Способ выявления уреазопродуцирующих микроорганизмов "быстрый уреазный тест геликобактер тест" и устройство для его применения

Авторы патента:

 


Владельцы патента RU 2540473:

Плисс Михаил Гениевич (RU)

Изобретение относится к медицине и может быть использовано для выявления продуцирующих уреазу микроорганизмов, в частности Helicobacter pylori. Для этого проводят экспресс-анализ на диагностических дисках для определения уреазной активности образцов. Диски выполнены из фильтровальной бумаги, на которую заранее наносят мочевину, кислотно-основной индикатор, муромидазу и кондиционирующие вещества. При наличии уреазной активности в пробе происходит цветовое окрашивание индикаторного диска. Изобретение обеспечивает повышение чувствительности способа диагностики Helicobacter pylori. 3 пр.

 

Изобретение относится к разделу аналитической химии, используемому в медико-биологических исследованиях, а именно в идентификации микроорганизмов по определению уреазной активности, и может быть использовано как в микробиологии, так и в медицине, в частности, для диагностики Helicobacter pylori. Данный микроорганизм отличается чрезвычайно высокой уреазной активностью, выполняемой in vivo: для контроля содержания равновесного аммиака.

Уреазную активность как in vivo, так и in vitro обычно измеряют по кинетике разложения мочевины и, в частности, по количеству аммиака или углекислого газа (Дж.Б. Самнер, Г.Ф. Сомерс, "Химия ферментов и методы их исследований", под ред. В.А. Энгельгардта, Иностранная литература, Москва, 1948, 584 с., с.178), выделяющихся в результате реакции ферментативного гидролиза. Для определения уреазной активности биоптатов классически используются жидкие среды, приготовляемые ex tempore из растворов, содержащих мочевину в воде, 50% этаноле или фосфатном буфере с кислотно-основным индикатором, обычно феноловым красным (рН перехода 6,8-8,4). Например, используемая в микробиологии среда Христйансена: мочевина 20 г/л, феноловый красный 0,012 г/л, KH2PO4 2 г/л, пептон 1 г/л, NaCl 5 г/л, глюкоза 10 г/л. Именно эта среда была впервые применена для определения HP в биоптатах слизистой оболочки желудка. Или среда, содержащая 2 г мочевины, 10 мг фенолового красного и азида натрия в 100 мл 0,01 М фосфатного буфера рН 6,5 (Н.В. Сафонова, А.В. Жебрун "Гастрит, язвенная болезнь и хеликобактериоз". Рекомендации для врачей, НИИ им.Пастера, Спб, 1993, 40 с., с.32). Известны уреазные коммерческие тесты, где в качестве реакционной среды используются гели. "Pyloritek" (B.J. Marshall and coil. Rapid urease test in the management of Campylobacter pyloridis-associated gastritis. Am. J. Gastroenterol. 1987; v.82, p.200-210; Westblom T.U. and coll. Evaluation of a rapid urease test to detect Campylobacter pylori infectim. J. Clin. Microbiol., 1988, v.26, p.1393-1394) и коммерческий CLOtest, выпускаемый фирмой "Delta West" (Австралия) совместно с фирмой "Tri-Med Specialites Inc." (США),тесты финской фирмы БИОХИТ.

Известно авторское свидетельство СССР 1564192, C12Q 1/04 от 18.04.88 «Способ определения Campylobacter pyloridis при язвенной болезни желудка и двенадцатиперстной кишки», где использованы плотные гелеобразные носители среды, изготовленные в виде таблетки. В качестве плотного носителя обычно используется агар, а в качестве консерванта - азид натрия. Для одного анализа используется питательная среда в количестве 0,05-0,15 мл, содержащая мочевину 15-25 г/л, фосфатный 0,01 М буфер рН 6,5 и индикатор феноловый красный 500 мг/мл. Время проведения реакции десятки минут. Известно изобретение (патент РФ 97117123.13), избранное в качестве прототипа, предполагающего проведение реакции индикации уреазной активности пробы на основе твердого гигроскопичного пористого или зернистого носителя, при этом реакция разложения мочевины и последующее выделение аммиака, вызывающего цветовую реакцию индикатора, происходит при использовании естественного количества жидкой среды, находящейся в пробе. Время проведения реакции достаточно короткое - до 5 минут.

Использование всех вышеописанных методов, равно как и избранного в качества прототипа, предполагает анализ уреазной активности находящихся на поверхности клеток микроорганизмов ферментов для разложения кондиционированного добавками, включающими индикатор субстрата (мочевины).

При этом чувствительность метода имеет принципиальное значение, так как при анализе биоптатов или других образцов на содержание микроорганизмов возможно попадание в пробу очень небольшого количенства микробных тел, что при недостаточной чувствительности может дать ложноотрицательный результат.

Поэтому с целью дальнейшего расширения аналитических возможностей, нами предлагается вариант быстрого уреазного теста на основе твердого гигроскопичного носителя, содержащего субстрат(мочевину)в количестве от 1.0 кг до 2.5,0 кг на 1 м2, один из кислотно-основных индикаторов с интервалом перехода в области от рН 3,2-5,0 до 8,2-9;0 в количестве от 21 г до 50 г на 1 м2 (например, (например, бромтимоловый синий), буфер (например, фосфатный) до рН 7.0, повышающий осмотическое давление агент (например, хлористый натрий) 1200 кг на 1 м2, фермент, разрушающий клеточую мембрану микроорганизма (например, муромидазу) - 0.001 кг на м2. Изготовление теста производится при последовательной кристаллизации растворов вышеперечисленных веществ на фильтровальной бумаге в вытяжном шкафу при использовании в качестве растворителя воды и изопропилового спирта.

При проведении анализа биоптат помещается на индикаторный диск и производится оценка индикаторного эффекта в течение 3-4 минут. При наличии уреазопродуцирующих микроорганизмов происходит разрушение клеточной оболочки вследствие повышенного осмотического градиента и воздействия ферментов. Выделяющийся внутриклеточный пул уреазы вызывает немедленную реакцию расщепления мочевины с выделением аммиака, меняющего рН среды, что и вызывает цветовое окрашивание индикаторного диска. Таким образом, происходит резкое повышение чувствительности теста, позволяющего выявить подпороговые количества микроорганизмов по другим методам. Применение способа делает возможной диагностику гастродуоденальной патологии человека в условиях клинико-бактериологической лаборатории лечебно-профилактических учреждений.

В целом способ заключается в том, что реакционная среда гипертонична и содержит вещества органического и неорганического происхождения, вызывающие повреждение клеточной стенки и выход в реакционную среду эндогенной уреазы.

Пример 1.

В клинику поступил больной В. в возрасте 28 лет с жалобами на боли в эпигастрии. В процессе фиброгастроскопии в антральном отделе желудка была обнаружена полныу эрозии, взят биопсийный материал. После разделения биоптата на 3 части одна из них была помещена на тест прототипа, вторая направлена на микроскопическое исследование, третья помещена на диск по описанному выше способу.

Через 3 минуты тест прототип - результат отрицательный, при микроскопии с окраской - единичные микробные тела Хеликобактер пилори, предлагаемый тест - результат положительный через 28 с, на основании чего был сделан вывод о наличии HP в материале, а следовательно, лабораторно подтвердили диагноз - пилорический хеликобактериоз, и была начала соответствующая этиотропная терапия заболевания.

Пример 2.

В клинику на дообследование поступила больная Б. в возрасте 35 лет по поводу болей в эпигастрии. При фиброгастроскопии выявлен хронический субатрофический гастрит с дуодено-гастральным рефлюксом IV ст. и взят материал для исследования.

Биоптат разделен на 3 части. В процессе тестирования биоптата по варианту прототипа микроскопического метода и предложенному выше способу не выявлено микроорганизмов - был сделан вывод об отсутствии HP.

Пример 3.

В клинику поступил больной Ф. в возрасте 48 лет с жалобами на боли в эпигастрии. В процессе фиброгастроскопии в желудке хронический атрофический гастрит, хроническая язва луковицы 1.0×0.8 см, рубцовая деформация луковицы 12 п кишки. Взят биопсийный материал. После разделения биоптата на 3 части одна из них была помещена на тест прототипа, вторая направлена на микроскопическое исследование, третья помещена на диск по описанному выше способу.

Через 3 минуты тест прототип - результат отрицательный, при микроскопии с окраской - единичные микробные тела Хеликобактер пилори, предлагаемый тест - результат положительный через 14 с - на основании чего был сделан вывод о наличии HP в материале, а следовательно, лабораторно подтвердили диагноз - хеликобактериоз, и была начала соответствующая этиотропная терапия заболевания.

Способ выявления продуцирующих уреазу микроорганизмов, заключающийся во внесении в среду, содержащую мочевину, кондиционирующие эту реакционную среду химические вещества и индикатор, реагирующий изменением цвета на сдвиг рН среды, вызванный выделением аммиака при разложении мочевины уреазой тестируемых микроорганизмов, и выполненной в виде диагностических дисков из природных или синтетичесих полимеров, отличающийся тем, что с целью повышения чувствительности метода реакционная среда гипертонична и содержит вещества органического и неорганического происхождения, вызывающие повреждение клеточной стенки и выход в реакционную среду эндогенной уреазы.



 

Похожие патенты:

Изобретение относится к ультратонким полимерным покрытиям, широко используемым в современной технике. .

Изобретение относится к гигиене и санитарии пресноводных водоемов и может быть использовано для микробиологического тестирования состояния водоисточника в зоне стоков сельскохозяйственных предприятий, в частности птицефабрик и свинокомплексов.

Изобретение относится к области медицинских технологий: неинвазивной атравматичной диагностике гастродуоденальных заболеваний, вызываемых бактериями Helicobacter pylori, далее по тексту хеликобактер.
Изобретение относится к области медицины, а точнее к медицинской микробиологии, и может быть использовано для лабораторной диагностики гастродуоденальной патологии, ассоциированной с Helicobacter pylori, на основании обнаружения указанных микроорганизмов в биоптатах, извлеченных в процессе эндоскопии, и определения их бактериальной обсемененности.

Изобретение относится к медицинской микробиологии и может быть использовано для биохимической дифференциации энтеробактерий. .

Группа изобретений относится к биохимии. Предложен способ получения стандартного образца мутности бактерийных взвесей, стандартный образец мутности бактерийных взвесей, применение стандартного образца мутности бактерийных взвесей, а также набор, содержащий стандартный образец мутности бактерийных взвесей.

Представлены наборы олигонуклеотидных зондов и праймеров, биологический микрочип и тест-система для идентификации и типирования вируса гриппа А и В. Охарактеризованная тест-система содержит: набор реагентов для выделения РНК вируса гриппа из биологического материала человека; набор реагентов для проведения ПЦР-амплификации, совмещенной с обратной транскрипцией, с образованием флуоресцентно-меченных фрагментов генома вируса гриппа, содержащий описанные олигонуклеотиды-праймеры; набор реагентов для проведения гибридизации фрагментов ДНК, полученных после проведения амплификации на биочипе, содержащем элементы с иммобилизованными описанными олигонуклеотидными зондами; и при необходимости, отрицательный и положительный контрольные образцы.

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к определению содержания микроорганизмов в различных объектах и средах. Способ предусматривает конъюгацию бактерий с электрохимической меткой, в качестве которой используют Fe0, MgFe2O4 или Fe3O4, осуществляемую в водной среде при заданных параметрах.
Изобретение относится к области медицинской микробиологии и биотехнологии, в частности к микробиологической лабораторной диагностике инфекционных болезней. Питательная среда содержит триптон, дрожжевой экстракт, глюкозу, хлорид натрия, эритроциты человека 0(I) группы Rh(+), сульфат железа(II), агар «Дифко» и дистиллированную воду при заданных соотношениях компонентов.
Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано при бактериологических исследованиях по выделению и идентификации бактерий рода Klebsiella, производстве питательных сред для этих исследований.
Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано для диагностики неспецифических инфекционных заболеваний мочеполовой системы. Питательная среда содержит питательный агар, сухой, из каспийской кильки, парааминобензойную кислоту, трис-(оксиметил) аминометан (трис-буфер), салицин, нейтральный красный, L-триптофан, 5-бром-4-хлор-3-индолил β-D-глюкуронид циклогексиламмонийной соли, 2-нитрофенил β-D-галактопиранозид и дистиллированную воду в заданном соотношении компонентов.

Группа изобретений относится к области биотехнологии и направлена на идентификацию микроорганизмов в тестируемом образце. В одном варианте способ идентификации неизвестного микроорганизма включает получение тестируемого образца, который может содержать неизвестный микроорганизм.

Изобретение относится к области лабораторной диагностики и может быть использовано для определения присутствия патогенных микроорганизмов в биологических образцах.
Изобретение относится к санитарной и клинической микробиологии. Питательная среда содержит панкреатический гидролизат казеина, пептон мясной, дрожжевой экстракт, натрий хлористый, калий фосфорнокислый двузамещенный, калий фосфорнокислый однозамещенный, магний сернокислый, цетримид, агар бактериологический, натрий углекислый, налидиксовую кислоту, глицерин и дистиллированную воду в заданном соотношении компонентов.
Изобретение относится к биотехнологии, в частности к ветеринарной микробиологии. Определяют чувствительность бактерий, вызывающих кишечные инфекции, к комплексным антибактериальным препаратам.

Изобретение относится к медицине и может быть использовано в стоматологии для выявления кариеса на видимых и скрытых поверхностях зубов. Предлагаемый способ диагностики начального кариеса зубов заключается в нанесении флуоресцирующего 1% красителя «Родамин С» на участок измененных тканей зуба после снятия зубного налета и фиксации красителя в течение 1-3 мин, при одновременном втирании красителя с помощью микроаппликатора, после чего избыток красителя смывают водой, влагу удаляют, осуществляют его проявление с помощью стоматологической полимеризационной лампы и по наличию окрашивания в красный цвет при визуализации через оранжевый светозащитный фильтр определяют начальный кариес.
Изобретение относится к медицине, а именно к офтальмологической хирургии, и может быть использовано при хирургическом лечении сквозных макулярных разрывов сетчатки с применением интравитреального красителя.

Настоящее изобретение относится к способу получения хелатного соединения металла или его соли, используемого в качестве диагностического реагента. Способ включает следующие стадии: a) контактирование жидкой композиции, содержащей компонент иона металла, с катионообменным твердым носителем, модифицированным функциональными группами иминодиуксусной кислоты или тиомочевины, для получения металлохелатного носителя; и b) контактирование указанного металлохелатного носителя с жидкой композицией, содержащей аминокарбоновый хелатообразующий реагент или его соль.
Наверх