно, применяя аминокислоту, защищенную Fmoc-группой (0,5 ммоль) для последовательной конденсации аминокислот.

(Boc-His(Trt)-OH применяют для конечной аминокислоты и применяют для конденсации таким же образом как в Fmoc-His(Trt)-OH.)

Fmoc-Gly, Fmoc-Arg (Pbf), Fmoc-Gly, Fmoc-Lys (Boc), Fmoc-Val, Fmoc-Leu, Fmoc-Trp (Boc), Fmoc-Ala, Fmoc-Ile, Fmoc-Phe, Fmoc-Glu (OtBu), Fmoc-Lys (Boc), Fmoc-Ala, Fmoc-Ala, Fmoc-Gln (Trt), Fmoc-Gly, Fmoc-Glu (OtBu), Fmoc-Leu, Fmoc-Tyr (tBu), Fmoc-Ser (tBu), Fmoc-Ser (tBu), Fmoc-Val, Fmoc-Asp (OtBu), Fmoc-Ser (tBu), Fmoc-Thr (tBu), Fmoc-Phe, Fmoc-Thr (tBu), Fmoc-Gly, Fmoc-Glu (OtBu), Fmoc-Ala и Fmoc-His (Trt) применяют, в качестве аминокислот, защищенных Fmoc-группой, и Boc-His(Trt)-OH применяют в качестве аминокислоты, защищенной Вос-группой, для получения на смоле, которая представляет собой твердую фазу, пептида, состоящего из 31-го аминокислотного остатка, следующего вида Gly-Arg(Pbf)-Gly-Lys(Boc)-Val-Leu-Trp(Boc)-Ala-Ile-Phe-Glu(OtBu)-Lys(Boc)-Ala-Ala-Gln(Trt)-Gly-Glu(OtBu)-Leu-Tyr(tBu)-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Val-Asp(OtBu)-Ser(tBu)-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Gly-Glu(OtBu)-Ala-His(Trt) (SEQ ID NO: 32).

После промывания с помощью DCM и DMF, смесь растворов трифторэтанола и уксусной кислоты (1:1) добавляют так, чтобы смола была полностью погружена в жидкость и перемешивают при комнатной температуре в течение 18 часов. Смолу удаляют фильтрованием, и реакционный раствор концентрируют при пониженном давлении. Полученный остаток концентрируют для получения защищенного пептида, который имеет следующий вид Gly-Arg(Pbf)-Gly-Lys(Boc)-Val-Leu-Trp(Boc)-Ala-Ile-Phe-Glu(OtBu)-Lys(Boc)-Ala-Ala-Gln(Trt)-Gly-Glu(OtBu)-Leu-Tyr(tBu)-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Val-Asp(OtBu)-Ser(tBu)-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Gly-Glu(OtBu)-Ala-His(Trt)-Boc (Последовательность No. 33). Состоящий из 31-го аминокислотного остатка защищенный пептид (эквивалент, равный 2 мкмоль) переносят во флакон, имеющий форму баклажана, и растворяют в DMF (0,03 мл). В отдельно подготовленную пробирку Eppendorf помещают асиало-аспарагин с присоединенной олигосахаридной цепью (свободный от амина) (4,9 мг, 1 мкмоль), PyBOP (1 мг, 1,9 мкмоль) и HOBt (0,3 мг, 2 мкмоль), растворенный в DMF (0,04 мл), и, в последнюю очередь, туда добавляют DIPEA (0,00052 мл, 3 мкмоль). Смесь растворов из этой пробирки Eppendorf переносят во заранее подготовленный флакон, имеющий форму баклажана, и перемешивают при комнатной температуре в течение 2,5 часов. После завершения реакции раствор концентрируют. К остатку добавляют смесь трифторуксусная кислота: вода: TIPS (=95:2,5:2,5) и перемешивают при комнатной температуре. Через 2 часа, раствор добавляют к отдельно подготовленному диэтиловому эфиру (150 мл) для получения кристалла. Раствор удаляют через мембранный фильтр для получения осадка, содержащего представляющий интерес пептид GLP-1 с присоединенной олигосахаридной цепью. Полученный остаток очищают с помощью ВЭЖХ [колонка: SHISEIDO UG-120 (С18 5 мкм), ϕ 20×250 мм, градиент: раствор А: 0,1% TFA вода, раствор В: 0,09% TFA/10% вода/90% AN 8,0 мл/мин; 35→60% раствор В, 20 мин, линейный градиент] для получения пептида GLP-1 с присоединенной олигосахаридной цепью, в котором позиция 38 GLP-1 заменена Asn с присоединенной олигосахаридной цепью (38Asn-асиало-GLP-1).

ESI-MC: Расчетная величина для C₂₁₇H₃₃₆N₄₆O₉₄: [М+3Н]⁺ 1697,8, получено 1697,9.

Результаты приведены в таблице 6.

Пример 7

Синтез пептида GLP-1 с присоединенной олигосахаридной цепью 19Asn-асиало

Колонку для твердофазного синтеза заполняют смолой Амино-PEGA (100 мкмоль), тщательно промывают с помощью DCM и DMF и дают смоле полностью набухнуть в DMF. 4-гидроксиметил-3-метоксифеноксимасляную кислоту (НМРВ) (0,25 ммоль), TBTU (0,25 ммоль) и N-этилморфолин (0,25 ммоль) растворяют в DMF (2 мл), загружают в колонку и перемешивают при комнатной температуре в течение 4 часов. Смолу тщательно промывают с помощью DMF и DCM, и получают смолу HMPB-PEG, которую применяют в качестве твердой фазы для твердофазного синтеза.

Fmoc-Gly (0,50 ммоль), MSNT (0,50 ммоль) и N-метилимидазол (0,375 ммоль) растворяют в DCM (2 мл), загружают в колонку для твердофазного синтеза и перемешивают при 25°С в течение 3-х часов.

После перемешивания, смолу промывают с помощью DCM и DMF. Fmoc-группу удаляют с помощью 20%-ного раствора пиперидина/DMF (2 мл) в течение 15 минут. После промывания с помощью DMF, аминокислоты последовательно конденсируют в соответствии с приведенным ниже способом удлинения пептидной цепи.

Аминокислоту, имеющую аминогруппу, защищенную Fmoc-группой,, растворяют в NMP (1 мл). После добавления 0,45 М HCTU·HOBT/NMP (0,4 ммоль), полученную смесь загружают в колонку для твердофазного синтеза. Потом, к колонке для твердофазного синтеза добавляют 0,9 М DIPEA/NMP (0,8 ммоль). После перемешивания при комнатной температуре в течение 20 минут, смолу промывают с помощью DCM и DMF, и Fmoc-группу удаляют с помощью 20%-ного раствора пиперидина/DMF (2 мл) в течение 15 минут. Эту операцию проводят повторно, применяя аминокислоту, защищенную Fmoc-группой (0,5 ммоль) для последовательной конденсации аминокислот.

Fmoc-Gly, Fmoc-Arg(Pbf), Fmoc-Gly, Fmoc-Lys(Boc), Fmoc-Val, Fmoc-Leu, Fmoc-Trp(Boc), Fmoc-Ala, Fmoc-Ile, Fmoc-Phe, Fmoc-Glu(OtBu), Fmoc-Lys(Boc), Fmoc-Ala, Fmoc-Ala, Fmoc-Gln(Trt), Fmoc-Gly, Fmoc-Glu(OtBu), и Fmoc-Leu применяют в качестве аминокислот, защищенных Fmoc-группой, для получения на смоле, которая представляет собой твердую фазу, пептида, состоящего из 18-ти аминокислот, следующего вида Gly-Arg(Pbf)-Gly-Lys(Boc)-Val-Leu-Trp(Boc)-Ala-Ile-Phe-Glu(OtBu)-Lys(Boc)-Ala-Ala-Gln(Trt)-Gly-Glu(OtBu)-Leu (SEQ ID NO:34).

После промывания с помощью DCM и DMF, эквивалент смолы, равный 5 мкмоль пептида, состоящего из 18-ти аминокислот, переносят в пробирку Eppendorf.

Аспарагин с присоединенной олигосахаридной цепью (b) (продукт компании OTSUKA Chemical Co., Ltd.) (18 мг, 10 мкмоль)

[Формула 6]

и DEPBT(4,5 мг, 15 мкмоль) растворяют в DMF (0,34 мл), и помещают в пробирку Eppendorf. Добавляют DIPEA (2,6 мкл, 15 мкмоль), и смесь перемешивают при комнатной температуре в течение 24 часов. После промывания с помощью DMF и DCM, на твердой фазе получают пептид, состоящий из 19-ти аминокислот, с присоединенной олигосахаридной цепью, следующего вида Gly-Arg(Pbf)-Gly-Lys(Boc)-Val-Leu-Trp(Boc)-Ala-Ile-Phe-Glu(OtBu)-Lys(Вос)-Ala-Ala-Gln(Trt)-Gly-Glu(OtBu)-Leu-Asn(олигосахаридная цепь) (SEQ ID NO:35). Затем аминокислоту, имеющую аминогруппу, защищенную Fmoc-группой, конденсируют с помощью HOBt (3,4 мг, 0,025 ммоль), DIPCI (3,8 мкл, 0,025 ммоль) и DMF (0,1 мл) и на твердой фазе получают пептид с присоединенной олигосахаридной цепью, состоящий из 31-го аминокислотного остатка, следующего вида Gly-Arg(Pbf)-Gly-Lys(Boc)-Val-Leu-Trp(Boc)-Ala-Ile-Phe-Glu(OtBu)-Lys(Boc)-Ala-Ala-Gln(Trt)-Gly-Glu(OtBu)-Leu-Asn(олигосахаридная цепь)-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Val-Asp(OtBu)-Ser(tBu)-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Gly-Glu(OtBu)-Ala-His(Trt) (SEQ ID NO:36).

Полученную смолу, на которой образовался пептид с присоединенной олигосахаридной цепью, частично переносят на колонку для твердофазного синтеза. Смесь трифторуксусная кислота: вода: TIPS (=95:2,5:2,5) добавляют так, чтобы смола была полностью погружена в жидкость, и перемешивают при комнатной температуре в течение 3-х часов. Смолу удаляют фильтрованием, и реакционный раствор концентрируют при пониженном давлении. Полученный остаток очищают с помощью ВЭЖХ [колонка: SHISEIDO UG-120 (С18 5 мкм), ϕ 20×250 мм, градиент: раствор А: ,1% TFA вода, раствор В: 0,09% TFA/10% вода/90% AN 7,0 мл/мин; 35→60%В, 20 мин, линейный градиент] и получают пептид с присоединенной олигосахаридной цепью в котором позиция 19 GLP-1 замещена Asn с присоединенной олигосахаридной цепью (19Asn GLP-1-асиало-).

ESI-MC: Расчетная величина для C₂₁₄H₃₃₁N₄₅O₉₂: [М+3Н]⁺ 1668,8, получено, 1668,1.

Результаты приведены в таблице 6.

[Таблица 6]
		EMI-MC
Пример 6	38Asn GLP-1-асиало	Рассчитанная для C217H336N46O94 [М+3Н]3+ 1697,8 найденная 1697,9
Пример 7	19Asn GLP-1-асиало	Рассчитанная для C214H331N45O92S [М+3Н]3+ 1668,8 найденная 1668,1

Пример 8

Синтез пептида GLP-1 с присоединенной олигосахаридной цепью 6Cys-дисиало

Колонку для твердофазного синтеза заполняют смолой Амино-PEGA (100 мкмоль) (продукт фирмы «Merck»), тщательно промывают дихлорметаном (DCM) и DMF и дают смоле полностью набухнуть в DMF. 4-гидроксиметил-3-метоксифеноксимасляную кислоту (НМРВ) (0,25 ммоль), TBTU (0,25 ммоль) и N-этилморфолин (0,25 ммоль) растворяют в DMF (2 мл), загружают в колонку и перемешивают при комнатной температуре в течение 4 часов. Смолу тщательно промывают с помощью DMF и DCM и получают смолу HMPB-PEG, которую применяют в качестве твердой фазы для твердофазного синтеза.

Fmoc-Gly (0,50 ммоль), MSNT (0,50 ммоль) и N-метилимидазол (0,375 ммоль) растворяют в DCM (2 мл), загружают в колонку для твердофазного синтеза и перемешивают при 25°С в течение 3-х часов.

После перемешивания, смолу промывают с помощью DCM и DMF. Fmoc-группу удаляют с помощью 20%-ного раствора пиперидина/DMF (2 мл) в течение 15 минут. После промывания с помощью DMF, аминокислоты последовательно конденсируют в соответствии с приведенным ниже способом удлинения пептидной цепи.

Аминокислоту, имеющую аминогруппу, защищенную Fmoc-группой, растворяют в N-метилпирролидоне (NMP) (1 мл). После добавления 0,45 М HCTU·HOBT/NMP (0,4 ммоль), полученную смесь загружают в колонку для твердофазного синтеза. Потом, к колонке для твердофазного синтеза добавляют 0,9 М DIPEA/NMP (0,8 ммоль). После перемешивания при комнатной температуре в течение 20-ти минут, смолу промывают с помощью DCM и DMF, и Fmoc-группу удаляют с помощью 20%-ного раствора пиперидина/DMF (2 мл) в течение 15 минут. Эту операцию проводят повторно, применяя аминокислоту, защищенную Fmoc-группой (0,5 ммоль), для последовательной конденсации аминокислот.

Fmoc-Gly, Fmoc-Arg(Pbf), Fmoc-Gly, Fmoe-Lys(Boc), Fmoc-Val, Fmoc-Leu, Fmoc-Trp(Boc), Fmoc-Ala, Fmoc-Ile, Fmoc-Phe, Fmoc-Glu(OtBu), Fmoc-Lys(Boc), Fmoc-Ala, Fmoc-Ala, Fmoc-Gln(Trt), Fmoc-Gly, Fmoc-Glu(OtBu), Fmoc-Leu, Fmoc-Tyr(tBu), Fmoc-Ser(tBu), Fmoc-Ser(tBu), Fmoc-Val, Fmoc-Asp(OtBu), Fmoc-Ser(tBu), Fmoc-Thr(tBu), Fmoc-Phe, Fmoc-Thr(tBu), Fmoc-Gly, Fmoc-Glu(OtBu), Fmoc-Ala, Fmoc-His(Trt) и Fmoc-Cys(Trt) применяют в качестве аминокислот, защищенных Fmoc-группой, для получения на смоле, которая представляет собой твердую фазу, пептида, состоящего из 32-х аминокислотных остатков, следующего вида Gly-Arg(Pbf)-Gly-Lys(Boc)-Val-Leu-Trp(Boc)-Ala-Ile-Phe-Glu(OtBu)-Lys(Boc)-Ala-Ala-Gln(Trt)-Gly-Glu(OtBu)-Leu-Tyr(tBu)-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Val-Asp(OtBu)-Ser(tBu)-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Gly-Glu(OtBu)-Ala-His(Trt)-Cys(Trt) (SEQ ID NO:37).

Полученную смолу с образовавшимся на ней пептидом частично переносят на колонку для твердофазного синтеза. Смесь трифторуксусная кислота: вода: TIPS (=95:2,5:2,5) добавляют так, чтобы смола была полностью погружена в жидкость и перемешивают при комнатной температуре в течение 3-х часов. Смолу удаляют фильтрованием, и реакционный раствор концентрируют при пониженном давлении. Полученный остаток очищают с помощью ВЭЖХ [колонка: SHISEIDO UG-120 (C18 5 мкм), ϕ 20×250 мм, градиент: раствор А: 0,1% TFA вода, раствор В: 0,09% TFA/10% вода/90% AN 8,0 мл/мин; 35→60% 20 мин, линейный градиент] и получают пептид GLP-1, у которого в 6-й позиции находится Cys.

Бромацетамидил-дисиало-олигосахарид (а) (продукт компании OTSUKA Chemical Co., Ltd.) (34 мг) и пептидную цепь, синтезированную выше (9,6 мг), растворяют в 100 мМ фосфатном буфере (рН 7,5, 1 мл) и оставляют для протекания реакции при 37°С в течение 4 часов. После того как исходные вещества будут полностью израсходованы и это будет подтверждено с помощью ВЭЖХ, реакционный раствор непосредственно подвергают очистке с помощью ВЭЖХ [колонка: SHISEIDO UG-120 (C18, 5 мкм), ϕ 20×250 мм, градиент: раствор А: 0,1% TFA вода, раствор В: 0,09% TFA/10% вода/90% AN 8,0 мл/мин; 35→60%В, 20 мин, линейный градиент] и получают 9,9 мг пептида GLP-1 с присоединенной олигосахаридной цепью, у которого в позицию 6 GLP-1 добавлен Cys с присоединенной олигосахаридной цепью (6Cys GLP-1-дисиало-).

Пример 9

Синтез пептида GLP-1 с присоединенной олигосахаридной цепью 8Cys-дисиало

Колонку для твердофазного синтеза заполняют смолой Амино-PEGA (100 мкмоль) (продукт фирмы «Merck»), тщательно промывают дихлорметаном (DCM) и DMF и дают смоле полностью набухнуть в DMF. 4-гидроксиметил-3-метоксифеноксимасляную кислоту (НМРВ) (0,25 ммоль), TBTU (0,25 ммоль) и N-этилморфолин (0,25 ммоль) растворяют в DMF (2 мл), загружают в колонку и перемешивают при комнатной температуре в течение 4 часов. Смолу тщательно промывают с помощью DMF и DCM и получают смолу HMPB-PEG, которую применяют в качестве твердой фазы для твердофазного синтеза.

Fmoc-Gly (0,50 ммоль), MSNT (0,50 ммоль) и N-метилимидазол (0,375 ммоль) растворяют в DCM (2 мл), загружают в колонку для твердофазного синтеза и перемешивают при 25°С в течение 3-х часов.

После перемешивания, смолу промывают с помощью DCM и DMF. Fmoc-группу удаляют с помощью 20%-ного раствора пиперидина/DMF (2 мл) в течение 15 минут. После промывания с помощью DMF, аминокислоты последовательно конденсируют в соответствии с приведенным ниже способом удлинения пептидной цепи.

Аминокислоту, имеющую аминогруппу, защищенную Fmoc-группой, растворяют в N-метилпирролидоне (NMP) (1 мл). После добавления 0,45 М HCTU·HOBT/NMP (0,4 ммоль), полученную смесь загружают в колонку для твердофазного синтеза. Потом, к колонке для твердофазного синтеза добавляют 0,9 М DIPEA/NMP (0,8 ммоль). После перемешивания при комнатной температуре в течение 20-ти минут, смолу промывают с помощью DCM и DMF, и Fmoc-группу удаляют с помощью 20%-ного раствора пиперидина/DMF (2 мл) в течение 15 минут. Эту операцию проводят повторно, применяя аминокислоту, защищенную Fmoc-группой (0,5 ммоль), для последовательной конденсации аминокислот.

Fmoc-Gly, Fmoc-Arg(Pbf), Fmoc-Gly, Fmoc-Lys(Boc), Fmoc-Val, Fmoc-Leu, Fmoc-Trp(Boc), Fmoc-Ala, Fmoc-Ile, Fmoc-Phe, Fmoc-Glu(OtBu), Fmoc-Lys(Boc), Fmoc-Ala, Fmoc-Ala, Fmoc-Gln(Trt), Fmoc-Gly, Fmoc-Glu(OtBu), Fmoc-Leu, Fmoc-Tyr(tBu), Fmoc-Ser(tBu), Fmoc-Ser(tBu), Fmoc-Val, Fmoc-Asp(OtBu), Fmoc-Ser(tBu), Fmoc-Thr(tBu), Fmoc-Phe, Fmoc-Thr(tBu), Fmoc-Gly, Fmoc-Glu(OtBu), Fmoc-Cys(Trt) и Fmoc-His(Trt) применяют, в качестве аминокислот, защищенных Fmoc-группой, для получения на смоле, которая представляет собой твердую фазу, пептида, состоящего из 31-го аминокислотного остатка, следующего вида Gly-Arg(Pbf)-Gly-Lys(Boc)-Val-Leu-Trp(Boc)-Ala-Ile-Phe-Glu(OtBu)-Lys(Boc)-Ala-Ala-Gln(Trt)-Gly-Glu(OtBu)-Leu-Tyr(tBu)-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Val-Asp(OtBu)-Ser(tBu)-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Gly-Glu(OtBu)-Cys(Trt)-His(Trt) (SEQ ID NO:38).

Полученную смолу с образовавшимся на ней пептидом частично переносят на колонку для твердофазного синтеза. Смесь трифторуксусная кислота: вода: TIPS (=95:2,5:2,5) добавляют так, чтобы смола была полностью погружена в жидкость и перемешивают при комнатной температуре в течение 3-х часов. Смолу удаляют фильтрованием, и реакционный раствор концентрируют при пониженном давлении. Полученный остаток очищают с помощью ВЭЖХ [колонка: SHISEIDO UG-120 (С18 5 мкм), ϕ 20×250 мм, градиент: раствор А: 0,1% TFA вода, раствор В: 0,09% TFA/10% вода/90% AN 8,0 мл/мин; 35→60% 20 мин, линейный градиент] и получают пептид, в котором 8Ala GLP-1 заменен Cys.

Бромацетамидил-дисиало-олигосахарид (а) (продукт компании OTSUKA Chemical Co., Ltd.) (25 мг) и пептидную цепь, синтезированную выше (7,3 мг) растворяют в 100 мМ фосфатном буфере (рН 7,5, 730 мкл) и оставляют для протекания реакции при 37°С в течение 4 часов. После того как исходные вещества будут полностью израсходованы и это будет подтверждено с помощью ВЭЖХ, реакционный раствор непосредственно подвергают очистке с помощью ВЭЖХ [колонка: SHISEIDO UG-120 (С18, 5 мкм), ϕ 20×250 мм, градиент: раствор А: 0,1% TFA вода, раствор В: 0,09% TFA/10% вода/90% AN 8 мл/мин; 35→60%В, 20 мин, линейный градиент] и получают 9,3 мг пептида GLP-1 с присоединенной олигосахаридной цепью, в котором 8Ala GLP-1 замещен Cys с присоединенной олигосахаридной цепью (8Cys GLP-1-дисиало-).

Пример 10

Синтез пептида GLP-1 с присоединенной олигосахаридной цепью 9Cys-дисиало

Колонку для твердофазного синтеза заполняют смолой Амино-PEGA (100 мкмоль) (продукт фирмы «Merck»), тщательно промывают дихлорметаном (DCM) и DMF и дают смоле полностью набухнуть в DMF. 4-Гидроксиметил-3-метоксифеноксимаспяную кислоту (НМРВ) (0,25 ммоль), TBTU (0,25 ммоль) и N-этилморфолин (0,25 ммоль) растворяют в DMF (2 мл), загружают в колонку и перемешивают при комнатной температуре в течение 4 часов. Смолу тщательно промывают с помощью DMF и DCM и получают смолу HMPB-PEG, которую применяют в качестве твердой фазы для твердофазного синтеза.

Fmoc-Gly (0,50 ммоль), MSNT (0,50 ммоль) и N-метилимидазол (0,375 ммоль) растворяют в DCM (2 мл), загружают в колонку для твердофазного синтеза и перемешивают при 25°С в течение 3-х часов.

После перемешивания смолу промывают с помощью DCM и DMF. Fmoc-группу удаляют с помощью 20%-ного раствора пиперидина/DMF (2 мл) в течение 15 минут. После промывания с помощью DMF, аминокислоты последовательно конденсируют в соответствии с приведенным ниже способом удлинения пептидной цепи.

Аминокислоту, имеющую аминогруппу, защищенную Fmoc-группой, растворяют в N-метилпирролидоне (NMP) (1 мл). После добавления 0,45 М HCTU·HOBT/NMP (0,4 ммоль), полученную смесь загружают в колонку для твердофазного синтеза. Потом, к колонке для твердофазного синтеза добавляют 0,9 М DIPEA/NMP (0,8 ммоль). После перемешивания при комнатной температуре в течение 20-ти минут, смолу промывают с помощью DCM и DMF, и Fmoc-группу удаляют с помощью 20%-ного раствора пиперидина/DMF (2 мл) в течение 15 минут. Эту операцию проводят повторно, применяя аминокислоту, защищенную Fmoc-группой (0,5 ммоль), для последовательной конденсации аминокислот.

Fmoc-Gly, Fmoc-Arg(Pbf), Fmoc-Gly, Fmoc-Lys(Boc), Fmoc-Val, Fmoc-Leu, Fmoc-Trp(Boc), Fmoc-Ala, Fmoc-Ile, Fmoc-Phe, Fmoc-Glu(OtBu), Fmoc-Lys(Boc), Fmoc-Ala, Fmoc-Ala, Fmoc-Gln(Trt), Fmoc-Gly, Fmoc-Glu(OtBu), Fmoc-Leu, Fmoc-Tyr(tBu), Fmoc-Ser(tBu), Fmoc-Ser(tBu), Fmoc-Val, Fmoc-Asp(OtBu), Fmoc-Scr(tBu), Fmoc-Thr(tBu), Fmoc-Phe, Fmoc-Thr(tBu), Fmoc-Gly, Fmoc-Cys(Trt), Fmoc-Ala и Fmoc-His(Trt) применяют, в качестве аминокислот, защищенных Fmoc-группой, для получения на смоле, которая представляет собой твердую фазу, пептида, состоящего из 31-го аминокислотного остатка, следующего вида Gly-Arg(Pbf)-Gly-Lys(Boc)-Val-Leu-Trp(Boc)-Ala-Ile-Phe-Glu(OtBu)-Lys(Boc)-Ala-Ala-Gln(Trt)-Gly-Glu(OtBu)-Leu-Tyr(tBu)-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Val-Asp(OtBu)-Ser(tBu)-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Gly-Cys(Trt)-Ala-His(Trt) (SEQ ID NO:39).

Полученную смолу с образовавшимся на ней пептидом частично переносят на колонку для твердофазного синтеза. Смесь трифторуксусная кислота: вода: TIPS (=95:2,5:2,5) добавляют так, чтобы смола была полностью погружена в жидкость и перемешивают при комнатной температуре в течение 3-х часов. Смолу удаляют фильтрованием, и реакционный раствор концентрируют при пониженном давлении. Полученный остаток очищают с помощью ВЭЖХ [колонка: SHISEIDO UG-120 (С18 5 мкм), ϕ 20×250 мм, градиент: раствор А: 0,1% TFA вода, раствор В: 0,09% TFA/10% вода/90% AN 8,0 мл/мин; 35→60%В, 20 мин, линейный градиент] и получают пептид, в котором 9Glu GLP-1 замещен Cys.

Бромацетамидил-дисиало-олигосахарид (а) (продукт компании OTSUKA Chemical Co., Ltd.) (50 мг) и пептидную цепь, синтезированную выше (16,4 мг), растворяют в 100 мМ фосфатном буфере (рН 7,5, 1,7 мл) и оставляют для протекания реакции при 37°С в течение 4 часов. После того как исходные вещества будут полностью израсходованы и это будет подтверждено с помощью ВЭЖХ, реакционный раствор непосредственно подвергают очистке с помощью ВЭЖХ [колонка: SHISEIDO UG-120 (C18, 5 мкм), ϕ 20×250 мм, градиент: раствор А: 0,1% TFA вода, раствор В: 0,09% TFA/10% вода/90% AN 8 мл/мин; 35→60%В, 20 мин, линейный градиент] и получают 7,3 мг пептида GLP-1 с присоединенной олигосахаридной цепью в котором 9Glu GLP-1 замещен Cys с присоединенной олигосахаридной цепью (9Cys GLP-1-дисиало-).

Пример 11

Синтез пептида GLP-1 с присоединенной олигосахаридной цепью 10Cys-дисиало

Колонку для твердофазного синтеза заполняют смолой Амино-PEGA (100 мкмоль) (продукт фирмы «Merck»), тщательно промывают дихлорметаном (DCM) и DMF и дают смоле полностью набухнуть в DMF. 4-Гидроксиметил-3-метоксифеноксимасляную кислоту (НМРВ) (0,25 ммоль), TBTU (0,25 ммоль) и N-этилморфолин (0,25 ммоль) растворяют в DMF (2 мл), загружают в колонку и перемешивают при комнатной температуре в течение 4 часов. Смолу тщательно промывают с помощью DMF и DCM и получают смолу HMPB-PEG, которую применяют в качестве твердой фазы для твердофазного синтеза.

Fmoc-Gly (0,50 ммоль), MSNT (0,50 ммоль) и N-метилимидазол (0,375 ммоль) растворяют в DCM (2 мл), загружают в колонку для твердофазного синтеза и перемешивают при 25°С в течение 3-х часов.

После перемешивания, смолу промывают с помощью DCM и DMF. Fmoc-группу удаляют с помощью 20%-ного раствора пиперидина/DMF (2 мл) в течение 15 минут. После промывания с помощью DMF, аминокислоты последовательно конденсируют в соответствии с приведенным ниже способом удлинения пептидной цепи.

Аминокислоту, имеющую аминогруппу, защищенную Fmoc-группой, растворяют в N-метилпирролидоне (NMP) (1 мл). После добавления 0,45 М HCTU·HOBT/NMP (0,4 ммоль) полученную смесь загружают в колонку для твердофазного синтеза. Потом, к колонке для твердофазного синтеза добавляют 0,9 М DIPEA/NMP (0,8 ммоль). После перемешивания при комнатной температуре в течение 20-ти минут, смолу промывают с помощью DCM и DMF, и Fmoc-группу удаляют с помощью 20%-ного раствора пиперидина/DMF (2 мл) в течение 15 минут. Эту операцию проводят повторно, применяя аминокислоту, защищенную Fmoc-группой (0,5 ммоль), для последовательной конденсации аминокислот.

Fmoc-Gly, Fmoc-Arg(Pbf), Fmoc-Gly, Fmoc-Lys(Boc), Fmoc-Val, Fmoc-Leu, Fmoc-Trp(Boc), Fmoc-Ala, Fmoc-Ile, Fmoc-Phe, Fmoc-Glu(OtBu), Fmoc-Lys(Boc), Fmoc-Ala, Fmoc-Ala, Fmoc-Gln(Trt), Fmoc-Gly, Fmoc-Glu(OtBu), Fmoc-Leu, Fmoc-Tyr(tBu), Fmoc-Ser(tBu), Fmoc-Ser(tBu), Fmoc-Val, Fmoc-Asp(OtBu), Fmoc-Ser(tBu), Fmoc-Thr(tBu), Fmoc-Phe, Fmoc-Thr(tBu), Fmoc-Cys(Trt), Fmoc-Glu(OtBu), Fmoc-Ala и Fmoc-His(Trt) применяют, в качестве аминокислот, защищенных Fmoc-группой, для получения на смоле, которая представляет собой твердую фазу, пептида, состоящего из 31-го аминокислотного остатка, следующего вида Gly-Arg(Pbf)-Gly-Lys(Boc)-Val-Leu-Trp(Boc)-Ala-Ile-Phe-Glu(OtBu)-Lys(Boc)-Ala-Ala-Gln(Trt)-Gly-Glu(OtBu)-Leu-Tyr(tBu)-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Val-Asp(OtBu)-Ser(tBu)-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Cys(Trt)-Glu(OtBu)-Ala-His(Trt) (SEQ ID NO:40).

Полученную смолу с образовавшимся на ней пептидом частично переносят на колонку для твердофазного синтеза. Смесь трифторуксусная кислота: вода: TIPS (=95:2,5:2,5) добавляют так, чтобы смола была полностью погружена в жидкость и перемешивают при комнатной температуре в течение 3-х часов. Смолу удаляют фильтрованием, и реакционный раствор концентрируют при пониженном давлении. Полученный остаток очищают с помощью ВЭЖХ [колонка: SHISEIDO UG-120 (С18 5 мкм), ϕ 20×250 мм, градиент: раствор А: 0,1% TFA вода, раствор В: 0,09% TFA/10% вода/90% AN 8,0 мл/мин; 35→60%В, 20 мин, линейный градиент] и получают пептид, в котором 10Gly GLP-1 заменен Cys.

Бромацетамидил-дисиало-олигосахарид (а) (продукт компании OTSUKA Chemical Co., Ltd.) (16,8 мг) и пептидную цепь, синтезированную выше (5,6 мг), растворяют в 100 мМ фосфатном буфере (рН 7,5, 560 мкл) и оставляют для протекания реакции при 37°С в течение 4 часов. После того как исходные вещества будут полностью израсходованы и это будет подтверждено с помощью ВЭЖХ, реакционный раствор непосредственно подвергают очистке с помощью ВЭЖХ [колонка: SHISEIDO UG-120 (С18, 5 мкм), ϕ 4,6×250 мм, градиент: раствор А: 0,1% TFA вода, раствор В: 0,09% TFA/10% вода/90% AN 0,7 мл/мин; 35→60%В, 20 мин, линейный градиент] и получают 3,0 мг пептида GLP-1 с присоединенной олигосахаридной цепью, в котором 10Gly GLP-1 заменен Cys с присоединенной олигосахаридной цепью (10Cys дисиало-GLP-1).

Пример 12

Синтез пептида GLP-1 с присоединенной олигосахаридной цепью 11Cys-дисиало

Колонку для твердофазного синтеза заполняют смолой Амино-PEGA (100 мкмоль) (продукт фирмы «Merck»), тщательно промывают дихлорметаном (DCM) и DMF и дают смоле полностью набухнуть в DMF. 4-Гидроксиметил-3-метоксифеноксимасляную кислоту (НМРВ) (0,25 ммоль), TBTU (0,25 ммоль) и N-этилморфолин (0,25 ммоль) растворяют в DMF (2 мл), загружают в колонку и перемешивают при комнатной температуре в течение 4 часов. Смолу тщательно промывают с помощью DMF и DCM и получают смолу НМРВ-PEG, которую применяют в качестве твердой фазы для твердофазного синтеза.

Fmoc-Gly (0,50 ммоль), MSNT (0,50 ммоль) и N-метилимидазол (0,375 ммоль) растворяют в DCM (2 мл), загружают в колонку для твердофазного синтеза и перемешивают при 25°С в течение 3-х часов.

После перемешивания смолу промывают с помощью DCM и DMF. Fmoc-группу удаляют с помощью 20%-ного раствора пиперидина/DMF (2 мл) в течение 15 минут. После промывания с помощью DMF, аминокислоты последовательно конденсируют в соответствии с приведенным ниже способом удлинения пептидной цепи.

Аминокислоту, имеющую аминогруппу, защищенную Fmoc-группой, растворяют в N-метилпирролидоне (NMP) (1 мл). После добавления 0,45 М HCTU·HOBT/NMP (0,4 ммоль), полученную смесь загружают в колонку для твердофазного синтеза. Потом, к колонке для твердофазного синтеза добавляют 0,9 М DIPEA/NMP (0,8 ммоль). После перемешивания при комнатной температуре в течение 20-ти минут, смолу промывают с помощью DCM и DMF, и Fmoc-группу удаляют с помощью 20%-ного раствора пиперидина/DMF (2 мл) в течение 15 минут. Эту операцию проводят повторно, применяя аминокислоту, защищенную Fmoc-группой (0,5 ммоль), для последовательной конденсации аминокислот.

Fmoc-Gly, Fmoc-Arg(Pbf), Fmoc-Gly, Fmoc-Lys(Boc), Fmoc-Val, Fmoc-Leu, Fmoc-Trp(Boc), Fmoc-Ala, Fmoc-Ile, Fmoc-Phe, Fmoc-Glu(OtBu), Fmoc-Lys(Boc), Fmoc-Ala, Fmoc-AIa, Fmoc-Gln(Trt), Fmoc-Gly, Fmoc-Glu(OtBu), Fmoc-Leu, Fmoc-Tyr(tBu), Fmoc-Ser(tBu), Fmoc-Ser(tBu), Fmoc-Val, Fmoc-Asp(OtBu), Fmoc-Ser(tBu), Fmoc-Thr(tBu), Fmoc-Phe, Fmoc-Cys(Trt), Fmoc-Gly, Fmoc-Glu(OtBu), Fmoc-Ala и Fmoc-His(Trt) применяют, в качестве аминокислот, защищенных Fmoc-группой, для получения на смоле, которая представляет собой твердую фазу, пептида, состоящего из 31-го аминокислотного остатка, следующего вида Gly-Arg(Pbf)-Gly-Lys(Boc)-Val-Leu-Trp(Boc)-Ala-Ile-Phe-Glu(OtBu)-Lys(Boc)-Ala-Ala-Gln(Trt)-Gly-Glu(OtBu)-Leu-Tyr(tBu)-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Val-Asp(OtBu)-Ser(tBu)-Thr(tBu)-Phe-Cyc(Trt)-Gly-Glu(OtBu)-Ala-His(Trt) (SEQ ID NO:41).

Полученную смолу с образовавшимся на ней пептидом частично переносят на колонку для твердофазного синтеза. Смесь трифторуксусная кислота: вода: TIPS (=95:2,5:2,5) добавляют так, чтобы смола была полностью погружена в жидкость и перемешивают при комнатной температуре в течение 3-х часов. Смолу удаляют фильтрованием, и реакционный раствор концентрируют при пониженном давлении. Полученный остаток очищают с помощью ВЭЖХ [колонка: SHISEIDO UG-120 (С18 5 мкм), ϕ 20×250 мм, градиент: раствор А: 0,1% TFA вода, раствор В: 0,09% TFA/10% вода/90% AN 8,0 мл/мин; 35→60%В, 20 мин, линейный градиент] и получают пептид, в котором 11Thr GLP-1 заменен Cys.

Бромацетамидил-дисиало-олигосахарид (а) (продукт компании OTSUKA Chemical Co., Ltd.) (41 мг) и пептидную цепь, синтезированную выше (12,8 мг) растворяют в 100 мМ фосфатном буфере (рН 7,5, 1,3 мл) и оставляют для протекания реакции при 37°С в течение 4 часов. После того как исходные вещества будут полностью израсходованы и это будет подтверждено с помощью ВЭЖХ, реакционный раствор непосредственно подвергают очистке с помощью ВЭЖХ [колонка: SHISEIDO UG-120 (C18, 5 мкм), ϕ 20×250 мм, градиент: раствор А: 0,1% TFA вода, раствор В: 0,09% TFA/10% вода/90% AN 8,0 мл/мин; 35→60%В, 20 мин, линейный градиент] и получают 11,9 мг пептида GLP-1 с присоединенной олигосахаридной цепью, в котором 11Thr GLP-1 заменен Cys с присоединенной олигосахаридной цепью (11Cys дисиало-GLP-1).

Пример 13

Синтез пептида GLP-1 с присоединенной олигосахаридной цепью 12Cys-дисиало

Колонку для твердофазного синтеза заполняют смолой Амино-PEGA (100 мкмоль) (продукт фирмы «Merck»), тщательно промывают дихлорметаном (DCM) и DMF и дают смоле полностью набухнуть в DMF. 4-Гидроксиметил-3-метоксифеноксимасляную кислоту (НМРВ) (0,25 ммоль), TBTU (0,25 ммоль) и N-этилморфолин (0,25 ммоль) растворяют в DMF (2 мл), загружают в колонку и перемешивают при комнатной температуре в течение 4 часов. Смолу тщательно промывают с помощью DMF и DCM и получают смолу HMPB-PEG, которую применяют в качестве твердой фазы для твердофазного синтеза.

Fmoc-Gly (0,50 ммоль), MSNT (0,50 ммоль) и N-метилимидазол (0,375 ммоль) растворяют в DCM (2 мл), загружают в колонку для твердофазного синтеза и перемешивают при 25°С в течение 3-х часов.

После перемешивания, смолу промывают с помощью DCM и DMF. Fmoc-группу удаляют с помощью 20%-ного раствора пиперидина/DMF (2 мл) в течение 15 минут. После промывания с помощью DMF, аминокислоты последовательно конденсируют в соответствии с приведенным ниже способом удлинения пептидной цепи.

Аминокислоту, имеющую аминогруппу, защищенную Fmoc-группой, растворяют в N-метилпирролидоне (NMP) (1 мл). После добавления 0,45 М HCTU·HOBT/NMP (0,4 ммоль), полученную смесь загружают в колонку для твердофазного синтеза. Потом, к колонке для твердофазного синтеза добавляют 0,9 М DIPEA/NMP (0,8 ммоль). После перемешивания при комнатной температуре в течение 20-ти минут, смолу промывают с помощью DCM и DMF, и Fmoc-группу удаляют с помощью 20%-ного раствора пиперидина/DMF (2 мл) в течение 15 минут. Эту операцию проводят повторно, применяя аминокислоту, защищенную Fmoc-группой (0,5 ммоль), для последовательной конденсации аминокислот.

Fmoc-Gly, Fmoc-Arg(Pbf), Fmoc-Gly, Fmoc-Lys(Boc), Fmoc-Val, Fmoc-Leu, Fmoc-Trp(Boc), Fmoc-Ala, Fmoc-Ile, Fmoc-Phe, Fmoc-Glu(OtBu), Fmoc-Lys(Boc), Fmoc-Ala, Fmoc-Ala, Fmoc-Gln(Trt), Fmoc-Gly, Fmoc-Glu(OtBu), Fmoc-Leu, Fmoc-Tyr(tBu), Fmoc-Ser(tBu), Fmoc-Ser(tBu), Fmoc-Val, Fmoc-Asp(OtBu), Fmoc-Ser(tBu), Fmoc-Thr(tBu), Fmoc-Cys(Trt), Fmoc-Thr(tBu), Fmoc-Gly, Fmoc-Glu(OtBu), Fmoc-Ala и Fmoc-His(Trt) применяют, в качестве аминокислот, защищенных Fmoc-группой, для получения на смоле, которая представляет собой твердую фазу, пептида, состоящего из 31-го аминокислотного остатка, следующего вида Gly-Arg(Pbf)-Gly-Lys(Boc)-Val-Leu-Trp(Boc)-Ala-Ile-Phe-Glu(OtBu)-Lys(Boc)-Ala-Ala-Gln(Trt)-Gly-Glu(OtBu)-Leu-Tyr(tBu)-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Val-Asp(OtBu)-Ser(tBu)-Thr(tBu)-Cyc(Trt)-Thr(tBu)-Gly-Glu(OtBu)-Ala-His(Trt) (SEQ ID NO:42).

Полученную смолу с образовавшимся на ней пептидом частично переносят на колонку для твердофазного синтеза. Смесь трифторуксусная кислота: вода: TIPS (=95:2,5:2,5) добавляют так, чтобы смола была полностью погружена в жидкость и перемешивают при комнатной температуре в течение 3-х часов. Смолу удаляют фильтрованием, и реакционный раствор концентрируют при пониженном давлении. Полученный остаток очищают с помощью ВЭЖХ [колонка: SHISEIDO UG-120 (С18 5 мкм), ϕ 20×250 мм, градиент: раствор А: 0,1% TFA вода, раствор В: 0,09% TFA/10% вода/90% AN 8,0 мл/мин; 35→60%В, 20 мин, линейный градиент] и получают пептид, в котором 12Phe GLP-1 заменен Cys.

Бромацетамидил-дисиало-олигосахарид (а) (продукт компании OTSUKA Chemical Co., Ltd.) (33 мг) и пептидную цепь, синтезированную выше (9,5 мг) растворяют в 100 мМ фосфатном буфере (рН 7,5, 1 мл) и оставляют для протекания реакции при 37°С в течение 4 часов. После того как исходные вещества будут полностью израсходованы и это будет подтверждено с помощью ВЭЖХ, реакционный раствор непосредственно подвергают очистке с помощью ВЭЖХ [колонка: SHISEIDO UG-120 (С18, 5 мкм), ϕ 20×250 мм, градиент: раствор А: 0,1% TFA вода, раствор В: 0,09% TFA/10% вода/90% AN 8,0 мл/мин; 35→60%В, 20 мин, линейный градиент] и получают 10,0 мг пептида GLP-1 с присоединенной олигосахаридной цепью, в котором 12Phe GLP-1 заменен Cys с присоединенной олигосахаридной цепью (12Cys дисиало-GLP-1).

Пример 14

Синтез пептида GLP-1 с присоединенной олигосахаридной цепью 14Cys дисиало

Колонку для твердофазного синтеза заполняют смолой Амино-PEGA (100 мкмоль) (продукт фирмы «Merck»), тщательно промывают дихлорметаном (DCM) и DMF и дают смоле полностью набухнуть в DMF. 4-Гидроксиметил-3-метоксифеноксимасляную кислоту (НМРВ) (0,25 ммоль), TBTU (0,25 ммоль) и N-этилморфолин (0,25 ммоль) растворяют в DMF (2 мл), загружают в колонку и перемешивают при комнатной температуре в течение 4 часов. Смолу тщательно промывают с помощью DMF и DCM и получают смолу HMPB-PEG, которую применяют в качестве твердой фазы для твердофазного синтеза.

Fmoc-Gly (0,50 ммоль), MSNT (0,50 ммоль) и N-метилимидазол (0,375 ммоль) растворяют в DCM (2 мл), загружают в колонку для твердофазного синтеза и перемешивают при 25°С в течение 3-х часов.

После перемешивания, смолу промывают с помощью DCM и DMF. Fmoc-группу удаляют с помощью 20%-ного раствора пиперидина/DMF (2 мл) в течение 15 минут. После промывания с помощью DMF, аминокислоты последовательно конденсируют в соответствии с приведенным ниже способом удлинения пептидной цепи.

Аминокислоту, имеющую аминогруппу, защищенную Fmoc-группой, растворяют в N-метилпирролидоне (NMP) (1 мл). После добавления 0,45 М HCTU·HOBT/NMP (0,4 ммоль), полученную смесь загружают в колонку для твердофазного синтеза. Потом, к колонке для твердофазного синтеза добавляют 0,9 М DIPEA/NMP (0,8 ммоль). После перемешивания при комнатной температуре в течение 20-ти минут, смолу промывают с помощью DCM и DMF, и Fmoc-группу удаляют с помощью 20%-ного раствора пиперидина/DMF (2 мл) в течение 15 минут. Эту операцию проводят повторно, применяя аминокислоту, защищенную Fmoc-группой (0,5 ммоль), для последовательной конденсации аминокислот.

Fmoc-Gly, Fmoc-Arg(Pbf), Fmoc-Gly, Fmoc-Lys(Boc), Fmoc-Val, Fmoc-Leu, Fmoc-Trp(Boc), Fmoc-Ala, Fmoc-Ile, Fmoc-Phe, Fmoc-Glu(OtBu), Fmoc-Lys(Boc), Fmoc-Ala, Fmoc-Ala, Fmoc-Gln(Trt), Fmoc-Gly, Fmoc-Glu(OtBu), Fmoc-Leu, Fmoc-Tyr(tBu), Fmoc-Ser(tBu), Fmoc-Ser(tBu), Fmoc-Val, Fmoc-Asp(OtBu), Fmoc-Cys(Trt), Fmoc-Thr(tBu), Fmoc-Phe, Fmoc-Thr(tBu), Fmoc-Gly, Fmoc-Glu(OtBu), Fmoc-Ala и Fmoc-His(Trt) применяют, в качестве аминокислот, защищенных Fmoc-группой, для получения на смоле, которая представляет собой твердую фазу, пептида, состоящего из 31-го аминокислотного остатка, следующего вида Gly-Arg(Pbf)-Gly-Lys(Boc)-Val-Leu-Trp(Boc)-Ala-Ile-Phe-Glu(OtBu)-Lys(Boc)-Ala-Ala-Gln(Trt)-Gly-Glu(OtBu)-Leu-Tyr(tBu)-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Val-Asp(OtBu)-Cys(Trt)-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Gly-Glu(OtBu)-Ala-His(Trt) (SEQ ID NO:43).

Полученную смолу с образовавшимся на ней пептидом частично переносят на колонку для твердофазного синтеза. Смесь трифторуксусная кислота: вода: TIPS (=95:2,5:2,5) добавляют так, чтобы смола была полностью погружена в жидкость и перемешивают при комнатной температуре в течение 3-х часов. Смолу удаляют фильтрованием, и реакционный раствор концентрируют при пониженном давлении. Полученный остаток очищают с помощью ВЭЖХ [колонка: SHISEIDO UG-120 (C18 5 мкм), ϕ 20×250 мм, градиент: раствор А: 0,1% TFA вода, раствор В: 0,09% TFA/10% вода/90% AN 8,0 мл/мин; 35→60%В, 20 мин, линейный градиент] и получают пептид, в котором 14Ser GLP-1 заменен Cys.

Бромацетамидил-дисиало-олигосахарид (а) (продукт компании OTSUKA Chemical Co., Ltd.) (32 мг) и пептидную цепь, синтезированную выше (8,8 мг) растворяют в 100 мМ фосфатном буфере (рН 7,5, 1 мл) и оставляют для протекания реакции при 37°С в течение 4 часов. После того как исходные вещества будут полностью израсходованы и это будет подтверждено с помощью ВЭЖХ, реакционный раствор непосредственно подвергают очистке с помощью ВЭЖХ [колонка: SHISEIDO UG-120 (С18, 5 мкм), ϕ 20×250 мм, градиент: раствор А: 0,1% TFA вода, раствор В: 0,09% TFA/10% вода/90% AN 8,0 мл/мин; 35→60%В, 20 мин, линейный градиент] и получают 8,4 мг пептида GLP-1 с присоединенной олигосахаридной цепью, в котором 14Ser GLP-1 заменен Cys с присоединенной олигосахаридной цепью (14Cys дисиало-GLP-1).

Пример 15

Синтез пептида GLP-1 с присоединенной олигосахаридной цепью 16Cys-дисиало

Колонку для твердофазного синтеза заполняют смолой Амино-PEGA (100 мкмоль) (продукт фирмы «Merck»), тщательно промывают дихлорметаном (DCM) и DMF и дают смоле полностью набухнуть в DMF. 4-Гидроксиметил-3-метоксифеноксимасляную кислоту (НМРВ) (0,25 ммоль), TBTU (0,25 ммоль) и N-этилморфолин (0,25 ммоль) растворяют в DMF (2 мл), загружают в колонку и перемешивают при комнатной температуре в течение 4 часов. Смолу тщательно промывают с помощью DMF и DCM и получают смолу HMPB-PEG, которую применяют в качестве твердой фазы для твердофазного синтеза.

Fmoc-Gly (0,50 ммоль), MSNT (0,50 ммоль) и N-метилимидазол (0,375 ммоль) растворяют в DCM (2 мл), загружают в колонку для твердофазного синтеза и перемешивают при 25°С в течение 3-х часов.

После перемешивания, смолу промывают с помощью DCM и DMF. Fmoc-группу удаляют с помощью 20%-ного раствора пиперидина/DMF (2 мл) в течение 15 минут. После промывания с помощью DMF, аминокислоты последовательно конденсируют в соответствии с приведенным ниже способом удлинения пептидной цепи.

Аминокислоту, имеющую аминогруппу, защищенную Fmoc-группой, растворяют в N-метилпирролидоне (NMP) (1 мл). После добавления 0,45 М HCTU·HOBT/NMP (0,4 ммоль), полученную смесь загружают в колонку для твердофазного синтеза. Потом, к колонке для твердофазного синтеза добавляют 0,9 М DIPEA/NMP (0,8 ммоль). После перемешивания при комнатной температуре в течение 20-ти минут, смолу промывают с помощью DCM и DMF, и Fmoc-группу удаляют с помощью 20%-ного раствора пиперидина/DMF (2 мл) в течение 15 минут. Эту операцию проводят повторно, применяя аминокислоту, защищенную Fmoc-группой (0,5 ммоль), для последовательной конденсации аминокислот.

Fmoc-Gly, Fmoc-Arg(Pbf), Fmoc-Gly, Fmoc-Lys(Boc), Fmoc-Val, Fmoc-Leu, Fmoc-Trp(Boc), Fmoc-Ala, Fmoc-Ile, Fmoc-Phe, Fmoc-Glu(OtBu), Fmoc-Lys(Boc), Fmoc-Ala, Fmoc-Ala, Fmoc-Gln(Trt), Fmoc-Gly, Fmoc-Glu(OtBu), Fmoc-Leu, Fmoc-Tyr(tBu), Fmoc-Ser(tBu), Fmoc-Ser(tBu), Fmoc-Cys(Trt), Fmoc-Asp(OtBu), Fmoc-Ser(tBu), Fmoc-Thr(tBu), Fmoc-Phe, Fmoc-Thr(tBu), Fmoc-Gly, Fmoc-Glu(OtBu), Fmoc-Ala и Fmoc-His(Trt) применяют, в качестве аминокислот, защищенных Fmoc-группой, для получения на смоле, которая представляет собой твердую фазу, пептида, состоящего из 31-го аминокислотного остатка, следующего вида Gly-Arg(Pbf)-Gly-Lys(Boc)-Val-Leu-Trp(Boc)-Ala-Ile-Phe-Glu(OtBu)-Lys(Boc)-Ala-Ala-Gln(Trt)-Gly-Glu(OtBu)-Leu-Tyr(tBu)-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Cys(Trt)-Asp(OtBu)-Ser(tBu)-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Gly-Glu(OtBu)-Ala-His(Trt) (SEQ ID NO:44).

Полученную смолу с образовавшимся на ней пептидом частично переносят на колонку для твердофазного синтеза. Смесь трифторуксусная кислота: вода: TIPS (=95:2,5:2,5) добавляют так, чтобы смола была полностью погружена в жидкость и перемешивают при комнатной температуре в течение 3-х часов. Смолу удаляют фильтрованием, и реакционный раствор концентрируют при пониженном давлении. Полученный остаток очищают с помощью ВЭЖХ [колонка: SHISEIDO UG-120 (С18 5 мкм), ϕ 20×250 мм, градиент: раствор А: 0,1% TFA вода, раствор В: 0,09% TFA/10% вода/90% AN 8,0 мл/мин; 35→60%В, 20 мин, линейный градиент] и получают пептид, в котором 16Val GLP-1 заменен Cys.

Бромацетамидил-дисиало-олигосахарид (а) (продукт компании OTSUKA Chemical Co., Ltd.) (36 мг) и пептидную цепь, синтезированную выше (12 мг), растворяют в 100 мМ фосфатном буфере (рН 7,5, 1,2 мл) и оставляют для протекания реакции при 37°С в течение 4 часов. После того как исходные вещества будут полностью израсходованы и это будет подтверждено с помощью ВЭЖХ, реакционный раствор непосредственно подвергают очистке с помощью ВЭЖХ [колонка: SHISEIDO UG-120 (С18, 5 мкм), ϕ 20×250 мм, градиент: раствор А: 0,1% TFA вода, раствор В: 0,09% TFA/10% вода/90% AN 8,0 мл/мин; 35→60%В, 20 мин, линейный градиент] и получают 8,4 мг пептида GLP-1 с присоединенной олигосахаридной цепью, в котором 16Val GLP-1 заменен Cys с присоединенной олигосахаридной цепью (16Cys дисиало-GLP-1).

Пример 16

Синтез пептида GLP-1 с присоединенной олигосахаридной цепью 20Cys-дисиало

Колонку для твердофазного синтеза заполняют смолой Амино-PEGA (100 мкмоль) (продукт фирмы «Merck»), тщательно промывают дихлорметаном (DCM) и DMF и дают смоле полностью набухнуть в DMF. 4-Гидроксиметил-3-мстоксифеноксимасляную кислоту (НМРВ) (0,25 ммоль), TBTU (0,25 ммоль) и N-этилморфолин (0,25 ммоль) растворяют в DMF (2 мл), загружают в колонку и перемешивают при комнатной температуре в течение 4 часов. Смолу тщательно промывают с помощью DMF и DCM и получают смолу HMPB-PEG, которую применяют в качестве твердой фазы для твердофазного синтеза.

Fmoc-Gly (0,50 ммоль), MSNT (0,50 ммоль) и N-метилимидазол (0,375 ммоль) растворяют в DCM (2 мл), загружают в колонку для твердофазного синтеза и перемешивают при 25°С в течение 3-х часов.

После перемешивания, смолу промывают с помощью DCM и DMF. Fmoc-группу удаляют с помощью 20%-ного раствора пиперидина/DMF (2 мл) в течение 15 минут. После промывания с помощью DMF, аминокислоты последовательно конденсируют в соответствии с приведенным ниже способом удлинения псптидной цепи.

Аминокислоту, имеющую аминогруппу, защищенную Fmoc-группой, растворяют в N-метилпирролидоне (NMP) (1 мл). После добавления 0,45 М HCTU·HOBT/NMP (0,4 ммоль), полученную смесь загружают в колонку для твердофазного синтеза. Потом, к колонке для твердофазного синтеза добавляют 0,9 М DIPEA/NMP (0,8 ммоль). После перемешивания при комнатной температуре в течение 20-ти минут, смолу промывают с помощью DCM и DMF, и Fmoc-группу удаляют с помощью 20%-ного раствора пиперидина/DMF (2 мл) в течение 15 минут. Эту операцию проводят повторно, применяя аминокислоту, защищенную Fmoc-группой (0,5 ммоль), для последовательной конденсации аминокислот.

Fmoc-Gly, Fmoc-Arg(Pbf), Fmoc-Gly, Fmoc-Lys(Boc), Fmoc-Val, Fmoc-Leu, Fmoc-Trp(Boc), Fmoc-Ala, Fmoc-Ile, Fmoc-Phe, Fmoc-Glu(OtBu), Fmoc-Lys(Boc), Fmoc-Ala, Fmoc-Ala, Fmoc-Gln(Trt), Fmoc-Gly, Fmoc-Glu(OtBu), Fmoc-Cys(Trt), Fmoc-Tyr(tBu), Fmoc-Ser(tBu), Fmoc-Ser(tBu), Fmoc-Val, Fmoc-Asp(OtBu), Fmoc-Ser(tBu), Fmoc-Thr(tBu), Fmoc-Phe, Fmoc-Thr(tBu), Fmoc-Gly, Fmoc-Glu(OtBu), Fmoc-Ala и Fmoc-His(Trt) применяют, в качестве аминокислот, защищенных Fmoc-группой, для получения на смоле, которая представляет собой твердую фазу, пептида, состоящего из 31-го аминокислотного остатка, следующего вида Gly-Arg(Pbf)-Gly-Lys(Boc)-Val-Leu-Trp(Boc)-Ala-Ile-Phe-Glu(OtBu)-Lys(Boc)-Ala-Ala-Gln(Trt)-Gly-Glu(OtBu)-Cys(Trt)-Tyr(tBu)-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Val-Asp(OtBu)-Ser(tBu)-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Gly-Glu(OtBu)-Ala-His(Trt) (SEQ ID NO:45).

Полученную смолу с образовавшимся на ней пептидом частично переносят на колонку для твердофазного синтеза. Смесь трифторуксусная кислота: вода: TIPS (=95:2,5:2,5) добавляют так, чтобы смола была полностью погружена в жидкость и перемешивают при комнатной температуре в течение 3-х часов. Смолу удаляют фильтрованием, и реакционный раствор концентрируют при пониженном давлении. Полученный остаток очищают с помощью ВЭЖХ [колонка: SHISEIDO UG-120 (С18 5 мкм), ϕ 20×250 мм, градиент: раствор А: 0,1% TFA вода, раствор В: 0,09% TFA/10% вода/90% AN 8,0 мл/мин; 35→60%В, 20 мин, линейный градиент] и получают пептид, в котором 20Leu GLP-1 заменен Cys.

Бромацетамидил-дисиало-олигосахарид (а) (продукт компании OTSUKA Chemical Co., Ltd.) (36,9 мг) и пептидную цепь, синтезированную выше (12,3 мг), растворяют в 100 мМ фосфатном буфере (рН 7,5, 1,5 мл) и оставляют для протекания реакции при 37°С в течение 4 часов. После того как исходные вещества будут полностью израсходованы и это будет подтверждено с помощью ВЭЖХ, реакционный раствор непосредственно подвергают очистке с помощью ВЭЖХ [колонка: SHISEIDO UG-120 (С18, 5 мкм), ϕ 20×250 мм, градиент: раствор А: 0,1% TFA вода, раствор В: 0,09% TFA/10% вода/90% AN 8,0 мл/мин; 35→60%В, 20 мин, линейный градиент] и получают 13,4 мг пептида GLP-1 с присоединенной олигосахаридной цепью, в котором 20Leu GLP-1 заменен Cys с присоединенной олигосахаридной цепью (20Cys диеиало-GLP-1).

Пример 17

Синтез пептида GLP-1 с присоединенной олигосахаридной цепью 24Cys-дисиало

Колонку для твердофазного синтеза заполняют смолой Амино-PEGA (100 мкмоль) (продукт фирмы «Merck»), тщательно промывают дихлорметаном (DCM) и DMF и дают смоле полностью набухнуть в DMF. 4-Гидроксиметил-3-метоксифеноксимасляную кислоту (НМРВ) (0,25 ммоль), TBTU (0,25 ммоль) и N-этилморфолин (0,25 ммоль) растворяют в DMF (2 мл), загружают в колонку и перемешивают при комнатной температуре в течение 4 часов. Смолу тщательно промывают с помощью DMF и DCM и получают смолу HMPB-PEG, которую применяют в качестве твердой фазы для твердофазного синтеза.

Fmoc-Gly (0,50 ммоль), MSNT (0,50 ммоль) и N-метилимидазол (0,375 ммоль) растворяют в DCM (2 мл), загружают в колонку для твердофазного синтеза и перемешивают при 25°С в течение 3-х часов.

После перемешивания, смолу промывают с помощью DCM и DMF. Fmoc-группу удаляют с помощью 20%-ного раствора пиперидина/DMF (2 мл) в течение 15 минут. После промывания с помощью DMF, аминокислоты последовательно конденсируют в соответствии с приведенным ниже способом удлинения пептидной цепи.

Аминокислоту, имеющую аминогруппу, защищенную Fmoc-группой, растворяют в N-метилпирролидоне (NMP) (1 мл). После добавления 0,45 М HCTU·HOBT/NMP (0,4 ммоль), полученную смесь загружают в колонку для твердофазного синтеза. Потом, к колонке для твердофазного синтеза добавляют 0,9 М DIPEA/NMP (0,8 ммоль). После перемешивания при комнатной температуре в течение 20-ти минут, смолу промывают с помощью DCM и DMF, и Fmoc-группу удаляют с помощью 20%-ного раствора пиперидина/DMF (2 мл) в течение 15 минут. Эту операцию проводят повторно, применяя аминокислоту, защищенную Fmoc-группой (0,5 ммоль), для последовательной конденсации аминокислот.

Fmoc-Gly, Fmoc-Arg(Pbf), Fmoc-Gly, Fmoc-Lys(Boc), Fmoc-Val, Fmoc-Leu, Fmoc-Trp(Boc), Fmoc-Ala, Fmoc-Ile, Fmoc-Phe, Fmoc-Glu(OtBu), Fmoc-Lys(Boc), Fmoc-Ala, Fmoc-Cys(Trt), Fmoc-Gln(Trt), Fmoc-Gly, Fmoc-Glu(OtBu), Fmoc-Leu, Fmoc-Tyr(tBu), Fmoc-Ser(tBu), Fmoc-Ser(tBu), Fmoc-Val, Fmoc-Asp(OtBu), Fmoc-Ser(tBu), Fmoc-Thr(tBu), Fmoc-Phe, Fmoc-Thr(tBu), Fmoc-Gly, Fmoc-Glu(OtBu), Fmoc-Ala и Fmoc-His(Trt) применяют, в качестве аминокислот, защищенных Fmoc-группой, для получения на смоле, которая представляет собой твердую фазу, пептида, состоящего из 31-го аминокислотного остатка, следующего вида Gly-Arg(Pbf)-Gly-Lys(Boc)-Val-Leu-Trp(Boc)-Ala-Ile-Phe-Glu(OtBu)-Lys(Boc)-Ala-Cys(Trt)-Gln(Trt)-Gly-Glu(OtBu)-Leu-Tyr(tBu)-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Val-Asp(OtBu)-Ser(tBu)-Thr(tBu)-Phc-Thr(tBu)-Gly-Glu(OtBu)-Ala-His(Trt) (SEQ ID NO:46).

Полученную смолу с образовавшимся на ней пептидом частично переносят на колонку для твердофазного синтеза. Смесь трифторуксусная кислота: вода: TIPS (=95:2,5:2,5) добавляют так, чтобы смола была полностью погружена в жидкость и перемешивают при комнатной температуре в течение 3-х часов. Смолу удаляют фильтрованием, и реакционный раствор концентрируют при пониженном давлении. Полученный остаток очищают с помощью ВЭЖХ [колонка: SHISEIDO UG-120 (C18 5 мкм), ϕ 20×250 мм, градиент: раствор А: 0,1% TFA вода, раствор В: 0,09% TFA/10% вода/90% AN 8,0 мл/мин; 35→60%В, 20 мин, линейный градиент] и получают пептид, в котором 24А1а GLP-1 заменен Cys.

Бромацетамидил-дисиало-олигосахарид (а) (продукт компании OTSUKA Chemical Co., Ltd.) (6,6 мг) и пептидную цепь, синтезированную выше (2,2 мг), растворяют в 100 мМ фосфатном буфере (рН 7,5, 250 мкл) и оставляют для протекания реакции при 37°С в течение 4 часов. После того как исходные вещества будут полностью израсходованы и это будет подтверждено с помощью ВЭЖХ, реакционный раствор непосредственно подвергают очистке с помощью ВЭЖХ [колонка: SHISEIDO UG-120 (C18, 5 мкм), ϕ 4,6×250 мм, градиент: раствор А: 0,1% TFA вода, раствор В: 0,09% TFA/10% вода/90% AN 0,7 мл/мин; 35→60%В, 20 мин, линейный градиент] и получают 1,8 мг пептида GLP-1 с присоединенной олигосахаридной цепью, в котором 24А1а GLP-1 заменен Cys с присоединенной олигосахаридной цепью (24Cys дисиало-GLP-1).

Пример 18

Синтез пептида GLP-1 с присоединенной олигосахаридной цепью 25Cys-дисиало

Колонку для твердофазного синтеза заполняют смолой Амино-PEGA (100 мкмоль) (продукт фирмы «Merck»), тщательно промывают дихлорметаном (DCM) и DMF и дают смоле полностью набухнуть в DMF. 4-Гидроксиметил-3-метоксифеноксимасляную кислоту (НМРВ) (0,25 ммоль), TBTU (0,25 ммоль) и N-этилморфолин (0,25 ммоль) растворяют в DMF (2 мл), загружают в колонку и перемешивают при комнатной температуре в течение 4 часов. Смолу тщательно промывают с помощью DMF и DCM и получают смолу HMPB-PEG, которую применяют в качестве твердой фазы для твердофазного синтеза.

Fmoc-Gly (0,50 ммоль), MSNT (0,50 ммоль) и N-метилимидазол (0,375 ммоль) растворяют в DCM (2 мл), загружают в колонку для твердофазного синтеза и перемешивают при 25°С в течение 3-х часов.

После перемешивания, смолу промывают с помощью DCM и DMF. Fmoc-группу удаляют с помощью 20%-ного раствора пиперидина/DMF (2 мл) в течение 15 минут. После промывания с помощью DMF, аминокислоты последовательно конденсируют в соответствии с приведенным ниже способом удлинения пептидной цепи.

Аминокислоту, имеющую аминогруппу, защищенную Fmoc-группой, растворяют в N-метилпирролидоне (NMP) (1 мл). После добавления 0,45 М HCTU·HOBT/NMP (0,4 ммоль), полученную смесь загружают в колонку для твердофазного синтеза. Потом, к колонке для твердофазного синтеза добавляют 0,9 М DIPEA/NMP (0,8 ммоль). После перемешивания при комнатной температуре в течение 20-ти минут, смолу промывают с помощью DCM и DMF, и Fmoc-группу удаляют с помощью 20%-ного раствора пиперидина/DMF (2 мл) в течение 15 минут. Эту операцию проводят повторно, применяя аминокислоту, защищенную Fmoc-группой (0,5 ммоль), для последовательной конденсации аминокислот.

Fmoc-Gly, Fmoc-Arg(Pbf), Fmoc-Gly, Fmoc-Lys(Boc), Fmoc-Val, Fmoc-Leu, Fmoc-Trp(Boc), Fmoc-Ala, Fmoc-Ile, Fmoc-Phe, Fmoc-Glu(OtBu), Fmoc-Lys(Boc), Fmoc-Cys(Trt), Fmoc-Ala, Fmoc-Gln(Trt), Fmoc-Gly, Fmoc-Glu(OtBu), Fmoc-Leu, Fmoc-Tyr(tBu), Fmoc-Ser(tBu), Fmoc-Ser(tBu), Fmoc-Val, Fmoc-Asp(OtBu), Fmoc-Ser(tBu), Fmoc-Thr(tBu), Fmoc-Phe, Fmoc-Thr(tBu), Fmoc-Gly, Fmoc-Glu(OtBu), Fmoc-Ala и Fmoc-His(Trt) применяют, в качестве аминокислот, защищенных Fmoc-группой, для получения на смоле, которая представляет собой твердую фазу, пептида, состоящего из 31-го аминокислотного остатка, следующего вида Gly-Arg(Pbf)-Gly-Lys(Boc)-Val-Leu-Trp(Boc)-Ala-Ile-Phe-Glu(OtBu)-Lys(Boc)-Cys(Trt)-Ala-Gln(Trt)-Gly-Glu(OtBu)-Leu-Tyr(tBu)-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Val-Asp(OtBu)-Ser(tBu)-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Gly-Glu(OtBu)-Ala-His(Trt) (SEQ ID NO:47).

Полученную смолу с образовавшимся на ней пептидом частично переносят на колонку для твердофазного синтеза. Смесь трифторуксусная кислота: вода: TIPS (=95:2,5:2,5) добавляют так, чтобы смола была полностью погружена в жидкость и перемешивают при комнатной температуре в течение 3-х часов. Смолу удаляют фильтрованием, и реакционный раствор концентрируют при пониженном давлении. Полученный остаток очищают с помощью ВЭЖХ [колонка: SHISEIDO UG-120 (C18 5 мкм), ϕ 20×250 мм, градиент: раствор А: 0,1% TFA вода, раствор В: 0,09% TFA/10% вода/90% AN 8,0 мл/мин; 35→60%В, 20 мин, линейный градиент] и получают пептид, в котором 25Ala GLP-1 заменен Cys.

Бромацетамидил-дисиало-олигосахарид (а) (продукт компании OTSUKA Chemical Co., Ltd.) (28 мг) и пептидную цепь, синтезированную выше (8,3 мг) растворяют в 100 мМ фосфатном буфере (рН 7,5, 830 мкл) и оставляют для протекания реакции при 37°С в течение 4 часов. После того как исходные вещества будут полностью израсходованы и это будет подтверждено с помощью ВЭЖХ, реакционный раствор непосредственно подвергают очистке с помощью ВЭЖХ [колонка: SHISEIDO UG-120 (C18, 5 мкм), ϕ 4,6×250 мм, градиент: раствор А: 0,1% TFA вода, раствор В: 0,09% TFA/10% вода/90% AN 8,0 мл/мин; 35→60%В, 20 мин, линейный градиент] и получают 5,6 мг пептида GLP-1 с присоединенной олигосахаридной цепью, в котором 25Ala GLP-1 заменен Cys с присоединенной олигосахаридной цепью (25Cys дисиало-GLP-1).

Пример 19

Синтез пептида GLP-1 с присоединенной олигосахаридной цепью 27Cys-дисиало

Колонку для твердофазного синтеза заполняют смолой Амино-PEGA (100 мкмоль) (продукт фирмы «Merck»), тщательно промывают дихлорметаном (DCM) и DMF и дают смоле полностью набухнуть в DMF. 4-Гидроксиметил-3-метоксифеноксимасляную кислоту (НМРВ) (0,25 ммоль), TBTU (0,25 ммоль) и N-этилморфолин (0,25 ммоль) растворяют в DMF (2 мл), загружают в колонку и перемешивают при комнатной температуре в течение 4 часов. Смолу тщательно промывают с помощью DMF и DCM и получают смолу HMPB-PEG, которую применяют в качестве твердой фазы для твердофазного синтеза.

Fmoc-Gly (0,50 ммоль), MSNT (0,50 ммоль) и N-метилимидазол (0,375 ммоль) растворяют в DCM (2 мл), загружают в колонку для твердофазного синтеза и перемешивают при 25°С в течение 3-х часов.

После перемешивания, смолу промывают с помощью DCM и DMF. Fmoc-группу удаляют с помощью 20%-ного раствора пиперидина/DMF (2 мл) в течение 15 минут. После промывания с помощью DMF, аминокислоты последовательно конденсируют в соответствии с приведенным ниже способом удлинения пептидной цепи.

Аминокислоту, имеющую аминогруппу, защищенную Fmoc-группой, растворяют в N-метилпирролидоне (NMP) (1 мл). После добавления 0,45 М HCTU·HOBT/NMP (0,4 ммоль), полученную смесь загружают в колонку для твердофазного синтеза. Потом, к колонке для твердофазного синтеза добавляют 0,9 М DIPEA/NMP (0,8 ммоль). После перемешивания при комнатной температуре в течение 20-ти минут, смолу промывают с помощью DCM и DMF, и Fmoc-группу удаляют с помощью 20%-ного раствора пиперидина/DMF (2 мл) в течение 15 минут. Эту операцию проводят повторно, применяя аминокислоту, защищенную Fmoc-группой (0,5 ммоль), для последовательной конденсации аминокислот.

Fmoc-Gly, Fmoc-Arg(Pbf), Fmoc-Gly, Fmoc-Lys(Boc), Fmoc-Val, Fmoc-Leu, Fmoc-Trp(Boc), Fmoc-Ala, Fmoc-Ile, Fmoc-Phe, Fmoc-Cys(Trt), Fmoc-Lys(Boc), Fmoc-Ala, Fmoc-Ala, Fmoc-Gln(Trt), Fmoc-Gly, Fmoc-Glu(OtBu), Fmoc-Leu, Fmoc-Tyr(tBu), Fmoc-Ser(tBu), Fmoc-Ser(tBu), Fmoc-Val, Fmoc-Asp(OtBu), Fmoc-Ser(tBu), Fmoc-Thr(tBu), Fmoc-Phe, Fmoc-Thr(tBu), Fmoc-Gly, Fmoc-Glu(OtBu), Fmoc-Ala и Fmoc-His(Trt) применяют, в качестве аминокислот, защищенных Fmoc-группой, для получения на смоле, которая представляет собой твердую фазу, пептида, состоящего из 31-го аминокислотного остатка, следующего вида Gly-Arg(Pbf)-Gly-Lys(Boc)-Val-Leu-Trp(Boc)-Ala-Ile-Phe-Cys(Trt)-Lys(Boc)-Ala-Ala-Gln(Trt)-Gly-Glu(OtBu)-Leu-Tyr(tBu)-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Val-Asp(OtBu)-Ser(tBu)-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Gly-Glu(OtBu)-Ala-His(Trt) (SEQ ID NO:48).

Полученную смолу с образовавшимся на ней пептидом частично переносят на колонку для твердофазного синтеза. Смесь трифторуксусная кислота: вода: TIPS (=95:2,5:2,5) добавляют так, чтобы смола была полностью погружена в жидкость и перемешивают при комнатной температуре в течение 3-х часов. Смолу удаляют фильтрованием, и реакционный раствор концентрируют при пониженном давлении. Полученный остаток очищают с помощью ВЭЖХ [колонка: SHISEIDO UG-120 (C18 5 мкм), ϕ 20×250 мм, градиент: раствор А: 0,1% TFA вода, раствор В: 0,09% TFA/10% вода/90% AN 8,0 мл/мин; 35→60%В, 20 мин, линейный градиент] и получают пептид, в котором 27Glu GLP-1 заменен Cys.

Бромацетамидил-дисиало-олигосахарид (а) (продукт компании OTSUKA Chemical Co., Ltd.) (34 мг) и пептидную цепь, синтезированную выше (10,8 мг), растворяют в 100 мМ фосфатном буфере (рН 7,5, 1,1 мл) и оставляют для протекания реакции при 37°С в течение 4 часов. После того как исходные вещества будут полностью израсходованы и это будет подтверждено с помощью ВЭЖХ, реакционный раствор непосредственно подвергают очистке с помощью ВЭЖХ [колонка: SHISEIDO UG-120 (C18, 5 мкм), ϕ 20×250 мм, градиент: раствор А: 0,1% TFA вода, раствор В: 0,09% TFA/10% вода/90% AN 8 мл/мин; 35→60%В, 20 мин, линейный градиент] и получают 8,7 мг пептида GLP-1 с присоединенной олигосахаридной цепью, в котором 27Glu GLP-1 заменен Cys с присоединенной олигосахаридной цепью (27Cys дисиало-GLP-1).

Пример 20

Синтез пептида GLP-1 с присоединенной олигосахаридной цепью 28Cys-дисиало

Колонку для твердофазного синтеза заполняют смолой Амино-PEGA (100 мкмоль) (продукт фирмы «Merck»), тщательно промывают дихлорметаном (DCM) и DMF и дают смоле полностью набухнуть в DMF. 4-Гидроксиметил-3-метоксифеноксимасляную кислоту (НМРВ) (0,25 ммоль), TBTU (0,25 ммоль) и N-этилморфолин (0,25 ммоль) растворяют в DMF (2 мл), загружают в колонку и перемешивают при комнатной температуре в течение 4 часов. Смолу тщательно промывают с помощью DMF и DCM и получают смолу HMPB-PEG, которую применяют в качестве твердой фазы для твердофазного синтеза.

Fmoc-Gly (0,50 ммоль), MSNT (0,50 ммоль) и N-метилимидазол (0,375 ммоль) растворяют в DCM (2 мл), загружают в колонку для твердофазного синтеза и перемешивают при 25°С в течение 3-х часов.

После перемешивания, смолу промывают с помощью DCM и DMF. Fmoc-группу удаляют с помощью 20%-ного раствора пиперидина/DMF (2 мл) в течение 15 минут. После промывания с помощью DMF, аминокислоты последовательно конденсируют в соответствии с приведенным ниже способом удлинения пептидной цепи.

Аминокислоту, имеющую аминогруппу, защищенную Fmoc-группой, растворяют в N-метилпирролидоне (NMP) (1 мл). После добавления 0,45 М HCTU·HOBT/NMP (0,4 ммоль), полученную смесь загружают в колонку для твердофазного синтеза. Потом, к колонке для твердофазного синтеза добавляют 0,9 М DIPEA/NMP (0,8 ммоль). После перемешивания при комнатной температуре в течение 20-ти минут, смолу промывают с помощью DCM и DMF, и Fmoc-группу удаляют с помощью 20%-ного раствора пиперидина/DMF (2 мл) в течение 15 минут. Эту операцию проводят повторно, применяя аминокислоту, защищенную Fmoc-группой (0,5 ммоль), для последовательной конденсации аминокислот.

Fmoc-Gly, Fmoc-Arg(Pbf), Fmoc-Gly, Fmoc-Lys(Boc), Fmoc-Val, Fmoc-Leu, Fmoc-Trp(Boc), Fmoc-Ala, Fmoc-Ile, Fmoc-Cys(Trt), Fmoc-Glu(OtBu), Fmoc-Lys(Boc), Fmoc-Ala, Fmoc-Ala, Fmoc-Gln(Trt), Fmoc-Gly, Fmoc-Glu(OtBu), Fmoc-Leu, Fmoc-Tyr(tBu), Fmoc-Ser(tBu), Fmoc-Ser(tBu), Fmoc-Val, Fmoc-Asp(OtBu), Fmoc-Ser(tBu), Fmoc-Thr(tBu), Fmoc-Phe, Fmoc-Thr(tBu), Fmoc-Gly, Fmoc-Glu(OtBu), Fmoc-Ala и Fmoc-His(Trt) применяют, в качестве аминокислот, защищенных Fmoc-группой, для получения на смоле, которая представляет собой твердую фазу, пептида, состоящего из 31-го аминокислотного остатка, следующего вида Gly-Arg(Pbf)-Gly-Lys(Boc)-Val-Leu-Trp(Boc)-Ala-Ile-Cys(Trt)-Glu(OtBu)-Lys(Boc)-Ala-Ala-Gln(Trt)-Gly-Glu(OtBu)-Leu-Tyr(tBu)-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Val-Asp(OtBu)-Ser(tBu)-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Gly-Glu(OtBu)-Ala-His(Trt) (SEQ ID NO:49).

Полученную смолу с образовавшимся на ней пептидом частично переносят на колонку для твердофазного синтеза. Смесь трифторуксусная кислота: вода: TIPS (=95:2,5:2,5) добавляют так, чтобы смола была полностью погружена в жидкость и перемешивают при комнатной температуре в течение 3-х часов. Смолу удаляют фильтрованием, и реакционный раствор концентрируют при пониженном давлении. Полученный остаток очищают с помощью ВЭЖХ [колонка: SHISEIDO UG-120 (C18 5 мкм), ϕ 20×250 мм, градиент: раствор А: 0,1% TFA вода, раствор В: 0,09% TFA/10% вода/90% AN 8,0 мл/мин; 35→60%В, 20 мин, линейный градиент] и получают пептид, в котором 28Phe GLP-1 заменен Cys.

Бромацетамидил-дисиало-олигосахарид (а) (продукт компании OTSUKA Chemical Co., Ltd.) (30,6 мг) и пептидную цепь, синтезированную выше (10,2 мг), растворяют в 100 мМ фосфатном буфере (рН 7,5, 1,2 мл) и оставляют для протекания реакции при 37°С в течение 4 часов. После того как исходные вещества будут полностью израсходованы и это будет подтверждено с помощью ВЭЖХ, реакционный раствор непосредственно подвергают очистке с помощью ВЭЖХ [колонка: SHISEIDO UG-120 (C18, 5 мкм), ϕ 20×250 мм, градиент: раствор А: 0,1% TFA вода, раствор В: 0,09% TFA/10% вода/90% AN 8 мл/мин; 35→60%В, 20 мин, линейный градиент] и получают 10,3 мг пептида GLP-1 с присоединенной олигосахаридной цепью, в котором 28Phe GLP-1 заменен Cys с присоединенной олигосахаридной цепью (28Cys дисиало-GLP-1).

Пример 21

Синтез пептида GLP-1 с присоединенной олигосахаридной цепью 30Cys-дисиало

Колонку для твердофазного синтеза заполняют смолой Амино-PEGA (100 мкмоль) (продукт фирмы «Merck»), тщательно промывают дихлорметаном (DCM) и DMF и дают смоле полностью набухнуть в DMF. 4-Гидроксиметил-3-метоксифеноксимасляную кислоту (НМРВ) (0,25 ммоль), TBTU (0,25 ммоль) и N-этилморфолин (0,25 ммоль) растворяют в DMF (2 мл), загружают в колонку и перемешивают при комнатной температуре в течение 4 часов. Смолу тщательно промывают с помощью DMF и DCM и получают смолу HMPB-PEG, которую применяют в качестве твердой фазы для твердофазного синтеза.

Fmoc-Gly (0,50 ммоль), MSNT (0,50 ммоль) и N-метилимидазол (0,375 ммоль) растворяют в DCM (2 мл), загружают в колонку для твердофазного синтеза и перемешивают при 25°С в течение 3-х часов.

После перемешивания, смолу промывают с помощью DCM и DMF. Fmoc-группу удаляют с помощью 20%-ного раствора пиперидина/DMF (2 мл) в течение 15 минут. После промывания с помощью DMF, аминокислоты последовательно конденсируют в соответствии с приведенным ниже способом удлинения пептидной цепи.

Аминокислоту, имеющую аминогруппу, защищенную Fmoc-группой, растворяют в N-метилпирролидоне (NMP) (1 мл). После добавления 0,45 М HCTU·HOBT/NMP (0,4 ммоль), полученную смесь загружают в колонку для твердофазного синтеза. Потом, к колонке для твердофазного синтеза добавляют 0,9 М DIPEA/NMP (0,8 ммоль). После перемешивания при комнатной температуре в течение 20-ти минут, смолу промывают с помощью DCM и DMF, и Fmoc-группу удаляют с помощью 20%-ного раствора пиперидина/DMF (2 мл) в течение 15 минут. Эту операцию проводят повторно, применяя аминокислоту, защищенную Fmoc-группой (0,5 ммоль), для последовательной конденсации аминокислот.

Fmoc-Gly, Fmoc-Arg(Pbf), Fmoc-Gly, Fmoc-Lys(Boc), Fmoc-Val, Fmoc-Leu, Fmoc-Trp(Boc), Fmoc-Cys(Trt), Fmoc-Ile, Fmoc-Phe, Fmoc-Glu(OtBu), Fmoc-Lys(Boc), Fmoc-Ala, Fmoc-Ala, Fmoc-Gln(Trt), Fmoc-Gly, Fmoc-Glu(OtBu), Fmoc-Leu, Fmoc-Tyr(tBu), Fmoc-Ser(tBu), Fmoc-Ser(tBu), Fmoc-Val, Fmoc-Asp(OtBu), Fmoc-Ser(tBu), Fmoc-Thr(tBu), Fmoc-Phe, Fmoc-Thr(tBu), Fmoc-Gly, Fmoc-Glu(OtBu), Fmoc-Ala и Fmoc-His(Trt) применяют, в качестве аминокислот, защищенных Fmoc-группой, для получения на смоле, которая представляет собой твердую фазу, пептида, состоящего из 31-го аминокислотного остатка, следующего вида Gly-Are(Pbf)-Gly-Lys(Вос)-Val-Leu-Trp(Вос)-Cys(Trt)-Ile-Phe-Glu(OtBu)-Lys(Boc)-Ala-Ala-Gln(Trt)-Gly-Glu(OtBu)-Leu-Tyr(tBu)-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Val-Asp(OtBu)-Ser(tBu)-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Gly-Glu(OtBu)-Ala-His(Trt) (SEQ ID NO:50).

Полученную смолу с образовавшимся на ней пептидом частично переносят на колонку для твердофазного синтеза. Смесь трифторуксусная кислота: вода: TIPS (=95:2,5:2,5) добавляют так, чтобы смола была полностью погружена в жидкость и перемешивают при комнатной температуре в течение 3-х часов. Смолу удаляют фильтрованием, и реакционный раствор концентрируют при пониженном давлении. Полученный остаток очищают с помощью ВЭЖХ [колонка: SHISEIDO UG-120 (C18 5 мкм), ϕ 20×250 мм, градиент: раствор А: 0,1% TFA вода, раствор В: 0,09% TFA/10% вода/90% AN 8,0 мл/мин; 35→60%В, 20 мин, линейный градиент] и получают пептид, в котором 30Ala GLP-1 заменен Cys.

Бромацетамидил-дисиало-олигосахарид (а) (продукт компании OTSUKA Chemical Co., Ltd.) (21,3 мг) и пептидную цепь, синтезированную выше (7,1 мг), растворяют в 100 мМ фосфатном буфере (рН 7,5, 0,7 мл) и оставляют для протекания реакции при 37°С в течение 4 часов. После того как исходные вещества будут полностью израсходованы и это будет подтверждено с помощью ВЭЖХ, реакционный раствор непосредственно подвергают очистке с помощью ВЭЖХ [колонка: SHISEIDO UG-120 (C18, 5 мкм), ϕ 20×250 мм, градиент: раствор А: 0,1% TFA вода, раствор В: 0,09% TFA/10% вода/90% AN 8,0 мл/мин; 35→60%В, 20 мин, линейный градиент] и получают 6,6 мг пептида GLP-1 с присоединенной олигосахаридной цепью, в котором 30Ala GLP-1 заменен Cys с присоединенной олигосахаридной цепью (30Cys дисиало-GLP-1).

Пример 22

Синтез пептида GLP-1 с присоединенной олигосахаридной цепью 32Cys-дисиало

Колонку для твердофазного синтеза заполняют смолой Амино-PEGA (100 мкмоль) (продукт фирмы «Merck»), тщательно промывают дихлорметаном (DCM) и DMF и дают смоле полностью набухнуть в DMF. 4-Гидроксиметил-3-метоксифеноксимасляную кислоту (НМРВ) (0,25 ммоль), TBTU (0,25 ммоль) и N-этилморфолин (0,25 ммоль) растворяют в DMF (2 мл), загружают в колонку и перемешивают при комнатной температуре в течение 4 часов. Смолу тщательно промывают с помощью DMF и DCM и получают смолу НМРВ-PEG, которую применяют в качестве твердой фазы для твердофазного синтеза.

Fmoc-Gly (0,50 ммоль), MSNT (0,50 ммоль) и N-метилимидазол (0,375 ммоль) растворяют в DCM (2 мл), загружают в колонку для твердофазного синтеза и перемешивают при 25°С в течение 3-х часов.

После перемешивания, смолу промывают с помощью DCM и DMF. Fmoc-группу удаляют с помощью 20%-ного раствора пиперидина/DMF (2 мл) в течение 15 минут. После промывания с помощью DMF, аминокислоты последовательно конденсируют в соответствии с приведенным ниже способом удлинения пептидной цепи.

Аминокислоту, имеющую аминогруппу, защищенную Fmoc-группой, растворяют в N-метилпирролидоне (NMP) (1 мл). После добавления 0,45 М HCTU·HOBT/NMP (0,4 ммоль), полученную смесь загружают в колонку для твердофазного синтеза. Потом, к колонке для твердофазного синтеза добавляют 0,9 М DIPEA/NMP (0,8 ммоль). После перемешивания при комнатной температуре в течение 20-ти минут, смолу промывают с помощью DCM и DMF, и Fmoc-группу удаляют с помощью 20%-ного раствора пиперидина/DMF (2 мл) в течение 15 минут. Эту операцию проводят повторно, применяя аминокислоту, защищенную Fmoc-группой (0,5 ммоль), для последовательной конденсации аминокислот.

Fmoc-Gly, Fmoc-Arg(Pbf), Fmoc-Gly, Fmoc-Lys(Boc), Fmoc-Val, Fmoc-Cys(Trt), Fmoc-Trp(Boc), Fmoc-Ala, Fmoc-Ile, Fmoc-Phe, Fmoc-Glu(OtBu), Fmoc-Lys(Boc), Fmoc-Ala, Fmoc-Ala, Fmoc-Gm(Trt), Fmoc-Gly, Fmoc-Glu(OtBu), Fmoc-Leu, Fmoc-Tyr(tBu), Fmoc-Ser(tBu), Fmoc-Ser(tBu), Fmoc-Val, Fmoc-Asp(OtBu), Fmoc-Ser(tBu), Fmoc-Thr(tBu), Fmoc-Phe, Fmoc-Thr(tBu), Fmoc-Gly, Fmoc-Glu(OtBu), Fmoc-Ala и Fmoc-His(Trt) применяют, в качестве аминокислот, защищенных Fmoc-группой, для получения на смоле, которая представляет собой твердую фазу, пептида, состоящего из 31-го аминокислотного остатка, следующего вида Gly-Arg(Pbf)-Gly-Lys(Boc)-Val-Cys(Trt)-Trp(Boc)-Ala-Ile-Phe-Glu(OtBu)-Lys(Boc)-Ala-Ala-Gln(Trt)-Gly-Glu(OtBu)-Leu-Tyr(tBu)-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Val-Asp(OtBu)-Ser(tBu)-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Gly-Glu(OtBu)-Ala-His(Trt) (SEQ ID NO:51).

Полученную смолу с образовавшимся на ней пептидом частично переносят на колонку для твердофазного синтеза. Смесь трифторуксусная кислота: вода: TIPS (=95:2,5:2,5) добавляют так, чтобы смола была полностью погружена в жидкость и перемешивают при комнатной температуре в течение 3-х часов. Смолу удаляют фильтрованием, и реакционный раствор концентрируют при пониженном давлении. Полученный остаток очищают с помощью ВЭЖХ [колонка: SHISEIDO UG-120 (C18 5 мкм), ϕ 20×250 мм, градиент: раствор А: 0,1% TFA вода, раствор В: 0,09% TFA/10% вода/90% AN 8,0 мл/мин; 35→60%В, 20 мин, линейный градиент] и получают пептид, в котором 32Leu GLP-1 заменен Cys.

Бромацетамидил-дисиало-олигосахарид (а) (продукт компании OTSUKA Chemical Co., Ltd.) (20 мг) и пептидную цепь, синтезированную выше (5,6 мг), растворяют в 100 мМ фосфатном буфере (рН 7,5, 600 мкл) и оставляют для протекания реакции при 37°С в течение 4 часов. После того как исходные вещества будут полностью израсходованы и это будет подтверждено с помощью ВЭЖХ, реакционный раствор непосредственно подвергают очистке с помощью ВЭЖХ [колонка: SHISEIDO UG-120 (C18, 5 мкм), ϕ 4,6×250 мм, градиент: раствор А: 0,1% TFA вода, раствор В: 0,09% TFA/10% вода/90% AN 0,7 мл/мин; 35→60%В, 20 мин, линейный градиент] и получают 3,5 мг пептида GLP-1 с присоединенной олигосахаридной цепью, в котором 32Leu GLP-1 заменен Cys с присоединенной олигосахаридной цепью (32Cys дисиало-GLP-1).

Пример 23

Синтез пептида GLP-1 с присоединенной олигосахаридной цепью 34Cys-дисиало

Колонку для твердофазного синтеза заполняют смолой Амино-PEGA (100 мкмоль) (продукт фирмы «Merck»), тщательно промывают дихлорметаном (DCM) и DMF и дают смоле полностью набухнуть в DMF. 4-Гидроксиметил-3-метоксифеноксимасляную кислоту (НМРВ) (0,25 ммоль), TBTU (0,25 ммоль) и N-этилморфолин (0,25 ммоль) растворяют в DMF (2 мл), загружают в колонку и перемешивают при комнатной температуре в течение 4 часов. Смолу тщательно промывают с помощью DMF и DCM и получают смолу HMPB-PEG, которую применяют в качестве твердой фазы для твердофазного синтеза.

Fmoc-Gly (0,50 ммоль), MSNT (0,50 ммоль) и N-метилимидазол (0,375 ммоль) растворяют в DCM (2 мл), загружают в колонку для твердофазного синтеза и перемешивают при 25°С в течение 3-х часов.

После перемешивания, смолу промывают с помощью DCM и DMF. Fmoc-группу удаляют с помощью 20%-ного раствора пиперидина/DMF (2 мл) в течение 15 минут. После промывания с помощью DMF, аминокислоты последовательно конденсируют в соответствии с приведенным ниже способом удлинения пептидной цепи.

Аминокислоту, имеющую аминогруппу, защищенную Fmoc-группой, растворяют в N-метилпирролидоне (NMP) (1 мл). После добавления 0,45 М HCTU·HOBT/NMP (0,4 ммоль), полученную смесь загружают в колонку для твердофазного синтеза. Потом, к колонке для твердофазного синтеза добавляют 0,9 М DIPEA/NMP (0,8 ммоль). После перемешивания при комнатной температуре в течение 20-ти минут, смолу промывают с помощью DCM и DMF, и Fmoc-группу удаляют с помощью 20%-ного раствора пиперидина/DMF (2 мл) в течение 15 минут. Эту операцию проводят повторно, применяя аминокислоту, защищенную Fmoc-группой (0,5 ммоль), для последовательной конденсации аминокислот.

Fmoc-Gly, Fmoc-Arg(Pbf), Fmoc-Gly, Fmoc-Cys(Trt), Fmoc-Val, Fmoc-Leu, Fmoc-Trp(Boc), Fmoc-Ala, Fmoc-Пе, Fmoc-Phe, Fmoc-Glu(OtBu), Fmoc-Lys(Boc), Fmoc-Ala, Fmoc-Ala, Fmoc-Gln(Trt), Fmoc-Gly, Fmoc-Glu(OtBu), Fmoc-Leu, Fmoc-Tyr(tBu), Fmoc-Ser(tBu), Fmoc-Ser(tBu), Fmoc-Val, Fmoc-Asp(OtBu), Fmoc-Ser(tBu), Fmoc-Thr(tBu), Fmoc-Phe, Fmoc-Thjr(tBu), Fmoc-Gly, Fmoc-Glu(OtBu), Fmoc-Ala и Fmoc-His(Trt) применяют, в качестве аминокислот, защищенных Fmoc-группой, для получения на смоле, которая представляет собой твердую фазу, пептида, состоящего из 31-го аминокислотного остатка, следующего вида Gly-Arg(Pbf)-Gly-Cys(Trt)-Val-Leu-Trp(Boc)-Ala-Ile-Phe-Glu(OtBu)-Lys(Boc)-Ala-Ala-Gln(Trt)-Gly-Glu(OtBu)-Leu-Tyr(tBu)-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Val-Asp(OtBu)-Ser(tBu)-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Gly-Glu(OtBu)-Ala-His(Trt) (SEQ ID NO:52).

Полученную смолу с образовавшимся на ней пептидом частично переносят на колонку для твердофазного синтеза. Смесь трифторуксусная кислота: вода: TIPS (=95:2,5:2,5) добавляют так, чтобы смола была полностью погружена в жидкость и перемешивают при комнатной температуре в течение 3-х часов. Смолу удаляют фильтрованием, и реакционный раствор концентрируют при пониженном давлении. Полученный остаток очищают с помощью ВЭЖХ [колонка: SHISEIDO UG-120 (C18 5 мкм), ϕ 20×250 мм, градиент: раствор А: 0,1% TFA вода, раствор В: 0,09% TFA/10% вода/90% AN 8,0 мл/мин; 35→60%В, 20 мин, линейный градиент] и получают пептид, в котором 34Lys GLP-1 заменен Cys.

Бромацетамидил-дисиало-олигосахарид (а) (продукт компании OTSUKA Chemical Co., Ltd.) (33 мг) и пептидную цепь, синтезированную выше (10,0 мг), растворяют в 100 мМ фосфатном буфере (рН 7,5, 1 мл) и оставляют для протекания реакции при 37°С в течение 4 часов. После того как исходные вещества будут полностью израсходованы и это будет подтверждено с помощью ВЭЖХ, реакционный раствор непосредственно подвергают очистке с помощью ВЭЖХ [колонка: SHISEIDO UG-120 (C18, 5 мкм), ϕ 20×250 мм, градиент: раствор А: 0,1% TFA вода, раствор В: 0,09% TFA/10% вода/90% AN 8,0 мл/мин; 35→60%В, 20 мин, линейный градиент] и получают 7,9 мг пептида GLP-1 с присоединенной олигосахаридной цепью, в котором 34Lys GLP-1 заменен Cys с присоединенной олигосахаридной цепью (34Cys дисиало-GLP-1).

Пример 24

Синтез пептида GLP-1 с присоединенной олигосахаридной цепью 22Cys-асиало

Колонку для твердофазного синтеза заполняют смолой Амино-PEGA (100 мкмоль) (продукт фирмы «Merck»), тщательно промывают дихлорметаном (DCM) и DMF и дают смоле полностью набухнуть в DMF. 4-Гидроксиметил-3-метоксифеноксимасляную кислоту (НМРВ) (0,25 ммоль), TBTU (0,25 ммоль) и N-этилморфолин (0,25 ммоль) растворяют в DMF (2 мл), загружают в колонку и перемешивают при комнатной температуре в течение 4 часов. Смолу тщательно промывают с помощью DMF и DCM и получают смолу HMPB-PEG, которую применяют в качестве твердой фазы для твердофазного синтеза.

Fmoc-Gly (0,50 ммоль), MSNT (0,50 ммоль) и N-метилимидазол (0,375 ммоль) растворяют в DCM (2 мл), загружают в колонку для твердофазного синтеза и перемешивают при 25°С в течение 3-х часов.

После перемешивания, смолу промывают с помощью DCM и DMF. Fmoc-группу удаляют с помощью 20%-ного раствора пиперидина/DMF (2 мл) в течение 15 минут. После промывания с помощью DMF, аминокислоты последовательно конденсируют в соответствии с приведенным ниже способом удлинения пептидной цепи.

Аминокислоту, имеющую аминогруппу, защищенную Fmoc-группой, растворяют в N-метилпирролидоне (NMP) (1 мл). После добавления 0,45 М HCTU·HOBT/NMP (0,4 ммоль), полученную смесь загружают в колонку для твердофазного синтеза. Потом, к колонке для твердофазного синтеза добавляют 0,9 М DIPEA/NMP (0,8 ммоль). После перемешивания при комнатной температуре в течение 20-ти минут, смолу промывают с помощью DCM и DMF, и Fmoc-группу удаляют с помощью 20%-ного раствора пиперидина/DMF (2 мл) в течение 15 минут. Эту операцию проводят повторно, применяя аминокислоту, защищенную Fmoc-группой (0,5 ммоль), для последовательной конденсации аминокислот.

Fmoc-Gly, Fmoc-Arg(Pbf), Fmoc-Gly, Fmoc-Lys(Boc), Fmoc-Val, Fmoc-Leu, Fmoc-Trp(Boc), Fmoc-Ala, Fmoc-Ile, Fmoc-Phe, Fmoc-Glu(OtBu), Fmoc-Lys(Boc), Fmoc-Ala, Fmoc-Ala, Fmoc-Gln(Trt), Fmoc-Cys(Trt), Fmoc-Glu(OtBu), Fmoc-Leu, Fmoc-Tyr(tBu), Fmoc-Ser(tBu), Fmoc-Ser(tBu), Fmoc-Val, Fmoc-Asp(OtBu), Fmoc-Ser(tBu), Fmoc-Thr(tBu), Fmoc-Phe, Fmoc-Thr(tBu), Fmoc-Gly, Fmoc-Glu(OtBu), Fmoc-Ala и Fmoc-His(Trt) применяют, в качестве аминокислот, защищенных Fmoc-группой, для получения на смоле, которая представляет собой твердую фазу, пептида, состоящего из 31-го аминокислотного остатка, следующего вида Gly-Arg(Pbf)-Gly-Lys(Boc)-Val-Leu-Trp(Boc)-AIa-Ile-Phe-Glu(OtBu)-Lys(Boc)-Ala-Ala-Gln(Trt)-Cys(Trt)-Glu(OtBu)-Leu-Tyr(tBu)-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Val-Asp(OtBu)-Ser(tBu)-Thr(tBu)-Phe-Thi(tBu)-Gly-Glu(OtBu)-Ala-His(Trt) (SEQ ID NO:53).

Полученную смолу с образовавшимся на ней пептидом частично переносят на колонку для твердофазного синтеза. Смесь трифторуксусная кислота: вода: TIPS (=95:2,5:2,5) добавляют так, чтобы смола была полностью погружена в жидкость и перемешивают при комнатной температуре в течение 3-х часов. Смолу удаляют фильтрованием, и реакционный раствор концентрируют при пониженном давлении. Полученный остаток очищают с помощью ВЭЖХ [колонка: SHISEIDO UG-120 (C18 5 мкм), ϕ 20×250 мм, градиент: раствор А: 0,1% TFA вода, раствор В: 0,09% TFA/10% вода/90% AN 8,0 мл/мин; 35→60%В, 20 мин, линейный градиент] и получают пептид, в котором 22Gly GLP-1 заменен Cys.

Бромацетамидил-дигалактозо-олигосахарид (с) (продукт компании OTSUKA Chemical Co., Ltd.) (15 мг)

[Формула 7]

и пептидную цепь, синтезированную выше (3,4 мг), растворяют в 100 мМ фосфатном буфере (рН 7,5, 340 мкл) и оставляют для протекания реакции при 37°С в течение 4 часов. После того как исходные вещества будут полностью израсходованы и это будет подтверждено с помощью ВЭЖХ, реакционный раствор непосредственно подвергают очистке с помощью ВЭЖХ [колонка: SHISEIDO UG-120 (C18, 5 мкм), ϕ 4,6×250 мм, градиент: раствор А: 0,1% TFA вода, раствор В: 0,09% TFA/10% вода/90% AN 0,7 мл/мин; 35→60%В, 20 мин, линейный градиент] и получают 0,7 мг пептида GLP-1 с присоединенной олигосахаридной цепью, в котором 22Gly GLP-1 заменен Cys с присоединенной олигосахаридной цепью (22Cys GLP-1-асиало-).

Пример 25

Синтез пептида GLP-1 с присоединенной олигосахаридной цепью 26Cys-асиало

Колонку для твердофазного синтеза заполняют смолой Амино-PEGA (100 мкмоль) (продукт фирмы «Merck»), тщательно промывают дихлорметаном (DCM) и DMF и дают смоле полностью набухнуть в DMF. 4-Гидроксиметил-3-метоксифеноксимасляную кислоту (НМРВ) (0,25 ммоль), TBTU (0,25 ммоль) и N-этилморфолин (0,25 ммоль) растворяют в DMF (2 мл), загружают в колонку и перемешивают при комнатной температуре в течение 4 часов. Смолу тщательно промывают с помощью DMF и DCM и получают смолу HMPB-PEG, которую применяют в качестве твердой фазы для твердофазного синтеза.

Fmoc-Gly (0,50 ммоль), MSNT (0,50 ммоль) и N-метилимидазол (0,375 ммоль) растворяют в DCM (2 мл), загружают в колонку для твердофазного синтеза и перемешивают при 25°С в течение 3-х часов.

После перемешивания, смолу промывают с помощью DCM и DMF. Fmoc-группу удаляют с помощью 20%-ного раствора пиперидина/DMF (2 мл) в течение 15 минут. После промывания с помощью DMF, аминокислоты последовательно конденсируют в соответствии с приведенным ниже способом удлинения пептидной цепи.

Аминокислоту, имеющую аминогруппу, защищенную Fmoc-группой, растворяют в N-метилпирролидоне (NMP) (1 мл). После добавления 0,45 М HCTU·HOBT/NMP (0,4 ммоль), полученную смесь загружают в колонку для твердофазного синтеза. Потом, к колонке для твердофазного синтеза добавляют 0,9 М DIPEA/NMP (0,8 ммоль). После перемешивания при комнатной температуре в течение 20-ти минут, смолу промывают с помощью DCM и DMF, и Fmoc-группу удаляют с помощью 20%-ного раствора пиперидина/DMF (2 мл) в течение 15 минут. Эту операцию проводят повторно, применяя аминокислоту, защищенную Fmoc-группой (0,5 ммоль), для последовательной конденсации аминокислот.

Fmoc-Gly, Fmoc-Arg(Pbf), Fmoc-Gly, Fmoc-Lys(Boc), Fmoc-Val, Fmoc-Leu, Fmoc-Trp(Boc), Fmoc-Ala, Fmoc-Ile, Fmoc-Phe, Fmoc-Glu(OtBu), Fmoc-Cys(Trt), Fmoc-Ala, Fmoc-Ala, Fmoc-Gln(Trt), Fmoc-Gly, Fmoc-Glu(OtBu), Fmoc-Leu, Fmoc-Tyr(tBu), Fmoc-Ser(tBu), Fmoc-Ser(tBu), Fmoc-Val, Fmoc-Asp(OtBu), Fmoc-Ser(tBu), Fmoc-Thr(tBu), Fmoc-Phe, Fmoc-Thr(tBu), Fmoc-Gly, Fmoc-Glu(OtBu), Fmoc-Ala и Fmoc-His(Trt) применяют, в качестве аминокислот, защищенных Fmoc-группой, для получения на смоле, которая представляет собой твердую фазу, пептида, состоящего из 31-го аминокислотного остатка, следующего вида Gly-Arg(Pbf)-Gly-Lys(Boc)-Val-Leu-Trp(Boc)-Ala-Ile-Phe-Glu(OtBu)-Cys(Trt)-Ala-Ala-Gln(Trt)-Gly-Glu(OtBu)-Leu-Tyr(tBu)-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Val-Asp(OtBu)-Ser(tBu)-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Gly-Glu(OtBu)-Ala-His(Trt) (SEQ ID NO:54).

Полученную смолу с образовавшимся на ней пептидом частично переносят на колонку для твердофазного синтеза. Смесь трифторуксусная кислота: вода: TIPS (=95:2,5:2,5) добавляют так, чтобы смола была полностью погружена в жидкость и перемешивают при комнатной температуре в течение 3-х часов. Смолу удаляют фильтрованием, и реакционный раствор концентрируют при пониженном давлении. Полученный остаток очищают с помощью ВЭЖХ [колонка: SHISEIDO UG-120 (C18 5 мкм), ϕ 20×250 мм, градиент: раствор А: 0,1% TFA вода, раствор В: 0,09% TFA/10% вода/90% AN 8,0 мл/мин; 35→60%В, 20 мин, линейный градиент] и получают пептид, в котором 26Lys GLP-1 заменен Cys.

Бромацетамидил-дигалактозо-олигосахарид (с) (продукт компании OTSUKA Chemical Co., Ltd.) (13 мг) и пептидную цепь, синтезированную выше (3,9 мг), растворяют в 100 мМ фосфатном буфере (рН 7,5, 400 мкл) и оставляют для протекания реакции при 37°С в течение 4 часов. После того как исходные вещества будут полностью израсходованы и это будет подтверждено с помощью ВЭЖХ, реакционный раствор непосредственно подвергают очистке с помощью ВЭЖХ [колонка: SHISEIDO UG-120 (С18, 5 мкм), ϕ 4,6×250 мм, градиент: раствор А: 0,1% TFA вода, раствор В: 0,09% TFA/10% вода/90% AN 0,7 мл/мин; 35→60%В, 20 мин, линейный градиент] и получают 1,0 мг пептида GLP-1 с присоединенной олигосахаридной цепью, в котором 26Lys GLP-1 заменен Cys с присоединенной олигосахаридной цепью (26Cys-асиало-GLP-1).

Пример 26

Синтез пептида GLP-1 с присоединенной олигосахаридной цепью 30Cys-асиало

Колонку для твердофазного синтеза заполняют смолой Амино-PEGA (100 мкмоль) (продукт фирмы «Merck»), тщательно промывают дихлорметаном (DCM) и DMF и дают смоле полностью набухнуть в DMF. 4-Гидроксиметил-3-метоксифеноксимасляную кислоту (НМРВ) (0,25 ммоль), TBTU (0,25 ммоль) и N-этилморфолин (0,25 ммоль) растворяют в DMF (2 мл), загружают в колонку и перемешивают при комнатной температуре в течение 4 часов. Смолу тщательно промывают с помощью DMF и DCM и получают смолу HMPB-PEG, которую применяют в качестве твердой фазы для твердофазного синтеза.

Fmoc-Gly (0,50 ммоль), MSNT (0,50 ммоль) и N-метилимидазол (0,375 ммоль) растворяют в DCM (2 мл), загружают в колонку для твердофазного синтеза и перемешивают при 25°С в течение 3-х часов.

После перемешивания, смолу промывают с помощью DCM и DMF. Fmoc-группу удаляют с помощью 20%-ного раствора пиперидина/DMF (2 мл) в течение 15 минут. После промывания с помощью DMF, аминокислоты последовательно конденсируют в соответствии с приведенным ниже способом удлинения пептидной цепи.

Аминокислоту, имеющую аминогруппу, защищенную Fmoc-группой, растворяют в N-метилпирролидоне (NMP) (1 мл). После добавления 0,45 М HCTU·HOBT/NMP (0,4 ммоль), полученную смесь загружают в колонку для твердофазного синтеза. Потом, к колонке для твердофазного синтеза добавляют 0,9 М DIPEA/NMP (0,8 ммоль). После перемешивания при комнатной температуре в течение 20-ти минут, смолу промывают с помощью DCM и DMF, и Fmoc-группу удаляют с помощью 20%-ного раствора пиперидина/DMF (2 мл) в течение 15 минут. Эту операцию проводят повторно, применяя аминокислоту, защищенную Fmoc-группой (0,5 ммоль), для последовательной конденсации аминокислот.

Fmoc-Gly, Fmoc-Arg(Pbf), Fmoc-Gly, Fmoc-Lys(Boc), Fmoc-Val, Fmoc-Leu, Fmoc-Trp(Boc), Fmoc-Cys(Trt), Fmoc-Ile, Fmoc-Phe, Fmoc-Glu(OtBu), Fmoc-Lys(Boc), Fmoc-Ala, Fmoc-Ala, Fmoc-Gln(Trt), Fmoc-Gly, Fmoc-Glu(OtBu), Fmoc-Leu, Fmoc-Tyr(tBu), Fmoc-Scr(tBu), Fmoc-Ser(tBu), Fmoc-Val, Fmoc-Asp(OtBu), Fmoc-Ser(tBu), Fmoc-Thr(tBu), Fmoc-Phe, Fmoc-Thr(tBu), Fmoc-Gly, Fmoc-Glu(OtBu), Fmoc-Ala и Fmoc-His(Trt) применяют, в качестве аминокислот, защищенных Fmoc-группой, для получения на смоле, которая представляет собой твердую фазу, пептида, состоящего из 31-го аминокислотного остатка, следующего вида Gly-Arg(Pbf)-Gly-Lys(Boc)-Val-Leu-Trp(Boc)-Cys(Trt)-Ile-Phe-Glu(OtBu)-Lys(Boc)-Ala-Ala-Gln(Trt)-Gly-Glu(OtBu)-Leu-Tyr(tBu)-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Val-Asp(OtBu)-Ser(tBu)-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Gly-Glu(OtBu)-Ala-His(Trt) (SEQ ID NO:55).

Полученную смолу с образовавшимся на ней пептидом частично переносят на колонку для твердофазного синтеза. Смесь трифторуксусная кислота: вода: TIPS (=95:2,5:2,5) добавляют так, чтобы смола была полностью погружена в жидкость и перемешивают при комнатной температуре в течение 3-х часов. Смолу удаляют фильтрованием, и реакционный раствор концентрируют при пониженном давлении. Полученный остаток очищают с помощью ВЭЖХ [колонка: SHISEIDO UG-120 (C18 5 мкм), ϕ 20×250 мм, градиент: раствор А: 0,1% TFA вода, раствор В: 0,09% TFA/10% вода/90% AN 8,0 мл/мин; 35→60%В, 20 мин, линейный градиент] и получают пептид, в котором 30Ala GLP-1 заменен Cys.

Бромацетамидил-дигалактозо-олигосахарид (с) (продукт компании OTSUKA Chemical Co., Ltd.) (9,0 мг) и пептидную цепь, синтезированную выше (4,1 мг), растворяют в 100 мМ фосфатном буфере (рН 7,5, 410 мкл) и оставляют для протекания реакции при 37°С в течение 4 часов. После того как исходные вещества будут полностью израсходованы и это будет подтверждено с помощью ВЭЖХ, реакционный раствор непосредственно подвергают очистке с помощью ВЭЖХ [колонка: SHISEIDO UG-120 (C18, 5 мкм), ϕ 4,6×250 мм, градиент: раствор А: 0,1% TFA вода, раствор В: 0,09% TFA/10% вода/90% AN 0,7 мл/мин; 35→60%В, 20 мин, линейный градиент] и получают 2,4 мг пептида GLP-1 с присоединенной олигосахаридной цепью, в котором 30Ala GLP-1 заменен Cys с присоединенной олигосахаридной цепью (30Cys-асиало-GLP-1).

Пример 27

Синтез пептида GLP-1 с присоединенной олигосахаридной цепью 34Cys-асиало

Колонку для твердофазного синтеза заполняют смолой Амино-PEGA (100 мкмоль) (продукт фирмы «Merck»), тщательно промывают дихлорметаном (DCM) и DMF и дают смоле полностью набухнуть в DMF. 4-Гидроксиметил-3-метоксифеноксимасляную кислоту (НМРВ) (0,25 ммоль), TBTU (0,25 ммоль) и N-этилморфолин (0,25 ммоль) растворяют в DMF (2 мл), загружают в колонку и перемешивают при комнатной температуре в течение 4 часов. Смолу тщательно промывают с помощью DMF и DCM и получают смолу HMPB-PEG, которую применяют в качестве твердой фазы для твердофазного синтеза.

Fmoc-Gly (0,50 ммоль), MSNT (0,50 ммоль) и N-метилимидазол (0,375 ммоль) растворяют в DCM (2 мл), загружают в колонку для твердофазного синтеза и перемешивают при 25°С в течение 3-х часов.

После перемешивания, смолу промывают с помощью DCM и DMF. Fmoc-группу удаляют с помощью 20%-ного раствора пиперидина/DMF (2 мл) в течение 15 минут. После промывания с помощью DMF, аминокислоты последовательно конденсируют в соответствии с приведенным ниже способом удлинения пептидной цепи.

Аминокислоту, имеющую аминогруппу, защищенную Fmoc-группой, растворяют в N-метилпирролидоне (NMP) (1 мл). После добавления 0,45 М HCTU·HOBT/NMP (0,4 ммоль), полученную смесь загружают в колонку для твердофазного синтеза. Потом, к колонке для твердофазного синтеза добавляют 0,9 М DIPEA/NMP (0,8 ммоль). После перемешивания при комнатной температуре в течение 20-ти минут, смолу промывают с помощью DCM и DMF, и Fmoc-группу удаляют с помощью 20%-ного раствора пиперидина/DMF (2 мл) в течение 15 минут. Эту операцию проводят повторно, применяя аминокислоту, защищенную Fmoc-группой (0,5 ммоль), для последовательной конденсации аминокислот.

Fmoc-Gty, Fmoc-Arg(Pbf), Fmoc-Gly, Fmoc-Cys(Trt), Fmoc-Val, Fmoc-Leu, Fmoc-Trp(Boc), Fmoc-Ala, Fmoc-Ile, Fmoc-Phe, Fmoc-Glu(OtBu), Fmoc-Lys(Boc), Fmoc-Ala, Fmoc-Ala, Fmoc-Gln(Trt), Fmoc-Gly, Fmoc-Glu(OtBu), Fmoc-Leu, Fmoc-Tyr(tBu), Fmoc-Ser(tBu), Fmoc-Ser(tBu), Fmoc-Val, Fmoc-Asp(OtBu), Fmoc-Ser(tBu), Fmoc-Thr(tBu), Fmoc-Phe, Fmoc-Thr(tBu), Fmoc-Gly, Fmoc-Glu(OtBu), Fmoc-Ala и Fmoc-His(Trt) применяют, в качестве аминокислот, защищенных Fmoc-группой, для получения пептида, состоящего из 31-го аминокислотного остатка, следующего вида Gly-Arg(Pbf)-Gly-Cys(Trt)-Val-Leu-Trp(Boc)-Ala-Ile-Phe-Glu(OtBu)-Lys(Boc)-Ala-Ala-Gln(Trt)-Gly-Glu(OtBu)-Leu-Tyr(tBu)-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Val-Asp(OtBu)-Ser(tBu)-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Gly-Glu(OtBu)-Ala-His(Trt) (SEQ ID NO:56) на смоле, которая представляет собой твердую фазу,.

Полученную смолу с образовавшимся на ней пептидом частично переносят на колонку для твердофазного синтеза. Смесь трифторуксусная кислота: вода: TIPS (=95:2,5:2,5) добавляют так, чтобы смола была полностью погружена в жидкость и перемешивают при комнатной температуре в течение 3-х часов. Смолу удаляют фильтрованием, и реакционный раствор концентрируют при пониженном давлении. Полученный остаток очищают с помощью ВЭЖХ [колонка: SHISEIDO UG-120 (C18 5 мкм), ϕ 20×250 мм, градиент: раствор А: 0,1% TFA вода, раствор В: 0,09% TFA/10% вода/90% AN 8,0 мл/мин; 35→60%В, 20 мин, линейный градиент] и получают пептид, в котором 34Lys GLP-1 заменен Cys.

Бромацетамидил-дигалактозо-олигосахарид (с) (продукт компании OTSUKA Chemical Co., Ltd.) (10 мг) и пептидную цепь, синтезированную выше (3,5 мг), растворяют в 100 мМ фосфатном буфере (рН 7,5, 350 мкл) и оставляют для протекания реакции при 37°С в течение 4 часов. После того как исходные вещества будут полностью израсходованы и это будет подтверждено с помощью ВЭЖХ, реакционный раствор непосредственно подвергают очистке с помощью ВЭЖХ [колонка: SHISEIDO UG-120 (С18, 5 мкм), ϕ 4,6×250 мм, градиент: раствор А: 0,1% TFA вода, раствор В: 0,09% TFA/10% вода/90% AN 0,7 мл/мин; 35→60%В, 20 мин, линейный градиент] и получают 2,2 мг пептида GLP-1а с присоединенной олигосахаридной цепью, в котором 34Lys GLP-1 заменен Cys с присоединенной олигосахаридной цепью (34Cys асиало-GLP-1).

Пример 28

Синтез пептида GLP-1 с присоединенной олигосахаридной цепью 36Cys-асиало

Колонку для твердофазного синтеза заполняют смолой Амино-PEGA (100 мкмоль) (продукт фирмы «Merck»), тщательно промывают дихлорметаном (DCM) и DMF и дают смоле полностью набухнуть в DMF. 4-Гидроксиметил-3-метоксифеноксимасляную кислоту (НМРВ) (0,25 ммоль), TBTU (0,25 ммоль) и N-этилморфолин (0,25 ммоль) растворяют в DMF (2 мл), загружают в колонку и перемешивают при комнатной температуре в течение 4 часов. Смолу тщательно промывают с помощью DMF и DCM и получают смолу HMPB-PEG, которую применяют в качестве твердой фазы для твердофазного синтеза.

Fmoc-Gly (0,50 ммоль), MSNT (0,50 ммоль) и N-метилимидазол (0,375 ммоль) растворяют в DCM (2 мл), загружают в колонку для твердофазного синтеза и перемешивают при 25°С в течение 3-х часов.

После перемешивания, смолу промывают с помощью DCM и DMF. Fmoc-группу удаляют с помощью 20%-ного раствора пиперидина/DMF (2 мл) в течение 15 минут. После промывания с помощью DMF, аминокислоты последовательно конденсируют в соответствии с приведенным ниже способом удлинения пептидной цепи.

Аминокислоту, имеющую аминогруппу, защищенную Fmoc-группой, растворяют в N-метилпирролидоне (NMP) (1 мл). После добавления 0,45 М HCTU·HOBT/NMP (0,4 ммоль), полученную смесь загружают в колонку для твердофазного синтеза. Потом, к колонке для твердофазного синтеза добавляют 0,9 М DIPEA/NMP (0,8 ммоль). После перемешивания при комнатной температуре в течение 20-ти минут, смолу промывают с помощью DCM и DMF, и Fmoc-группу удаляют с помощью 20%-ного раствора пиперидина/DMF (2 мл) в течение 15 минут. Эту операцию проводят повторно, применяя аминокислоту, защищенную Fmoc-группой (0,5 ммоль), для последовательной конденсации аминокислот.

Fmoc-Gly, Fmoc-Cys(Trt), Fmoc-Gly, Fmoc-Lys(Boc), Fmoc-Val, Fmoc-Leu, Fmoc-Trp(Boc), Fmoc-Ala, Fmoc-Ile, Fmoc-Phe, Fmoc-Glu(OtBu), Fmoc-Lys(Boe), Fmoc-Ala, Fmoc-Ala, Fmoc-Gln(Trt), Fmoc-Gly, Fmoc-Glu(OtBu), Fmoc-Leu, Fmoc-Tyr(tBu), Fmoc-Ser(tBu), Fmoc-Ser(tBu), Fmoc-Val, Fmoc-Asp(OtBu), Fmoc-Ser(tBu), Fmoc-Thr(tBu), Fmoc-Phe, Fmoc-Thr(tBu), Fmoc-Gly, Fmoc-Glu(OtBu), Fmoc-Ala и Fmoc-His(Trt) применяют, в качестве аминокислот, защищенных Fmoc-группой, для получения на смоле, которая представляет собой твердую фазу, пептида, состоящего из 31-го аминокислотного остатка, следующего вида Gly-Cys(Trt)-Gly-Lys(Boc)-Val-Lcu-Trp(Boc)-Ala-Ile-Phe-Glu(OtBu)-Lys(Boc)-Ala-Ala-Gln(Trt)-Gly-Glu(OtBu)-Leu-Tyr(tBu)-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Val-Asp(OtBu)-Ser(tBu)-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Gly-Glu(OtBu)-Ala-His(Trt) (SEQ ID NO:57).

Полученную смолу с образовавшимся на ней пептидом частично переносят на колонку для твердофазного синтеза. Смесь трифторуксусная кислота: вода: TIPS (=95:2,5:2,5) добавляют так, чтобы смола была полностью погружена в жидкость и перемешивают при комнатной температуре в течение 3-х часов. Смолу удаляют фильтрованием, и реакционный раствор концентрируют при пониженном давлении. Полученный остаток очищают с помощью ВЭЖХ [колонка: SHISEIDO UG-120 (C18 5 мкм), ϕ 20×250 мм, градиент: раствор А: 0,1% TFA вода, раствор В: 0,09% TFA/10% вода/90% AN 8,0 мл/мин; 35→60%В, 20 мин, линейный градиент] и получают пептид, в котором 36Arg GLP-1 заменен Cys.

Бромацетамидил-дигалактозо-олигосахарид (с) (продукт компании OTSUKA Chemical Co., Ltd.) (3,0 мг) и пептидную цепь, синтезированную выше (0,5 мг), растворяют в 100 мМ фосфатном буфере (рН 7,5, 100 мкл) и оставляют для протекания реакции при 37°С в течение 4 часов. После того как исходные вещества будут полностью израсходованы и это будет подтверждено с помощью ВЭЖХ, реакционный раствор непосредственно подвергают очистке с помощью ВЭЖХ [колонка: SHISEIDO UG-120 (С18, 5 мкм), ϕ 4,6×250 мм, градиент: раствор А: 0,1% TFA вода, раствор В: 0,09% TFA/10% вода/90% AN 0,7 мл/мин; 35→60%В, 20 мин, линейный градиент] и получают 0,2 мг пептида GLP-1 с присоединенной олигосахаридной цепью, в котором 36Arg GLP-1 заменен Cys с присоединенной олигосахаридной цепью (36Cys-асиало-GLP-1).

Пример 29

Синтез пептида GLP-1 с присоединенной олигосахаридной цепью 22Cys-диGlcNAc

Колонку для твердофазного синтеза заполняют смолой Амино-PEGA (100 мкмоль) (продукт фирмы «Merck»), тщательно промывают дихлорметаном (DCM) и DMF и дают смоле полностью набухнуть в DMF. 4-Гидроксиметил-3-метоксифеноксимасляную кислоту (НМРВ) (0,25 ммоль), TBTU (0,25 ммоль) и N-этилморфолин (0,25 ммоль) растворяют в DMF (2 мл), загружают в колонку и перемешивают при комнатной температуре в течение 4 часов. Смолу тщательно промывают с помощью DMF и DCM и получают смолу HMPB-PEG, которую применяют в качестве твердой фазы для твердофазного синтеза.

Fmoc-Gly (0,50 ммоль), MSNT (0,50 ммоль) и N-метилимидазол (0,375 ммоль) растворяют в DCM (2 мл), загружают в колонку для твердофазного синтеза и перемешивают при 25°С в течение 3-х часов.

После перемешивания, смолу промывают с помощью DCM и DMF. Fmoc-группу удаляют с помощью 20%-ного раствора пиперидина/DMF (2 мл) в течение 15 минут. После промывания с помощью DMF, аминокислоты последовательно конденсируют в соответствии с приведенным ниже способом удлинения пептидной цепи.

Аминокислоту, имеющую аминогруппу, защищенную Fmoc-группой, растворяют в N-мстилпирролидоне (NMP) (1 мл). После добавления 0,45 М HCTU·HOBT/NMP (0,4 ммоль), полученную смесь загружают в колонку для твердофазного синтеза. Потом, к колонке для твердофазного синтеза добавляют 0,9 М DIPEA/NMP (0,8 ммоль). После перемешивания при комнатной температуре в течение 20-ти минут, смолу промывают с помощью DCM и DMF, и Fmoc-группу удаляют с помощью 20%-ного раствора пиперидина/DMF (2 мл) в течение 15 минут. Эту операцию проводят повторно, применяя аминокислоту, защищенную Fmoc-группой (0,5 ммоль), для последовательной конденсации аминокислот.

Fmoc-Gly, Fmoc-Arg(Pbf), Fmoc-Gly, Fmoc-Lys(Boc), Fmoc-Val, Fmoc-Lcu, Fmoc-Trp(Boc), Fmoc-Ala, Fmoc-Ile, Fmoc-Phe, Fmoc-Glu(OtBu), Fmoc-Lys(Boc), Fmoc-Ala, Fmoc-Ala, Fmoe-Gln(Trt), Fmoc-Cys(Trt), Fmoc-Glu(OtBu), Fmoc-Leu, Fmoc-Tyr(tBu), Fmoc-Ser(tBu), Fmoc-Ser(tBu), Fmoc-Val, Fmoc-Asp(OtBu), Fmoc-Ser(tBu), Fmoc-Thi(tBu), Fmoc-Phe, Fmoc-Thr(tBu), Fmoc-Gly, Fmoc-Glu(OtBu), Fmoc-Ala и Fmoc-His(Trt) применяют, в качестве аминокислот, защищенных Fmoc-группой, для получения на смоле, которая представляет собой твердую фазу, пептида, состоящего из 31-го аминокислотного остатка, следующего вида Gly-Arg(Pbf)-Gly-Lys(Boc)-Val-Leu-Trp(Boc)-Ala-Ile-Phe-Glu(OtBu)-Lys(Boc)-Ala-Ala-Gln(Trt)-Cys(Trt)-Glu(OtBu)-Leu-Tyr(tBu)-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Val-Asp(OtBu)-Ser(tBu)-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Gly-Glu(OtBu)-Ala-His(Trt) (SEQ ID NO:58).

Полученную смолу с образовавшимся на ней пептидом частично переносят на колонку для твердофазного синтеза. Смесь трифторуксусная кислота: вода: TIPS (=95:2,5:2,5) добавляют так, чтобы смола была полностью погружена в жидкость и перемешивают при комнатной температуре в течение 3-х часов. Смолу удаляют фильтрованием, и реакционный раствор концентрируют при пониженном давлении. Полученный остаток очищают с помощью ВЭЖХ [колонка: SHISEIDO UG-120 (C18 5 мкм), ϕ 20×250 мм, градиент: раствор А: 0,1% TFA вода, раствор В: 0,09% TFA/10% вода/90% AN 8,0 мл/мин; 35→60%В, 20 мин, линейный градиент] и получают пептид, в котором 22Gly GLP-1 заменен Cys.

Бромацетамидил-ди-N-ацетилглюкозамин-олигосахарид (d) (продукт компании OTSUKA Chemical Co., Ltd.) (8,4 мг)

[Формула 8]

и пептидную цепь, синтезированную выше (3,4 мг), растворяют в 100 мМ фосфатном буфере (рН 7,5, 340 мкл) и оставляют для протекания реакции при 37°С в течение 4 часов. После того как исходные вещества будут полностью израсходованы и это будет подтверждено с помощью ВЭЖХ, реакционный раствор непосредственно подвергают очистке с помощью ВЭЖХ [колонка: SHISEIDO UG-120 (C18, 5 мкм), ϕ 4,6×250 мм, градиент: раствор А: 0,1% TFA вода, раствор В: 0,09% TFA/10% вода/90% AN 0,7 мл/мин; 35→60%В, 20 мин, линейный градиент] и получают 2,2 мг пептида GLP-1 с присоединенной олигосахаридной цепью, в котором 22Gly GLP-1 заменен Cys с присоединенной олигосахаридной цепью (22Cys ди-GlcNAc-GLP-1).

Пример 30

Синтез пептида GLP-1 с присоединенной олигосахаридной цепью 30Cys-диGlcNAc

Колонку для твердофазного синтеза заполняют смолой Амино-PEGA (100 мкмоль) (продукт фирмы «Merck»), тщательно промывают дихлорметаном (DCM) и DMF и дают смоле полностью набухнуть в DMF. 4-Гидроксиметил-3-метоксифеноксимасляную кислоту (НМРВ) (0,25 ммоль), TBTU (0,25 ммоль) и N-этилморфолин (0,25 ммоль) растворяют в DMF (2 мл), загружают в колонку и перемешивают при комнатной температуре в течение 4 часов. Смолу тщательно промывают с помощью DMF и DCM и получают смолу HMPB-PEG, которую применяют в качестве твердой фазы для твердофазного синтеза.

Fmoc-Gly (0,50 ммоль), MSNT (0,50 ммоль) и N-метилимидазол (0,375 ммоль) растворяют в DCM (2 мл), загружают в колонку для твердофазного синтеза и перемешивают при 25°С в течение 3-х часов.

После перемешивания, смолу промывают с помощью DCM и DMF. Fmoc-группу удаляют с помощью 20%-ного раствора пиперидина/DMF (2 мл) в течение 15 минут. После промывания с помощью DMF, аминокислоты последовательно конденсируют в соответствии с приведенным ниже способом удлинения пептидной цепи.

Аминокислоту, имеющую аминогруппу, защищенную Fmoc-группой, растворяют в N-метилпирролидоне (NMP) (1 мл). После добавления 0,45 М HCTU·HOBT/NMP (0,4 ммоль), полученную смесь загружают в колонку для твердофазного синтеза. Потом, к колонке для твердофазного синтеза добавляют 0,9 М DIPEA/NMP (0,8 ммоль). После перемешивания при комнатной температуре в течение 20-ти минут, смолу промывают с помощью DCM и DMF, и Fmoc-группу удаляют с помощью 20%-ного раствора пиперидина/DMF (2 мл) в течение 15 минут. Эту операцию проводят повторно, применяя аминокислоту, защищенную Fmoc-группой (0,5 ммоль), для последовательной конденсации аминокислот.

Fmoc-Gly, Fmoc-Arg(Pbf), Fmoc-Gly, Fmoc-Lys(Boc), Fmoc-Val, Fmoc-Leu, Fmoc-Trp(Boc), Fmoc-Cys(Trt), Fmoc-Ile, Fmoc-Phe, Fmoc-Glu(OtBu), Fmoc-Lys(Boc), Fmoc-Ala, Fmoc-Ala, Fmoc-Gln(Trt), Fmoc-Gly, Fmoc-Glu(OtBu), Fmoc-Leu, Fmoc-Tyr(tBu), Fmoc-Ser(tBu), Fmoc-Ser(tBu), Fmoc-Val, Fmoc-Asp(OtBu), Fmoc-Ser(tBu), Fmoc-Thr(tBu), Fmoc-Phe, Fmoc-Thr(tBu), Fmoc-Gly, Fmoc-Glu(OtBu), Fmoc-Ala и Fmoc-His(Trt) применяют, в качестве аминокислот, защищенных Fmoc-группой, для получения на смоле, которая представляет собой твердую фазу, пептида, состоящего из 31-го аминокислотного остатка, следующего вида Gly-Arg(Pbf)-Gly-Lys(Boc)-Val-Leu-Trp(Boc)-Cys(Trt)-Ile-Phe-Glu(OtBu)-Lys(Boc)-Ala-Ala-Gln(Trt)-Gly-Glu(OtBu)-Leu-Tyr(tBu)-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Val-Asp(OtBu)-Ser(tBu)-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Gly-Glu(OtBu)-Ala-His(Trt) (SEQ ID NO:59).

Полученную смолу с образовавшимся на ней пептидом частично переносят на колонку для твердофазного синтеза. Смесь трифторуксусная кислота: вода: TIPS (=95:2,5:2,5) добавляют так, чтобы смола была полностью погружена в жидкость и перемешивают при комнатной температуре в течение 3-х часов. Смолу удаляют фильтрованием, и реакционный раствор концентрируют при пониженном давлении. Полученный остаток очищают с помощью ВЭЖХ [колонка: SHISEIDO UG-120 (C18 5 мкм), ϕ 20×250 мм, градиент: раствор А: 0,1% TFA вода, раствор В: 0,09% TFA/10% вода/90% AN 8,0 мл/мин; 35→60%В, 20 мин, линейный градиент] и получают пептид, в котором ЗОА1а GLP-1 заменен Cys.

Бромацетамидил-ди-N-ацетилглюкозамин-олигосахарид (d) (продукт компании OTSUKA Chemical Co., Ltd.) (9,3 мг) и пептидную цепь, синтезированную выше (4,1 мг), растворяют в 100 мМ фосфатном буфере (рН 7,5, 410 мкл) и оставляют для протекания реакции при 37°С в течение 4 часов. После того как исходные вещества будут полностью израсходованы и это будет подтверждено с помощью ВЭЖХ, реакционный раствор непосредственно подвергают очистке с помощью ВЭЖХ [колонка: SHISEIDO UG-120 (С18, 5 мкм), ϕ 4,6×250 мм, градиент: раствор А: 0,1% TFA вода, раствор В: 0,09% TFA/10% вода/90% AN 0,7 мл/мин; 35→60%В, 20 мин, линейный градиент] и получают 2,2 мг пептида GLP-1 с присоединенной олигосахаридной цепью, в котором 30Ala GLP-1 заменен Cys с присоединенной олигосахаридной цепью (30Cys ди-GlcNAc-GLP-1).

Пример 31

Синтез пептида GLP-1 с присоединенной олигосахаридной цепью 34Cys-диGlcNAc

Колонку для твердофазного синтеза заполняют смолой Амино-PEGA (100 мкмоль) (продукт фирмы «Merck»), тщательно промывают дихлорметаном (DCM) и DMF и дают смоле полностью набухнуть в DMF. 4-Гидроксиметил-3-метоксифеноксимасляную кислоту (НМРВ) (0,25 ммоль), TBTU (0,25 ммоль) и N-этилморфолин (0,25 ммоль) растворяют в DMF (2 мл), загружают в колонку и перемешивают при комнатной температуре в течение 4 часов. Смолу тщательно промывают с помощью DMF и DCM и получают смолу HMPB-PEG, которую применяют в качестве твердой фазы для твердофазного синтеза.

Fmoc-Gly (0,50 ммоль), MSNT (0,50 ммоль) и N-метилимидазол (0,375 ммоль) растворяют в DCM (2 мл), загружают в колонку для твердофазного синтеза и перемешивают при 25°С в течение 3-х часов.

После перемешивания, смолу промывают с помощью DCM и DMF. Fmoc-группу удаляют с помощью 20%-ного раствора пиперидина/DMF (2 мл) в течение 15 минут. После промывания с помощью DMF, аминокислоты последовательно конденсируют в соответствии с приведенным ниже способом удлинения пептидной цепи.

Аминокислоту, имеющую аминогруппу, защищенную Fmoc-группой, растворяют в N-метилпирролидоне (NMP) (1 мл). После добавления 0,45 М HCTU·HOBT/NMP (0,4 ммоль), полученную смесь загружают в колонку для твердофазного синтеза. Потом, к колонке для твердофазного синтеза добавляют 0,9 М DIPEA/NMP (0,8 ммоль). После перемешивания при комнатной температуре в течение 20-ти минут, смолу промывают с помощью DCM и DMF, и Fmoc-группу удаляют с помощью 20%-ного раствора пиперидина/DMF (2 мл) в течение 15 минут. Эту операцию проводят повторно, применяя аминокислоту, защищенную Fmoc-группой (0,5 ммоль), для последовательной конденсации аминокислот.

Fmoc-Gly, Fmoc-Arg(Pbf), Fmoc-Gly, Fmoc-Cys(Trt), Fmoc-Val, Fmoc-Leu, Fmoc-Trp(Boc), Fmoc-Ala, Fmoc-Ile, Fmoc-Phe, Fmoc-Glu(OtBu), Fmoc-Lys(Boc), Fmoc-Ala, Fmoc-Ala, Fmoc-Gm(Trt), Fmoc-Gly, Fmoc-Glu(OtBu), Fmoc-Leu, Fmoc-Tyr(tBu), Fmoc-Ser(tBu), Fmoc-Ser(tBu), Fmoc-Val, Fmoc-Asp(OtBu), Fmoc-Ser(tBu), Fmoc-Thr(tBu), Fmoc-Phe, Fmoc-Thr(tBu), Fmoc-Gly, Fmoc-Glu(OtBu), Fmoc-Ala и Fmoc-His(Trt) применяют, в качестве аминокислот, защищенных Fmoc-группой, для получения на смоле, которая представляет собой твердую фазу, пептида, состоящего из 31-го аминокислотного остатка, следующего вида Gly-Arg(Pbf)-Gly-Cys(Trt)-Val-Leu-Trp(Boc)-Ala-Ile-Phe-Glu(OtBu)-Lys(Boc)-Ala-Ala-Gln(Trt)-Gly-Glu(OtBu)-Leu-Tyr(tBu)-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Val-Asp(OtBu)-Ser(tBu)-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Gly-Glu(OtBu)-Ala-His(Trt) (SEQ ID NO:60).

Полученную смолу с образовавшимся на ней пептидом частично переносят на колонку для твердофазного синтеза. Смесь трифторуксусная кислота: вода: TIPS (=95:2,5:2,5) добавляют так, чтобы смола была полностью погружена в жидкость и перемешивают при комнатной температуре в течение 3-х часов. Смолу удаляют фильтрованием, и реакционный раствор концентрируют при пониженном давлении. Полученный остаток очищают с помощью ВЭЖХ [колонка: SHISEIDO UG-120 (C18 5 мкм), ϕ 20×250 мм, градиент: раствор А: 0,1% TFA вода, раствор В: 0,09% TFA/10% вода/90% AN 8,0 мл/мин; 35→60%В, 20 мин, линейный градиент] и получают пептид, в котором 34Lys GLP-1 заменен Cys.

Бромацетамидил-ди-N-ацетилглюкозамин-олигосахарид (d) (продукт компании OTSUKA Chemical Co., Ltd.) (12 мг) и пептидную цепь, синтезированную выше (3,9 мг), растворяют в 100 мМ фосфатном буфере (рН 7,5, 390 мкл) и оставляют для протекания реакции при 37°С в течение 4 часов. После того как исходные вещества будут полностью израсходованы и это будет подтверждено с помощью ВЭЖХ, реакционный раствор непосредственно подвергают очистке с помощью ВЭЖХ [колонка: SHISEIDO UG-120 (C18, 5 мкм), ϕ 4,6×250 мм, градиент: раствор А: 0,1% TFA вода, раствор В: 0,09% TFA/10% вода/90% AN 0,7 мл/мин; 35→60%В, 20 мин, линейный градиент] и получают 1,5 мг пептида GLP-1 с присоединенной олигосахаридной цепью, в котором 34Lys GLP-1 заменен Cys с присоединенной олигосахаридной цепью (34Cys ди-GlcNAc-GLP-1).

Пример 32

Синтез пептида GLP-1 с присоединенной олигосахаридной цепью 22Cys-диманнозо

Колонку для твердофазного синтеза заполняют смолой Амино-PEGA (100 мкмоль) (продукт фирмы «Merek»), тщательно промывают дихлорметаном (DCM) и DMF и дают смоле полностью набухнуть в DMF. 4-Гидроксиметил-3-метоксифеноксимасляную кислоту (НМРВ) (0,25 ммоль), TBTU (0,25 ммоль) и N-этилморфолин (0,25 ммоль) растворяют в DMF (2 мл), загружают в колонку и перемешивают при комнатной температуре в течение 4 часов. Смолу тщательно промывают с помощью DMF и DCM и получают смолу HMPB-PEG, которую применяют в качестве твердой фазы для твердофазного синтеза.

Fmoc-Gly (0,50 ммоль), MSNT (0,50 ммоль) и N-метилимидазол (0,375 ммоль) растворяют в DCM (2 мл), загружают в колонку для твердофазного синтеза и перемешивают при 25°С в течение 3-х часов.

После перемешивания, смолу промывают с помощью DCM и DMF. Fmoc-группу удаляют с помощью 20%-ного раствора пиперидина/DMF (2 мл) в течение 15 минут. После промывания с помощью DMF, аминокислоты последовательно конденсируют в соответствии с приведенным ниже способом удлинения пептидной цепи.

Аминокислоту, имеющую аминогруппу, защищенную Fmoc-группой, растворяют в N-метилпирролидоне (NMP) (1 мл). После добавления 0,45 М HCTU·HOBT/NMP (0,4 ммоль), полученную смесь загружают в колонку для твердофазного синтеза. Потом, к колонке для твердофазного синтеза добавляют 0,9 М DIPEA/NMP (0,8 ммоль). После перемешивания при комнатной температуре в течение 20-ти минут, смолу промывают с помощью DCM и DMF, и Fmoc-группу удаляют с помощью 20%-ного раствора пиперидина/DMF (2 мл) в течение 15 минут. Эту операцию проводят повторно, применяя аминокислоту, защищенную Fmoc-группой (0,5 ммоль), для последовательной конденсации аминокислот.

Fmoc-Gly, Fmoc-Arg(Pbf), Fmoc-Gly, Fmoc-Lys(Boc), Fmoc-Val, Fmoc-Leu, Fmoc-Trp(Boc), Fmoc-Ala, Fmoc-Ile, Fmoc-Phe, Fmoc-Glu(OtBu), Fmoc-Lys(Boc), Fmoc-Ala, Fmoc-AIa, Fmoc-Gln(Trt), Fmoc-Cys(Trt), Fmoc-Glu(OtBu), Fmoc-Leu, Fmoc-Tyr(tBu), Fmoc-Ser(tBu), Fmoc-Ser(tBu), Fmoc-Val, Fmoc-Asp(OtBu), Fmoc-Ser(tBu), Fmoc-Thr(tBu), Fmoc-Phe, Fmoc-Thr(tBu), Fmoc-Gly, Fmoc-Glu(OtBu), Fmoc-Ala и Fmoc-His(Trt) применяют, в качестве аминокислот, защищенных Fmoc-группой, для получения на смоле, которая представляет собой твердую фазу, пептида, состоящего из 31-го аминокислотного остатка, следующего вида Gly-Arg(Pbf)-Gly-Lys(Boc)-Val-Leu-Trp(Boc)-Ala-Ile-Phe-Glu(OtBu)-Lys(Boc)-Ala-Ala-Gln(Trt)-Cys(Trt)-Glu(OtBu)-Leu-Tyr(tBu)-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Val-Asp(OtBu)-Ser(tBu)-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Gly-Glu(OtBu)-Ala-His(Trt) (SEQ ID NO:61).

Полученную смолу с образовавшимся на ней пептидом частично переносят на колонку для твердофазного синтеза. Смесь трифторуксусная кислота: вода: TIPS (=95:2,5:2,5) добавляют так, чтобы смола была полностью погружена в жидкость и перемешивают при комнатной температуре в течение 3-х часов. Смолу удаляют фильтрованием, и реакционный раствор концентрируют при пониженном давлении. Полученный остаток очищают с помощью ВЭЖХ [колонка: SHISEIDO UG-120 (C18 5 мкм), ϕ 20×250 мм, градиент: раствор А: 0,1% TFA вода, раствор В: 0,09% TFA/10% вода/90% AN 8,0 мл/мин; 35→60%В, 20 мин, линейный градиент] и получают пептид, в котором 22Gly GLP-1 заменен Cys.

Бромацетамидил-диманнозо-олигосахарид (е) (продукт компании OTSUKA Chemical Co., Ltd.) (7,2 мг)

[Формула 9]

и пептидную цепь, синтезированную выше (3,4 мг), растворяют в 100 мМ фосфатном буфере (рН 7,5, 340 мкл) и оставляют для протекания реакции при 37°С в течение 4 часов. После того как исходные вещества будут полностью израсходованы и это будет подтверждено с помощью ВЭЖХ, реакционный раствор непосредственно подвергают очистке с помощью ВЭЖХ [колонка: SHISEIDO UG-120 (C18, 5 мкм), ϕ 4,6×250 мм, градиент: раствор А: 0,1% TFA вода, раствор В: 0,09% TFA/10% вода/90% AN 0,7 мл/мин; 35→60%В, 20 мин, линейный градиент] и получают 1,6 мг пептида GLP-1 с присоединенной олигосахаридной цепью, в котором 22Gly GLP-1 заменен Cys с присоединенной олигосахаридной цепью (22Cys диманнозо-GLP-1).

Пример 33

Синтез пептида GLP-1 с присоединенной олигосахаридной цепью 30Cys-диманнозо

Колонку для твердофазного синтеза заполняют смолой Амино-PEGA (100 мкмоль) (продукт фирмы «Merck»), тщательно промывают дихлорметаном (DCM) и DMF и дают смоле полностью набухнуть в DMF. 4-Гидроксиметил-3-метоксифеноксимасляную кислоту (НМРВ) (0,25 ммоль), TBTU (0,25 ммоль) и N-этилморфолин (0,25 ммоль) растворяют в DMF (2 мл), загружают в колонку и перемешивают при комнатной температуре в течение 4 часов. Смолу тщательно промывают с помощью DMF и DCM и получают смолу НМРВ-PEG, которую применяют в качестве твердой фазы для твердофазного синтеза.

Fmoc-Gly (0,50 ммоль), MSNT (0,50 ммоль) и N-метилимидазол (0,375 ммоль) растворяют в DCM (2 мл), загружают в колонку для твердофазного синтеза и перемешивают при 25°С в течение 3-х часов.

После перемешивания, смолу промывают с помощью DCM и DMF. Fmoc-группу удаляют с помощью 20%-ного раствора пиперидина/DMF (2 мл) в течение 15 минут. После промывания с помощью DMF, аминокислоты последовательно конденсируют в соответствии с приведенным ниже способом удлинения пептидной цепи.

Аминокислоту, имеющую аминогруппу, защищенную Fmoc-группой, растворяют в N-метилпирролидоне (NMP) (1 мл). После добавления 0,45 М HCTU·HOBT7NMP (0,4 ммоль), полученную смесь загружают в колонку для твердофазного синтеза. Потом, к колонке для твердофазного синтеза добавляют 0,9 М DIPEA/NMP (0,8 ммоль). После перемешивания при комнатной температуре в течение 20-ти минут, смолу промывают с помощью DCM и DMF, и Fmoc-группу удаляют с помощью 20%-ного раствора пиперидина/DMF (2 мл) в течение 15 минут. Эту операцию проводят повторно, применяя аминокислоту, защищенную Fmoc-группой (0,5 ммоль), для последовательной конденсации аминокислот.

Fmoc-Gly, Fmoc-Arg(Pbf), Fmoc-Gly, Fmoc-Lys(Boc), Fmoc-Val, Fmoc-Leu, Fmoc-Trp(Boc), Fmoc-Cys(Trt), Fmoc-Ile, Fmoc-Phe, Fmoc-Glu(OtBu), Fmoc-Lys(Boc), Fmoc-Ala, Fmoc-Ala, Fmoc-Gln(Trt), Fmoc-Gly, Fmoc-Glu(OtBu), Fmoc-Leu, Fmoc-Tyr(tBu), Fmoc-Ser(tBu), Fmoc-Ser(tBu), Fmoc-Val, Fmoc-Asp(OtBu), Fmoc-Ser(tBu), Fmoc-Thr(tBu), Fmoc-Phe, Fmoc-Thr(tBu), Fmoc-Gly, Fmoc-Glu(OtBu), Fmoc-Ala и Fmoc-His(Trt) применяют, в качестве аминокислот, защищенных Fmoc-группой, для получения на смоле, которая представляет собой твердую фазу, пептида, состоящего из 31-го аминокислотного остатка, следующего вида Gly-Arg(Pbi)-Gly-Lys(Boc)-Val-Leu-Trp(Boc)-Cys(Trt)-Ile-Phe-Glu(OtBu)-Lys(Boc)-Ala-Ala-Gln(Trt)-Gly-Glu(OtBu)-Leu-Tyr(tBu)-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Val-Asp(OtBu)-Ser(tBu)-Thjr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Gly-Glu(OtBu)-Ala-His(Trt) (SEQ ID NO:62).

Полученную смолу с образовавшимся на ней пептидом частично переносят на колонку для твердофазного синтеза. Смесь трифторуксусная кислота: вода: TIPS (=95:2,5:2,5) добавляют так, чтобы смола была полностью погружена в жидкость и перемешивают при комнатной температуре в течение 3-х часов. Смолу удаляют фильтрованием, и реакционный раствор концентрируют при пониженном давлении. Полученный остаток очищают с помощью ВЭЖХ [колонка: SHISEIDO UG-120 (C18 5 мкм), ϕ 20×250 мм, градиент: раствор А: 0,1% TFA вода, раствор В: 0,09% TFA/10% вода/90% AN 8,0 мл/мин; 35→60%В, 20 мин, линейный градиент] и получают пептид, в котором ЗОА1а GLP-1 заменен Cys.

Бромацетамидил-диманнозо-олигосахарид (е) (продукт компании OTSUKA Chemical Co., Ltd.) (10,2 мг) и пептидную цепь, синтезированную выше (4,1 мг), растворяют в 100 мМ фосфатном буфере (рН 7,5, 410 мкл) и оставляют для протекания реакции при 37°С в течение 4 часов. После того как исходные вещества будут полностью израсходованы и это будет подтверждено с помощью ВЭЖХ, реакционный раствор непосредственно подвергают очистке с помощью ВЭЖХ [колонка: SHISEIDO UG-120 (С18, 5 мкм), ϕ 4,6×250 мм, градиент: раствор А: 0,1% TFA вода, раствор В: 0,09% TFA/10% вода/90% AN 0,7 мл/мин; 35→60%В, 20 мин, линейный градиент] и получают 2,4 мг пептида GLP-1 с присоединенной олигосахаридной цепью, в котором 30Ala GLP-1 заменен Cys с присоединенной олигосахаридной цепью (30Cys-диманнозо-GLP-1).

Пример 34

Синтез пептида GLP-1 с присоединенной олигосахаридной цепью 34Cys-диманнозо

Колонку для твердофазного синтеза заполняют смолой Амино-PEGA (100 мкмоль) (продукт фирмы «Merck»), тщательно промывают дихлорметаном (DCM) и DMF и дают смоле полностью набухнуть в DMF. 4-Гидроксиметил-3-метоксифеноксимасляную кислоту (НМРВ) (0,25 ммоль), TBTU (0,25 ммоль) и N-этилморфолин (0,25 ммоль) растворяют в DMF (2 мл), загружают в колонку и перемешивают при комнатной температуре в течение 4 часов. Смолу тщательно промывают с помощью DMF и DCM и получают смолу НМРВ-PEG, которую применяют в качестве твердой фазы для твердофазного синтеза.

Fmoc-Gly (0,50 ммоль), MSNT (0,50 ммоль) и N-метилимидазол (0,375 ммоль) растворяют в DCM (2 мл), загружают в колонку для твердофазного синтеза и перемешивают при 25°С в течение 3-х часов.

После перемешивания, смолу промывают с помощью DCM и DMF. Fmoc-группу удаляют с помощью 20%-ного раствора пиперидина/DMF (2 мл) в течение 15 минут. После промывания с помощью DMF, аминокислоты последовательно конденсируют в соответствии с приведенным ниже способом удлинения пептидной цепи.

Аминокислоту, имеющую аминогруппу, защищенную Fmoc-группой, растворяют в N-метилпирролидоне (NMP) (1 мл). После добавления 0,45 М HCTU·HOBT/NMP (0,4 ммоль), полученную смесь загружают в колонку для твердофазного синтеза. Потом, к колонке для твердофазного синтеза добавляют 0,9 М DIPEA/NMP (0,8 ммоль). После перемешивания при комнатной температуре в течение 20-ти минут, смолу промывают с помощью DCM и DMF, и Fmoc-группу удаляют с помощью 20%-ного раствора пиперидина/DMF (2 мл) в течение 15 минут. Эту операцию проводят повторно, применяя аминокислоту, защищенную Fmoc-группой (0,5 ммоль), для последовательной конденсации аминокислот.

Fmoc-Gly, Fmoc-Arg(Pbf), Fmoc-Gly, Fmoc-Cys(Trt), Fmoc-Val, Fmoc-Leu, Fmoc-Trp(Boc), Fmoc-Ala, Fmoc-Ile, Fmoc-Phe, Fmoc-Glu(OtBu), Fmoc-Lys(Boc), Fmoc-Ala, Fmoc-Ala, Fmoc-Gln(Trt), Fmoc-Gly, Fmoc-Glu(OtBu), Fmoc-Leu, Fmoc-Tyr(tBu), Fmoc-Ser(tBu), Fmoc-Ser(tBu), Fmoc-Val, Fmoc-Asp(OtBu), Fmoc-Ser(tBu), Fmoc-Thr(tBu), Fmoc-Phe, Fmoc-Thr(tBu), Fmoc-Gly, Fmoc-Glu(OtBu), Fmoc-Ala и Fmoc-His(Trt) применяют, в качестве аминокислот, защищенных Fmoc-группой, для получения на смоле, которая представляет собой твердую фазу, пептида, состоящего из 31-го аминокислотного остатка, следующего вида Gly-Arg(Pbf)-Gly-Cys(Trt)-Val-Leu-Trp(Boc)-Ala-Ile-Phe-Glu(OtBu)-Lys(Boc)-Ala-Ala-Gln(Trt)-Gly-Glu(OtBu)-Leu-Tyr(tBu)-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Val-Asp(OtBu)-Ser(tBu)-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Gly-Glu(OtBu)-Ala-His(Trt) (SEQ ID NO:63).

Полученную смолу с образовавшимся на ней пептидом частично переносят на колонку для твердофазного синтеза. Смесь трифторуксусная кислота: вода: TIPS (=95:2,5:2,5) добавляют так, чтобы смола была полностью погружена в жидкость и перемешивают при комнатной температуре в течение 3-х часов. Смолу удаляют фильтрованием, и реакционный раствор концентрируют при пониженном давлении. Полученный остаток очищают с помощью ВЭЖХ [колонка: SHISEIDO UG-120 (C18 5 мкм), ϕ 20×250 мм, градиент: раствор А: 0,1% TFA вода, раствор В: 0,09% TFA/10% вода/90% AN 8,0 мл/мин; 35→60%В, 20 мин, линейный градиент] и получают пептид, в котором 34Lys GLP-1 заменен Cys.

Бромацетамидил-диманнозо-олигосахарид (с) (продукт компании OTSUKA Chemical Co., Ltd.) (10 мг) и пептидную цепь, синтезированную выше (3,9 мг), растворяют в 100 мМ фосфатном буфере (рН 7,5, 390 мкл) и оставляют для протекания реакции при 37°С в течение 4 часов. После того как исходные вещества будут полностью израсходованы и это будет подтверждено с помощью ВЭЖХ, реакционный раствор непосредственно подвергают очистке с помощью ВЭЖХ [колонка: SHISEIDO UG-120 (C18, 5 мкм), ϕ 4,6×250 мм, градиент: раствор А: 0,1% TFA вода, раствор В: 0,09% TFA/10% вода/90% AN 0,7 мл/мин; 35→60%В, 20 мин, линейный градиент] и получают 1,3 мг пептида GLP-1 с присоединенной олигосахаридной цепью, в котором 34Lys GLP-1 заменен Cys с присоединенной олигосахаридной цепью (34Cys GLP-1-диманнозных).

Пример 35

Синтез пептида GLP-1 с присоединенной олигосахаридной цепью 12Asn-асиало

Колонку для твердофазного синтеза заполняют смолой Амино-PEGA (100 мкмоль) (продукт фирмы «Merck»), тщательно промывают дихлорметаном (DCM) и DMF и дают смоле полностью набухнуть в DMF. 4-Гидроксиметил-3-метоксифеноксимасляную кислоту (НМРВ) (0,25 ммоль), TBTU (0,25 ммоль) и N-этилморфолин (0,25 ммоль) растворяют в DMF (2 мл), загружают в колонку и перемешивают при комнатной температуре в течение 4 часов. Смолу тщательно промывают с помощью DMF и DCM и получают смолу HMPB-PEG, которую применяют в качестве твердой фазы для твердофазного синтеза.

Fmoc-Ala (0,50 ммоль), MSNT (0,50 ммоль) и N-метилимидазол (0,375 ммоль) растворяют в DCM (2 мл), загружают в колонку для твердофазного синтеза и перемешивают при 25°С в течение 4 часов.

После перемешивания, смолу промывают с помощью DCM и DMF. Fmoc-группу удаляют с помощью 20%-ного раствора пиперидина/DMF (2 мл) в течение 15 минут. После промывания с помощью DMF, аминокислоты последовательно конденсируют в соответствии с приведенным ниже способом удлинения пептидной цепи.

Аминокислоту, имеющую аминогруппу, защищенную Fmoc-группой, растворяют в N-метилпирролидоне (NMP) (1 мл). После добавления 0,45 М HCTU·HOBT/NMP (0,4 ммоль), полученную смесь загружают в колонку для твердофазного синтеза. Потом, к колонке для твердофазного синтеза добавляют 0,9 М DIPEA/NMP (0,8 ммоль). После перемешивания при комнатной температуре в течение 20-ти минут, смолу промывают с помощью DCM и DMF, и Fmoc-группу удаляют с помощью 20%-ного раствора пиперидина/DMF (2 мл) в течение 15 минут. Эту операцию проводят повторно, применяя аминокислоту, защищенную Fmoc-группой (0,5 ммоль), для последовательной конденсации аминокислот.

Fmoc-Ala, Fmoc-Gln(Trt), Fmoc-Gly, Fmoc-Glu(OtBu), Fmoc-Leu, Fmoc-Tyr(tBu), Fmoc-Ser(tBu), Fmoc-Ser(tBu), Fmoc-Val, Fmoc-Asp(OtBu), Fmoc-Ser(tBu и Fmoc-Thr(tBu) применяют, в качестве аминокислот, защищенных Fmoc-группой, для получения на смоле, которая представляет собой твердую фазу, пептида, состоящего из 12-ти аминокислотных остатков, следующего вида Ala-Gln(Trt)-Gly-Glu(OtBu)-Leu-Tyr(tBu)-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Val-Asp(OtBu)-Ser(tBu)-Thr(tBu) (SEQ ID NO:64). Псптид, состоящий из 12-ти аминокислотных остатков (эквивалент 7,0 мкмоль), переносят в отдельную колонку для твердофазного синтеза, Fmoc-группу удаляют с помощью 20%-ного раствора пиперидина/DMF (1 мл) в течение 15 минут, и промывают DMF. В отдельной центрифужной пробирке асиало-аспарагин с присоединенной олигосахаридной цепью (b) (продукт компании OTSUKA Chemical Co., Ltd.) 27,7 мг (14,0 мкмоль) и DEPBT 6,3 мг (21,1 мкмоль) растворяют в DMF/DMSO (смесь растворов в отношении 1:4, 0,35 мл) и загружают в колонку для твердофазного синтеза. После добавления DIPEA 2,4 мкл (14,1 мкмоль), смесь перемешивают при комнатной температуре в течение 18 часов. После промывания с помощью DMF и DCM, получают на твердой фазе пептид с присоединенной олигосахаридной цепью, состоящий из 13-ти аминокислотных остатков, следующего вида Ala-Gln(Trt)-Gly-Glu(OtBu)-Leu-Tyr(tBu)-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Val-Asp(OtBu)-Ser(tBu)-Thr(tBu)-Asn(олигосахаридная цепь) (SEQ ID NO:65).

Аминокислоту, имеющую аминогруппу, защищенную Fmoc-группой, и HOBt (4,7 мг, 0,03 ммоль), и DIPCI (5,4 мкл, 0,03 ммоль) растворяют в DMF (0,875 мл). После активации в течение 15 минут, смесь загружают в колонку для твердофазного синтеза. После перемешивания при комнатной температуре в течение одного часа, Fmoc-группу удаляют с помощью 20%-ного раствора пиперидина/DMF (1 мл) в течение 20-ти минут. Эту операцию проводят повторно для последовательной конденсации аминокислот. Fmoc-Thr(tBu), Fmoc-Gly, Fmoc-Glu(OtBu) и Fmoc-Ala применяют в качестве аминокислот, защищенных Fmoc-группой, и Boc-His(Trt) применяют в качестве аминокислоты, защищенной Вос-группой, для получения на смоле, которая представляет собой твердую фазу, пептида с присоединенной олигосахаридной цепью, состоящего из 18-ти аминокислот, следующего вида Ala-Gln(Trt)-Gly-Glu(OtBu)-Leu-Tyr(tBu)-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Val-Asp(OtBu)-Ser(tBu)-Thr(tBu)-Asn(олигосахаридная цепь)-Thr(tBu)-Gly-Glu(OtBu)-Ala-His(Trt) (SEQ ID NO:66).

После промывания с помощью DCM и DMF, смесь растворов трифторэтанола и уксусной кислоты (1:1) добавляют так, чтобы смола была полностью погружена в жидкость, и перемешивают при комнатной температуре в течение 18 часов. Смолу удаляют фильтрованием, и реакционный раствор концентрируют при пониженном давлении. Полученный остаток концентрируют, и получают защищенный пептид с присоединенной олигосахаридной цепью, следующего вида Ala-Gln(Trt)-Gly-Glu(OtBu)-Leu-Tyr(tBu)-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Val-Asp(OtBu)-Ser(tBu)-Thr(tBu)-Asn(олигосахаридная цепь)-Thr(tBu)-Gly-Glu(OtBu)-Ala-His(Trt)-NH-Boc (SEQ ID NO:67).

Защищенный пептид с присоединенной олигосахаридной цепью, состоящий из 18-ти аминокислотных остатков, (эквивалент 2,45 мкмоль) переносят во флакон, имеющий форму баклажана, растворяют в DMF (0,1 мл) и охлаждают до от -15 до -20°С под атмосферой аргона. К этому, добавляют бензилтиол (8,7 мкл, 73,6 мкмоль) и добавляют отдельно приготовленный раствор РуВОР (6,4 мг, 12,3 мкмоль) в DMF (0,231 мл), и потом, добавляют DIPEA 2,1 мкл (12,3 мкмоль). Смесь перемешивают при от -15 до -20°С в течение 2-х часов и добавляют к холодному диэтиловому эфиру (150 мл). После осаждения пептидного компонента, раствор удаляют через мембранный фильтр. К остатку добавляют смесь трифторуксусная кислота: вода: TIPS (=95:2,5:2,5) и перемешивают при комнатной температуре. Через 2 часа, раствор снова добавляют к отдельно подготовленному диэтиловому эфиру (150 мл) для получения осадка. После этого, раствор удаляют через мембранный фильтр для получения осадка, содержащего желаемое тиоэфирное соединение пептида. Этот осадок очищают с помощью ВЭЖХ [колонка: SHISEIDO UG-120 (C18 5 мкм), ϕ 20×250 мм, градиент: раствор А: 0,1% TFA вода, раствор В: 0,09% TFA/10% вода/90% AN 7,0 мл/мин; 25→45%В (15 мин) → 60%В (10 мин) → 95%В (10 мин), линейный градиент] и получают 2,1 мг пептида, который имеет на С-конце бензилтиоэфир: PhS-Ala-Gln-Gly-Glu-Leu-Tyr-Ser-Ser-Val-Asp-Ser-Thr-Asn(олигосахаридная цепь)-Thr-Gly-Glu-Ala-His (SEQ ID NO:68).

С другой стороны, колонку для твердофазного синтеза заполняют смолой Амино-PEGA (продукт фирмы «Merck») (100 мкмоль), тщательно промывают дихлорметаном (DCM) и DMF и дают полностью набухнуть в DMF. 4-Гидроксиметил-3-метоксифеноксимасляную кислоту (НМРВ) (0,25 ммоль), TBTU (0,25 ммоль) и N-этилморфолин (0,25 ммоль) растворяют в DMF (2 мл), загружают в колонку и перемешивают при комнатной температуре в течение 4 часов. Смолу тщательно промывают с помощью DMF и DCM и получают смолу HMPB-PEG, которую применяют в качестве твердой фазы для твердофазного синтеза.

Fmoc-Gly (0,50 ммоль), MSNT (0,50 ммоль) и N-метилимидазол (0,375 ммоль) растворяют в DCM (2 мл), загружают в колонку для твердофазного синтеза и перемешивают при 25°С в течение 4 часов. После перемешивания, смолу промывают с помощью DCM и DMF. Fmoc-группу удаляют с помощью 20%-ного раствора пиперидина/DMF (2 мл) в течение 15 минут. После промывания с помощью DMF, аминокислоты последовательно конденсируют в соответствии с приведенным ниже способом удлинения пептидной цепи.

Аминокислоту, имеющую аминогруппу, защищенную Fmoc-группой, растворяют в N-метилпирролидоне (NMP) (1 мл). После добавления 0,45 М HCTU·HOBT/NMP (0,4 ммоль), полученную смесь загружают в колонку для твердофазного синтеза. Потом, к колонке для твердофазного синтеза добавляют 0,9 М DIPEA/NMP (0,8 ммоль). После перемешивания при комнатной температуре в течение 20-ти минут, смолу промывают с помощью DCM и DMF, и Fmoc-группу удаляют с помощью 20%-ного раствора пиперидина/DMF (2 мл) в течение 15 минут. Эту операцию проводят повторно, применяя аминокислоту, защищенную Fmoc-группой (0,5 ммоль), для последовательной конденсации аминокислот.

Fmoc-Gly, Fmoc-Arg(Pbf), Fmoc-Gly, Fmoc-Lys(Boc), Fmoc-Val, Fmoc-Leu, Fmoc-Trp(Boc), Fmoc-Ala, Fmoc-Ilc, Fmoc-Phe, Fmoc-Glu(OtBu), Fmoc-Lys(Boc) применяют, в качестве аминокислот, защищенных Fmoc-группой, и Boc-Cys(Trt) применяют в качестве аминокислоты, защищенной Вос-группой и получают на смоле, которая представляет собой твердую фазу, пептид, состоящий из 13 аминокислотных остатков, следующего вида Gly-Arg(Pbf)-Gly-Lys(Boc)-Val-Leu-Trp(Boc)-Ala-Ile-Phe-Glu(OtBu)-Lys(Boc)-Cys(Trt) (SEQ ID NO:69). К этому, добавляют смесь трифторуксусная кислота: вода: TIPS (=95:2,5:2,5) и перемешивают при комнатной температуре в течение 3,5 часов. Затем смесь добавляют к отдельно подготовленному диэтиловому эфиру (150 мл) для получения осадка. После этого, раствор удаляют через мембранный фильтр для получения осадка, содержащего желаемое тиоэфирное соединение пептида. Этот осадок очищают с помощью ВЭЖХ [колонка: SHISEIDO UG-120 (C18 5 мкм), ϕ 20×250 мм, градиент: раствор А: 0,1% TFA вода, раствор В: 0,09% TFA/10% вода/90% AN 7,0 мл/мин; 25→45%В (15 мин) → 60%В (10 мин) → 95%В (10 мин), линейный градиент] и получают желаемый пептид: Gly-Arg-Gly-Lys-Val-Leu-Trp-Ala-Ile-Phe-Glu-Lys-Cys (SEQ ID NO:70).

Таким способом получают два типа пептидов: пептид, состоящий из 18-ти аминокислот, который имеет бензилтиоэфир на С-конце, (2,1 мг), и пептид, состоящий из 13 аминокислотных остатков (2,6 мг), которые помещают в одну цетрифужную пробирку и растворяют в буферном растворе (рН 6,8, 0,58 мл) (приготовленном из 6 М раствора гуанидин гидрохлорида и 0,2 мМ раствора фосфорной кислоты). Затем при комнатной температуре добавляют тиофенол (2,9 мкл) и проводят реакцию при комнатной температуре. Через 24 часа реакционный раствор очищают с помощью ВЭЖХ [колонка: SHISEIDO UG-120 (C18 5 мкм), ϕ 20×250 мм, градиент: раствор А: 0,1% TFA вода, раствор В: 0,09% TFA/10% вода/90% AN 7,0 мл/мин; 25→45%В (15 мин) → 60%В (10 мин) → 95%В (10 мин), линейный градиент] и получают 1,5 мг пептида с присоединенной олигосахаридной цепью, состоящего из 31-го аминокислотного остатка.

Полученный пептид с присоединенной олигосахаридной цепью помещают в центрифужную пробирку и растворяют в буферном растворе (рН 7,0, который готовят из 35 мМ раствора ТСЕР, 6 М раствора гуанидин гидрохлорида и 0,2 мМ раствора фосфорной кислоты). К реакционному раствору при комнатной температуре добавляют активированный никель Ренея. Через 26 часов завершение реакции подтверждают с помощью ВЭЖХ. После этого реакционный раствор фильтруют через мембранный фильтр и фильтрат, содержащий желаемый пептид GLP-1 с присоединенной олигосахаридной цепью подвергают очистке с помощью ВЭЖХ [колонка: SHISEIDO UG-120 (C18 5 мкм), ϕ 20×250 мм, градиент: раствор А: 0,1% TFA вода, раствор В: 0,09% TFA/10% вода/90% AN 7,0 мл/мин; 25→45%В (15 мин) → 60%В (10 мин) → 95%В (10 мин), линейный градиент] и получают 0,8 мг желаемого пептида GLP-1 с присоединенной олигосахаридной цепью, в котором 12Phe GLP-1 заменен асиало-Asn с присоединенной олигосахаридной цепью (12Asn-асиало-GLP-1).

Пример 36

Синтез пептида GLP-1 с присоединенной олигосахаридной цепью 18Asn-асиало

Колонку для твердофазного синтеза заполняют смолой Амино-PEGA (50 мкмоль) (продукт фирмы «Merck»), тщательно промывают дихлорметаном (DCM) и DMF и дают смоле полностью набухнуть в DMF. 4-Гидроксиметил-3-метоксифеноксимасляную кислоту (НМРВ) (0,125 ммоль), TBTU (0,125 ммоль) и N-этилморфолин (0,125 ммоль) растворяют в DMF (2 мл), загружают в колонку и перемешивают при комнатной температуре в течение 4 часов. Смолу тщательно промывают с помощью DMF и DCM и получают смолу HMPB-PEG, которую применяют в качестве твердой фазы для твердофазного синтеза.

Fmoc-Gly (0,25 ммоль), MSNT (0,25 ммоль) и N-метилимидазол (0,175 ммоль) растворяют в DCM (2 мл), загружают в колонку для твердофазного синтеза и перемешивают при 25°С в течение 3-х часов.

После перемешивания, смолу промывают с помощью DCM и DMF. Fmoc-группу удаляют с помощью 20%-ного раствора пиперидина/DMF (2 мл) в течение 15 минут. После промывания с помощью DMF, аминокислоты последовательно конденсируют в соответствии с приведенным ниже способом удлинения пептидной цепи.

Аминокислоту, имеющую аминогруппу, защищенную Fmoc-группой, растворяют в N-метилпирролидоне (NMP) (1 мл). После добавления 0,45 М HCTU·HOBT/NMP (0,25 ммоль), полученную смесь загружают в колонку для твердофазного синтеза. Потом, 0,9 М DIPEA/NMP (0,25 ммоль) добавляют к колонке для твердофазного синтеза. После перемешивания при комнатной температуре в течение 20-ти минут, смолу промывают с помощью DCM и DMF, и Fmoc-группу удаляют с помощью 20%-ного раствора пиперидина/DMF (2 мл) в течение 15 минут. Эту операцию проводят повторно, применяя аминокислоту, защищенную Fmoc-группой (0,25 ммоль), для последовательной конденсации аминокислот.

Fmoc-Gly, Fmoc-Arg(Pbf), Fmoc-Gly, Fmoc-Lys(Boc), Fmoc-Val, Fmoc-Leu, Fmoc-Trp(Boc), Fmoc-Ala, Fmoc-Ile, Fmoc-Phe, Fmoc-Glu(OtBu), Fmoc-Lys(Boc), Fmoc-Ala, Fmoc-Ala, Fmoc-Gln(Trt), Fmoc-Gly, Fmoc-Glu(OtBu), Fmoe-Leu и Fmoc-Tyr(tBu) применяют, в качестве аминокислот, защищенных Fmoc-группой, для получения на смоле, которая представляет собой твердую фазу, пептида, состоящего из 19-ти аминокислотных остатков, следующего вида Gly-Arg(Pbf)-Gly-Lys(Boc)-Val-Leu-Trp(Boc)-Ala-Ile-Phe-Glu(OtBu)-Lys(Boc)-Ala-Ala-Gln(Trt)-Gly-Glu(OtBu)-Leu-Tyr(tBu) (SEQ ID NO:71).

Асиало-аспарагин с присоединенной олигосахаридной цепью (b) (продукт компании OTSUKA Chemical Co., Ltd.) 198 мг (100 мкмоль) и DEPBT 30,0 мг (100 мкмоль) растворяют в NMP/DMSO (2,4/0,6 мл) и загружают в колонку для твердофазного синтеза. После добавления DIPEA 26 мкл (150 мкмоль), смесь перемешивают при комнатной температуре в течение 24 часов. После промывания с помощью DMF и DCM, на твердой фазе получают пептид с присоединенной олигосахаридной цепью, состоящий из 20-ти аминокислотных остатков, следующего вида Gly-Arg(Pbf)-Gly-Lys(Boc)-Val-Leu-Trp(Boc)-Ala-Ile-Phe-Glu(OtBu)-Lys(Boc)-Ala-Ala-Gln(Trt)-Gly-Glu(OtBu)-Leu-Tyr(tBu)-Asn(олигосахаридная цепь) (SEQ ID NO:72). Потом, аминокислоту, имеющую аминогруппу, защищенную Fmoc-группой, конденсируют с помощью HOBt 34 мг (0,25 ммоль), DIPCI 38 мкл (0,25 ммоль) и DMF (1 мл) с образованием пептида с присоединенной олигосахаридной цепью, состоящего из 31-го аминокислотного остатка, следующего вида Gly-Arg(Pbf)-Gly-Lys(Boc)-Val-Leu-Trp(Boc)-Ala-Ile-Phe-Glu(OtBu)-Lys(Вос)-Ala-Ala-Gln(Trt)-Gly-Glu(OtBu)-Leu-Tyr(tBu)-Asn(олигосахаридная цепь)-Ser(tBu)-Val-Asp(OtBu)-Ser(tBu)-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Gly-Glu(OtBu)-Ala-His(Trt) (SEQ ID NO:73).

К полученной смоле, на которой сформирован пептид с присоединенной олигосахаридной цепью, добавляют смесь трифторуксусная кислота: вода: TIPS (=95:2,5:2,5) так, чтобы смола была полностью погружена в жидкость и перемешивают при комнатной температуре в течение 3-х часов. Смолу удаляют фильтрованием, и реакционный раствор концентрируют при пониженном давлении. Полученный остаток очищают с помощью ВЭЖХ [колонка: SHISEIDO UG-120 (C18 5 мкм), ϕ 20×250 мм, градиент: раствор А: 0,1% TFA вода, раствор В: 0,09% TFA/10% вода/90% AN 8,0 мл/мин; 35→60%В, 20 мин, линейный градиент] и получают 8,2 мг пептида GLP-1 с присоединенной олигосахаридной цепью, в котором 18Ser GLP-1 заменена асиало-Asn с присоединенной олигосахаридной цепью (18Asn-асиало-GLP-1).

Пример 37

Синтез пептида GLP-1 с присоединенной олигосахаридной цепью 22Asn-асиало

Колонку для твердофазного синтеза заполняют смолой Амино-PEGA (50 мкмоль) (продукт фирмы «Merck»), тщательно промывают дихлорметаном (DCM) и DMF и дают смоле полностью набухнуть в DMF. 4-Гидроксиметил-3-метоксифеноксимасляную кислоту (НМРВ) (0,125 ммоль), TBTU (0,125 ммоль) и N-этилморфолин (0,125 ммоль) растворяют в DMF (2 мл), загружают в колонку и перемешивают при комнатной температуре в течение 4 часов. Смолу тщательно промывают с помощью DMF и DCM и получают смолу HMPB-PEG, которую применяют в качестве твердой фазы для твердофазного синтеза.

Fmoc-Gly (0,25 ммоль), MSNT (0,25 ммоль) и N-метилимидазол (0,175 ммоль) растворяют в DCM (2 мл), загружают в колонку для твердофазного синтеза и перемешивают при 25°С в течение 3-х часов.

После перемешивания, смолу промывают с помощью DCM и DMF. Fmoc-группу удаляют с помощью 20%-ного раствора пиперидина/DMF (2 мл) в течение 15 минут. После промывания с помощью DMF, аминокислоты последовательно конденсируют в соответствии с приведенным ниже способом удлинения пептидной цепи.

Аминокислоту, имеющую аминогруппу, защищенную Fmoc-группой, растворяют в N-метилпирролидоне (NMP) (1 мл). После добавления 0,45 М HCTU·HOBT/NMP (0,25 ммоль), полученную смесь загружают в колонку для твердофазного синтеза. Потом, к колонке для твердофазного синтеза добавляют 0,9 М DIPEA/NMP (0,25 ммоль). После перемешивания при комнатной температуре в течение 20-ти минут, смолу промывают с помощью DCM и DMF, и Fmoc-группу удаляют с помощью 20%-ного раствора пиперидина/DMF (2 мл) в течение 15 минут. Эту операцию проводят повторно, применяя аминокислоту, защищенную Fmoc-группой (0,25 ммоль), для последовательной конденсации аминокислот.

Fmoc-Gly, Fmoc-Arg(Pbf), Fmoc-Gly, Fmoc-Lys(Boc), Fmoc-Val, Fmoc-Leu, Fmoc-Trp(Boc), Fmoc-Ala, Fmoc-Ile, Fmoc-Phe, Fmoc-Glu(OtBu), Fmoc-Lys(Boc), Fmoc-Ala, Fmoc-Ala и Fmoc-Gln(Trt) применяют, в качестве аминокислот, защищенных Fmoc-группой, для получения на смоле, которая представляет собой твердую фазу, пептида, состоящего из 15-ти аминокислотных остатков, следующего вида Gly-Arg(Pbf)-Gly-Lys(Boc)-Val-Leu-Trp(Boc)-Ala-Ile-Phe-Glu(OtBu)-Lys(Boc)-Ala-Ala-Gln(Trt) (SEQ ID NO:74).

Асиало-аспарагин с присоединенной олигосахаридной цепью (b) (продукт компании OTSUKA Chemical Co., Ltd.) 198 мг (100 мкмоль) и DEPBT 30 мг (100 мкмоль) растворяют в NMP/DMSO (2,4/0,6 мл) и загружают в колонку для твердофазного синтеза. После добавления DIPEA (26 мкл, 150 мкмоль) смесь перемешивают при комнатной температуре в течение 24 часов. После промывания с помощью DMF и DCM, на твердой фазе получают пептид с присоединенной олигосахаридной цепью, состоящий из 16-ти аминокислотных остатков, следующего вида Gly-Arg(Pbf)-Gly-Lys(Boc)-Val-Leu-Trp(Boc)-Ala-Ile-Phe-Glu(OtBu)-Lys(Вос)-Ala-Ala-Gln(Trt)-Asn(олигосахаридная цепь) (SEQ ID NO:75). Потом, аминокислоту, имеющую аминогруппу, защищенную Fmoc-группой, конденсируют с помощью HOBt 34 мг (0,25 ммоль), DIPCI 38 мкл (0,25 ммоль) и DMF (1 мл) с образованием пептида с присоединенной олигосахаридной цепью, состоящего из 31-го аминокислотного остатка, следующего вида Gly-Arg(Pbf)-Gly-Lys(Boc)-Val-Leu-Trp(Вос)-Ala-Ile-Phe-Glu(OtBu)-Lys(Вос)-Ala-Ala-Gln(Trt)-Asn(олигосахаридная цепь)-Glu(OtBu)-Leu-Tyr(tBu)-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Val-Asp(OtBu)-Ser(tBu)-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Gly-Glu(OtBu)-Ala-His(Trt) (SEQ ID NO:76).

К полученной смоле, на которой сформирован пептид с присоединенной олигосахаридной цепью, добавляют смесь трифторуксусная кислота: вода: TIPS (=95:2,5:2,5) так, чтобы смола была полностью погружена в жидкость и перемешивают при комнатной температуре в течение 3-х часов. Смолу удаляют фильтрованием, и реакционный раствор концентрируют при пониженном давлении. Полученный остаток очищают с помощью ВЭЖХ [колонка: SHISEIDO UG-120 (C18 5 мкм), ϕ 20×250 мм, градиент: раствор А: 0,1% TFA вода, раствор В: 0,09% TFA/10% вода/90% AN 7,0 мл/мин; 35→60%В, 20 мин, линейный градиент] и получают 12,2 мг пептида GLP-1 с присоединенной олигосахаридной цепью, в котором 22Gly GLP-1 заменен асиало-Asn с присоединенной олигосахаридной цепью (22Asn-аеиало-GLP-1).

Пример 38

Синтез пептида GLP-1 с присоединенной олигосахаридной цепью 26Asn-асиало

Колонку для твердофазного синтеза заполняют смолой Амино-PEGA (100 мкмоль) (продукт фирмы «Merck»), тщательно промывают дихлорметаном (DCM) и DMF и дают смоле полностью набухнуть в DMF. 4-Гидроксиметил-3-метоксифеноксимасляную кислоту (НМРВ) (0,25 ммоль), TBTU (0,25 ммоль) и N-этилморфолин (0,25 ммоль) растворяют в DMF (2 мл), загружают в колонку и перемешивают при комнатной температуре в течение 4 часов. Смолу тщательно промывают с помощью DMF и DCM и получают смолу HMPB-PEG, которую применяют в качестве твердой фазы для твердофазного синтеза.

Fmoc-Gly (0,50 ммоль), MSNT (0,50 ммоль) и N-метилимидазол (0,375 ммоль) растворяют в DCM (2 мл), загружают в колонку для твердофазного синтеза и перемешивают при 25°С в течение 4 часов.

После перемешивания смолу промывают с помощью DCM и DMF. Fmoc-группу удаляют с помощью 20%-ного раствора пиперидина/DMF (2 мл) в течение 15 минут. После промывания с помощью DMF аминокислоты последовательно конденсируют в соответствии с приведенным ниже способом удлинения пептидной цепи.

Аминокислоту, имеющую аминогруппу, защищенную Fmoc-группой, растворяют в N-метилпирролидоне (NMP) (1 мл). После добавления 0,45 М HCTU·HOBT/NMP (0,4 ммоль) полученную смесь загружают в колонку для твердофазного синтеза. Потом, к колонке для твердофазного синтеза добавляют 0,9 М DIPEA/NMP (0,8 ммоль). После перемешивания при комнатной температуре в течение 20-ти минут, смолу промывают с помощью DCM и DMF, и Fmoc-группу удаляют с помощью 20%-ного раствора пиперидина/DMF (2 мл) в течение 15 минут. Эту операцию проводят повторно, применяя аминокислоту, защищенную Fmoc-группой (0,5 ммоль), для последовательной конденсации аминокислот.

Fmoc-Ala,Fmoc-Gln(Trt), Fmoc-Gly, Fmoc-Glu(OtBu), Fmoc-Leu, Fmoc-Tyr(tBu), Fmoc-Ser(tBu), Fmoc-Ser(tBu), Fmoc-Val, Fmoc-Asp(OtBu), Fmoc-Ser(tBu), Fmoc-Thr(tBu), Fmoc-Phe, Fmoc-Thr(tBu), Fmoc-Gly, Fmoc-Glu(OtBu) и Fmoc-Ala применяют, в качестве аминокислот, защищенных Fmoc-группой, и Boc-His(Trt) применяют в качестве аминокислоты, защищенной Вос-группой, для получения на смоле, которая представляет собой твердую фазу, пептида, состоящего из 18-ти аминокислот, следующего вида Ala-Gln(Trt)-Gly-Glu(OtBu)-Leu-Tyr(tBu)-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Val-Asp(OtBu)-Ser(tBu)-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Gly-Glu(OtBu)-Ala-His(Trt) (SEQ ID NO:77).

После промывания с помощью DCM и DMF, смесь растворов трифторэтанола и уксусной кислоты (1:1) добавляют так, чтобы смола была полностью погружена в жидкость и перемешивают при комнатной температуре в течение 18 часов. Смолу удаляют фильтрованием, и реакционный раствор концентрируют при пониженном давлении. Полученный остаток концентрируют и получают защищенный пептид, следующего вида Ala-Gln(Trt)-Gly-Glu(OtBu)-Leu-Tyr(tBu)-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Val-Asp(OtBu)-Ser(tBu)-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Gly-Glu(OtBu)-Ala-His(Trt)-NHBoc (SEQ ID NO:78).

Защищенный пептид, состоящий из 18-ти аминокислотных остатков (эквивалент 35 мкмоль), переносят во флакон, имеющий форму баклажана, растворяют в DMF (3,7 мл) и охлаждают до от -15 до -20°С под атмосферой аргона. К этому добавляют бензилтиол (125 мкл, 1,06 ммоль) и добавляют отдельно подготовленный раствор РуВОР (94,7 мг, 182 мкмоль) в DMF (1,0 мл), и потом, добавляют DIPEA (29,8 мкл, 175 мкмоль). Смесь перемешивают при от -15 до -20°С в течение 2-х часов и добавляют к охлажденному диэтиловому эфиру (150 мл). После осаждения пептидного компонента, раствор удаляют через мембранный фильтр. К остатку добавляют смесь трифторуксусная кислота: вода: TIPS (=95:2,5:2,5) и перемешивают при комнатной температуре. Через 2 часа раствор снова добавляют к отдельно подготовленному диэтиловому эфиру (150 мл) для получения осадка. После этого, раствор удаляют через мембранный фильтр для получения осадка, содержащего желаемое тиоэфирное соединение пептида. Этот осадок очищают с помощью ВЭЖХ [колонка: SHISEIDO UG-120 (C18 5 мкм), ϕ 20×250 мм, градиент: раствор А: 0,1% TFA вода, раствор В: 0,09% TFA/10% вода/90% AN 7,0 мл/мин; 25→45%В (15 мин) → 60%В (10 мин) → 95%В (10 мин), линейный градиент] и получают пептида, состоящего из 18-ти аминокислот, который имеет на С-конце бензилтиоэфир: PhS-Ala-Gln-Gly-Glu-Leu-Tyr-Ser-Ser-Val-Asp-Ser-Thr-Phe-Thr-Gly-Glu-Ala-His (SEQ ID NO:79).

С другой стороны, колонку для твердофазного синтеза заполняют смолой Амино-PEGA (продукт фирмы «Merck») (100 мкмоль), тщательно промывают дихлорметаном (DCM) и DMF и дают смоле полностью набухнуть в DMF. 4-Гидроксиметил-3-метоксифеноксимасляную кислоту (НМРВ) (0,25 ммоль), TBTU (0,25 ммоль) и N-этилморфолин (0,25 ммоль) растворяют в DMF (2 мл), загружают в колонку и перемешивают при комнатной температуре в течение 4 часов. Смолу тщательно промывают с помощью DMF и DCM и получают смолу HMPB-PEG, которую применяют в качестве твердой фазы для твердофазного синтеза.

Fmoc-Gly (0,50 ммоль), MSNT (0,50 ммоль) и N-метилимидазол (0,375 ммоль) растворяют в DCM (2 мл), загружают в колонку для твердофазного синтеза и перемешивают при 25°С в течение 4 часов. После перемешивания смолу промывают с помощью DCM и DMF. Fmoc-группу удаляют с помощью 20%-ного раствора пиперидина/DMF (2 мл) в течение 15 минут. После промывания с помощью DMF, аминокислоты последовательно конденсируют в соответствии с приведенным ниже способом удлинения пептидной цепи.

Аминокислота, имеющая аминогруппу, защищенную Fmoc-группой, HOBt (67,6 мг, 0,50 ммоль) и DIPCI (77,0 мкл, 63,1 мг, 0,50 ммоль) растворяют в DMF (2 мл). После активации в течение 15 минут полученную смесь загружают в колонку для твердофазного синтеза. После перемешивания при комнатной температуре в течение одного часа Fmoc-группу удаляют с помощью 20%-ного раствора пиперидина/DMF (2 мл) в течение 20-ти минут. Эту операцию проводят повторно, применяя аминокислоту, защищенную Fmoc-группой (0,5 ммоль), для последовательной конденсации аминокислот.

Fmoc-Gly, Fmoc-Arg(Pbf), Fmoc-Gly, Fmoc-Lys(Boc), Fmoc-Val, Fmoc-Leu, Fmoc-Trp(Boc), Fmoc-Ala, Fmoc-Ile, Fmoc-Phe и Fmoc-Glu(OtBu) применяют, в качестве аминокислот, защищенных Fmoc-группой, для получения пептида, состоящего из 11 аминокислотных остатков, следующего вида Fmoe-Gly-Arg(Pbf)-Gly-Lys(Boc)-Val-Leu-Trp(Boc)-Ala-Ile-Phe-Glu(OtBu) (SEQ ID NO:80) на смоле, которая представляет собой твердую фазу. Пептид, состоящий из 11 аминокислотных остатков (эквивалент 10 мкмоль), переносят в отдельно подготовленную колонку для твердофазного синтеза, Fmoc-группу удаляют, применяя 20%-ный раствор пиперидин/DMF (2 мл) в течение 15 минут, и промывают DMF. В отдельной центрифужной пробирке, асиало-аспарагин с присоединенной олигосахаридной цепью (b) (продукт компании OTSUKA Chemical Co., Ltd.) 40,0 мг (20,0 мкмоль) и DEPBT 9,0 мг (30,0 мкмоль) растворяют в DMF/DMSO (смесь растворов 4:1, 0,5 мл) и загружают в колонку для твердофазного синтеза. После добавления DIPEA 3,4 мкл (20 мкмоль), смесь перемешивают при комнатной температуре в течение 16 часов.

После перемешивания смолу промывают с помощью DCM и DMF. Fmoc-группу удаляют с помощью 20%-ного раствора пиперидина/DMF (1 мл) в течение 15 минут и then, промывают DMF. Boc-Cys(Trt), HOBt 6,8 мг (0,05 ммоль), и DIPCI 7,7 мкл (0,05 ммоль) растворяют в DMF (1 мл). После активации в течение 15 минут смесь загружают в колонку для твердофазного синтеза. После перемешивания при комнатной температуре в течение одного часа, смолу промывают с помощью DCM и DMF и получают на твердой фазе смолы пептид с присоединенной олигосахаридной цепью, состоящий из 13 аминокислотных остатков, следующего вида Gly-Arg(Pbf)-Gly-Lys(Boc)-Val-Leu-Trp(Boc)-Ala-Ile-Phe-Glu(OtBu)-Asn(олигосахаридная цепь)-Cys(trt) (SEQ ID NO:81). К этому, добавляют смесь трифторуксусная кислота: вода: TIPS (=95:2,5:2,5) и перемешивают при комнатной температуре в течение 3,5 часов. После этого, раствор добавляют к отдельно подготовленному диэтиловому эфиру (150 мл) для получения осадка, и подвергают центрифугированию для отделения осадка, содержащего желаемый пептид с присоединенной олигосахаридной цепью от раствора. После удаления раствора осадок подвергают очистке с помощью ВЭЖХ [колонка: SHISEIDO UG-120 (C18 5 мкм), ϕ 20×250 мм, градиент: раствор А: 0,1% TFA вода, раствор В: 0,09% TFA/10% вода/90% AN 7,0 мл/мин; 25→45%В (15 мин) → 60%В (10 мин) → 95%В (10 мин) линейный градиент] и получают 7,1 мг желаемого пептида с присоединенной олигосахаридной цепью.

Таким способом получают два типа пептидов: пептид, состоящий из 18-ти аминокислот, который имеет бензилтиоэфир на С-конце (1,6 мг), и пептид с присоединенной олигосахаридной цепью, состоящий из 13 аминокислотных остатков (2,5 мг), которые помещают в одну цетрифужную пробирку и растворяют в буферном растворе (рН 6,8, 0,8 мл) (приготовленной из 6 М раствора гуанидин гидрохлорида и 0,2 мМ раствора фосфорной кислоты).) Затем при комнатной температуре добавляют тиофенол (8,0 мкл), и проводят реакцию при комнатной температуре. Через 24 часа завершение реакции подтверждают с помощью ВЭЖХ. После этого, реакционный раствор непосредственно очищают с помощью ВЭЖХ [колонка: SHISEIDO UG-120 (C18 5 мкм), ϕ 20×250 мм, градиент: раствор А: 0,1% TFA вода, раствор В: 0,09% TFA/10% вода/90% AN 7,0 мл/мин; 25→45%В (15 мин) → 60%В (10 мин) → 95%В (10 мин), линейный градиент] и получают 2,0 мг желаемого пептида с присоединенной олигосахаридной цепью, состоящего из 31-го аминокислотного остатка.

Полученный пептид с присоединенной олигосахаридной цепью (1,0 мг) помещают в центрифужную пробирку и растворяют в буферном растворе (рН 7,0, который готовят из 35 мМ раствора ТСЕР, 6 М раствора гуанидин гидрохлорида и 0,2 мМ раствора фосфорной кислоты). К реакционному раствору добавляют активированный никель Ренея при комнатной температуре. Через 18 часов завершение реакции подтверждают с помощью ВЭЖХ. После этого, реакционный раствор фильтруют через мембранный фильтр, и фильтрат, содержащий желаемый пептид с присоединенной олигосахаридной цепью подвергают очистке с помощью ВЭЖХ [колонка: SHISEIDO UG-120 (C18 5 мкм), ϕ 20×250 мм, градиент: раствор А: 0,1% TFA вода, раствор В: 0,09% TFA/10% вода/90% AN 7,0 мл/мин; 25→45%В (15 мин) → 60%В (10 мин) → 95%В (10 мин), линейный градиент] и получают 0,2 мг желаемого пептида GLP-1 с присоединенной олигосахаридной цепью, в котором 26Lys GLP-1 заменен асиало-Asn с присоединенной олигосахаридной цепью (26Asn асиало-GLP-1).

Пример 39

Синтез пептида GLP-1 с присоединенной олигосахаридной цепью 27Asn-асиало

Колонку для твердофазного синтеза заполняют смолой Амино-PEGA (100 мкмоль) (продукт фирмы «Merck»), тщательно промывают дихлорметаном (DCM) и DMF и дают смоле полностью набухнуть в DMF. 4-Гидроксиметил-3-метоксифенокеимасляную кислоту (НМРВ) (0,25 ммоль), TBTU (0,25 ммоль) и N-этилморфолин (0,25 ммоль) растворяют в DMF (2 мл), загружают в колонку и перемешивают при комнатной температуре в течение 4 часов. Смолу тщательно промывают с помощью DMF и DCM и получают смолу HMPB-PEG, которую применяют в качестве твердой фазы для твердофазного синтеза.

Fmoc-Ala (0,50 ммоль), MSNT (0,50 ммоль) и N-метилимидазол (0,375 ммоль) растворяют в DCM (2 мл), загружают в колонку для твердофазного синтеза и перемешивают при 25°С в течение 4 часов.

После перемешивания, смолу промывают с помощью DCM и DMF. Fmoc-группу удаляют с помощью 20%-ного раствора пиперидина/DMF (2 мл) в течение 15 минут. После промывания с помощью DMF, аминокислоты последовательно конденсируют в соответствии с приведенным ниже способом удлинения пептидной цепи.

Аминокислоту, имеющую аминогруппу, защищенную Fmoc-группой, растворяют в N-метилпирролидоне (NMP) (1 мл). После добавления 0,45 М HCTU·HOBT/NMP (0,4 ммоль), полученную смесь загружают в колонку для твердофазного синтеза. Потом, к колонке для твердофазного синтеза добавляют 0,9 М DIPEA/NMP (0,8 ммоль). После перемешивания при комнатной температуре в течение 20-ти минут, смолу промывают с помощью DCM и DMF, и Fmoc-группу удаляют с помощью 20%-ного раствора пиперидина/DMF (2 мл) в течение 15 минут. Эту операцию проводят повторно, применяя аминокислоту, защищенную Fmoc-группой (0,5 ммоль), для последовательной конденсации аминокислот.

Fmoc-Ala,Fmoc-Gln(Trt), Fmoc-Gly, Fmoc-Glu(OtBu), Fmoc-Leu, Fmoc-Tyr(tBu), Fmoc-Ser(tBu), Fmoc-Ser(tBu), Fmoc-Val, Fmoc-Asp(OtBu), Fmoc-Ser(tBu), Fmoc-Thr(tBu), Fmoc-Phe, Fmoc-Thr(tBu), Fmoc-Gly, Fmoc-Glu(OtBu) и Fmoc-Ala применяют, в качестве аминокислот, защищенных Fmoc-группой, и Boc-His(Trt) применяют в качестве аминокислоты, защищенной Вос-группой, для получения на смоле, которая представляет собой твердую фазу, пептида, состоящего из 18-ти аминокислот, следующего вида А1а-Gln(Trt)-Gly-Glu(OtBu)-Leu-Tyr(tBu)-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Val-Asp(OtBu)-Ser(tBu)-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Gly-Glu(OtBu)-Ala-His(Trt) (SEQ ID NO:82).

После промывания с помощью DCM и DMF, смесь растворов трифторэтанола и уксусной кислоты (1:1) добавляют так, чтобы смола была полностью погружена в жидкость и перемешивают при комнатной температуре в течение 18 часов. Смолу удаляют фильтрованием, и реакционный раствор концентрируют при пониженном давлении. Полученный остаток концентрируют и получают защищенный пептид, состоящий из 18-ти аминокислотных остатков, следующего вида Ala-Gln(Trt)-Gly-Glu(OtBu)-Leu-Tyr(tBu)-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Val-Asp(OtBu)-Ser(tBu)-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Gly-Glu(OtBu)-Ala-His(Trt)-NHBoc (SEQ ID NO:83).

Защищенный пептид, состоящий из 18-ти аминокислотных остатков (эквивалент 35 мкмоль), переносят во флакон, имеющий форму баклажана, растворяют в DMF (3,7 мл) и охлаждают до от -15 до -20°С под атмосферой аргона. К этому добавляют бензилтиол (125 мкл, 1,06 ммоль) и добавляют отдельно подготовленный раствор PyBOP (94,7 мг, 182 мкмоль) в DMF (1,0 мл), и потом добавляют DIPEA (29,8 мкл, 175 мкмоль). Смесь перемешивают при от -15 до -20°С в течение 2-х часов и добавляют к охлажденному диэтиловому эфиру (150 мл). После осаждения пептидного компонента, раствор удаляют через мембранный фильтр. К остатку добавляют смесь трифторуксусная кислота: вода: TIPS (=95:2,5:2,5) и перемешивают при комнатной температуре. Через 2 часа раствор снова добавляют к отдельно подготовленному диэтиловому эфиру (150 мл) для получения осадка. После этого, раствор удаляют через мембранный фильтр для получения осадка, содержащего желаемое тиоэфирное соединение пептида. Этот осадок очищают с помощью ВЭЖХ [колонка: SHISEIDO UG-120 (C18 5 мкм), ϕ 20×250 мм, градиент: раствор А: 0,1% TFA вода, раствор В: 0,09% TFA/10% вода/90% AN 7,0 мл/мин; 25→45%В (15 мин) → 60%В (10 мин) → 95%В (10 мин), линейный градиент] и получают пептид, состоящий из 18-ти аминокислотных остатков, который имеет на С-конце бензилтиоэфир: PhS-Ala-Gln-Gly-Glu-Leu-Tyr-Ser-Ser-Val-Asp-Ser-Thr-Phe-Thr-Gly-Glu-Ala-His (SEQ ID NO:84).

С другой стороны, колонку для твердофазного синтеза заполняют смолой Амино-PEGA (продукт фирмы «Merck») (100 мкмоль), тщательно промывают дихлорметаном (DCM) и DMF и дают смоле полностью набухнуть в DMF. 4-Гидроксиметил-3-метоксифеноксимасляную кислоту (НМРВ) (0,25 ммоль), TBTU (0,25 ммоль) и N-этилморфолин (0,25 ммоль) растворяют в DMF (2 мл), загружают в колонку и перемешивают при комнатной температуре в течение 4 часов. Смолу тщательно промывают с помощью DMF и DCM и получают смолу HMPB-PEG, которую применяют в качестве твердой фазы для твердофазного синтеза.

Fmoc-Gly (0,50 ммоль), MSNT (0,50 ммоль) и N-метилимидазол (0,375 ммоль) растворяют в DCM (2 мл), загружают в колонку для твердофазного синтеза и перемешивают при 25°С в течение 4 часов.

После перемешивания, смолу промывают с помощью DCM и DMF. Fmoc-группу удаляют с помощью 20%-ного раствора пиперидина/DMF (2 мл) в течение 15 минут. После промывания с помощью DMF, аминокислоты последовательно конденсируют в соответствии с приведенным ниже способом удлинения пептидной цепи.

Аминокислота, имеющая аминогруппу, защищенную Fmoc-группой, HOBt (67,6 мг, 0,50 ммоль) и DIPCI (77,0 мкл, 63,1 мг, 0,50 ммоль) растворяют в DMF (2 мл). После активации в течение 15 минут полученную смесь загружают в колонку для твердофазного синтеза. После перемешивания при комнатной температуре в течение одного часа Fmoc-группу удаляют с помощью 20%-ного раствора пиперидина/DMF (2 мл) в течение 20-ти минут. Эту операцию проводят повторно, применяя аминокислоту, защищенную Fmoc-группой (0,5 ммоль), для последовательной конденсации аминокислот.

Fmoc-Gly, Fmoc-Arg(Pbf), Fmoc-Gly, Fmoc-Lys(Boc), Fmoc-Val, Fmoc-Leu, Fmoc-Trp(Boc), Fmoc-Ala, Fmoc-Ile, и Fmoc-Phe применяют, в качестве аминокислот, защищенных Fmoc-группой, для получения на смоле, которая представляет собой твердую фазу, пептида, состоящего из 10-ти аминокислотных остатков, следующего вида Gly-Arg(Pbf)-Gly-Lys(Boc)-Val-Leu-Trp(Boe)-Ala-Ile-Phe (SEQ ID NO:85). Пептид, состоящий из 10-ти аминокислотных остатков (эквивалент 10 мкмоль), переносят в отдельно подготовленную колонку для твердофазного синтеза. Fmoc-группу удаляют, применяя 20%-ный раствор пиперидин/DMF (1 мл) в течение 15 минут, и промывают DMF. В отдельной центрифужной пробирке, асиало-аспарагин с присоединенной олигосахаридной цепью (b) (продукт компании OTSUKA Chemical Co., Ltd.) 37,2 мг (18,8 мкмоль) и DEPBT 8,5 мг (28,4 мкмоль) растворяют в DMF/DMSO (4:1 смесь растворов, 1,0 мл) и загружают в колонку для твердофазного синтеза. После добавления DIPEA 3,2 мкл (18,8 мкмоль), смесь перемешивают при комнатной температуре в течение 16 часов.

После перемешивания, смолу промывают с помощью DCM и DMF. Fmoc-группу удаляют с помощью 20%-ного раствора пиперидина/DMF (1 мл) в течение 15 минут. После промывания с помощью DMF, аминокислоты последовательно конденсируют в соответствии с приведенным ниже способом удлинения пептидной цепи.

Аминокислоту, имеющую аминогруппу, защищенную Fmoc-группой, и HOBt (6,8 мг, 0,05 ммоль) и DIPCI (7,7 мкл, 0,05 ммоль) растворяют в DMF (1 мл). После активации в течение 15 минут полученную смесь загружают в колонку для твердофазного синтеза. После перемешивания при комнатной температуре в течение одного часа Fmoc-группу удаляют с помощью 20%-ного раствора пиперидина/DMF (1 мл) в течение 20-ти минут. Эту операцию проводят повторно для последовательной конденсации аминокислот.Fmoc-Lys(Boc) применяют в качестве аминокислоты, защищенной Fmoc-группой и Boc-Cys(Trt) применяют в качестве аминокислоты, защищенной Вос-группой, и получают на смоле, которая представляет собой твердую фазу, пептид с присоединенной олигосахаридной цепью, состоящий из 13-ти аминокислотных остатков, следующего вида Gly-Arg(Pbf)-Gly-Lys(Boc)-Val-Leu-Trp(Boc)-Ala-Ile-Phe-Asn(олигосахаридная цепь)-Lys(Boc)-Cys(Trt) (SEQ ID NO:86). К этому добавляют смесь трифторуксусная кислота: вода: TIPS (=95:2,5:2,5) и перемешивают при комнатной температуре в течение 3,5 часов. После этого раствор добавляют к отдельно подготовленному диэтиловому эфиру (150 мл) для получения осадка, и подвергают центрифугированию для отделения осадка, содержащего желаемый пептид с присоединенной олигосахаридной цепью, от раствора. Раствор удаляют, и получение желаемого продукта подтверждают с помощью ВЭЖХ. После очистки с помощью ВЭЖХ [колонка: SHISEIDO UG-120 (C18 5 мкм), ϕ 20×250 мм, градиент: раствор А: 0,1% TFA вода, раствор В: 0,09% TFA/10% вода/90% AN 7,0 мл/мин; 25→45%В (15 мин) → 60%В (10 мин) → 95%В (10 мин) линейный градиент] и получают 6,1 мг пептида с присоединенной олигосахаридной цепью, состоящего из 13-го аминокислотного остатка.

Таким способом получают два типа пептидов: пептид, состоящий из 18-ти аминокислотных остатков, который имеет бензилтиоэфир на С-конце (1,3 мг), и пептид с присоединенной олигосахаридной цепью, состоящий из 13-ти аминокислотных остатков (2,0 мг), которые помещают в одну цетрифужную пробирку и растворяют в буферном растворе (рН 6,8, 0,64 мл) (приготовленном из 6 М раствора гуанидин гидрохлорида и 0,2 мМ раствора фосфорной кислоты). Затем добавляют при комнатной температуре тиофенол (6,4 мкл) и проводят реакцию при комнатной температуре. Через 24 часа, завершение реакции подтверждают с помощью ВЭЖХ. После этого, реакционный раствор непосредственно очищают с помощью ВЭЖХ [колонка: SHISEIDO UG-120 (C18 5 мкм), ϕ 20×250 мм, градиент: раствор А: 0,1% TFA вода, раствор В: 0,09% TFA/10% вода/90% AN 7,0 мл/мин; 25→45%В (15 мин) → 60%В (10 мин) → 95%В (10 мин), линейный градиент] и получают 1,0 мг пептид с присоединенной олигосахаридной цепью, состоящий из 31-го аминокислотного остатка.

Полученный пептид с присоединенной олигосахаридной цепью (1,0 мг) помещают в центрифужную пробирку и растворяют в буферном растворе (рН 7,0, который готовят из 35 мМ раствора ТСЕР, 6 М раствора гуанидин гидрохлорида и 0,2 мМ раствора фосфорной кислоты). К реакционному раствору добавляют активированный никель Ренея при комнатной температуре. Через 18 часов завершение реакции подтверждают с помощью ВЭЖХ. После этого, реакционный раствор фильтруют через мембранный фильтр, и фильтрат, содержащий пептид с присоединенной олигосахаридной цепью, подвергают очистке с помощью ВЭЖХ [колонка: SHISEIDO UG-120 (C18 5 мкм), ϕ 20×250 мм, градиент: раствор А: 0,1% TFA вода, раствор В: 0,09% TFA/10% вода/90% AN 7,0 мл/мин; 25→45%В (15 мин) → 60%В (10 мин) → 95%В (10 мин), линейный градиент] и получают 0,5 мг желаемого пептида GLP-1 с присоединенной олигосахаридной цепью, в котором 27Glu GLP-1 заменен асиало-Asn с присоединенной олигосахаридной цепью (27Asn асиало-GLP-1).

Пример 40

Синтез пептида GLP-1 с присоединенной олигосахаридной цепью 28Asn-асиало

Колонку для твердофазного синтеза заполняют смолой Амино-PEGA (100 мкмоль) (продукт фирмы «Merck»), тщательно промывают дихлорметаном (DCM) и DMF и дают смоле полностью набухнуть в DMF. 4-Гидроксиметил-3-метоксифеноксимасляную кислоту (НМРВ) (0,25 ммоль), TBTU (0,25 ммоль) и N-этилморфолин (0,25 ммоль) растворяют в DMF (2 мл), загружают в колонку и перемешивают при комнатной температуре в течение 4-х часов. Смолу тщательно промывают с помощью DMF и DCM и получают смолу HMPB-PEG, которую применяют в качестве твердой фазы для твердофазного синтеза.

Fmoc-Ala (0,50 ммоль), MSNT (0,50 ммоль) и N-метилимидазол (0,375 ммоль) растворяют в DCM (2 мл), загружают в колонку для твердофазного синтеза и перемешивают при 25°С в течение 4-х часов.

После перемешивания смолу промывают с помощью DCM и DMF. Fmoc-группу удаляют с помощью 20%-ного раствора пиперидина/DMF (2 мл) в течение 15 минут. После промывания с помощью DMF, аминокислоты последовательно конденсируют в соответствии с приведенным ниже способом удлинения пептидной цепи.

Аминокислоту, имеющую аминогруппу, защищенную Fmoc-группой, растворяют в N-метилпирролидоне (NMP) (1 мл). После добавления 0,45 М HCTU·HOBT/NMP (0,4 ммоль), полученную смесь загружают в колонку для твердофазного синтеза. Потом к колонке для твердофазного синтеза добавляют 0,9 М DIPEA/NMP (0,8 ммоль). После перемешивания при комнатной температуре в течение 20-ти минут, смолу промывают с помощью DCM и DMF, и Fmoc-группу удаляют с помощью 20%-ного раствора пиперидина/DMF (2 мл) в течение 15 минут. Эту операцию проводят повторно, применяя аминокислоту, защищенную Fmoc-группой (0,5 ммоль), для последовательной конденсации аминокислот.

Fmoc-Ala, Fmoc-Gln(Trt), Fmoc-Gly, Fmoc-Glu(OtBu), Fmoc-Leu, Fmoc-Tyr(tBu), Fmoc-Ser(tBu), Fmoc-Ser(tBu), Fmoc-Val, Fmoc-Asp(OtBu), Fmoc-Scr(tBu), Fmoc-Thr(tBu), Fmoc-Phe, Fmoc-Thr(tBu), Fmoc-Gly, Fmoc-Glu(OtBu) и Fmoc-Ala применяют, в качестве аминокислот, защищенных Fmoc-группой, и Boc-His(Trt) применяют в качестве аминокислоты, защищенной Вос-группой, для получения на смоле, которая представляет собой твердую фазу, пептида, состоящего из 18-ти аминокислотных остатков, следующего вида Ala-Gln(Trt)-Gly-Glu(OtBu)-Leu-Tyr(tBu)-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Val-Asp(OtBu)-Ser(tBu)-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Gly-Glu(OtBu)-Ala-His(Trt) (SEQ ID NO:87).

После промывания с помощью DCM и DMF, смесь растворов трифторэтанола и уксусной кислоты (1:1) добавляют так, чтобы смола была полностью погружена в жидкость и перемешивают при комнатной температуре в течение 18 часов. Смолу удаляют фильтрованием, и реакционный раствор концентрируют при пониженном давлении. Полученный остаток концентрируют и получают защищенный пептид, состоящий из 18-ти аминокислотных остатков, следующего вида Ala-Gln(Trt)-Gly-Glu(OtBu)-Leu-Tyr(tBu)-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Val-Asp(OtBu)-Ser(tBu)-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Gly-Glu(OtBu)-AIa-His(Trt)-NHBoc (SEQ ID NO:88).

Защищенный пептид, состоящий из 18-ти аминокислотных остатков (эквивалент 35 мкмоль), переносят во флакон, имеющий форму баклажана, растворяют в DMF (3,7 мл) и охлаждают до от -15 до -20°С под атмосферой аргона. К этому добавляют бензилтиол (125 мкл, 1,06 мкмоль) и добавляют отдельно подготовленный раствор PyBOP (94,7 мг, 182 мкмоль) в DMF (1,0 мл), и потом добавляют DIPEA (29,8 мкл, 175 мкмоль). Смесь перемешивают при от -15 до -20°С в течение 2 часов и добавляют к охлажденному диэтиловому эфиру (150 мл). После осаждения псптидного компонента раствор удаляют через мембранный фильтр. К остатку добавляют смесь трифторуксусная кислота: вода: TIPS (=95:2,5:2,5) и перемешивают при комнатной температуре. Через 2 часа раствор снова добавляют к отдельно подготовленному диэтиловому эфиру (150 мл) для получения осадка. После этого раствор удаляют через мембранный фильтр для получения осадка, содержащего желаемое тиоэфирное соединение пептида. Этот осадок очищают с помощью ВЭЖХ [колонка: SHISEIDO UG-120 (C18 5 мкм), ϕ 20×250 мм, градиент: раствор А: 0,1% TFA вода, раствор В: 0,09% TFA/10% вода/90% AN 7,0 мл/мин; 25→45%В (15 мин) → 60%В (10 мин) → 95%В (10 мин), линейный градиент] и получают пептида, состоящего из 18-ти аминокислотных остатков, который имеет на С-конце бензилтиоэфир: PhS-Ala-Gln-GIy-GIu-Leu-Tyr-Ser-Ser-Val-Asp-Ser-Thr-Phe-Thr-Gly-Glu-Ala-His (SEQ ID NO:89).

С другой стороны, колонку для твердофазного синтеза заполняют смолой Амино-PEGA (продукт фирмы «Merck») (100 мкмоль), тщательно промывают дихлорметаном (DCM) и DMF и дают смоле полностью набухнуть в DMF. 4-Гидроксиметил-3-метоксифеноксимасляную кислоту (НМРВ) (0,25 ммоль), TBTU (0,25 ммоль) и N-этилморфолин (0,25 ммоль) растворяют в DMF (2 мл), загружают в колонку и перемешивают при комнатной температуре в течение 4-х часов. Смолу тщательно промывают с помощью DMF и DCM и получают смолу HMPB-PEG, которую применяют в качестве твердой фазы для твердофазного синтеза.

Fmoc-Gly (0,50 ммоль), MSNT (0,50 ммоль) и N-метилимидазол (0,375 ммоль) растворяют в DCM (2 мл), загружают в колонку для твердофазного синтеза и перемешивают при 25°С в течение 4-х часов. После перемешивания, смолу промывают с помощью DCM и DMF. Fmoc-группу удаляют с помощью 20%-ного раствора пиперидина/DMF (2 мл) в течение 15 минут. После промывания с помощью DMF аминокислоты последовательно конденсируют в соответствии с приведенным ниже способом удлинения пептидной цепи.

Аминокислоту, имеющую аминогруппу, защищенную Fmoc-группой, и HOBt (67,6 мг, 0,50 ммоль) и DIPCI (77,0 мкл, 63,1 мг, 0,50 ммоль) растворяют в DMF (2 мл). После активации в течение 15 минут полученную смесь загружают в колонку для твердофазного синтеза. После перемешивания при комнатной температуре в течение одного часа, Fmoc-группу удаляют с помощью 20%-ного раствора пиперидина/DMF (2 мл) в течение 20-ти минут. Эту операцию проводят повторно, применяя аминокислоту, защищенную Fmoc-группой (0,5 ммоль), для последовательной конденсации аминокислот.

Fmoc-Gly, Fmoc-Arg(Pbf), Fmoc-Gly, Fmoc-Lys(Boc), Fmoc-Val, Fmoc-Leu, Fmoc-Trp(Boc), Fmoc-Ala и Fmoc-Ile применяют, в качестве аминокислот, защищенных Fmoc-группой, для получения на смоле, которая представляет собой твердую фазу, пептида, состоящего из 9-ти аминокислотных остатков, следующего вида Gly-Arg(Pbf)-Gly-Lys(Boc)-Val-Leu-Trp(Boc)-Ala-Ile (SEQ ID NO:90). Пептид, состоящий из 9-ти аминокислотных остатков (эквивалент 11 мкмоль), переносят в отдельно подготовленную колонку для твердофазного синтеза, Fmoc-группу удаляют, применяя 20%-ный раствор пиперидин/DMF (1 мл) в течение 15 минут, и промывают DMF. В отдельной центрифужной пробирке, асиало-аспарагин с присоединенной олигосахаридной цепью (b) (продукт компании OTSUKA Chemical Co., Ltd.) 82,6 мг (41,8 мкмоль) и DEPBT 18,7 мг (62,5 мкмоль) растворяют в DMF/DMSO (смесь растворов 4:1, 1,4 мл) и загружают в колонку для твердофазного синтеза. После добавления DIPEA 7,0 мкл (41,2 мкмоль), смесь перемешивают при комнатной температуре в течение 16 часов.

После перемешивания смолу промывают с помощью DCM и DMF. Fmoc-группу удаляют с помощью 20%-ного раствора пиперидина/DMF (1 мл) в течение 15 минут. После промывания с помощью DMF, аминокислоты последовательно конденсируют в соответствии с приведенным ниже способом удлинения пептидной цепи.

Аминокислоту, имеющую аминогруппу, защищенную Fmoe-группой, HOBt 6,8 мг (0,05 ммоль) и DIPCI 7,7 мкл (0,05 ммоль) растворяют в DMF (1 мл). После активации в течение 15 минут смесь загружают в колонку для твердофазного синтеза. После перемешивания при комнатной температуре в течение одного часа, Fmoc-группу удаляют с помощью 20%-ного раствора пиперидина/DMF (1 мл) в течение 20-ти минут. Эту операцию проводят повторно для последовательной конденсации аминокислот. Fmoc-Glu(OtBu) и Fmoc-Lys(Boc) применяют, в качестве аминокислот, защищенных Fmoc-группой, и Boc-Cys(Trt) применяют в качестве аминокислоты, защищенной Вос-группой, и получают на смоле, которая представляет собой твердую фазу, пептид с присоединенной олигосахаридной цепью, состоящий из 13-ти-ти аминокислотных остатков, следующего вида Gly-Arg(Pbf)-Gly-Lys(Boc)-Val-Leu-Trp(Boc)-Ala-Ile-Asn(олигосахаридная цепь)-Glu(OtBu)-Lys(Boc)-Cys(Trt) (SEQ ID NO:91). К этому добавляют смесь трифторуксусная кислота: вода: TIPS (=95:2,5:2,5) и перемешивают при комнатной температуре в течение 3,5 часов. После этого раствор добавляют к отдельно подготовленному диэтиловому эфиру (150 мл) для получения осадка, и подвергают центрифугированию для отделения осадка, содержащего желаемый пептид с присоединенной олигосахаридной цепью от раствора. После удаления раствора, осадок подвергают очистке с помощью ВЭЖХ [колонка: SHISEIDO UG-120 (C18 5 мкм), ϕ 20×250 мм, градиент: раствор А: 0,1% TFA вода, раствор В: 0,09% TFA/10% вода/90% AN 7,0 мл/мин; 25→45%В (15 мин) → 60%В (10 мин) → 95%В (10 мин) линейный градиент] и получают 10,1 мг пептида с присоединенной олигосахаридной цепью, состоящего из 13-ти аминокислотных остатков.

Таким способом получают два типа пептидов: пептид, состоящий из 18-ти аминокислотных остатков, который имеет бензилтиоэфир на С-конце (3,6 мг), и пептид с присоединенной олигосахаридной цепью, состоящий из 13-ти аминокислотных остатков (5,6 мг), которые помещают в одну цетрифужную пробирку и растворяют в буферном растворе (рН 6,8, 1,8 мл) (приготовленной из 6 М раствора гуанидин гидрохлорида и 0,2 мМ раствора фосфорной кислоты). Затем добавляют при комнатной температуре тиофенол (18 мкл) и проводят реакцию при комнатной температуре. Через 24 часа, завершение реакции подтверждают с помощью ВЭЖХ. После этого, реакционный раствор непосредственно очищают с помощью ВЭЖХ [колонка: SHISEIDO UG-120 (C18 5 мкм), ϕ 20×250 мм, градиент: раствор А: 0,1% TFA вода, раствор В: 0,09% TFA/10% вода/90% AN 7,0 мл/мин; 25→45%В (15 мин) → 60%В (10 мин) → 95%В (10 мин), линейный градиент] и получают 3,8 мг пептида с присоединенной олигосахаридной цепью, состоящего из 31 -го аминокислотного остатка.

Полученный пептид с присоединенной олигосахаридной цепью (1,3 мг) помещают в центрифужную пробирку и растворяют в буферном растворе (рН 7,0, который готовят из 35 мМ раствора ТСЕР, 6 М раствора гуанидин гидрохлорида и 0,2 мМ раствора фосфорной кислоты). К реакционному раствору добавляют активированный никель Ренея при комнатной температуре. Через 40 часов завершение реакции подтверждают с помощью ВЭЖХ. После этого реакционный раствор фильтруют через мембранный фильтр, и фильтрат, содержащий пептид с присоединенной олигосахаридной цепью, подвергают очистке с помощью ВЭЖХ [колонка: SHISEIDO UG-120 (C18 5 мкм), ϕ 20×250 мм, градиент: раствор А: 0,1% TFA вода, раствор В: 0,09% TFA/10% вода/90% AN 7,0 мл/мин; 25→45%В (15 мин) → 60%В (10 мин) → 95%В (10 мин), линейный градиент] и получают 0,8 мг желаемого пептида GLP-1 с присоединенной олигосахаридной цепью, в котором 28Phe GLP-1 заменен асиало-Asn с присоединенной олигосахаридной цепью (28Asn асиало-GLP-1).

Пример 41

Синтез пептида GLP-1 с присоединенной олигосахаридной цепью 30 Asn-асиало

Колонку для твердофазного синтеза заполняют смолой Амино-PEGA (50 мкмоль) (продукт фирмы «Merck»), тщательно промывают дихлорметаном (DCM) и DMF и дают смоле полностью набухнуть в DMF. 4-Гидроксиметил-3-метоксифеноксимасляную кислоту (НМРВ) (0,125 ммоль), TBTU (0,125 ммоль) и N-этилморфолин (0,125 ммоль) растворяют в DMF (2 мл), загружают в колонку и перемешивают при комнатной температуре в течение 4-х часов. Смолу тщательно промывают с помощью DMF и DCM и получают смолу HMPB-PEG, которую применяют в качестве твердой фазы для твердофазного синтеза.

Fmoc-Gly (0,25 ммоль), MSNT (0,25 ммоль) и N-метилимидазол (0,175 ммоль) растворяют в DCM (2 мл), загружают в колонку для твердофазного синтеза и перемешивают при 25°С в течение 3-х часов.

После перемешивания смолу промывают с помощью DCM и DMF. Fmoc-группу удаляют с помощью 20%-ного раствора пиперидина/DMF (2 мл) в течение 15 минут. После промывания с помощью DMF, аминокислоты последовательно конденсируют в соответствии с приведенным ниже способом удлинения пептидной цепи.

Аминокислоту, имеющую аминогруппу, защищенную Fmoc-группой, растворяют в N-метилпирролидоне (NMP) (1 мл). После добавления 0,45 М HCTU·HOBT/NMP (0,25 ммоль) полученную смесь загружают в колонку для твердофазного синтеза. Потом, к колонке для твердофазного синтеза добавляют 0,9 М DIPEA/NMP (0,25 ммоль). После перемешивания при комнатной температуре в течение 20-ти минут, смолу промывают с помощью DCM и DMF, и Fmoc-группу удаляют с помощью 20%-ного раствора пиперидина/DMF (2 мл) в течение 15 минут. Эту операцию проводят повторно, применяя аминокислоту, защищенную Fmoc-группой (0,25 ммоль), для последовательной конденсации аминокислот.

Fmoc-Gly, Fmoc-Arg(Pbf), Fmoc-Gly, Fmoc-Lys(Boc), Fmoc-Val, Fmoc-Leu и Fmoc-Trp(Boc) применяют, в качестве аминокислот, защищенных Fmoc-группой, для получения на смоле, которая представляет собой твердую фазу, пептида, состоящего из 7-ми аминокислотных остатков, следующего вида Gly-Arg(Pbf)-Gly-Lys(Boc)-Val-Leu-Trp(Boc) (SEQ ID NO:92).

Асиало-аспарагин с присоединенной олигосахаридной цепью (b) (продукт компании OTSUKA Chemical Co., Ltd.) 198 мг (100 мкмоль) и DEPBT 30,0 мг (100 мкмоль) растворяют в NMP/DMSO (2,4/0,6 мл) и загружают в колонку для твердофазного синтеза. После добавления DIPEA 26 мкл (150 мкмоль) смесь перемешивают при комнатной температуре в течение 24 часов. После промывания с помощью DCM и DMF, получают на твердой фазе пептид с присоединенной олигосахаридной цепью, состоящий из 8-ми аминокислотных остатков, следующего вида Gly-Arg(Pbf)-Gly-Lys(Boc)-Val-Lcu-Тгр(Вос)-Asn(олигосахаридная цепь) (SEQ ID NO:93). Потом аминокислоту, имеющую аминогруппу, защищенную Fmoc-группой, конденсируют с помощью HOBt 34 мг (0,25 ммоль), DIPCI 38 мкл (0,25 ммоль) и DMF (1 мл) с образованием пептида с присоединенной олигосахаридной цепью, состоящего из 31-го аминокислотного остатка, следующего вида Gly-Arg(PbI)-Gly-Lys(Boc)-Val-Leu-Trp(Boe)-Asn(олигосахаридная цепь)-Ile-Phe-Glu(OtBu)-Lys(Boc)-Ala-Ala-Gln(Trt)-Gly-Glu(OtBu)-Leu-Tyr(tBu)-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Val-Asp(OtBu)-Ser(tBu)-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Gly-Glu(OtBu)-Ala-His(Trt) (SEQ ID NO:94).

К полученной смоле, на которой сформирован пептид с присоединенной олигосахаридной цепью, добавляют смесь трифторуксусная кислота: вода: TIPS (=95:2,5:2,5) так, чтобы смола была полностью погружена в жидкость и перемешивают при комнатной температуре в течение 3-х часов. Смолу удаляют фильтрованием, и реакционный раствор концентрируют при пониженном давлении. Полученный остаток очищают с помощью ВЭЖХ [колонка: SHISEIDO UG-120 (C18 5 мкм), ϕ 20×250 мм, градиент: раствор А: 0,1% TFA вода, раствор В: 0,09% TFA/10% вода/90% AN 7,0 мл/мин; 35→60%В, 20 мин, линейный градиент] и получают 6,4 мг пептида GLP-1 с присоединенной олигосахаридной цепью, в котором 30Ala GLP-1 заменена асиало-Asn с присоединенной олигосахаридной цепью (30Asn асиало-GLP-1).

Пример 42

Синтез пептида GLP-1 с присоединенной олигосахаридной цепью 36Asn асиало

Колонку для твердофазного синтеза заполняют смолой Амино-PEGA (50 мкмоль) (продукт фирмы «Merck»), тщательно промывают дихлорметаном (DCM) и DMF и дают смоле полностью набухнуть в DMF. 4-Гидроксиметил-3-метоксифеноксимасляную кислоту (НМРВ) (0,125 ммоль), TBTU (0,125 ммоль) и N-этилморфолин (0,125 ммоль) растворяют в DMF (2 мл), загружают в колонку и перемешивают при комнатной температуре в течение 4-х часов. Смолу тщательно промывают с помощью DMF и DCM и получают смолу HMPB-PEG, которую применяют в качестве твердой фазы для твердофазного синтеза.

Fmoc-Gly (0,25 ммоль), MSNT (0,25 ммоль) и N-метилимидазол (0,175 ммоль) растворяют в DCM (2 мл), загружают в колонку для твердофазного синтеза и перемешивают при 25°С в течение 3-х часов.

После перемешивания смолу промывают с помощью DCM и DMF. Fmoc-группу удаляют с помощью 20%-ного раствора пиперидина/DMF (2 мл) в течение 15 минут. После промывания с помощью DMF аминокислоты последовательно конденсируют в соответствии с приведенным ниже способом удлинения пептидной цепи.

Аминокислоту, имеющую аминогруппу, защищенную Fmoc-группой, растворяют в N-метилпирролидоне (NMP) (1 мл). После добавления 0,45 М HCTU·HOBT/NMP (0,25 ммоль), полученную смесь загружают в колонку для твердофазного синтеза. Потом, 0,9 М DIPEA/NMP (0,25 ммоль) добавляют к колонке для твердофазного синтеза. После перемешивания при комнатной температуре в течение 20-ти минут, смолу промывают с помощью DCM и DMF, и Fmoc-группу удаляют с помощью 20%-ного раствора пиперидина/DMF (2 мл) в течение 15 минут. Асиало-аспарагин с присоединенной олигосахаридной цепью (b) (продукт компании OTSUKA Chemical Co., Ltd.) 198 мг (100 мкмоль) и DEPBT 30,0 мг (100 мкмоль) растворяют в NMP/DMSO (2,4/0,6 мл) и загружают в колонку для твердофазного синтеза. После добавления DIPEA 26 мкл (150 мкмоль), смесь перемешивают при комнатной температуре в течение 24 часов. После промывания с помощью DCM и DMF, получают на твердой фазе пептид с присоединенной олигосахаридной цепью, состоящий из 2-х аминокислотных остатков, следующего вида Gly-Asn(олигосахаридная цепь).

Потом, аминокислоту, имеющую аминогруппу, защищенную Fmoc-группой, конденсируют с помощью HOBt 34 мг (0,25 ммоль), DIPCI 38 мкл (0,25 ммоль) и DMF (1 мл) с образованием пептида с присоединенной олигосахаридной цепью, состоящего из 31-го аминокислотного остатка, следующего вида Gly-Asn(олигосахаридная цспь)-Gly-Lys(Boc)-Val-Leu-Trp(Boc)-Ala-Ile-Phe-Glu(OtBu)-Lys(Boc)-Ala-Ala-Gln(Trt)-Gly-Glu(OtBu)-Leu-Tyr(tBu)-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Val-Asp(OtBu)-Ser(tBu)-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Gly-Glu(OtBu)-Ala-His(Trt) (SEQ ID NO:95).

К полученной смоле, на которой сформирован пептид с присоединенной олигосахаридной цепью, добавляют смесь трифторуксусная кислота: вода: TIPS (=95:2,5:2,5) так, чтобы смола была полностью погружена в жидкость и перемешивают при комнатной температуре в течение 3-х часов. Смолу удаляют фильтрованием, и реакционный раствор концентрируют при пониженном давлении. Полученный остаток очищают с помощью ВЭЖХ [колонка: SHISEIDO UG-120 (C18 5 мкм), ϕ 20×250 мм, градиент: раствор А: 0,1% TFA вода, раствор В: 0,09% TFA/10% вода/90% AN 7,0 мл/мин; 35→60%В, 20 мин, линейный градиент] и получают 8,0 мг пептида GLP-1 с присоединенной олигосахаридной цепью, в котором 36Aeg GLP-1 заменен асиало-Asn с присоединенной олигосахаридной цепью (36Asn асиало-GLP-1).

Пример 43

Синтез пептида GLP-1 с присоединенной олигосахаридной цепью

18Asn-дисиало 18Asn-асиало-GLP-1, синтезированный по примеру 36 (0,6 мг), растворяют в 50 мМ какодилатном буфере (рН=5,0, 200 мкл) и добавляют бычий сывороточный альбумин (BSA, 1 мг). Дополнительно добавляют СМР-сиаловую кислоту (5 мг) и щелочную фосфатазу (1 мкл), и смесь гомогенизируют. Наконец, добавляют α2,6-сиалилтрансферазу (продукт фирмы Japan Tobacco Inc., 10 мЕд.) и реакцию проводят при 30°С в течение 24 часов. (Условия для контроля протекания реакции с помощью ВЭЖХ: колонка: SHISEIDO CAPCELPAK C18 UG120, ϕ 4,6×250 мм, система растворителей А: 0,1%-ный водный раствор TFA, система растворителей В: 0,09% TFA ацетонитрил/вода=90/10, градиент А/В=60/40→30/60 40 минут, скорость элюции: 0,7 мл/мин). Фиг.1 показывает типичную регистрацию ВЭЖХ-анализа. На фиг.1, в пике фронта показан 18Asn-асиало-GLP-1 (материал), и в пике, который двигался с отставанием, показан 18Asn-дисиало GLP-1. После очистки с помощью ВЭЖХ в тех же условиях получают 0,3 мг гликозилированного пептида GLP-1 с присоединенной олигосахаридной цепью, в котором 18Ser GLP-1 замещен дисиало-Asn с присоединенной олигосахаридной цепью (18Asn-дисиало-GLP-1).

Пример 44

Синтез пептида GLP-1 с присоединенной олигосахаридной цепью

22Asn-дисиало 22Asn-асиало-GLP-1, синтезированный по примеру 37 (1,3 мг), растворяют в 50 мМ какодилатном буфере (рН=5,0, 200 мкл) и добавляют бычий сывороточный альбумин (BSA, 1 мг). Дополнительно добавляют СМР-сиаловую кислоту (5 мг) и щелочную фосфатазу (1 мкл) и смесь гомогенизируют. Наконец, добавляют α2,6-сиалилтрансферазу (продукт фирмы Japan Tobacco Inc., 10 мЕд.) и реакцию проводят при 30°С в течение 24 часов. (Условия для контроля протекания реакции с помощью ВЭЖХ: колонка: SHISEIDO CAPCELPAK C18 UG120, ϕ 4,6×250 мм, система растворителей А: 0,1% Водный раствор TFA, система растворителей В: 0,09% TFA ацетонитрил/вода=90/10, градиент А/В=60/40→30/60 40 минут, скорость элюции: 0,7 мл/мин). Фиг.2 показывает типичную регистрацию ВЭЖХ. На фиг.2, в пике фронта показан 22Asn-асиало-GLP-1 (материал), и пик, двигавшийся с отставанием, показывает 22Asn-дисиало-GLP-1. После очистки с помощью ВЭЖХ в тех же условиях получают 1,3 мг пептида GLP-1 с присоединенной олигосахаридной цепью, в котором 22Gly GLP-1 замещен дисиало-Asn с присоединенной олигосахаридной цепью (22Asn-дисиало-GLP-1).

Пример 45

Синтез пептида GLP-1 с присоединенной олигосахаридной цепью 30Asn-дисиало

30Asn-асиало-GLP-1, синтезированный по примеру 41 (0,9 мг), растворяют в 50 мМ какодилатном буфере (рН=5,0, 200 мкл) и добавляют бычий сывороточный альбумин (BSA, 1 мг). Дополнительно добавляют СМР-сиаловую кислота (5 мг) и щелочную фосфатазу (1 мкл) и смесь гомогенизируют. Наконец, добавляют α2,6-сиалилтрансферазу (продукт фирмы Japan Tobacco Inc., 10 мЕд.) и реакцию проводят при 30°С в течение 24 часов. (Условия для контроля протекания реакции с помощью ВЭЖХ: колонка: SHISEIDO CAPCELPAK CIS UG120, ϕ 4,6×250 мм, система растворителей А: 0,1% Водный раствор TFA, система растворителей В: 0,09% TFA ацетонитрил/вода=90/10, градиент А/В=60/40→30/60 40 минут, скорость элюции: 0,7 мл/мин). Фиг.3 показывает типичную регистрацию ВЭЖХ. На фиг.3, в пике фронта показан 30Asn-асиало-GLP-1 (материал), и пик, двигавшийся с отставанием, показывает 30Asn-дисиало-GLP-1. После очистки с помощью ВЭЖХ в тех же условиях, получают 0,6 мг пептида GLP-1 с присоединенной олигосахаридной цепью, в котором 30Ala GLP-1 замещен дисиало-Asn с присоединенной олигосахаридной цепью (30Asn-дисиало-GLP-1).

Пример 46

Синтез пептида GLP-1 с присоединенной олигосахаридной цепью 30Asn-дисиало

Колонку для твердофазного синтеза заполняют смолой Амино-PEGA (100 мкмоль) (продукт фирмы «Merck»), тщательно промывают дихлорметаном (DCM) и DMF и дают смоле полностью набухнуть в DMF. 4-Гидроксиметил-3-метоксифеноксимасляную кислоту (НМРВ) (0,25 ммоль), TBTU (0,25 ммоль) и N-этилморфолин (0,25 ммоль) растворяют в DMF (2 мл), загружают в колонку и перемешивают при комнатной температуре в течение 4-х часов. Смолу тщательно промывают с помощью DMF и DCM и получают смолу HMPB-PEG, которую применяют в качестве твердой фазы для твердофазного синтеза.

Fmoc-Ala (0,50 ммоль), MSNT (0,50 ммоль) и N-метилимидазол (0,375 ммоль) растворяют в DCM (2 мл), загружают в колонку для твердофазного синтеза и перемешивают при 25°С в течение 4-х часов.

После перемешивания смолу промывают с помощью DCM и DMF. Fmoc-группу удаляют с помощью 20%-ного раствора пиперидина/DMF (2 мл) в течение 15 минут. После промывания с помощью DMF, аминокислоты последовательно конденсируют в соответствии с приведенным ниже способом удлинения пептидной цепи.

Аминокислоту, имеющую аминогруппу, защищенную Fmoc-группой, растворяют в N-метилпирролидоне (NMP) (1 мл). После добавления 0,45 М HCTU·HOBT/NMP (0,4 ммоль) смесь загружают в колонку для твердофазного синтеза. Потом к колонке для твердофазного синтеза добавляют 0,9 М DIPEA/NMP (0,8 ммоль). После перемешивания при комнатной температуре в течение 20-ти минут смолу промывают с помощью DCM и DMF, и Fmoc-группу удаляют с помощью 20%-ного раствора пиперидина/DMF (2 мл) в течение 15 минут. Эту операцию проводят повторно, применяя аминокислоту, защищенную Fmoc-группой (0,5 ммоль), для последовательной конденсации аминокислот.

Fmoc-Ala, Fmoc-Gln(Trt), Fmoc-Gly, Fmoc-Glu(OtBu), Fmoc-Leu, Fmoc-Tyr(tBu), Fmoc-Ser(tBu), Fmoc-Ser(tBu), Fmoc-Val, Fmoc-Asp(OtBu), Fmoc-Ser(tBu), Fmoc-Thr(tBu), Fmoc-Phe, Fmoc-Thr(tBu), Fmoc-Gly, Fmoc-Glu(OtBu) и Fmoc-Ala применяют в качестве аминокислот, защищенных Fmoc-группой, и Boc-His(Trt) применяют в качестве аминокислоты, защищенной Вос-группой, для получения на смоле, которая представляет собой твердую фазу, пептида, состоящего из 18-ти аминокислотных остатков, следующего вида Ala-Gln(Trt)-Gly-Glu(OtBu)-Leu-Tyr(tBu)-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Val-Asp(OtBu)-Ser(tBu)-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Gly-Glu(OtBu)-Ala-His(Trt) (SEQ ID NO:96).

После промывания с помощью DCM и DMF, добавляют смесь растворов трифторэтанола и уксусной кислоты (1:1), так чтобы смола была полностью погружена в раствор и перемешивают при комнатной температуре в течение 18 часов. Смолу удаляют фильтрованием, и реакционный раствор концентрируют при пониженном давлении. Полученный остаток концентрируют для получения защищенного пептида: Ala-Gln(Trt)-Gly-Glu(OtBu)-Leu-Tyr(tBu)-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Val-Asp(OtBu)-Ser(tBu)-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Gly-Glu(OtBu)-Ala-His(Trt)-NHBoc (SEQ ID NO:97).

Защищенный пептид, состоящий из 18-ти аминокислотных остатков (эквивалент 35 мкмопь), переносят во флакон, имеющий форму баклажана, растворяют в DMF (3,7 мл) и охлаждают до от -15 до -20°С под атмосферой аргона. К этому добавляют бензилтиол 125 мкл (1,06 ммоль) и добавляют отдельно подготовленный раствор PyBOP 94,7 мг (182 мкмоль) в DMF (1,0 мл), и потом добавляют DIPEA 29,8 мкл (175 мкмоль). Смесь перемешивают при от -15 до -20°С в течение 2 часов и добавляют к охлажденному диэтиловому эфиру (150 мл). После осаждения пептидного компонента, раствор удаляют через мембранный фильтр. К остатку добавляют смесь трифторуксусная кислота: вода: TIPS (=95:2,5:2,5) и перемешивают при комнатной температуре. Через 2 часа раствор снова добавляют к отдельно подготовленному диэтиловому эфиру (150 мл) для получения осадка. После этого, раствор удаляют через мембранный фильтр для получения осадка, содержащего желаемое тиоэфирное соединение пептида. Этот осадок очищают с помощью ВЭЖХ [колонка: SHISEIDO UG-120 (C18 5 мкм), ϕ 20×250 мм, градиент: раствор А: 0,1% TFA вода, раствор В: 0,09% TFA/10% вода/90% AN 7,0 мл/мин; 25→45%В (15 мин) → 60%В (10 мин) → 95%В (10 мин) линейный градиент] для получения пептида, состоящего из 18-ти аминокислотных остатков, который имеет на С-конце бензилтиоэфир: PhS-Ala-Gln-Gly-Glu-Leu-Tyr-Ser-Ser-Val-Asp-Ser-Thr-Phe-Thr-Gly-Glu-Ala-His (SEQ ID NO:98).

ESI-MC: Расчетная величина для C₈₈H₁₂₅N₂₁O₃₁S: [М+2Н]²⁺ 1002,9, получено. 1003,3

С другой стороны, колонку для твердофазного синтеза заполняют смолой Амино-PEGA (продукт фирмы «Merck») (100 мкмоль), тщательно промывают дихлорметаном (DCM) и DMF и дают смоле полностью набухнуть в DMF. 4-Гидроксиметил-3-метоксифеноксимасляную кислоту (НМРВ) (0,25 ммоль), TBTU (0,25 ммоль) и N-этилморфолин (0,25 ммоль) растворяют в DMF (2 мл), загружают в колонку и перемешивают при комнатной температуре в течение 4-х часов. Смолу тщательно промывают с помощью DMF и DCM и получают смолу HMPB-PEG, которую применяют в качестве твердой фазы для твердофазного синтеза.

Fmoc-Gly (0,50 ммоль), MSNT (0,50 ммоль) и N-метилимидазол (0,375 ммоль) растворяют в DCM (2 мл), загружают в колонку для твердофазного синтеза и перемешивают при 25°С в течение 4-х часов.

После перемешивания, смолу промывают с помощью DCM и DMF. Fmoc-группу удаляют с помощью 20%-ного раствора пиперидина/DMF (2 мл) в течение 15 минут. После промывания с помощью DMF, аминокислоты последовательно конденсируют в соответствии с приведенным ниже способом удлинения пептидной цепи.

Аминокислоту, имеющую аминогруппу, защищенную Fmoc-группой, HOBt 67,6 мг (0,50 ммоль) и DIPCI 77,0 мкл (63,1 мг, 0,50 ммоль) растворяют в DMF (2 мл). После активации в течение 15 минут полученную смесь загружают в колонку для твердофазного синтеза. После перемешивания при комнатной температуре в течение одного часа Fmoc-группу удаляют с помощью 20%-ного раствора пиперидина/DMF (2 мл) в течение 20-ти минут. Эту операцию проводят повторно, применяя аминокислоту, защищенную Fmoc-группой (0,5 ммоль), для последовательной конденсации аминокислот.

Fmoc-Gly, Fmoc-Arg(Pbf), Fmoc-Gly, Fmoc-Lys(Boc), Fmoc-Val, Fmoc-Leu и Fmoc-Trp(Вос) применяют в качестве аминокислот, защищенных Fmoc-группой, для получения на смоле, которая представляет собой твердую фазу, пептида, состоящего из 7-ми аминокислотных остатков, следующего вида Gly-Arg(Pbf)-Gly-Lys(Boc)-Val-Leu-Trp(Boc) (SEQ ID NO:99). Пептид, состоящий из 7-ми аминокислотных остатков (34,6 мкмоль), переносят в отдельно подготовленную колонку для твердофазного синтеза для удаления Fmoc-группы с применением 20%-ного раствора пиперидина/DMF (2 мл) в течение 15 минут и промывают DMF. В отдельной центрифужной пробирке аспарагин с присоединенной олигосахаридной цепью (f) (продукт компании OTSUKA Chemical Co., Ltd.) 132,7 мг (48,4 мкмоль) и DEPBT 31,2 мг (104,3 мкмоль) растворяют в DMF/DMSO (смесь растворов 1: 4, 0,6 мл) и загружают в колонку для твердофазного синтеза. После добавления DIPEA 18,1 мкл (103,8 мкмоль) смесь перемешивают при комнатной температуре в течение 18 часов.

[Формула 10]

После перемешивания смолу промывают с помощью DCM и DMF. Fmoc-группу удаляют с помощью 20%-ного раствора пиперидина/DMF (1 мл) в течение 15 минут. После промывания с помощью DMF аминокислоты последовательно конденсируют в соответствии с приведенным ниже способом удлинения пептидной цепи.

Аминокислоту, имеющую аминогруппу, защищенную Fmoc-группой, HOBt 33,8 мг (0,25 ммоль) и DIPCI 38,5 мкл (31,5 мг, 0,25 ммоль) растворяют в DMF (1 мл). После активации в течение 15 минут смесь загружают в колонку для твердофазного синтеза. После перемешивания при комнатной температуре в течение одного часа, Fmoc-группу удаляют с помощью 20%-ного раствора пиперидина/DMF (1 мл) в течение 20-ти минут. Эту операцию проводят повторно для последовательной конденсации аминокислот. Fmoc-Ile, Fmoc-Phe, Fmoc-Glu(OtBu) и Fmoc-Lys(Boc) применяют в качестве аминокислот, защищенных Fmoc-группой, и Boc-Cys(Trt) применяют в качестве аминокислоты, защищенной Вос-группой, и получают на смоле, которая представляет собой твердую фазу, пептид с присоединенной олигосахаридной цепью, состоящий из 13-ти аминокислотных остатков, следующего вида Gly-Arg(Pbf)-Gly-Lys(Boc)-Val-Leu-Trp(Boc)-Asn(олигосахаридная цепь)-Ile-Phc-01u(OtBu)-Lys(Boc)-Cys(trt) (SEQ ID NO:100). К этому добавляют смесь трифторуксусная кислота: вода: TIPS (=95:2,5:2,5) и перемешивают при комнатной температуре в течение 3,5 часов. После этого раствор добавляют к отдельно подготовленному диэтиловому эфиру (150 мл) для получения осадка, и подвергают центрифугированию для отделения от раствора осадка, содержащего пептид с присоединенной олигосахаридной цепью. После удаления раствора, полученный осадок растворяют в раствор 50 мМ буфера с дитиотреитолом рН 6,8 (который готовят из раствора 50 мМ дитиотреитола, раствора 6 М гуанидин гидрохлорида и раствора 0,2 мМ фосфорной кислоты) и оставляют для протекания реакции на ночь. После того как получение желаемого продукта будет подтверждено с помощью ВЭЖХ, реакционный раствор непосредственно подвергают очистке с помощью ВЭЖХ [колонка: SHISEIDO UG-120 (C18 5 мкм), ϕ 2×0250 мм, градиент: раствор А: 0,1% TFA вода, раствор В: 0,09% TFA/10% вода/90% AN 7,0 мл/мин; 25→45%В (15 мин) → 60%В (10 мин) → 95%В (10 мин) линейный градиент] и получают пептид с присоединенной олигосахаридной цепью, состоящий из 13-ти аминокислотных остатков (18,2 мг).

ESI-MC: Расчетная величина для C₁₆₉H₂₆₀N₂₆O₇₈S: [М+3Н]³⁺ 1312,2, получено. 1313,0

Таким способом получают два типа пептидов: пептид, состоящий из 18-ти аминокислотных остатков, который имеет бензилтиоэфир на С-конце (9,3 мг), и пептид с присоединенной олигосахаридной цепью, состоящий из 13-ти аминокислотных остатков (18,2 мг), которые помещают в одну цетрифужную пробирку и растворяют в буферном растворе (рН 6,8, 0,15 мл) (который готовят из раствора 6 М гуанидин гидрохлорида и раствора 0,2 мМ фосфорной кислоты). Затем добавляют при комнатной температуре тиофенол (15,4 мкл) и проводят реакцию при 37°С. Через 24 часа реакционный раствор непосредственно подвергают очистке с помощью ВЭЖХ [колонка: SHISEIDO UG-120 (C18 5 мкм), ϕ 20×250 мм, градиент: раствор А: 0,1% TFA вода, раствор В: 0,09% TFA/10% вода/90% AN 7,0 мл/мин; 25→45%В (15 мин) → 60%В (10 мин) → 95%В (10 мин), линейный градиент] и получают пептид с присоединенной олигосахаридной цепью, состоящий из 31-го аминокислотного остатка (9,2 мг).

ESI-MC: Расчетная величина для C₂₅₀H₃₇₇N₄₇O₁₀₉S: [М+4Н]⁴⁺ 1454,4, получено. 1455,0

Полученный пептид с присоединенной олигосахаридной цепью (9,2 мг) помещают в центрифужную пробирку и растворяют в буферном растворе (рН 7,0, который готовят из 35 мМ раствора ТСЕР, 6 М раствора гуанидин гидрохлорида и 0,2 мМ раствора фосфорной кислоты). К реакционному раствору добавляют активированный никель Ренея при комнатной температуре. Через 72 часа завершение реакции подтверждают с помощью ВЭЖХ. После этого реакционный раствор фильтруют через мембранный фильтр, и фильтрат, содержащий желаемый пептид с присоединенной олигосахаридной цепью, подвергают очистке с помощью ВЭЖХ [колонка: SHISEIDO UG-120 (C18 5 мкм), ϕ 20×250 мм, градиент: раствор А: 0,1% TFA вода, раствор В: 0,09% TFA/10% вода/90% AN 7,0 мл/мин; 25→45%В (15 мин) → 60%В (10 мин) → 95%В (10 мин), линейный градиент] для получения пептида с присоединенной олигосахаридной цепью, состоящего из 31-го аминокислотного остатка (1,3 мг).

ESI-MC: Расчетная величина для C₂₅₀H₃₇₇N₄₇O₁₀₉: [М+4Н]⁴⁺ 1446,4, получено. 1447,2

Полученные таким образом пептид с присоединенной олигосахаридной цепью, состоящий из 31-го аминокислотного остатка (1,3 мг), помещают в пробирку Eppendorf растворяют дистиллированной водой (25 мкл). К этому раствору при комнатной температуре добавляют водный раствор 100 мМ гидроксида натрия (25 мкл). Через 30 минут получение желаемого продукта подтверждают с помощью ВЭЖХ, раствор охлаждают до 0°С и нейтрализуют добавлением водного раствора 50 мМ уксусной кислоты (50 мкл). Раствор очищают с помощью ВЭЖХ [колонка: колонка Vydac (C18 5 мкм), ϕ 4,6×250 мм, градиент: раствор А: 0,1% TFA вода, раствор В: 0,09% TFA/10% вода/90% AN 7,0 мл/мин; 25→45%В (15 мин) → 60%В (10 мин) → 95%В (10 мин), линейный градиент] и получают 0,3 мг желаемого пептида GLP-1 с присоединенной олигосахаридной цепью, в котором 30Ala GLP-1 заменен дисиало-Asn с присоединенной олигосахаридной цепью (30Asn-дисиало-GLP-1).

ESI-MC: Расчетная величина для C₂₃₆H₃₆₅N₄₇O₁₀₉: [M+4H]⁴⁺ 1401,4, получено. 1402,1

Пример 47

Синтез пептида GLP-1 с присоединенной олигосахаридной цепью 36Asn-дисиало

36As-асиало-GLP-1, синтезированный по примеру 42 (0,8 мг), растворяют в 50 мМ какодилатного буфера (рН=5,0, 200 мкл) и добавляют бычий сывороточный альбумин (BSA, 1 мг). Дополнительно добавляют СМР-сиаловую кислота (5 мг) и щелочную фосфатазу (1 мкл) и смесь гомогенизируют. Наконец, добавляют α2,6-сиалилтрансферазу (продукт фирмы Japan Tobacco Inc., 10 мЕд.) и реакцию проводят при 30°С в течение 24-х часов. (Условия для контроля протекания реакции с помощью ВЭЖХ: колонка: SHISEIDO CAPCELPAK C18 U0120, ϕ 4,6×250 мм, система растворителей А: 0,1% Водный раствор TFA, система растворителей В: 0,09% TFA ацетонитрил/вода=90/10, градиент А/В=60/40→30/60 40 минут, скорость элюции: 0,7 мл/мин). Фиг.4 показывает типичную регистрацию ВЭЖХ. На фиг.4 в пике фронта показан 36Asn-асиало-GLP-1 (материал), и пик, двигавшийся с отставанием, показывает 36Asn-асиало-GLP-1. После очистки с помощью ВЭЖХ в тех же условиях, получают 0,6 мг пептида GLP-1 с присоединенной олигосахаридной цепью, в котором 36Arg GLP-1 заменен дисиало-Asn с присоединенной олигосахаридной цепью (36Asn-дисиало-GLP-1).

Пример 48

Синтез пептида GLP-1 с присоединенной олигосахаридной цепью 26 и 34Cys-дисиало

Колонку для твердофазного синтеза заполняют смолой Амино-PEGA (100 мкмоль) (продукт фирмы «Merck»), тщательно промывают дихлорметаном (DCM) и DMF и дают смоле полностью набухнуть в DMF. 4-Гидроксиметил-3-метоксифеноксимасляную кислоту (НМРВ) (0,25 ммоль), TBTU (0,25 ммоль) и N-этилморфолин (0,25 ммоль) растворяют в DMF (2 мл), загружают в колонку и перемешивают при комнатной температуре в течение 4-х часов. Смолу тщательно промывают с помощью DMF и DCM и получают смолу HMPB-PEG, которую применяют в качестве твердой фазы для твердофазного синтеза.

Fmoc-Gly (0,50 ммоль), MSNT (0,50 ммоль) и N-метилимидазол (0,375 ммоль) растворяют в DCM (2 мл), загружают в колонку для твердофазного синтеза и перемешивают при 25°С в течение 3-х часов.

После перемешивания смолу промывают с помощью DCM и DMF. Fmoc-группу удаляют с помощью 20%-ного раствора пиперидина/DMF (2 мл) в течение 15 минут. После промывания с помощью DMF, аминокислоты последовательно конденсируют в соответствии с приведенным ниже способом удлинения пептидной цепи.

Аминокислоту, имеющую аминогруппу, защищенную Fmoc-группой, растворяют в N-метилпирролидоне (NMP) (1 мл). После добавления 0,45 М HCTU·HOBT/NMP (0,4 ммоль), смесь загружают в колонку для твердофазного синтеза. Потом, к колонке для твердофазного синтеза добавляют 0,9 М DIPEA/NMP (0,8 ммоль). После перемешивания при комнатной температуре в течение 20-ти минут, смолу промывают с помощью DCM и DMF, и Fmoc-группу удаляют с помощью 20%-ного раствора пиперидина/DMF (2 мл) в течение 15 минут. Эту операцию проводят повторно, применяя аминокислоту, защищенную Fmoc-группой (0,5 ммоль), для последовательной конденсации аминокислот.

Fmoc-Gly, Fmoc-Arg(Pbf), Fmoc-Gly, Fmoc-Cys(Trt), Fmoc-Val, Fmoc-Leu, Fmoc-Trp(Boc), Fmoc-Ala, Fmoc-Ile, Fmoc-Phe, Fmoc-Glu(OtBu), Fmoc-Cys(Trt), Fmoc-Ala, Fmoc-Ala, Fmoc-Gln(Trt), Fmoc-Gly, Fmoc-Glu(OtBu), Fmoc-Leu, Fmoc-Tyr(tBu), Fmoc-Ser(tBu), Fmoc-Ser(tBu), Fmoc-Val, Fmoc-Asp(OtBu), Fmoc-Ser(tBu), Fmoc-Thr(tBu), Fmoc-Phe, Fmoc-Thr(tBu), Fmoc-Gly, Fmoc-Glu(OtBu), Fmoc-Ala и Fmoc-His(Trt) применяют в качестве аминокислот, защищенных Fmoc-группой, и на смоле, которая представляет собой твердую фазу, получают пептид, состоящий из 31-го аминокислотного остатка, следующего вида Gly-Arg(Pbf)-Gly-Cys(Trt)-Val-Leu-Trp(Boc)-Ala-Ile-Phe-Glu(OtBu)-Cys(Trt)-Ala-Ala-Gln(Trt)-Gly-Glu(OtBu)-Leu-Tyr(tBu)-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Val-Asp(OtBu)-Ser(tBu)-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Gly-Glu(OtBu)-Ala-His(Trt) (SEQ ID NO:101).

Часть полученной смолы с образовавшимся на ней пептидом переносят на колонку для твердофазного синтеза, смесь трифторуксусная кислота: вода: TIPS (=95:2,5:2,5) добавляют так, чтобы смола была полностью погружена в жидкость и перемешивают при комнатной температуре в течение 3-х часов. Смолу удаляют фильтрованием, и реакционный раствор концентрируют при пониженном давлении. Полученный остаток очищают с помощью ВЭЖХ [колонка: SHISEIDO UG-120 (C18 5 мкм), ϕ 20×250 мм, градиент: раствор А: 0,1% TFA вода, раствор В: 0,09% TFA/10% вода/90% AN 8,0 мл/мин; 35→60%В, 20 мин, линейный градиент] и получают пептид, в котором каждый из 26 и 34Lys GLP-1 замещен Cys.

Бромацетамидил-дисиало-олигосахарид (а) (продукт компании OTSUKA Chemical Co., Ltd.) (10,5 мг) и пептидную цепь, синтезированную выше (2,1 мг), растворяют в 100 мМ фосфатном буфере (рН 7,5, 210 мкл) и оставляют для протекания реакции при 37°С в течение 4-х часов. После того как исходные вещества будут полностью израсходованы, и это будет подтверждено с помощью ВЭЖХ, реакционный раствор непосредственно подвергают очистке с помощью ВЭЖХ [колонка: SHISEIDO UG-120 (C18, 5 мкм), ϕ 4,6×250 мм, градиент: раствор А: 0,1% TFA вода, раствор В: 0,09% TFA/10% вода/90% AN 0,7 мл/мин; 35→60%В, 20 мин, линейный градиент] и получают 0,1 мг пептида GLP-1 с присоединенной олигосахаридной цепью, в котором 26 и 34Lys GLP-1 оба заменены Cys с присоединенной олигосахаридной цепью (26-34Cys-дисиало-GLP-1).

Пример 49

Синтез пептида GLP-1 с присоединенной олигосахаридной цепью 18 и 36Cys-дисиало

Колонку для твердофазного синтеза заполняют смолой Амино-PEGA (100 мкмоль) (продукт фирмы «Merck»), тщательно промывают дихлорметаном (DCM) и DMF и дают смоле полностью набухнуть в DMF. 4-Гидроксиметил-3-метоксифеноксимасляную кислоту (НМРВ) (0,25 ммоль), TBTU (0,25 ммоль) и N-этилморфолин (0,25 ммоль) растворяют в DMF (2 мл), загружают в колонку и перемешивают при комнатной температуре в течение 4-х часов. Смолу тщательно промывают с помощью DMF и DCM и получают смолу HMPB-PEG, которую применяют в качестве твердой фазы для твердофазного синтеза.

Fmoc-Gly (0,50 ммоль), MSNT (0,50 ммоль) и N-метилимидазол (0,375 ммоль) растворяют в DCM (2 мл), загружают в колонку для твердофазного синтеза и перемешивают при 25°С в течение 3-х часов.

После перемешивания смолу промывают с помощью DCM и DMF. Fmoc-группу удаляют с помощью 20%-ного раствора пиперидина/DMF (2 мл) в течение 15 минут. После промывания с помощью DMF, аминокислоты последовательно конденсируют в соответствии с приведенным ниже способом удлинения пептидной цепи.

Аминокислоту, имеющую аминогруппу, защищенную Fmoc-группой, растворяют в N-метилпирролидоне (NMP) (1 мл). После добавления 0,45 М HCTU·HOBT/NMP (0,4 ммоль), смесь загружают в колонку для твердофазного синтеза. Потом, к колонке для твердофазного синтеза добавляют 0,9 М DIPEA/NMP (0,8 ммоль). После перемешивания при комнатной температуре в течение 20-ти минут, смолу промывают с помощью DCM и DMF, и Fmoc-группу удаляют с помощью 20%-ного раствора пиперидина/DMF (2 мл) в течение 15 минут. Эту операцию проводят повторно, применяя аминокислоту, защищенную Fmoc-группой (0,5 ммоль), для последовательной конденсации аминокислот.

Fmoc-Gly, Fmoc-Cys(Trt), Fmoc-Gly, Fmoc-Lys(Boc), Fmoc-Val, Fmoc-Leu, Fmoc-Trp(Boc), Fmoc-Ala, Fmoc-Ile, Fmoc-Phe, Fmoc-Glu(OtBu), Fmoc-Lys(Boc), Fmoc-Ala, Fmoc-Ala, Fmoc-Gln(Trt), Fmoc-Gly, Fmoc-Glu(OtBu), Fmoc-Leu, Fmoc-Tyr(tBu), Fmoc-Cys(Trt), Fmoc-Ser(tBu), Fmoc-Val, Fmoc-Asp(OtBu), Fmoc-Ser(tBu), Fmoc-Thr(tBu), Fmoc-Phe, Fmoc-Thr(tBu), Fmoc-Gly, Fmoc-Glu(OtBu), Fmoc-Ala и Fmoc-His(Trt) применяют в качестве аминокислот, защищенных Fmoc-группой, и на смоле, которая представляет собой твердую фазу, получают пептид, состоящий из 31-го аминокислотного остатка, следующего вида Gly-Cys(Trt)-Gly-Lys(Boc)-Val-Leu-Trp(Boc)-Ala-Ile-Phe-Glu(OtBu)-Lys(Boc)-Ala-Ala-Gln(Trt)-Gly-Glu(OtBu)-Leu-Tyr(tBu)-Cys(Trt)-Ser(tBu)-Val-Asp(OtBu)-Ser(tBu)-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Gly-Glu(OtBu)-Ala-His(Trt) (SEQ ID NO:102).

Часть полученной смолы с образовавшимся на ней пептидом переносят на колонку для твердофазного синтеза, смесь трифторуксусная кислота: вода: TIPS (=95:2,5:2,5) добавляют так, чтобы смола была полностью погружена в жидкость и перемешивают при комнатной температуре в течение 3-х часов. Смолу удаляют фильтрованием, и реакционный раствор концентрируют при пониженном давлении. Полученный остаток очищают с помощью ВЭЖХ [колонка: SHISEIDO UG-120 (C18 5 мкм), ϕ 20×250 мм, градиент: раствор А: 0,1% TFA вода, раствор В: 0,09% TFA/10% вода/90% AN 8,0 мл/мин; 35→60%В, 20 мин, линейный градиент] и получают пептид, в котором каждый из 18Ser и 36Arg GLP-1 заменен Cys.

Бромацетамидил-дисиало-олигоеахарид (а) (продукт компании OTSUKA Chemical Co., Ltd.) (10,5 мг) и пептидную цепь, синтезированную выше (2,1 мг), растворяют в 100 мМ фосфатном буфере (рН 7,5, 210 мкл) и оставляют для протекания реакции при 37°С в течение 4-х часов. После того как исходные вещества будут полностью израсходованы и это будет подтверждено с помощью ВЭЖХ, реакционный раствор непосредственно подвергают очистке с помощью ВЭЖХ [колонка: SHISEIDO UG-120 (C18, 5 мкм), ϕ 4,6×250 мм, градиент: раствор А: 0,1% TFA вода, раствор В: 0,09% TFA/10% вода/90% AN 0,7 мл/мин; 35→60%В, 20 мин, линейный градиент] и получают 0,8 мг пептида GLP-1 с присоединенной олигосахаридной цепью, в котором оба 18Ser и 36Arg GLP-1 заменены Cys с присоединенной олигосахаридной цепью (18-36Cys-дисиало-GLP-1).

На приведенной ниже таблице 7 приведены результаты МС-анализа пептида GLP-1 с присоединенными олигосахаридными цепями, полученными по примерам 8-49. В таблице [М+Н]⁺ представляет собой результаты измерений массы методом MALDI-TOF, и [М+3Н]³⁺ и [М+4Н]⁴⁺ представляют собой результаты измерений методом EMI-МС.

[Таблица 7]
Пример 8	6Cys GLP-1- дисиало	Рассчитанная для	C240H372N48O110S	[М+Н]+	5719,5	найденная	5721,9
Пример 9	8Cys GLP-1-дисиало	Рассчитанная для	C237H367N47O 109S	[M+H]+	5648,4	найденная	5649,3
Пример 10	9CysGLP-1-дисиало	Рассчитанная для	C235H365N47O107S	[M+H]+	5590,4	найденная	5590,7
Пример 11	10Cys GLP-1-дисиало	Рассчитанная для	C238H369N47O109S	[M+H]+	5662,5	найденная	5665,4
Пример12	11 Cys GLP-1-дисиало	Рассчитанная для	C238H365N47O108S	[M+H]+	5618,4	найденная	5618,5
Пример 13	12Cys GLP-1-дисиало	Рассчитанная для	C231H363N47O 108S	[M+H]+	5572,4	найденная	5571,2
Пример 14	14Cys GLP-1-дисиало	Рассчитанная для	C237H367N47O108S	[М+Н]+	5632,5	найденная	5632,6
Пример 15	16Cys GLP-1-дисиало	Рассчитанная для	C235H363N47O108S	[M+H]+	5620,4	найденная	5623,5
Пример 16	20Cys GLP-1-дисиало	Рассчитанная для	C234H361N47O108S	[M+H]+	5606,4	найденная	5606,0
Пример 17	24Cys GLP-1-дисиало	Рассчитанная для	C237H367N47O108S	[M+H]+	5648,4	найденная	5648,2
Пример 18	25Cys GLP-1-дисиало	Рассчитанная для	C237H367N47O108S	[M+H]+	5648,4	найденная	5650,5
Пример 19	27Cys GLP-1-дисиало	Рассчитанная для	C235H365N47O107S	[М+Н]+	5590,4	найденная	5552,4
Пример 20	28Cys GLP-1-дисиало	Рассчитанная для	C231H363N47O109S	[М+Н]+	5572,4	найденная	5575,2
Пример 21	30Cys GLP-1-дисиало	Рассчитанная для	C237H367N47O109S	[М+Н]+	5648,4	найденная	5651,7
Пример 22	32Cys GLP-1-дисиало	Рассчитанная для	C234H361N47O109S	[М+Н]+	5606,4	найденная	5606,2
Пример 23	3 4Cys GLP-1-дисиало	Рассчитанная для	C234H360N46O109S	[М+Н]+	5591,4	найденная	5591,1
Пример 24	22Cys GLP-1-асиало	Рассчитанная для	C216H335N45O93S	[М+Н]+	5080,3	найденная	5081,9
Пример 25	26Cys GLP-1-асиало	Рассчитанная для	C212H326N44O93S	[М+Н]+	5009,2	найденная	5010,1
Пример 26	30Cys GLP-1-асиало	Рассчитанная для	C215H333N45O93S	[М+Н]+	5066,3	найденная	5068,0
Пример 27	34Cys GLP-1-асиало	Рассчитанная для	C212H326N44O93S	[М+Н]+	5009,2	найденная	5010,1
Пример 28	36Cys GLP-1-асиало	Рассчитанная для	C212H326N42O93S	[М+Н]+	4981,2	найденная	4983,1
Пример 29	22Cys GLP-1-диGloNAc	Рассчитанная для	C204H315N45O83S	[М+Н]+	4756,2	найденная	4758,2
Пример 30	30Cys GLP-1-диGlcNAc	Рассчитанная для	C203H313N45O83S	[М+Н]+	4742,1	найденная	4742,0
Пример 31	34Cys GLP-1-диGlcNAc	Рассчитанная для	C200H306N44O83S	[М+Н]+	4685,1	найденная	4686,8
Пример 32	22Cys GLP-1-диманнозо	Рассчитанная для	C188H289N43073S	[М+Н]+	4350,0	найденная	4351,0
Пример 33	30Cys GLP-1-диманнозо	Рассчитанная для	C187H287N43O73S	[М+Н]+	4336,0	найденная	4338,0
Пример 34	34Cys GLP-1-диманнозо	Рассчитанная для	C184H280N42O73S	[М+Н]+	4278,9	найденная	4280,3
Пример 35	12Asn GLP-1-асиало	Рассчитанная для	C208H327N45O93	[М+3Н]3+	1648,7	найденная	1649,5
Пример 36	18Asn GLP-1-асиало	Рассчитанная для	C214H331N45O92	[М+Н]+	5004,3	найденная	5003,4
Пример 37	22Asn GLP-1-асиало	Рассчитанная для	C215H333N45O93	[М+Н]+	5034,3	найденная	5035,9
Пример 38	26Asn GLP-1-асиало	Рассчитанная для	C211H324N44O93	[М+3Н]3+	1656,0	найденная	1655,8
Пример 39	27Asn GLP-1-асиало	Рассчитанная для	C212H329N45O91	[М+3Н]3+	1655,7	найденная	1655,5
Пример 40	28Asn GLP-1-асиало	Рассчитанная для	C208H327N45O93	[М+3Н]3+	1648,7	найденная	1649,6
Пример 41	30Asn GLP-1-асиало	Рассчитанная для	C212H331N45O93	[М+Н]+	5020,3	найденная	5020,8
Пример 42	36Asn GLP-1-асиало	Рассчитанная для	C211H324N42O93	[М+Н]+	4935,2	найденная	4936,7
Пример 43	18Asn GLP-1-дисиало	Рассчитанная для	C236H365N47O108	[М+Н]+	5586,5	найденная	5588,6
Пример 44	22Asn GLP-1-дисиало	Рассчитанная для	C237H367N47O109	[М+Н]+	5616,5	найденная	5S18.4
Пример 45	30Asn GLP-1-дисиало	Рассчитанная для	C236H365N47O109	[М+Н]+	5602,5	найденная	5606,2
Пример 46	30Asn GLP-1-дисиало	Рассчитанная для	C236H365N47O109	[М+4Н]4+	1401,4	найденная	1402,1
Пример 47	36Asn GLP-1-дисиало	Рассчитанная для	C233H358N44O109	[М+Н]+	5517,4	найденная	5521,7
Пример 48	26,34Cys GLP-1-дисиало	Рассчитанная для	C317H492N52O171S2	[М+Н]+	7828,1	найденная	7828,8
Пример 49	18,36Cys GLP-1-дисиало	Рассчитанная для	C320H449N51O170S2	[М+Н]+	7841,1	найденная	7845,3

Тестовый пример 1 (стабильность в плазме)

0,1 мг пептида, полученного по примеру 7 или по сравнительному примеру 1, помещают в пробирку Eppendorf, и PBS (0,08 мл, 70% от общего количества) и плазму (0,034 мл, 30% от общего количества) последовательно вносят в пробирку и доводят объем раствора до 0,114 мл. Смесь оставляют для протекания реакции при 37°С.

Момент добавления плазмы к реакционному сосуду обозначают как 0 мин. Из реакционного раствора на 10, 30, 60, 180, 360, 720 и 1440 минуте отбирают 0,01 мл аликвоты для образцов.

Каждый отобранный реакционный раствор перемешивают с 0,02 мл раствора 10%-ной трифторуксусной кислоты в заранее приготовленной в пробирке Eppendorf и затем центрифугируют. Аликвоту в 0,025 мл супернатанта смеси растворов впрыскивают в ВЭЖХ для анализа композиции реакционного раствора (условия контролирования протекания реакции: Shiseido CAPCELL РАК С18, UG120, 250×4,6 мм, система растворителей А: 0,1% водный TF раствор, В: 0,1% TFA ацетонитрил: вода=90:10, градиент А:В=95:5→5:95, 15 мин, скорость элюции: 0,7 мл/мин). Результаты приведены на фиг.5 (пример 7) и 6 (сравнительный пример 1).

На фиг.5, пики пептида GLP-1 с присоединенной олигосахаридной цепью наблюдали в области 13,3 минут. Как показано на фиг.5, пептид GLP-1 с присоединенной олигосахаридной цепью по примеру 7 в основном сохраняется даже через 24 часа (1440 минут) после добавления плазмы.

С другой стороны, на фиг.6, пик, наблюдаемый между 16 и 16,5 минутами, указывает на недеградированный GLP-1, и пики, наблюдаемые между 17,5 и 18 минутами, указывают на фрагмент GLP-1 (9-36), из которого удален 7His-8Ala. Как показано на фиг.6, GLP-1 без присоединенной олигосахаридной цепи по сравнительному примеру 1 деградирует главным образом к 180 минуте после добавления плазмы.

Тестовый пример 2 (влияние на снижение уровня сахара в крови у db/db мышей-1)

Пептид, полученный в каждом из примеров 1-5 или в сравнительном примере 1, вводят внутрибрюшинно в виде одинаковых образцов в дозе, равной 8 мл в сумме на кг массы тела (концентрация образца: 9 нмоль/кг массы тела) каждому из трех 8-недельных мышей-самцов с модельным диабетом 2-го типа (BKS.Cg- + Lepr^db/Lepr^db/Jcl*). В частности, пептид в растворе PBS (9 нмоль/10 мл) вводят внутрибрюшинно в дозе, равной 10 мл/кг мышам BKS.Cg-+ Lepr^db/+Lepr^db/Jcl (8-недельные, самцы). Через 0, 30, 60, 90, 120 и 180 минут после введения отбирают по 0,03 мл периферической крови из ретро-глазничного венозного сплетения. Полученную кровь разводят PBS до 0,3 мл в сумме, и раствор центрифугируют для разделения плазмы и клеточных компонентов крови. Затем, только плазму переносят в отдельно подготовленную и охлажденную пробирку Eppendorf. Концентрацию глюкозы в плазме измеряют в соответствии с СП-тестом Wako на глюкозу, с помощью абсорбциометра. Результаты получены с помощью статистической обработки. Результаты приведены на фиг.7.

Как показано на фиг.7, GLP-1 без добавленной олигосахаридной цепи по сравнительному примеру 1 с трудом снижает уровень сахара в крови. Напротив, все пептиды GLP-1 с присоединенными олигосахаридными цепями по примерам 1-5 значительно снижают уровень сахара в крови, и их влияние сохраняется даже через 120 минут.

Тестовый пример 3 (влияние на снижение уровня сахара в крови у db/db мышей-2)

Пептид, полученный по примеру 5 или по сравнительному примеру 1, вводят внутрибрюшинно в виде одинаковых образцов в дозе, равной 8 мл в сумме на кг массы тела (концентрация образца на кг массы тела: 0,9 нмоль/кг, 9 нмоль/кг, 90 нмоль/кг или 900 нмоль/кг) каждому из трех 8-недельных мышей-самцов с модельным диабетом 2-го типа (BKS.Cg- + Lepr^db/Lepr^dv/Jcl*). В частности, пептид в растворе PBS (0,9 нмоль/10 мл, 9 нмоль/10 мл, 90 нмоль/10 мл или 900 нмоль/10 мл) вводят внутрибрюшинно в дозе, равной 10 мл/кг мышам BKS.Cg-+ Lepr^db/+Lepr^db/Jcl (8-недельные самцы). Через 0, 30, 60, 90 и 120 минут после введения образца, отбирают по 0,03 мл периферической крови из ретро-глазничного венозного сплетения. Полученную кровь разводят PBS до 0,3 мл в сумме, и раствор центрифугируют для разделения плазмы и клеточных компонентов крови. Затем, только плазму переносят в отдельно подготовленную и охлажденную пробирку Eppendorf. Концентрация глюкозу в плазме измеряют в соответствии с СП-тестом Wako на глюкозу, с помощью абсорбциометра. Результаты получены с помощью статистической обработки. Результаты приведены на фиг.8.

Результаты, представленный на фиг.8 показывают, что пептид GLP-1 с присоединенной олигосахаридной цепью демонстрирует отличный эффект на снижение уровня сахара в крови даже в дозе, которая представляет собой 1/100 от дозы GLP-1, равной 900 нмоль/кг.

Тестовый пример 4 (тест на устойчивость к дипептидилпептидазе IV (DPP-IV) -1)

17,7 нмоль пептида GLP-1 с присоединенной олигосахаридной цепью, полученного по одному из примеров 1-5, 13-23, 25, 27, 31, 34, 36, 48 или 49 или GLP-1, полученный по сравнительному примеру 1, добавляют вместе с 2,2 мЕд. DPP-IV (дипептидилпептидаза IV из почки свиньи, продукт фирмы SIGMA) в 0,5-мл пробирку Eppendorf. Каждую смесь растворов доводят 100 мМ натрий-фосфатным буфером до суммарного объема, равного 100 мкл, и оставляют для протекания реакции при 37°С. Аликвоту реакционного раствора в 10 мкл перемешивают с 15 мкл заранее приготовленной 10%-ной трифторуксусной кислотой в другой пробирке Eppendorf. 20 мкл полученной смеси впрыскивают в ВЭЖХ для контроля полного превращения исходных материалов (условия проведения ВЭЖХ: колонка: SHISEIDO CAPCELPAK C18 UG120, ϕ 4,6×250 мм, система растворителей А: 0,1%-ный водный раствор TF, система растворителей В: 0,09% TFA ацетонитрил/вода=90/10, градиент А/В=65/30→30/60,20 мин, скорость элюции: 0,7 мл/мин).

Время полужизни (t1/2) GLP-1 без добавленной олигосахаридной цепи по сравнительному примеру 1 применяют в качестве критерия устойчивости к DPP-IV и обозначают как стандарт (=1). Величина, определенная для пептида GLP-1 с присоединенной олигосахаридной цепью по каждому примеру, приведена в таблице 8.

[Таблица 8]
Пример	Соединение	Относительная устойчивость
Пример 13	12Cys GLP-1-дисиало	34.4
Пример 14	14Cys GLP-1-дисиало	6.3
Пример 15	16Cys GLP-1-дисиало	1.2
Пример 1	18Cys GLP-1-дисиало	1.6
Пример 16	20Cys GLP-1-дисиало	2.6
Пример 2	22Cys GLP-1-дисиало	3.1
Пример 17	24Cys GLP-1-дисиало	3.0
Пример 18	25Cys GLP-1-дисиало	3.1
Пример 3	26Cys GLP-1-дисиало	4.6
Пример 19	27Cys GLP-1-дисиало	2.3
Пример 20	28Cys GLP-1-дисиало	9.0
Пример 21	30Cys GLP-1-дисиало	2.4
Пример 22	32Cys GLP-1-дисиало	3.7
Пример 23	34Cys GLP-1-дисиало	3.0
Пример 4	36Cys GLP-1-дисиало	1.6
Пример 5	38Cys GLP-1-дисиало	1.7
Пример 25	26Cys GLP-1-асиало	4.6
Пример 27	34Cys GLP-1-асиало	2.0
Пример 31	34Cys GLP-1-диGlcNAc	2.0
Пример 34	34Cys GLP-1-диманнозо	1.6
Пример 36	18Asn GLP-1-асиало	1.3
Пример 48	26, 34Cys GLP-1-дисиало	23.6
Пример 49	18, 36Cys GLP-1-дисиало	128.6

Пептид GLP-1 с присоединенной олигосахаридной цепью по каждому примеру демонстрирует в от 1,2 до 128 раз более высокую устойчивость к DPP-IV по сравнению с GLP-1 по сравнительному примеру 1. Максимальную устойчивость продемонстрировал 18,36Су$-дисиало-пептид GLP-1 с присоединенной олигосахаридной цепью, затем устойчивость уменьшалась в ряду 12Cys-дисиало-, 26,34Cys-дисиало-, 28Cys-дисиало-, 14Cys-дисиало-, 26Cys-дисиало-, 26Cys-асиало-, 32Cys-дисиало-, 25Cys-дисиало-, 22Cys-дисиало-, 24Cys-дисиало-, 34Cys-дисиало-, 20Cys-дисиало-, 30Cys-дисиало-, 27Cys-дисиало-, 34Cys-асиало-, 34Cys-диGlcNAc, 38Cys-дисиало-, 36Cys-дисиало-, 34Cys-диманнозных, 18Cys-дисиало-, 18Asn-асиало- и 16Cys-дисиало-пептид GLP-1, в этом порядке.

Пептид GLP-1 с присоединенными олигосахаридными цепями по примерам 3, 23 и 48 или примерам 1, 4 и 49 сравнили в отношении устойчивости к DPP-IV. Результаты показывают, что пептид GLP-1 с присоединенной олигосахаридной цепью, который имеет 2 цепи олигосахаридов, обладает более высокой устойчивостью к DPP-IV по сравнению с пептидом GLP-1 с присоединенной олигосахаридной цепью, который имеет 1 олигосахаридную цепь, и, следовательно, присоединение 2-х или более цепей олигосахаридов дает синергический эффект.

В терминах структуры олигосахаридных цепей, которые нужно присоединить к пептиду GLP-1 с присоединенными олигосахаридными цепями, увеличение устойчивости к DPP-IV было продемонстрировано в следующем ряду дисиало-олигосахаридная цепь > асиало-олигосахаридная цепь > диGlcNAc-олигосахаридная цепь > диманнозо-олигосахаридная цепь.

Тестовый пример 5 (тест на устойчивость к дипептидилпептидазе IV (DPP-IV) -2)

17,7 нмоль пептида GLP-1 с присоединенной олигосахаридной цепью, полученного по каждому из примеров 10- 13, добавляют вместе с 22 мЕд. DPP-IV (дипептидилпептидаза IV из почки свиньи, продукт фирмы «SIGMA») в 0,5-мл пробирку Eppendorf. Каждую смесь растворов доводят 100 мМ натрий-фосфатным буфером до суммарного объема, равного 100 мкл, и оставляют для протекания реакции при 37°С. Аликвоту реакционного раствора в 10 мкл перемешивают с 15 мкл заранее приготовленной 10%-ной трифторуксусной кислотой в другой пробирке Eppendorf. 20 мкл полученной смеси впрыскивают в ВЭЖХ для контроля полноты превращения исходных материалов (условия проведения ВЭЖХ: колонка: SHISEIDO CAPCELPAK CIS UG120, ϕ 4,6×250 мм, система растворителей А: 0,1%-ный водный раствор TF, система растворителей В: 0,09% TFA ацетонитрил/вода=90/10, градиент А/В=65/30→30/60, 20 мин, скорость элюции: 0,7 мл/мин).

Время полужизни (t1/2) пептида GLP-1 с присоединенной олигосахаридной цепью по примеру 13 применяют в качестве критерия устойчивости к DPP-IV и обозначают как стандарт (=1). Величина, определенная для пептида GLP-1 с присоединенными олигосахаридными цепями по примерам 10-12, приведена в таблице 9.

[Таблица 9]
Пример	Соединение	Относительная устойчивость
Пример 10	9Cys GLP-1-дисиало	17.4
Пример 11	10Cys GLP-1-дисиало	9.0
Пример 12	11Cys GLP-1-дисиало	1.1
Пример 13	12Cys GLP-1-дисиало	1.0

В тестовом примере 4, пептид GLP-1 с присоединенной олигосахаридной цепью по примеру 13 демонстрирует устойчивость к DPP-IV примерно в 34 раз больше той, что показана для GLP-1 без добавленной олигосахаридной цепи по сравнительному примеру 1. Пептид GLP-1 с присоединенными олигосахаридными цепями по примерам 10-12 демонстрирует устойчивость к DPP-IV в от 1,1 до 17,2 раз выше, по сравнению с таковой для пептида GLP-1 с присоединенной олигосахаридной цепью по примеру 13 (12Cys-дисиало-). Максимальную устойчивость продемонстрировал 9Cys-дисиало-пептид GLP-1, затем устойчивость уменьшалась в ряду 10Cys-дисиало-, 11Cys-дисиало- и 12Cys-дисиало-пептид GLP-1, в таком порядке, и более высокая устойчивостью к DPP-IV была получена в результате добавления олигосахаридная цепь в сайт, более близкий к N-концу GLP-1. Известно, что сайт взаимодействия с DPP-IV находится на N-конце GLP-1, и пептид GLP-1 с присоединенной олигосахаридной цепью демонстрирует более высокую устойчивость к DPP-IV в результате присоединения олигосахаридной цепи к этому сайту.

Тестовый пример 6 (тест на способность синтезировать сАМР)

1. Конструирование вектора экспрессии мышиного рецептора GLP-1

Раздельно синтезировали смысловой праймер мышиного рецептора GLP1 (5'-GTTGCTAGCGCCACCATGGCCAGCACCCCAAGCCT-3') (SEQ ID NO: 152) и анти смысловой праймер мышиного рецептора GLP-1 (5'-CCTGAATTCTCAGCTGTAGGAACTCTGGCAG-3') (SEQ ID NO: 153) способного к связыванию с 5'- и 3'-концами кДНК мышиного рецептора GLP-1. PCR проводили, применяя Ex Taq полимеразу (TaKaRa) с кДНК (клон ID: 40046534, фирмы «Open Biosystems») в качестве матрицы. В частности, суммарно применяют 50 мкл реакционного раствора, состоящего из 1 мкл матричной кДНК (10 нг/мкл), 4 мкл 2,5 мМ dNTP, 1 мкл смесей растворов праймеров (каждый 50 мкМ), 5 мкл × 10 буфера для Ех Taq полимеразы, 0,25 мкл Ех Taq полимеразы и 38,75 мкл стерилизованной воды и оставляют для протекания реакции при 94°С в течение 1 минуты; при 94°С в течение 45 секунд, при 55°С в течение 1 минуты и 72°С в течение 2-х минут (35 циклов); и 72°С в течение 10 минут. Продукт PCR-реакции анализируют с помощью электрофореза в 1%-ном агарозном геле, и фрагмент кДНК очищают, применяя Wizard SV Gel и PCR Clean-up System (фирма «Promega»), обрабатывают ферментами рестрикции (EcoRI и NheI) и получают кДНК мышиного рецептора GLP-1.

К эффективно полученным клеткам с высокой экспрессией мышиного рецептора GLP-1, применяют вектор pIRES-gfp в качестве вектора экспрессии. Этот вектор получают путем вставки в вектор pEGFP-N1 (фирмы «Clontech») фрагмента ДНК, содержащего ген IRJES, полученного после обработки pIRESpuro2 (фирмы «Clontech») рестриктиазам (Sal I и BamHI).

Фрагмент кДНК мышиного рецептора GLP-1 вставляют в pIRES-gfp, и, таким образом, получают вектор экспрессии mGLP-1R/pIRES-gfp мышиного рецептора GLP-1. Последовательность ДНК полученного вектора подтверждают, применяя ABI3100-Avant (фирма «Applied Biosystems»).

2. Получение клеток СНО-К1, экспрессирующих мышиный рецептор GLP-1

СНО-К1 клетки (No. по каталогу АТСС CCL-61) трансфицируют полученным mGLP-1R/pIRES-gfp, с помощью FuGENE (зарегистрированная торговая марка) (фирма «Roche») в соответствии с инструкцией производителя. Трансфицированные клетки СНО-К1 культивируют в среде RPMI1640 (фирма «Wako Pure Chemical Industries»), содержащей 10%-ную FCS (фирма «Hyclones) и пенициллин-стрептомицин (фирма «SIGMA»). Отбор с помощью лекарственных препаратов проводили путем добавления 1,0 мг/мл G418 (фирма «Wako Pure Chemical Industries»). Устойчивые к лекарственным препаратам клетки сортировали с помощью сортировщика клеток (EPICS ALTRA, фирмы «Beckman Coulter»), применяя в качестве критерия уровень экспрессии GFP. После сортировки применяют метод отграниченного разведения и получают клетки с высокой экспрессией GFP, а именно, клетки с высокой экспрессией мышиного рецептора GLP-1. Полученные клетки применяют в качестве клеток СНО-К1, экспрессирующих мышиный рецептор GLP-1, в приведенном ниже эксперименте.

3. Анализ агонистического эффекта пептида GLP-1 с присоединенной олигосахаридной цепью (способность синтезировать сАМР)

Клетки СНО-К1, экспрессирующие мышиный рецептор GLP-1, полученные в предыдущем параграфе 2, применяют для оценки агонистического эффекта пептида GLP-1 с присоединенной олигосахаридной цепью по способности синтезировать сАМР в качестве критерия.

Клетки СНО-К1, экспрессирующие мышиный рецептор GLP-1, суспендируют в концентрации, равной 5×10⁵ клеток/мл в среде RPMI1640, содержащей 10%-ную FCS. Суспензию клеток пересевают в концентрации, равной 100 мкл на лунку, в плоскодонный 96-луночный планшет (фирмы «Falcon») и культивируют при 5% CO₂ при 37°С в течение 16 часов. Культуральный супернатант удаляют. Пептид GLP-1 с присоединенной олигосахаридной цепью растворяют в бикарбонатном буфере Кребса-Рингера, содержащем 2,5 мМ глюкозу, добавляют в концентрации, равной 100 мкл/лунку, и культивируют при 37°С в течение 30 минут. Культуральный супернатант немедленно отбрасывают. Измеряют количество сАМР, синтезированного в клетках СНО-К1, экспрессирующих мышиный рецептор GLP-1, применяя cAMP ELISA Kit (фирм «GE Healthcare» или «Cayman»), и применяют в качестве критерия для антагонистического эффекта пептида GLP-1 с присоединенной олигосахаридной цепью на мышиные рецепторы GLP-1.

GLP-1 увеличивает внутриклеточную концентрацию cAMP, путем связывания со своим рецептором, и стимулирует секрецию инсулина. Таким образом, оценивают активность пептида GLP-1 с присоединенной олигосахаридной цепью, путем применения в качестве критерия способности синтезировать cAMP. Клетки СНО-К1, экспрессирующие мышиный рецептор GLP-1, стимулируют с помощью пептида GLP-1 с присоединенной олигосахаридной цепью. Измеряют количество синтезированного в клетках cAMP. Величину ЕС50 для GLP-1 без добавленной олигосахаридной цепи по сравнительному примеру 1 обозначают как 1. Относительные активности пептида GLP-1 с присоединенными олигосахаридными цепями по примерам 1-5, 8-23, 25 и 27 приведены в таблице 10.

[Таблица 10]
Пример	Соединение	Относительная активность
Пример 8	6Cys GLP-1-дисиало	<0.1
Пример 9	8Cys GLP-1-дисиало	<0.1
Пример 10	9Cys GLP-1-дисиало	<0.1
Пример 11	10Cys GLP-1-дисиало	<0. 1
Пример 12	11Cys GLP-1-дисиало	<0.1
Пример 13	12Cys GLP-1-дисиало	<0.1
Пример 14	14Cys GLP-1-дисиало	<0.1
Пример 15	16Cys GLP-1-дисиало	<0.1
Пример 1	18Cys GLP-1-дисиало	<0.1
Пример 16	20Cys GLP-1-дисиало	<0.1
Пример 2	22Cys GLP-1-дисиало	1.0
Пример 17	24Cys GLP-1-дисиало	<0.1
Пример 18	25Cys GLP-1-дисиало	<0.1
Пример 3	26Cys GLP-1-дисиало	0.2
Пример 19	27Cys GLP-1-дисиало	0.2
Пример 20	28Cys GLP-1-дисиало	<0.1
Пример 21	30Cys GLP-1-дисиало	0.6
Пример 22	32Cys GLP-1-дисиало	<0.1
Пример 23	34Cys GLP-1-дисиало	0.7
Пример 4	36Cys GLP-1-дисиало	1.9
Пример 5	3 8Cys GLP-1-дисиало	1.9
Пример 25	26Cys GLP-1-асиало	0.8
Пример 27	34Cys GLP-1-асиало	2.2

Было получено, что пептид GLP-1 е присоединенными олигосахаридными цепями 22Cys дисиало-GLP-1, 26Cys-асиало-GLP-1, 30Cys дисиало-GLP-1, 34Cys дисиало-GLP-1, 34Cys-асиало-GLP-1, 36Cys дисиало-GLP-1 и 38Cys дисиало-GLP-1 по примерам демонстрирует активность равную или более высокую, по сравнению с GLP-1 без добавленной олигосахаридной цепи по сравнительному примеру 1, следовательно, можно предположить, что аминокислота в позиции 22, 26, 30, 34, 36 или 38 (=присоединение аминокислоты с присоединенной олигосахаридной цепью к аминокислоте в позиции 37) представляет собой сайт, подходящий для присоединения олигосахаридной цепи.

Тестовый пример 7 (пероральный тест на толерантность к глюкозе (OGTT))

Раствор пептида GLP-1 с присоединенной олигосахаридной цепью в PBS, полученного по одному из примеров 1-5, 9, 10, 13, 16, 21, 23-27, 29-34, 38, 45, 48 или 49, или GLP-1, полученного по сравнительному примеру 1, вводят внутрибрюшинно в дозе, равной 10 мл/кг мышам C57BL/6JJcl (10-недельные самцы), голодавшим в течение ночи. Через 30 минут раствор глюкозы вводят перорально в дозе, равной 1 мг/г. Кровь отбирают из глазниц перед введением глюкозы и через 30 минут, 60 минут и 120 минут после введения глюкозы. Уровень сахара в крови измеряют, применяя ACCU-CHEK Aviva (фирма «Roche Diagnostics»).

Тестовый пример 7-1 (OGTT с различными пептидами GLP-1 с присоединенными олигосахаридными цепями)

После перорального введения раствора глюкозы мышам, голодавшим в течение ночи, кровь отбирают во времени, и измеряют уровень сахара в крови. Уровень сахара в крови мышей возрастает в результате введения глюкозы, достигает максимума через 30 минут после введения и затем постепенно снижается. За 30 минут до введения глюкозы, пептид GLP-1 с присоединенной олигосахаридной цепью (8Cys дисиало-GLP-1, 9Cys дисиало-GLP-1, 12Cys дисиало-GLP-1, 18Cys дисиало-GLP-1, 20Cys дисиало-GLP-1, 22Cys дисиало-GLP-1, 26Cys дисиало-GLP-1, 26Cys-асиало-GLP-1, 30Cys дисиало-GLP-1, 34Cys дисиало-GLP-1, 34Cys-асиало-GLP-1, 36Cys дисиало-GLP-1 или 38Cys дисиало-GLP-1), полученный по каждому из примеров, или GLP-1, полученный по сравнительному примеру 1, вводят внутрибрюшинно в дозе, равной 9 нмоль/кг каждой мыши, и сравнивают их эффекты на подавление роста уровня сахара в крови. Результаты приведены на фиг.9-11.

GLP-1 без добавленной олигосахаридной цепи по сравнительному примеру 1 имеет низкую стабильность в крови и имеет незначительный эффект на подавление роста уровня сахара в крови, так как он быстро деградирует после введения.

Напротив, пептид GLP-1 с присоединенными олигосахаридными цепями 18Cys дисиало-GLP-1, 20Cys дисиало-GLP-1, 22Cys дисиало-GLP-1, 26Cys дисиало-GLP-1, 26Cys-асиало-GLP-1, 30Cys дисиало-GLP-1, 34Cys дисиало-GLP-1, 34Cys-асиало-GLP-1, 36Cys дисиало-GLP-1 и 38Cys дисиало-GLP-1 демонстрирует сильный эффект на подавление роста уровня сахара в крови.

Тестовый пример 7-2 (роль структуры олигосахаридной цепи пептида GLP-1 с присоединенной олигосахаридной цепью в OGTT)

Пептид GLP-1 с присоединенной олигосахаридной цепью, имеющий олигосахаридную цепь из одиннадцати сахаров (дисиало-олигосахаридная цепь), девяти сахаров (асиало-олигосахаридная цепь), семи сахаров (диGlcNAc-олигосахаридная цепь) или пяти сахаров (диманнозо-олигосахаридная цепь) (22Cys-дисиало-GLP-1, 22Cys-асиало-GLP-1, 22Cys ди-GlcNAc-GLP-1, 22Cys диманнозо-GLP-1, 30Cys-дисиало-GLP-1, 30Cys-асиало-GLP-1, 30Cys ди-GlcNAc-GLP-1, 30Cys диманнозо-GLP-1, 34Cys-дисиало-GLP-1, 34Cys-асиало-GLP-1, 34Cys ди-GlcNAc-GLP-1 или 34Cys диманнозо-GLP-1) или GLP-1, полученный по сравнительному примеру 1, вводят внутрибрюшинно в дозе, равной 9 нмоль/кг каждой мыши. Корреляцию между структурой олигосахаридной цепи и активность исследовали на мышином OGTT. Результаты приведены на фиг.12-14.

Наиболее сильный эффект на подавление роста уровня сахара в крови проявил пептид GLP-1 с присоединенными олигосахаридными цепями, который имел олигосахаридную цепь, состоящую из одиннадцати сахаров (дисиало-олигосахаридная цепь), и который был самым большим, при любом положении вставки (позиции 22, 30 и 34). Повышенная активность в отношении подавления роста уровня сахара в крови убывала в ряду одиннадцать сахаров ≥ девять сахаров ≥ семь сахаров ≥ пять сахаров.

Тестовый пример 7-3 (зависимость от дозы пептида GLP-1 с присоединенной олигосахаридной цепью в OGTT)

Для распределения по активности высокоактивные пептиды GLP-1 с присоединенными олигосахаридными цепями, 26Cys-дисиало-GLP-1, 30Cys-дисиало-GLP-1, 34Cys-дисиало-GLP-1 и 36Cys-дисиало-GLP-1 отдельно оценивали в тесте в OGTT на мышах, применяя дозы, равные 1/10 (0,9 нмоль/кг) или 1/100 (0,09 нмоль/кг). Результаты приведены на фиг.15-18. На фиг.15-18, приведены результаты OGTT для GLP-1, полученные в дозе, равной 9 нмоль/кг, по сравнению с тестовым примером 7-2.

Все пептиды GLP-1 с присоединенными олигосахаридными цепями 26Cys-дисиало-GLP-1, 30Cys-дисиало-GLP-1, 34Cys-дисиало-GLP-1 и 36Cys-дисиало-GLP-1 продемонстрировали дозо-зависимую активность в отношении подавления роста уровня сахара в крови. В дозе, равной 0,9 нмоль/кг, рост уровня сахара в крови наиболее сильно был подавлен пептидами 30Cys-дисиало-GLP-1 и 36Cys-дисиало-GLP-1, которые подавляли рост уровня сахара в крови практически полностью.

36Cys-дисиало-GLP-1 в дозе, равной 0,09 нмоль/кг, проявлял активность в отношении подавления роста уровня сахара в крови эквивалентно GLP-1 в дозе, равной 9 нмоль/кг, следовательно, можно предположить, что активность 36Cy-дисиало-GLP-1 была примерно в 100 раз выше по сравнению с GLP-1. Кроме того, 30Cys-дисиало-GLP-1 в дозе, равной 0,09 нмоль/кг, имел пониженную активность в отношении подавления роста уровня сахара в крови по сравнению с 36Cys-дисиало-GLP-1 в той же дозе, следовательно, можно предположить, что активность 30Cys-дисиало-GLP-1 вплоть до от 10 до 100 раз выше активности GLP-1. 26Cys-дисиало-GLP-1 и 34Cys-дисиало-GLP-1 в дозе, равной 0,9 нмоль/кг имеет эффективность примерно 1/2 от активности в отношении подавления роста уровня сахара в крови, которую имеют 30Cys-дисиало-GLP-1 и 36Cys-дисиало-GLP-1 в той же дозе, следовательно, можно предположить, что активности 26Cys-дисиало-GLP-1 и 34Cys-дисиало-GLP-1 примерно в от 5 до 50 раз выше активности GLP-1. Места присоединения олигосахаридной цепи, которые проявляют высокую активность в OGTT, находятся в позициях 30 и 36.

Тестовый пример 7-4 (OGTT пептида GLP-1 с присоединенной олигосахаридной цепью, имеющего Asn с присоединенной олигосахаридной цепью)

Пептид GLP-1 с присоединенной олигосахаридной цепью, в котором аминокислота в позиции 22 или 30 GLP-1 заменена Asn с присоединенной олигосахаридной цепью (существующий в природе тип присоединенной олигосахаридной цепи) или Cys с присоединенной олигосахаридной цепью, сравнили по активности в дозе, равной 0,9 нмоль/кг в тесте OGTT на мышах. Результаты приведены на фиг.19. На фиг.19, результаты OGTT для GLP-1 получали в дозе, равной 9 нмоль/кг, в сравнении с тестовым примером 7-2.

В случае, когда присоединяли олигосахаридную цепь, состоящую из девяти сахаров (асиало-олигосахаридная цепь), в позицию 22 и присоединяли олигосахаридную цепь, состоящую из одиннадцати сахаров (дисиало-олигосахаридная цепь) в позицию 30, в обоих случаях не было показано разницы во влиянии на подавление роста уровня сахара в крови с помощью пептида GLP-1 с присоединенной олигосахаридной цепью между Asn с присоединенной олигосахаридной цепью и Cys с присоединенной олигосахаридной цепью. Активность проявляет пептид GLP-1 с присоединенными олигосахаридными цепями, имеющий любую аминокислоту с присоединенной олигосахаридной цепью.

Тестовый пример 7-5 (влияние числа цепей олигосахаридов, которые следует присоединить, на эффект пептида GLP-1 с присоединенной олигосахаридной цепью в OGTT)

Пептид GLP-1 с присоединенными олигосахаридными цепями по примерам 48 и 49, имеющий 2 цепи олигосахаридов, оценивали в отношении его эффекта на подавление роста уровня сахара в крови, применяя OGTT в мышах. Результаты OGTT для 26,34Cys-дисиало-GLP-1 и 18,36Cys-дисиало-GLP-1 в дозе, равной 9 нмоль/кг, приведены на фиг.20. На фиг.20, приведены результаты OGTT, полученные для GLP-1 в дозе, равной 9 нмоль/кг, по сравнению с тестовым примером 7-2.

Эффект 18,36Cys-дисиало-GLP-1 в дозе, равной 9 нмоль/кг, полностью равен эффекту 36Cys-дисиало-GLP-1, приведенному на фиг.5 или 14. 26,34Cys-дисиало-GLP-1 в дозе, равной 9 нмоль/кг, обладает немного лучшей активностью в отношении подавления роста уровня сахара в крови по сравнению с GLP-1 в той же дозе.

Затем, 18,36Cys-дисиало-GLP-1 оценивали с помощью OGTT, применяя 1/10 дозы (0,9 нмоль/кг). Кроме того, GLP-1 в дозе, равной 9 нмоль/кг, оценивали с помощью OGTT и сравнивали C18, 36Cys-дисиало-GLP-1. Результаты приведены на фиг.21.

Влияние на снижение уровня сахара в крови 18,36Cys-дисиало-GLP-1 в дозе, равной 0,9 нмоль/кг, было практически равно влиянию GLP-1 в дозе, равной 9 нмоль/кг, следовательно, можно предположить, что активность в отношении подавления роста уровня сахара в крови, которую проявил 18,36Cys-дисиало-GLP-1, примерно в 10 раз выше активности GLP-1.

Тестовый пример 8 (влияние пептида GLP-1 с присоединенной олигосахаридной цепью на снижение уровня сахара в крови у мышей с модельным диабетом)

Пептид GLP-1 с присоединенной олигосахаридной цепью, полученный по примеру 2, 3, 4, 21 или 23, или GLP-1, полученный по сравнительному примеру 1, в растворе PBS (9 нмоль/10 мл) вводят внутрибрюшинно в дозе, равной 10 мл/кг мышам BKS.Cg-+ Lepr^db/+Lepr^db/Jcl (10-недельные самцы). Кровь отбирают из глазниц перед введением соединения и через 30 минут, 60 минут, 120 минут, 180 минут и 300 минут после введения соединения. Уровень сахара в крови измеряют, применяя ACCU-CHEK Aviva (фирма «Roche Diagnostics»).

Мыши db/db (BKS.Cg- + Lepr^db/+Lepr^db/Jcl), которые служили в качестве мышей с модельным диабетом, имеют мутацию в рецепторе лептина, который представляет собой вызывающий анорексию/усиливающий энергетический метаболизм гормон, приводящую к развитию таких состояний, как ожирение или гипергликемия.

Пептиды GLP-1 с присоединенными олигосахаридными цепями, которые демонстрируют активность в отношении подавления роста уровня сахара в крови в тесте OGTT в мышах (тестовый пример 7), 22Cys-дисиало-GLP-1, 26Cys-дисиало-GLP-1, 30Cys-дисиало-GLP-1, 34Cys-дисиало-GLP-1 или 36Cys-дисиало-GLP-1 вводят внутрибрюшинно в дозе, равной 9 нмоль/кг the db/db мышам. Уровень сахара в крови измеряют во времени, и их эффекты на снижение уровня сахара в крови сравнивают с эффектом GLP-1 без добавленной олигосахаридной цепи по сравнительному примеру 1. Результаты приведены на фиг.22.

GLP-1 обладает низкой стабильностью в крови и имеет слабое влияние на снижение уровня сахара в крови, поскольку он быстро деградирует после введения. Следовательно, уровень сахара в крови у мышей, которым был введен GLP-1, был практически равен уровню мышей, которым был введен PBS.

Напротив, пептиды GLP-1 с присоединенными олигосахаридными цепями (26Cys-дисиало-GLP-1, 30Cys-дисиало-GLP-1, 34Cys-дисиало-GLP-1 и 36Cys-дисиало-GLP-1) показали сильное влияние на снижение уровня сахара в крови. Те из них, которые продемонстрировали активность в отношении подавление роста уровня сахара в крови в тесте OGTT в мышах, также продемонстрировали влияние на снижение уровня сахара в крови у the db/db мышей (влияние на снижение уровня сахара в крови на 120 минуте: 26Cys-дисиало-GLP-1, 30Cys-дисиало-GLP-1, 34Cys-дисиало-GLP-1 и 36Cys-дисиало-GLP-1 ≥ 22Cys-дисиало-GLP-1).

Если вводили 26Cys-дисиало-GLP-1 или 34Cys-дисиало-GLP-1, то уровень сахара в крови постепенно увеличивался после введения, их эффекты на снижение уровня сахара в крови немного ослабевали во времени. Если вводили 30Cys-дисиало-GLP-1 или 36Cys-дисиало-GLP-1, то уровень в крови сохранялся на низком уровне через 300 минут (влияние на снижение уровня сахара в крови на 300 минуте: 30Cys-дисиало-GLP-1 и 36Cys-дисиало-GLP-1 ≥ 22Cys-дисиало-GLP-1, 26Cys-дисиало-GLP-1 и 34Cys-дисиало-GLP-1).

Перечень последовательностей в виде свободного текста

SEQ ID NO:1 представляет собой пептид GLP-1 с присоединенной олигосахаридной цепью, представленный общей формулой (1).

SEQ ID NO:2 представляет собой GLP-1 (7-37).

SEQ ID NO:3 представляет собой GLP-1 (7-36 NH₂).

SEQ ID NO:4 представляет собой пептид GLP-1 с присоединенной олигосахаридной цепью, приведенный в (а1).

SEQ ID NO:5 представляет собой пептид GLP-1 с присоединенной олигосахаридной цепью, приведенный в (а2).

SEQ ID NO:6 представляет собой пептид GLP-1 с присоединенной олигосахаридной цепью, приведенный в (а3).

SEQ ID NO:7 представляет собой пептид GLP-1 с присоединенной олигосахаридной цепью, приведенный в (а4).

SEQ ID NO:8 представляет собой пептид GLP-1 с присоединенной олигосахаридной цепью, приведенный в (а5).

SEQ ID NO:9 представляет собой пептид GLP-1 с присоединенной олигосахаридной цепью, приведенный в (а6).

SEQ ID NO:10 представляет собой пептид GLP-1 с присоединенной олигосахаридной цепью, приведенный в (а7).

SEQ ID NO:11 представляет собой пептид GLP-1 с присоединенной олигосахаридной цепью, приведенный в (а8).

SEQ ID NO:12 представляет собой пептид GLP-1 с присоединенной олигосахаридной цепью, приведенный в (а9).

SEQ ID NO:13 представляет собой пептид GLP-1 с присоединенной олигосахаридной цепью, приведенный в (а10).

SEQ ID NO:14 представляет собой пептид GLP-1 с присоединенной олигосахаридной цепью, приведенный в (а11).

SEQ ID NO:15 представляет собой пептид GLP-1 с присоединенной олигосахаридной цепью, приведенный в (а12).

SEQ ID NO:16 представляет собой пептид GLP-1 с присоединенной олигосахаридной цепью, приведенный в (а13).

SEQ ID NO:17 представляет собой пептид GLP-1 с присоединенной олигосахаридной цепью, приведенный в (а14).

SEQ ID NO:18 представляет собой пептид GLP-1 с присоединенной олигосахаридной цепью, приведенный в (а15).

SEQ ID NO:19 представляет собой пептид GLP-1 с присоединенной олигосахаридной цепью, приведенный в (а16).

SEQ ID NO:20 представляет собой пептид GLP-1 с присоединенной олигосахаридной цепью, приведенный в (а17).

[0456]

SEQ ID NO:21 представляет собой пептид GLP-1 с присоединенной олигосахаридной цепью, приведенный в (а18).

SEQ ID NO:22 представляет собой пептид GLP-1 с присоединенной олигосахаридной цепью, приведенный в (a19).

SEQ ID NO:23 представляет собой пептид GLP-1 с присоединенной олигосахаридной цепью, приведенный в (a20).

SEQ ID NO:24 представляет собой пептид GLP-1 с присоединенной олигосахаридной цепью, приведенный в (a21).

SEQ ID NO:25 представляет собой пептид GLP-1 с присоединенной олигосахаридной цепью, приведенный в (a22).

SEQ ID NO:26 представляет собой пептид GLP-1 с присоединенной олигосахаридной цепью, приведенный в (a23).

SEQ ID NO:27 представляет собой пептид GLP-1 с присоединенной олигосахаридной цепью, приведенный в (a24).

SEQ ID NO:28 представляет собой пептид GLP-1 с присоединенной олигосахаридной цепью, приведенный в (a25).

SEQ ID NO:29 представляет собой пептид GLP-1 с присоединенной олигосахаридной цепью, приведенный в (a26).

SEQ ID NO:30 представляет собой пептид, состоящий из 31-го аминокислотного остатка, с защитной группой, синтезированной по примеру 1.

SEQ ID NO:31 представляет собой пептид, состоящий из 31-го аминокислотного остатка, с защитной группой, синтезированной по сравнительному примеру 1.

SEQ ID NO:32 представляет собой пептид, состоящий из 31-го аминокислотного остатка, с защитной группой, синтезированной по примеру 6.

SEQ ID NO:33 представляет собой пептид, состоящий из 31-го аминокислотного остатка, с защитной группой, синтезированной по примеру 6.

SEQ ID NO:34 представляет собой пептид, состоящий из 18-ти аминокислотных остатков, с защитной группой, синтезированной по примеру 7.

SEQ ID NO:35 представляет собой пептид, состоящий из 19-ти аминокислот, с присоединенной олигосахаридной цепью с защитной группой, синтезированной по примеру 7.

SEQ ID NO:36 представляет собой пептид с присоединенной олигосахаридной цепью, состоящий из 31-го аминокислотного остатка, с защитной группой, синтезированной по примеру 7.

SEQ ID NO:37 представляет собой пептид, состоящий из 32 аминокислотных остатков, с защитной группой, синтезированной по примеру 8.

SEQ ID NO:38 представляет собой пептид, состоящий из 31-го аминокислотного остатка, с защитной группой, синтезированной по примеру 9.

SEQ ID NO:39 представляет собой пептид, состоящий из 31-го аминокислотного остатка, с защитной группой, синтезированной по примеру 10.

SEQ ID NO:40 представляет собой пептид, состоящий из 31-го аминокислотного остатка, с защитной группой, синтезированной по примеру 11.

SEQ ID NO:41 представляет собой пептид, состоящий из 31-го аминокислотного остатка, с защитной группой, синтезированной по примеру 12.

SEQ ID NO:42 представляет собой пептид, состоящий из 31-го аминокислотного остатка, с защитной группой, синтезированной по примеру 13.

SEQ ID NO:43 представляет собой пептид, состоящий из 31-го аминокислотного остатка, с защитной группой, синтезированной по примеру 14.

SEQ ID NO:44 представляет собой пептид, состоящий из 31-го аминокислотного остатка, с защитной группой, синтезированной по примеру 15.

SEQ ID NO:45 представляет собой пептид, состоящий из 31-го аминокислотного остатка, с защитной группой, синтезированной по примеру 16.

SEQ ID NO:46 представляет собой пептид, состоящий из 31-го аминокислотного остатка, с защитной группой, синтезированной по примеру 17.

SEQ ID NO:47 представляет собой пептид, состоящий из 31-го аминокислотного остатка, с защитной группой, синтезированной по примеру 18.

SEQ ID NO:48 представляет собой пептид, состоящий из 31-го аминокислотного остатка, с защитной группой, синтезированной по примеру 19.

SEQ ID NO:49 представляет собой пептид, состоящий из 31-го аминокислотного остатка, с защитной группой, синтезированной по примеру 20.

SEQ ID NO:50 представляет собой пептид, состоящий из 31-го аминокислотного остатка, с защитной группой, синтезированной по примеру 21.

SEQ ID NO:51 представляет собой пептид, состоящий из 31-го аминокислотного остатка, с защитной группой, синтезированной по примеру 22.

SEQ ID NO:52 представляет собой пептид, состоящий из 31-го аминокислотного остатка, с защитной группой, синтезированной по примеру 23.

SEQ ID NO:53 представляет собой пептид, состоящий из 31-го аминокислотного остатка, с защитной группой, синтезированной по примеру 24.

SEQ ID NO:54 представляет собой пептид, состоящий из 31-го аминокислотного остатка, с защитной группой, синтезированной по примеру 25.

SEQ ID NO:55 представляет собой пептид, состоящий из 31-го аминокислотного остатка, с защитной группой, синтезированной по примеру 26.

SEQ ID NO:56 представляет собой пептид, состоящий из 31-го аминокислотного остатка, с защитной группой, синтезированной по примеру 27.

SEQ ID NO:57 представляет собой пептид, состоящий из 31-го аминокислотного остатка, с защитной группой, синтезированной по примеру 28.

SEQ ID NO:58 представляет собой пептид, состоящий из 31-го аминокислотного остатка, с защитной группой, синтезированной по примеру 29.

SEQ ID NO:59 представляет собой пептид, состоящий из 31-го аминокислотного остатка, с защитной группой, синтезированной по примеру 30.

SEQ ID NO:60 представляет собой пептид, состоящий из 31-го аминокислотного остатка, с защитной группой, синтезированной по примеру 31.

SEQ ID NO:61 представляет собой пептид, состоящий из 31-го аминокислотного остатка, с защитной группой, синтезированной по примеру 32.

SEQ ID NO:62 представляет собой пептид, состоящий из 31-го аминокислотного остатка, с защитной группой, синтезированной по примеру 33.

SEQ ID NO:63 представляет собой пептид, состоящий из 31-го аминокислотного остатка, с защитной группой, синтезированной по примеру 34.

SEQ ID NO:64 представляет собой пептид, состоящий из 12-ти аминокислотных остатков, с защитной группой, синтезированной по примеру 35.

SEQ ID NO:65 представляет собой пептид, состоящий из 13-ти аминокислотных остатков, с защитной группой, синтезированной по примеру 35.

SEQ ID NO:66 представляет собой пептид с присоединенной олигосахаридной цепью, состоящий из 18-ти аминокислотных остатков, с защитной группой, синтезированной по примеру 35.

SEQ ID NO:67 представляет собой пептид с присоединенной олигосахаридной цепью, состоящий из 18-ти аминокислотных остатков, с защитной группой, синтезированной по примеру 35.

SEQ ID NO:68 представляет собой пептид с присоединенной олигосахаридной цепью, состоящий из 18-ти аминокислотных остатков, с уходящей группой, синтезированной по примеру 35.

SEQ ID NO:69 представляет собой пептид, состоящий из 13-ти аминокислотных остатков с защитной группой, синтезированной по примеру 35.

SEQ ID NO:70 представляет собой пептид, состоящий из 13-ти аминокислотных остатков синтезированного по примеру 35.

SEQ ID NO:71 представляет собой пептид, состоящий из 19-ти аминокислотных остатков, с защитной группой, синтезированной по примеру 36.

SEQ ID NO:72 представляет собой пептид, с присоединенной олигосахаридной цепью, состоящий из 20-ти аминокислотных остатков пептид с защитной группой, синтезированной по примеру 36.

SEQ ID NO:73 представляет собой пептид с присоединенной олигосахаридной цепью, состоящий из 31-го аминокислотного остатка, с защитной группой, синтезированной по примеру 36.

SEQ ID NO:74 представляет собой пептид, состоящий из 15-ти аминокислотных остатков, с защитной группой, синтезированной по примеру 37.

SEQ ID NO:75 представляет собой пептид с присоединенной олигосахаридной цепью, состоящий из 16-ти аминокислотных остатков, с защитной группой, синтезированной по примеру 37.

SEQ ID NO:76 представляет собой пептид с присоединенной олигосахаридной цепью, состоящий из 31-го аминокислотного остатка, с защитной группой, синтезированной по примеру 37.

SEQ ID NO:77 представляет собой пептид, состоящий из 18-ти аминокислотных остатков, с защитной группой, синтезированной по примеру 38.

SEQ ID NO:78 представляет собой пептид, состоящий из 18-ти аминокислотных остатков, с защитной группой, синтезированной по примеру 38.

SEQ ID NO:79 представляет собой пептид, состоящий из 18-ти аминокислотных остатков, с уходящей группой, синтезированной по примеру 38.

SEQ ID NO:80 представляет собой пептид, состоящий 11-ти аминокислотных остатков пептид с защитной группой, синтезированной по примеру 38.

SEQ ID NO:81 представляет собой пептид с присоединенной олигосахаридной цепью, состоящий из 13-ти аминокислотных остатков с защитной группой, синтезированной по примеру 38.

SEQ ID NO:82 представляет собой пептид, состоящий из 18-ти аминокислотных остатков, с защитной группой, синтезированной по примеру 39.

SEQ ID NO:83 представляет собой пептид, состоящий из 18-ти аминокислотных остатков, с защитной группой, синтезированной по примеру 39.

SEQ ID NO:84 представляет собой пептид, состоящий из 18-ти аминокислотных остатков, с уходящей группой синтезированного по примеру 39.

SEQ ID NO:85 представляет собой пептид, состоящий из 10-ти аминокислотных остатков, с защитной группой, синтезированной по примеру 39.

SEQ ID NO:86 представляет собой пептид с присоединенной олигосахаридной цепью, состоящий из 13-ти аминокислотных остатков, с защитной группой, синтезированной по примеру 39.

SEQ ID NO:87 представляет собой пептид, состоящий из 18-ти аминокислотных остатков, с защитной группой, синтезированной по примеру 40.

SEQ ID NO:88 представляет собой пептид, состоящий из 18-ти аминокислотных остатков, с защитной группой, синтезированной по примеру 40.

SEQ ID NO:89 представляет собой пептид, состоящий из 18-ти аминокислотных остатков, с уходящей группой синтезированного по примеру 40.

SEQ ID NO:90 представляет собой пептид, состоящий из 9-ти аминокислотных остатков с защитной группой, синтезированной по примеру 40.

SEQ ID NO:91 представляет собой пептид с присоединенной олигосахаридной цепью, состоящий из 13-ти аминокислотных остатков, с защитной группой, синтезированной по примеру 40.

SEQ ID NO:92 представляет собой пептид, состоящий из 7-ми аминокислотных остатков, с защитной группой, синтезированной по примеру 41.

SEQ ID NO:93 представляет собой пептид, с присоединенной олигосахаридной цепью состоящий из 8-ти аминокислотных остатков, с защитной группой, синтезированной по примеру 41.

SEQ ID NO:94 представляет собой пептид с присоединенной олигосахаридной цепью, состоящий из 31-го аминокислотного остатка, с защитной группой, синтезированной по примеру 41.

SEQ ID NO:95 представляет собой пептид с присоединенной олигосахаридной цепью, состоящий из 31-го аминокислотного остатка, с защитной группой, синтезированной по примеру 42.

SEQ ID NO:96 представляет собой пептид, состоящий из 18-ти аминокислотных остатков, с защитной группой, синтезированной по примеру 46.

SEQ ID NO:97 представляет собой пептид, состоящий из 18-ти аминокислотных остатков, с защитной группой, синтезированной по примеру 46.

SEQ ID NO:98 представляет собой пептид, состоящий из 18-ти аминокислотных остатков, с уходящей группой синтезированного по примеру 46.

SEQ ID NO:99 представляет собой пептид, состоящий из 7-ми аминокислотных остатков, с защитной группой, синтезированной по примеру 46.

SEQ ID NO:100 представляет собой пептид с присоединенной олигосахаридной цепью, состоящий из 13-ти аминокислотных остатков с защитной группой, синтезированной по примеру 46.

SEQ ID NO:101 представляет собой пептид, состоящий из 31-го аминокислотного остатка, с защитной группой, синтезированной по примеру 48.

SEQ ID NO:102 представляет собой пептид, состоящий из 31-го аминокислотного остатка, с защитной группой, синтезированной по примеру 49.

SEQ ID NO:103 представляет собой пептид GLP-1 с присоединенной олигосахаридной цепью, приведенный в (b1).

SEQ ID NO:104 представляет собой пептид GLP-1 с присоединенной олигосахаридной цепью, приведенный в (b2).

SEQ ID NO:105 представляет собой пептид GLP-1 с присоединенной олигосахаридной цепью, приведенный в (b3).

SEQ ID NO:106 представляет собой пептид GLP-1 с присоединенной олигосахаридной цепью, приведенный в (b4).

SEQ ID NO:107 представляет собой пептид GLP-1 с присоединенной олигосахаридной цепью, приведенный в (b5).

SEQ ID NO:108 представляет собой пептид GLP-1 с присоединенной олигосахаридной цепью, приведенный в (b6).

SEQ ID NO:109 представляет собой пептид GLP-1 с присоединенной олигосахаридной цепью, приведенный в (b7).

SEQ ID NO:110 представляет собой пептид GLP-1 с присоединенной олигосахаридной цепью, приведенный в (b8).

SEQ ID NO:111 представляет собой пептид GLP-1 с присоединенной олигосахаридной цепью, приведенный в (b9).

SEQ ID NO:112 представляет собой пептид GLP-1 с присоединенной олигосахаридной цепью, приведенный в (b10).

SEQ ID NO:113 представляет собой пептид GLP-1 с присоединенной олигосахаридной цепью, приведенный в (b11).

SEQ ID NO:114 представляет собой пептид GLP-1 с присоединенной олигосахаридной цепью, приведенный в (b12).

SEQ ID NO:115 представляет собой пептид GLP-1 с присоединенной олигосахаридной цепью, приведенный в (b13).

SEQ ID NO:116 представляет собой пептид GLP-1 с присоединенной олигосахаридной цепью, приведенный в (b14).

SEQ ID NO:117 представляет собой пептид GLP-1 с присоединенной олигосахаридной цепью, приведенный в (b15).

SEQ ID NO:118 представляет собой пептид GLP-1 с присоединенной олигосахаридной цепью, приведенный в (b16).

SEQ ID NO:119 представляет собой пептид GLP-1 с присоединенной олигосахаридной цепью, приведенный в (b17).

SEQ ID NO:120 представляет собой пептид GLP-1 с присоединенной олигосахаридной цепью, приведенный в (b18).

SEQ ID NO:121 представляет собой пептид GLP-1 с присоединенной олигосахаридной цепью, приведенный в (b19).

SEQ ID NO:122 представляет собой пептид GLP-1 с присоединенной олигосахаридной цепью, приведенный в (b20).

SEQ ID NO:123 представляет собой пептид GLP-1 с присоединенной олигосахаридной цепью, приведенный в (b21).

SEQ ID NO:124 представляет собой пептид GLP-1 с присоединенной олигосахаридной цепью, приведенный в (b22).

SEQ ID NO:125 представляет собой пептид GLP-1 с присоединенной олигосахаридной цепью, приведенный в (b23).

SEQ ID NO:126 представляет собой пептид GLP-1 с присоединенной олигосахаридной цепью, приведенный в (b24).

SEQ ID NO:127 представляет собой пептид GLP-1 с присоединенной олигосахаридной цепью, приведенный в (b25).

SEQ ID NO:128 представляет собой пептид GLP-1 с присоединенной олигосахаридной цепью, приведенный в (b26).

SEQ ID NO:129 представляет собой пептид GLP-1 с присоединенной олигосахаридной цепью, приведенный в (b27).

SEQ ID NO:130 представляет собой пептид GLP-1 с присоединенной олигосахаридной цепью, приведенный в (b28).

SEQ ID NO:131 представляет собой пептид GLP-1 с присоединенной олигосахаридной цепью, приведенный в (b29).

SEQ ID NO:132 представляет собой пептид GLP-1 с присоединенной олигосахаридной цепью, приведенный в (b30).

SEQ ID NO:133 представляет собой пептид GLP-1 с присоединенной олигосахаридной цепью, приведенный в (b31).

SEQ ID NO:134 представляет собой пептид GLP-1 с присоединенной олигосахаридной цепью, приведенный в (b32).

SEQ ID NO:135 представляет собой пептид GLP-1 с присоединенной олигосахаридной цепью, приведенный в (b33).

SEQ ID NO:136 представляет собой пептид GLP-1 с присоединенной олигосахаридной цепью, приведенный в (b34).

SEQ ID NO:137 представляет собой пептид GLP-1 с присоединенной олигосахаридной цепью, приведенный в (b35).

SEQ ID NO:138 представляет собой пептид GLP-1 с присоединенной олигосахаридной цепью, приведенный в (b36).

SEQ ID NO:139 представляет собой пептид GLP-1 с присоединенной олигосахаридной цепью, приведенный в (b37).

SEQ ID NO:140 представляет собой пептид GLP-1 с присоединенной олигосахаридной цепью, приведенный в (b38).

SEQ ID NO:141 представляет собой пептид GLP-1 с присоединенной олигосахаридной цепью, приведенный в (b39).

SEQ ID NO:142 представляет собой пептид GLP-1 с присоединенной олигосахаридной цепью, приведенный в (b40).

SEQ ID NO:143 представляет собой пептид GLP-1 с присоединенной олигосахаридной цепью, приведенный в (b41).

SEQ ID NO:144 представляет собой пептид GLP-1 с присоединенной олигосахаридной цепью, приведенный в (b42).

SEQ ID NO:145 представляет собой пептид GLP-1 с присоединенной олигосахаридной цепью, приведенный в (b43).

SEQ ID NO:146 представляет собой пептид GLP-1 с присоединенной олигосахаридной цепью, приведенный в (b44).

SEQ ID NO:147 представляет собой пептид GLP-1 с присоединенной олигосахаридной цепью, приведенный в (b45).

SEQ ID NO:148 представляет собой пептид GLP-1 с присоединенной олигосахаридной цепью, приведенный в (b46).

SEQ ID NO:149 представляет собой пептид GLP-1 с присоединенной олигосахаридной цепью, приведенный в (b47).

SEQ ID NO:150 представляет собой пептид GLP-1 с присоединенной олигосахаридной цепью, приведенный в (b48).

SEQ ID NO:151 представляет собой пептид GLP-1 с присоединенной олигосахаридной цепью, приведенный в (b49).

SEQ ID NO:152 представляет собой смысловой праймер мышиного рецептора GLP-1, состоящий из 35-ти аминокислотных остатков, синтезированный в тестовом примере 6.

SEQ ID NO:153 представляет собой антисмысловой праймер мышиного рецептора мышиного рецептора GLP-1, состоящий из 31-го аминокислотного остатка, синтезированный в тестовом примере 6.

Промышленная применимость

Настоящее изобретение обеспечивает пептид GLP-1 с присоединенной олигосахаридной цепью, который имеет более высокую стабильность в крови по сравнению с GLP-1 и, предпочтительно, проявляет более высокую активность в контролировании уровня сахара в крови по сравнению с GLP-1. Настоящее изобретение в особенности полезно в области фармацевтики.

1. Пептид GLP-1 с присоединенной олигосахаридной цепью, обладающий активностью GLP-1, в котором одна или две аминокислоты заменены аминокислотой с присоединенной олигосахаридной цепью, представляющий собой:
(a1) пептид GLP-1 (7-37) с присоединенной олигосахаридной цепью, имеющий одну аминокислоту, дополнительно присоединенную к C-концу (позиция 37) GLP-1 (7-37), в котором указанная присоединенная аминокислота заменена аминокислотой с присоединенной олигосахаридной цепью;
(a2) пептид GLP-1 (7-37) с присоединенной олигосахаридной цепью, в котором одна или две аминокислоты заменены аминокислотой с присоединенной олигосахаридной цепью и сайт замены выбирают из позиций 18, 20, 22, 30 и 36 GLP-1(7-37); или
(b) пептид GLP-1 (7-37) с присоединенной олигосахаридной цепью, имеющий аминокислотную последовательность пептида GLP-1 (7-37) с присоединенной олигосахаридной цепью, определенную в любом из пунктов (a1)-(a2) с делецией, заменой или вставкой от одной до пяти аминокислот за исключением аминокислоты(аминокислот) с присоединенной олигосахаридной цепью, и
где пептид GLP-1 (7-37) с присоединенной олигосахаридной цепью проявляет 80% или менее от уровня сахара в крови, полученного при введении GLP-1 (7-37), при измерении через 30 минут после введения глюкозы в OGTT (пероральный тест на толерантность к глюкозе),
где указанная олигосахаридная цепь содержит пять или более сахаров,
где указанная олигосахаридная цепь представлена следующей формулой:

в которой R¹ и R² представляют собой одинаковые или различные группы и каждая представляет собой следующее

и Ac представляет собой ацетильную группу.

2. Пептид GLP-1 с присоединенной олигосахаридной цепью по п.1, в котором:
указанная аминокислота с присоединенной олигосахаридной цепью представляет собой Asn с присоединенной олигосахаридной цепью;
в указанной аминокислоте с присоединенной олигосахаридной цепью олигосахаридная цепь присоединена к аминокислоте без помощи линкера;
олигосахаридная цепь выбрана из группы, состоящей из дисиало-, моносиало-, асиало-, диGlcNAc- и диманнозных олигосахаридных цепей; и
указанная олигосахаридная цепь является в значительной степени однородной.

3. Пептид GLP-1 с присоединенной олигосахаридной цепью по п.1, представляющий собой:
(A) пептид GLP-1 (7-37) с присоединенной олигосахаридной цепью, в котором две аминокислоты GLP-1 (7-37) каждая заменены аминокислотой с присоединенной олигосахаридной цепью и замещенные сайты все выбраны из позиций 18, 20, 22, 30 и 36 GLP-1 (7-37); или
(B) пептид GLP-1 (7-37) с присоединенной олигосахаридной цепью, имеющий аминокислотную последовательность пептида GLP-1 (7-37) с присоединенной олигосахаридной цепью, как определено в пункте (a1), с делецией, заменой или вставкой от одной до пяти аминокислот, за исключением аминокислот с присоединенной олигосахаридной цепью,
где каждая из указанных олигосахаридных цепей независимо выбрана из группы, состоящей из дисиало-, моносиало-, асиало-, диGlcNAc- и диманнозных олигосахаридных цепей.

4. Пептид GLP-1 с присоединенной олигосахаридной цепью по п.3, в котором:
каждая из указанных аминокислот с присоединенной олигосахаридной цепью представляет собой Asn с присоединенной олигосахаридной цепью;
в указанной аминокислоте с присоединенной олигосахаридной цепью олигосахаридная цепь присоединена к аминокислоте без помощи линкера;
каждая из указанных олигосахаридных цепей независимо выбрана из группы, состоящей из дисиало-, моносиало-, асиало-, диGlcNAc- и диманнозных олигосахаридных цепей; и
указанная олигосахаридная цепь является в значительной степени однородной.

5. Пептид GLP-1 с присоединенной олигосахаридной цепью по п.1, в котором указанная аминокислота с присоединенной олигосахаридной цепью представляет собой Asn с присоединенной олигосахаридной цепью или Cys с присоединенной олигосахаридной цепью.

6. Пептид GLP-1 с присоединенной олигосахаридной цепью по п.1, в котором в указанной аминокислоте с присоединенной олигосахаридной цепью олигосахаридная цепь присоединена к аминокислоте без помощи линкера.

7. Пептид GLP-1 с присоединенной олигосахаридной цепью по п.1, в котором указанная олигосахаридная цепь выбрана из группы, состоящей из дисиало-, моносиало-, асиало-, диGlcNAc- и диманнозных олигосахаридных цепей.

8. Пептид GLP-1 с присоединенной олигосахаридной цепью по п.1, в котором указанная олигосахаридная цепь является в значительной степени однородной.

9. Пептид GLP-1 с присоединенной олигосахаридной цепью по п.1, обладающий по меньшей мере одним из следующих свойств:
более высокая стабильность в крови по сравнению с GLP-1 (7-37);
активность в контролировании уровня сахара в крови по меньшей мере в 10 раз более высокая, чем у GLP-1(7-37), в OGTT (пероральный тест на толерантность к глюкозе); и
по меньшей мере в 30 раз более высокая устойчивость к DPP-IV, чем у GLP-1 (7-37).

10. Фармацевтическая композиция, включающая пептид GLP-1 с присоединенной олигосахаридной цепью по п.1 для лечения или предупреждения заболевания, поддающегося лечению или предупреждаемого путем введения эффективного количества GLP-1 (7-37).

11. Фармацевтическая композиция по п.10, где указанное заболевание, поддающееся лечению или предупреждаемое введением GLP-1 (7-37), представляет собой диабет.

12. Фармацевтическая композиция по п.10, в которой указанная олигосахаридная цепь имеет по меньшей мере 90%-ную однородность.

13. Способ лечения или предупреждения заболевания, поддающегося лечению или предупреждаемого введением GLP-1(7-37), включающий введение эффективного количества пептида GLP-1 с присоединенной олигосахаридной цепью по п.1.

14. Способ по п.13, где указанное заболевание, поддающееся лечению или предупреждаемое введением GLP-1 (7-37), представляет собой диабет.