Способ получения пропионилхолинэстеразы


 


Владельцы патента RU 2540148:

Общество с ограниченной ответственностью "Биотехнологии" ООО "Биотехнологии" (RU)

Изобретение относится к области биотехнологии. Заявлен способ получения пропионилхолинэстеразы из животной ткани. Гомогенизируют ганглии головоногих моллюсков двукратной обработкой ультразвуком. Полученный гомогенат разводят дистиллированной водой, фильтруют смесь, центрифугируют, пропускают надосадочную жидкость через хроматографическую колонку, где в качестве сорбента используют конконавалин A-сефарозу (Con-A-сефароза), и сушат, причем перед сушкой пропионилхолинэстеразы в раствор фермента добавляют раствор полиэтиленгликоля. Раствор фермента сублимируют при температуре досушивания не более 30°C. Преимуществом изобретения является получение пропионилхолинэстеразы с оптимальной удельной активностью в промышленных масштабах. 1 з.п. ф-лы, 1 пр.

 

Изобретение относится к биохимии и может быть использовано для получения пропионилхолинэстеразы (ПХЭ) - фермента, который может быть использован для оценки антихолинэстеразных свойств фосфорорганических и корбаматных соединений.

Известен способ получения псевдохолинэстеразы из плазмы крови лошадей, при этом разделение белковых фракций плазмы проводят высаливанием сернокислым аммонием, а выделение псевдохолинэстеразы производят фракционированием солями тяжелых металлов совместно с сернокислым аммонием (А.С. №187238 Способ получения псевдохолинэстеразы).

Недостатком данного способа является его многоступенчатость и трудоемкость процесса получения конечного продукта за счет использования при его получении солей тяжелых металлов. Кроме того, использование в качестве сырья плазмы крови лошадей не позволяет получить конечный продукт с высокой активностью.

Известен способ получения холинэстеразы из ганглиев головоногих моллюсков (Михеев Е.В. Автореферат, Комплексная технология биологически активной добавки к пище «Тинростим» и препарата холинэстеразы из ганглиев кальмаров, Владивосток, 2009). В описанном способе сублимированные ганглии кальмаров обрабатывают ферментными препаратами протеолитического действия, гомогенат центрифугируют, полученную массу очищают методом ультрафильтрации. Удельная активность полученного препарата составляет 24,7 Е/мг белка.

Недостатком данного способа является применение ферментных препаратов протеолитического действия, а также использование ультрафильтрации для очистки конечного продукта, которые значительно снижают активность холинэстеразы.

Наиболее близким аналогом по технической сущности к заявляемому техническому решению является «Способ получения холинэстеразы» (А.С. №543652 от 15.03.1974 г.) ,который заключается в гомогенизации сырья, обработке его органическими растворителями, фильтровании смеси, центрифугировании, пропускании надосадочной жидкости через хроматографическую колонку. В качестве сырья использовали ткань электрического органа ската.

Недостатком данного способа является использование в качестве сырья электрического органа ската, что не позволяет наладить промышленный масштаб производства конечного продукта, так как количество сырья очень ограничено. Кроме того, использование в качестве растворителей как органических, так и неорганических веществ, что значительно снижает выход готовой продукции. Полученный данным способом продукт является химически чистый и его можно использовать только в лабораторных условиях в научных целях.

Задачей данного изобретения является получение пропионилхолинэстеразы с оптимальной удельной активностью в промышленных масштабах.

Поставленная задача решается тем, что в способе получения пропионилхолинэстеразы из животной ткани, включающий гомогенизацию ткани, фильтрование смеси, центрифугирование, пропускание надосадочной жидкости через хроматографическую колонку и сушку, СОГЛАСНО ИЗОБРЕТЕНИЮ в качестве исходного сырья используют ганглии головоногих моллюсков, гомогенизированное сырье подвергают двукратной обработке ультразвуком в течение 1-2 мин при 400-700 Гц., полученный гомогенат разводят дистиллированной водой в соотношении 1:3 (сырье : вода), при этом в хроматографической колонке в качестве сорбента используют конконавалин А-сефарозу (Con-А-сефароза), а перед сушкой пропионилхолинэстеразы в раствор фермента добавляют 0,5% раствор полиэтиленгликоля с молекулярной массой 6000. При этом раствор фермента сублимируют при температуре досушивания не более 30°C.

Сущность способа поясняется следующей последовательностью операций.

Замороженное сырье нервной ткани головоногих моллюсков (ганглии) гомогенизируют и подвергают двукратной обработке ультразвуком в течение 1-2 мин при 400-700 Гц. Обработка ультразвуком позволяет добиться более тонкого измельчения сырья, в результате чего большее количество фермента переходит в раствор. Гомогенат разводят дистиллированной водой в соотношении 1:3 сырье/вода и периодически перемешивают в течение 1-2 ч и температуре 3-5°C. Затем фильтруют через капроновый фильтр или центрифугируют на центрифуге (3500 об/мин) для отделения надосадочной жидкости, которая является источником пропилхолинэстеразы. К надосадочной жидкости добавляют сульфат аммония до концентрации раствора равной 60%. Раствор оставляют на 2-4 ч для образования осадка. Осадок удаляют центрифугированием при 100000 об/мин. Надосадочную жидкость подвергают аффинной колоночной хроматографии на сорбенте. В качестве сорбента используют конконавалин А-сефарозу (Con-А-сефароза). Колонку с сорбентом уравновешивают натрий фосфатным буфером с pH 7,0. На колонку наносят количество раствора фермента, равное, в мл, свободному объему колонки. Несорбированные белковые компоненты смывают с колонки фосфатным буфером. Контроль наличия в элюате белков контролируют по величине поглощения длины волны при 280 нм.

Элюцию ПХЭ с колонки проводили 0,02 М фосфатным буфером pH 7,0 с 0,5 М NaCl.

Элюированный фермент диализовали против дистиллированной воды в течение 12 ч.

Для повышения термоустойчивости фермента перед сушкой в раствор фермента добавляют 0,5% раствор полиэтиленгликоля в количестве 1:20 (1 мл полиэтиленгликоля на 20 мл раствора фермента) с молекулярной массой 6000, что значительно увеличивает удельную активность белка. Раствор фермента сублимировали при температуре досушивания не более 30°C.

Активность ПХЭ определяли спектрофотометрическим методом с использованием в качестве субстрата ацетилтиохолина. Количество белка определяли методом Эллмана.

В результате очистки был получен ферментный препарат с величиной удельной активности 250 ед/мг белка.

Заявляемое техническое решение соответствует критериям изобретения:

«новизна», так как для получения пропионилхолинэстеразы впервые использованы приемы обработки гомогенизированного сырья ультразвуком, а для получения ПХЭ с более высокой удельной активностью использована колонная хроматография с Con-А-сефарозой и 0,5% раствор полиэтиленгликоль с молекулярной массой 6000;

«промышленная применимость» - данная технология проста в исполнении и может быть применена для получения ПХЭ в промышленных масштабах.

Пример конкретного выполнения.

1 кг замороженных ганглий командорского кальмара гомогенизируют и подвергают двукратной обработке ультразвуком в течение 1-2 мин при 400-700 Гц. Обработанный ультразвуком гомогенат разводят дистиллированной водой в соотношении 1:3 сырье/вода. Гомогенат периодически перемешивают в течение 1-2 ч при температуре 3-5°C и фильтруют через капроновый фильтр для отделения надосадочной жидкости. К надосадочной жидкости добавляют сульфат аммония до конечной концентрации раствора равной 60%. Раствор оставляют на 3 ч для образования осадка. Осадок удаляют центрифугированием при 100000 об/мин.

Надосадочную жидкость подвергают аффинной колоночной хроматографии на сорбенте. В качестве сорбента используют конконавалин А-сефарозу (Con-А-сефароза). Колонку с сорбентом уравновешивали натрий фосфатным буфером с pH 7,0. На колонку наносили количество раствора фермента, равное, в мл, свободному объему колонки. Не сорбированные белковые компоненты смывали с колонки фосфатным буфером.

Контроль наличия в элюате белков контролировали по величине поглощения длины волны при 280 нм. Элюцию ПХЭ с колонки проводили 0,02 М фосфатным буфером pH 7,0 с 0,5 М NaCl. Элюированный фермент диализовали против дистиллированной воды в течение 12 ч.

Для повышения термоустойчивости ПХЭ перед сушкой в раствор фермента добавляют 0,5% раствор полиэтиленгликоля в количестве 1:20 (1 мл полиэтиленгликоля на 20 мл раствора фермента) с молекулярной массой 6000, что значительно увеличивает удельную активность белка.

Раствор фермента сублимировали при температуре досушивания не более 30°C.

Активность ПХЭ определяли спектрофотометрическим методом с использованием в качестве субстрата ацетилтиохолина. Количество белка определяли методом Эллмана.

В результате очистки был получен ферментный препарат в количестве 300 мг из 1 кг сырья) с величиной удельной активности 250 ед/мг белка.

1. Способ получения пропионилхолинэстеразы из животной ткани, включающий гомогенизацию ткани, фильтрование смеси, центрифугирование, пропускание надосадочной жидкости через хроматографическую колонку и сушку, отличающийся тем, что в качестве исходного сырья используют ганглии головоногих моллюсков, гомогенизированное сырье подвергают двукратной обработке ультразвуком в течение 1-2 мин при 400-700 Гц, полученный гомогенат разводят дистиллированной водой в соотношении 1:3 (сырье:вода), при этом в хроматографической колонке в качестве сорбента используют конконавалин А-сефарозу (Con-A-сефароза), а перед сушкой пропионилхолинэстеразы в раствор фермента добавляют 0,5%-ный раствор полиэтиленгликоля.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что раствор фермента сублимируют при температуре досушивания не более 30°C.



 

Похожие патенты:

Группа изобретений относится к биотехнологии. Предложена клетка мицелиального гриба Penicillium canescens со снятой катаболитной репрессией и арабинозной индукцией, продуцирующая ксиланазу и лакказу.
Изобретение относится к биотехнологии и представляет собой способ получения гетерогенного биокатализатора на основе гидролазы эфиров альфа-аминокислот (AEH) из рекомбинантных бактерий Escherichia coli, несущих ген aehR из Xanthomonas rubrilineans.

Изобретение относится к биотехнологии. Штамм бактерий Serratia species является продуцентом внеклеточных рибонуклеазы и дезоксирибонуклеазы, обладающих противовирусной активностью в отношении вирусов птичьего гриппа A/chickenKurgan/05/2005 (H5N1) и вируса гриппа человека A/Aichi/2/68 (H3N2).
Изобретение относится к биотехнологии. Способ предусматривает обработку чувствительного слоя биосенсора раствором общей фракции протеаз гепатопанкреаса камчатского краба в буфере состава трис-НСl 50 мМ, СаСl2 3 мМ, NaCl 100 мМ, рН 8,0 при температуре раствора в диапазоне 35-40°С.

Изобретение относится к биотехнологии. Предложен способ получения разжиженной биомассы, предусматривающий получение материала биомассы из сахарной свеклы и/или сахарного тростника, разжижение упомянутой биомассы ферментной смесью.

Изобретение относится к способу идентификации улучшенных вариантов белка. Способ включает тестирование множества вариантов белка с единичными заменами в первом тесте первого свойства и во втором тесте второго свойства.

Изобретение относится к области биохимии и биотехнологии. Проводят дробление, просеивание лигноцеллюлозного материала и отбор гранул с размером частиц от 0,08-0,1 мм.
Изобретение относится к области биохимии и представляет собой способ выделения эндонуклеазы из яда кобры. Сначала проводят гель-фильтрацию раствора яда среднеазиатской кобры (Naja naja oxiana) на сверхмелком сефадексе G-75, затем хроматографию эндонуклеазы на SP-сефадексе C-25, диализ выделенного фермента с добавлением балластного белка, стерилизацию и лиофилизацию.

Изобретение относится к биотехнологии. Способ получения глоботриозы заключается в ферментативном переносе галактозного мономера от донора галактозила на лактозу, выполняющую роль акцептора.

Изобретение относится к области медицины и ветеринарии. Способ предусматривает использование рибонуклеазы бактериальной 7P для увеличения эффективности подавления размножения РНК- и ДНК-содержащих вирусов для лечения острых вирусных заболеваний млекопитающих и теплокровных животных.

Изобретение относится к улучшенному способу хроматографического фракционирования для очистки полиненасыщенных жирных кислот (ПНЖК) и их производных. Способ хроматографического разделения для выделения продукта - полиненасыщенной жирной кислоты (ПНЖК) из исходной смеси включает введение исходной смеси в хроматографическую установку с псевдодвижущимся или истинным движущимся слоем, имеющую множество связанных хроматографических колонок, содержащих в качестве элюента водный спирт, где установка имеет множество зон, включающих по меньшей мере первую зону и вторую зону, причем каждая зона имеет поток экстракта и поток рафината, из которых можно отобрать жидкость из указанного множества связанных хроматографических колонок, и где (а) поток рафината, содержащий ПНЖК продукт совместно с более полярными компонентами, отбирается из колонки в первой зоне и вводится в несмежную колонку во второй зоне и/или (б) поток экстракта, содержащий ПНЖК продукт совместно с менее полярными компонентами, отбирается из колонки во второй зоне и вводится в несмежную колонку в первой зоне, причем указанный ПНЖК продукт отделяется от других компонентов исходной смеси в каждой зоне.

Изобретение относится к области охраны окружающей среды и может быть использовано при сорбционной очистке сточных вод от бензина. Природный цеолит клиноптилолит активируют в импульсном магнитном поле с величиной магнитной индукции 11 мТл и временем активации 0,5 мин и вводят в загрязненную бензином воду.

Изобретение относится к способу удаления примесей из потока углеводородов, содержащего по меньшей мере одно винилароматическое соединение. Один из вариантов способа включает: приведение в контакт углеводородного потока по меньшей мере с одним сорбентом, который адсорбирует по меньшей мере часть примесей из углеводородного потока с получением очищенного углеводородного потока; затем отделение очищенного углеводородного потока по меньшей мере от одного сорбента; далее предварительную обработку по меньшей мере одного сорбента до стадии контактирования, где стадия предварительной обработки представляет собой изготовление по меньшей мере одного сорбента, способного адсорбировать примеси; где стадия предварительной подготовки включает: a) промывку по меньшей мере одного сорбента растворителем, b) регулирование рН по меньшей мере одного сорбента, находящегося в растворителе до рН выше чем 10, c) деаэрирование по меньшей мере одного сорбента, находящегося в растворителе, d) удаление растворителя по меньшей мере из одного сорбента и e) сушку по меньшей мере одного сорбента, причем по меньшей мере один сорбент представляет собой глину.

Изобретение относится к способу получения активной фармацевтической субстанции для синтеза препаратов галлия-68, применяемых в позитронно-эмиссионной томографии.

Изобретение относится к способу адсорбционного выделения одного соединения из смеси C8 ароматических углеводородов, а именно, пара-ксилола. Способ выделения пара-ксилола из смеси исходного сырья включает введение жидкости, содержащей нежелательный изомер, в контакт со слоем адсорбента, включающего кристаллы металлоорганической каркасной структуры, выбираемые из группы, состоящей из Al-MIL-53, Zn-MOF-5 и их смесей, и извлечение пара-ксилола из адсорбента.

Изобретение относится к способам очистки проточной воды от загрязнителей, содержащихся в воде в низкой концентрации, и может быть использовано для очистки рек и сточных вод от загрязнений антропогенного и природного происхождения, для очистки воды на водозаборах в системах коммунального водоснабжения и в бытовых системах водоочистки.

Изобретение относится к удалению экстракцией полициклических ароматических углеводородов из курительного материала или полученного из него материала, такого как табак или экстракты табака, или из материала, отличающегося от курительного материала или полученного из него материала, такого как растительный материал, пищевой продукт, ароматизатор.

Изобретение может быть использовано в химической промышленности. Способ десорбции в слое адсорбента включает пропускание потока десорбента через слой адсорбента, расположенный в зоне удаления, для удаления по меньшей мере одного нитрильного соединения и кислородсодержащего соединения.

Изобретение относится к спрессованной основе для применения в энергоустановках совместного сжигания и обогреве дома, содержащей первые частицы, представляющие собой материал биомассы, выбранный из группы, включающей посадочный материал соевых бобов, шалфей, посадочный материал кукурузы и посадочный материал подсолнечника, и вторые частицы, представляющие собой частицы угля, где спрессованная основа, содержащая первые и вторые частицы, а также связующее, которое представляет собой водоросли или воск, является устойчивой к фрагментации.

Изобретение относится к области хроматографии. Описаны варианты способов и устройств для непрерывной или квазинепрерывной очистки многокомпонентной смеси (Fd).

Изобретение относится к получению сорбентов для выделения и детекции рекомбинантных белков, содержащих полигистидиновые последовательности. Предложен способ получения магнитного аффинного сорбента для выделения рекомбинантных белков. Способ включает нанесение пористого кремнеземного слоя на поверхность магнитных микросфер летучих зол от сжигания угля и пропитку раствором, содержащим ионы переходных металлов. В качестве микросфер используют фракцию магнитных микросфер, содержащую 40-41 мас.% стеклофазы. Нанесение пористого кремнеземного слоя осуществляют в гидротермальных условиях. Магнитные микросферы контактируют с жидкой реакционной смесью, содержащей тетраэтоксисилан и гексадецилтриаммоний бромид в качестве структуроформирующего агента. После нанесения кремнезёмного слоя твердую фазу отделяют, промывают, термообрабатывают и активируют при кипячении в водной среде. Изобретение позволяет повысить прочность кремнезёмной оболочки на поверхности микросфер без снижения сорбционной ёмкости по белкам среднего размера. 6 з.п. ф-лы, 2 ил., 3 табл., 9 пр.
Наверх