Способ идентификации синегнойной палочки pseudomonas aeruginosa

Изобретение относится к биологии и медицине, а именно к молекулярной биологии, микробиологии и хирургии, и может быть использовано в диагностических целях для идентификации синегнойной палочки Pseudomonas aeruginosa в клиническом биоматериале. Способ идентификации синегнойной палочки Pseudomonas aeruginosa включает посев исследуемого материала на твердую питательную среду, инкубирование посева в аэробных условиях при 37°С в течение 16-18 часов. Полученную бактериальную массу в количестве одной бактериологической петли помещают в 300 мкл физиологического раствора и прогревают при 98-99°С в течение 20-30 минут, центрифугируют при 12000 об/мин в течение 30 секунд. В супернатант добавляют краситель для электрофоретической детекции в количестве 0,5 мкл и 20 мкл вносят в лунку размером 4×1 мм 1,2% агарозного геля на ТАЕ-буфере с 10 мкл 1% бромистого этидия. Параллельно в контрольную лунку вносят 3 мкл раствора стандартного ДНК-маркера 1 kb, содержащего фрагменты ДНК в диапазоне 250-10000 bp. Проводят горизонтальный электрофорез в течение 15-20 минут, и при выявлении на полученной электрофореграмме исследуемой бактериальной массы трех светящихся в ультрафиолетовом свете полос, одна из которых соответствует фрагментам стандартного ДНК-маркера размером 10000 bp, вторая соответствует фрагментам стандартного ДНК-маркера размером 6000-8000 bp и третьей полосы в конце трека в форме «метелки», соответствующей фрагментам стандартного ДНК-маркера размером менее 750 bp, идентифицируют Pseudomonas aeruginosa в исследуемой бактериальной массе. Способ позволяет быстро и полно идентифицировать пигментообразующие и беспигментные штаммы Pseudomonas aeruginosa в исследуемой бактерийной массе. 5 ил., 2 пр.

 

Изобретение относится к биологии и медицине, а именно к молекулярной биологии, микробиологии и хирургии, и может быть использовано в диагностических целях для идентификации синегнойной палочки (Pseudomonas aeruginosa) в клиническом биоматериале.

Палочка сине-зеленого гноя - Pseudomonas aeruginosa (Ps. aeruginosa) является типовым видом рода Pseudomonas. Она широко распространена во внешней среде. В незначительном количестве она встречается в кишечнике человека и животных, обнаруживается на коже, слизистых оболочках, различных предметах обихода, в почве, воде. Ps. aeruginosa может вызывать разнообразные гнойные заболевания, особенно у лиц с пониженной сопротивляемостью к инфекции: нагноение ран, остеомиелиты, отиты, пневмонии, легочные абсцессы, а также пищевые отравления, эндокардиты, сепсис и др. Нередко Ps. aeruginosa можно обнаружить в длительно незаживающих, плохо дренирующихся ранах, трофических язвах, пролежнях. Ps. aeruginosa является одним из наиболее частых возбудителей инфекций, связанных с оказанием медицинской помощи, которые характеризуются тяжелым течением и ассоциируются с высокой летальностью. Высокая биохимическая активность и широкий набор ферментов обеспечивают синегнойной палочке адаптацию к разнообразным условиям существования в окружающей среде. Полианти-биотикорезистентность, способность длительно сохраняться в окружающей среде, в том числе и при воздействии различных химических соединений и др., характеризуют этот микроорганизм как идеальный госпитальный патоген.

В большинстве случаев для диагностики поражений внутренних органов синегнойной палочкой необходимо выделение возбудителя. Основной метод лабораторной диагностики Ps. aeruginosa - бактериологическое исследование с последующей идентификацией, при которой учитывают способность микроба к образованию пигментов и биохимические свойства. Общие принципы идентификации Ps. aeruginosa включают [Manual of Clinical Microbiology 7th ed., ed. in chief PR. Muttay. Washington: Am. Soc. Microbiol., 1999; 1773р.]:

- применение сред общего назначения и дифференциально-диагностических сред для первичного выделения бактерий и предварительной их дифференциации от ферментирующих глюкозу грамотрицательных бактерий;

- изучение морфологии клеток в окраске по Граму;

- скрининг кардинальных признаков выделенной культуры - продукция пигмента, наличие подвижности, цитохромоксидазы, сахаролитической активности на окислительно-ферментативной (ОФ) среде Хью-Лейфсона с глюкозой;

- использование дополнительных биохимических и других тестов для идентификации.

Недостатки этого метода:

1) частота правильной идентификации этих микроорганизмов в клинических лабораториях не превышает 30-60%, т.к. диагностические признаки неферментирующих бактерий, в том числе Ps. aeruginosa, изменчивы и нестабильны;

2) схемы исследования многоэтапны, громоздки, большое количество тестов сложны для выполнения;

3) существенно затрудняет выделение и идентификацию синегнойной палочки то, что она, как правило, находится в исследуемом материале не в монокультуре, а в ассоциации с другими микроорганизмами, особенно часто с протеем, что способствует увеличению продолжительности проведения лабораторных исследований;

4) поскольку образование пигментов Ps. aeruginosa рассматривается рядом авторов [Рубан Е.Л. Физиология и биохимия представителей рода Pseudomonas. - М.: Наука, 1986. - 200 с.; Беляков В.Д., Ряпис Л.А., Илюхин В.И. Псевдомонады и псевдомонозы. - М.: Медицина, 1990, 224 с.] как ключевой и видообразующий признак при внутриродовой дифференциации, трудности диагностики Ps. aeruginosa связаны с большим количеством ее беспигментных штаммов. Так, в начале 60-х годов на долю беспигментных штаммов синегнойной палочки приходилось 18-25%, а к началу 90-х годов - уже 50%. Непигментированную синегнойную палочку бывает трудно отличить от других неферментирующих бактерий, относящихся к родам Acinetobacter, Moraxella, Flavobacterium.

Для идентификации беспигментных штаммов Pseudomonas aeruginosa требуется постановка дополнительных тестов: на барийчувствительность, цитохромоксидазу, нитратредуктазу, желатиназу, аргининдигидролазу, лизиндекарбоксилазу, окисление глюкозы и маннита на среде Хью-Лейфсона, индукцию продукции пиоцианина на среде Кинг А и пиовердина на среде Кинг В. [Зубков М.Н. Неферментирующие бактерии: классификация, общая характеристика, роль в патологии человека. Идентификация Pseudomonas spp.и сходных микроорганизмов // Инфекции и антимикробная терапия. - 2003. - Т. 5. - №1. - С.24-30; Приказ МЗ СССР №535 от 22.04.85 «Об унификации микробиологических (бактериологических) методов исследования, применяемых в клинико-диагностических лабораториях лечебно-профилактических учреждений». - С.109-115].

Однако каждый из предлагаемых тестов имеет ограничения, поскольку дают возможность определить только те штаммы, которые обладают перечисленными свойствами.

Известна схема высокоспецифичной бактериологической идентификации и дифференциации атипичных и беспигментных штаммов Ps. aeruginosa из объектов внешней среды, пищевого сырья и пищевых продуктов с помощью накопительной среды с сукцинатом натрия, аргинином и фурадонином и усовершенствованной селективной среды с цетримидом и подобранных тестов бактериологической идентификации, которая осуществляется в течение 75 часов, с дальнейшим типированием с помощью специфичного бактериофага в течение 19-20 часов (Шестаков А.Г. Усовершенствование методов выделения, идентификации и индикации бактерий Pseudomonas aeruginosa. Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук, 2010 - 22 страницы).

Недостатком метода является сложность технологического процесса - трудоемкость, большая длительность постановки, использование большого количества разнообразных реактивов.

Известен способ диагностики госпитального штамма синегнойной палочки Ps. aeruginosa, включающий определение чувствительности штамма к антибиотикам и его фаготипа. Дополнительно определяют устойчивость штамма к дезинфицирующим веществам, его плазмидный профиль, серотип, адгезию к эпителиальным клеткам и диагностируют штамм синегнойной палочки Ps. aeruginosa как госпитальный при отсутствии чувствительности штамма к не менее 9 антибиотикам, одинаковых фаго- и серотипе, устойчивости к не менее пяти дезинфицирующим веществам, сходном плазмидном профиле и коэффициенте адгезии к эпителиальным клеткам 15±0,2 и более (Шкарин В.В., Никифоров В.А., Воробьева О.Н., Давыдова Н.А., Саргина Е.С. Способ диагностики госпитального штамма синегнойной палочки Ps. aeruginosa. Заявка на изобретение 94026116/13, опубл. 20.08.1996).

Недостатком способа является сложность технологического процесса.

Таким образом, несмотря на то, что потребность в диагностике синегнойной инфекции очевидна, существующие бактериологические параметры схем, методов выделения, идентификации и индикации Ps. aeruginosa несовершенны.

Наиболее близким к заявляемому способу является способ выделения беспигментных штаммов Pseudomonas aeruginosa (Надтока В.Л., Волянский Ю.Л., Воробьева О.Н., Божко Н.Г., Гришко А.А., Кириченко И.А., Редько И.А., Гоголев И.В., Рязанова Н.В., Зуб Л.И., Куликова Е.А. Авторское свидетельство №1442550, опубл. 07.12.88 г.) путем посева исследуемого материала на питательные среды с последующим инкубированием посевов и исследованием выросших культур на наличие пигмента. С целью ускорения способа посев осуществляют на мясопептонный агар и/или бульон, в который непосредственно перед посевом добавляют хлорофиллипт дозой 12,5-25 мкг/мл среды, а инкубирование проводят в течение 16-18 ч. В результате верхний слой среды окрашивается в сине-зеленый цвет, присущий синегнойной палочке. Авторы считают, что их способ позволяет выделять беспигментные штаммы синегнойной палочки в 2 раза быстрее и в 6 раз эффективнее по сравнению со средой Кинг А.

Однако среда Кинг А используется для усиления способности синегнойной палочки продуцировать только два пигмента - сине-зеленый пигмент пиоцианин и в некоторых случаях пиорубин, дающий красное окрашивание. В предложенном авторами способе также определяются лишь штаммы, стимулированные на выработку только пиоцианина, а штаммы, продуцирующие другие пигменты - пиовердин (бурый цвет), пиорубин (ярко-красный цвет), флуоресцеин (флуоресцирует в УФ-лучах), данным способом не определяются.

Задачей настоящего изобретения является разработка лабораторного способа идентификации синегнойной палочки, который позволит более точно и полно диагностировать и идентифицировать как пигментные, так и беспигментные штаммы Ps. aeruginosa за счет выявления бактериальной ДНК как неотъемлемого структурного и функционального компонента клетки.

Поставленная задача достигается способом идентификации синегнойной палочки Pseudomonas aeruginosa, включающим посев исследуемого материала на твердую питательную среду, инкубирование посева в аэробных условиях при 37°С в течение 16-18 часов. Полученную бактериальную массу в количестве одной бактериологической петли помещают в 300 мкл физиологического раствора и прогревают при 98-99°С в течение 20-30 минут, центрифугируют при 12000 об/мин в течение 30 секунд. В супернатант добавляют краситель для электрофоретической детекции в количестве 0,5 мкл и 20 мкл вносят в лунку размером 4×1 мм 1,2% агарозного геля на ТАЕ-буфере с 10 мкл 1% бромистого этидия. Параллельно в контрольную лунку вносят 3 мкл раствора стандартного ДНК-маркера 1 kb, содержащего фрагменты ДНК в диапазоне 250-10000 bp. Проводят горизонтальный электрофорез в течение 15-20 минут, и при выявлении на полученной электрофореграмме исследуемой бактериальной массы трех светящихся в ультрафиолетовом свете полос, одна из которых соответствует фрагментам стандартного ДНК-маркера размером 10000 bp, вторая соответствует фрагментам стандартного ДНК-маркера размером 6000-8000 bp и третьей полосы в конце трека в форме «метелки», соответствующей фрагментам стандартного ДНК-маркера размером менее 750 bp, идентифицируют Pseudomonas aeruginosa в исследуемой бактериальной массе.

Новизна изобретения

- Полученную бактериальную массу в количестве одной бактериологической петли помещают в 300 мкл физиологического раствора и прогревают при 98-99°С в течение 20-30 минут, центрифугируют при 12000 об/мин в течение 30 секунд. В супернатант добавляют краситель для электрофоретической детекции в количестве 0,5 мкл и 20 мкл вносят в лунку размером 4×1 мм 1,2% агарозного геля на ТАЕ-буфере с 10 мкл 1% бромистого этидия.

- Параллельно в контрольную лунку вносят 3 мкл раствора стандартного ДНК-маркера 1 kb, содержащего фрагменты ДНК в диапазоне 250-10000 bp.

- Проводят горизонтальный электрофорез в течение 15-20 минут, и при выявлении на полученной электрофореграмме исследуемой бактериальной массы трех светящихся в ультрафиолетовом свете полос, одна из которых соответствует фрагментам стандартного ДНК-маркера размером 10000 bp, вторая соответствует фрагментам стандартного ДНК-маркера размером 6000-8000 bp и третьей полосы в конце трека в форме «метелки», соответствующей фрагментам стандартного ДНК-маркера размером менее 750 bp, идентифицируют Pseudomonas aeruginosa в исследуемой бактериальной массе.

В патентной и научной литературе отсутствуют сведения об аналогичном способе идентификации Ps. aeruginosa.

Совокупность существенных признаков изобретения позволяет получить новый технический результат, заключающийся в быстрой и полной идентификации пигментообразующих и беспигментных штаммов Pseudomonas aeruginosa в исследуемой бактерийной массе, полученной выращиванием на твердых питательных средах. Способ позволяет дифференцировать Pseudomonas aeruginosa от других представителей неферментирующих грамотрицательных бактерий (Acinetobacter spp.) и от наиболее значимых родов и видов семейства Enterobacteriaceae.

Изобретение иллюстрируется фотографиями Фиг.1 - Фиг.5, на которых представлены результаты идентификации Ps. aeruginosa в бактерийной массе, выращенной стандартно из различных источников биоматериала, предлагаемым способом.

На фиг.1 представлена фотография электрофореграммы образца ДНК Pseudomonas aeruginosa, идентифицированной предлагаемым способом, после электрофореза в 2%-агарозном геле.

На фиг.2 представлена фотография электрофореграммы образцов культур различных родов и штаммов бактерий, в том числе Ps. aeruginosa, обработанных предлагаемым способом, после электрофореза в 1,2%-агарозном геле: Klebsiella spp. №11, Enterobacter spp. №23, Enterobacter spp. №22, Acinetobacter baumannii №18, Acinetobacter baumannii №10, Acinetobacter baumannii №51, Ps. aeruginosa №42 беспигментный штамм, Ps. aeruginosa №3, Ps. aeruginosa №2, Ps. aeruginosa №1 беспигментный штамм, Escherichia coli №5, Escherichia coli №6, Escherichia coli лактозоне-гативная №7, Escherichia coli №4, Proteus mirabilis №17., Proteus mirabilis №16.

На фиг.3 представлена фотография электрофореграммы образца ДНК Ps. aeruginosa, выделенного предлагаемым способом в сравнении с образцом стандартного ДНК-маркера, и рисунок, показывающий структуру стандартного ДНК-маркера (OOO «Лаборатория МЕДИГЕН», г. Новосибирск).

На фиг.4 представлена фотография электрофореграммы образцов ДНК различных штаммов Ps. aeruginosa в сравнении с образцами ДНК Proteus mirabilis и Escherichia coli, выделенными из раневого отделяемого пациента ожогового отделения.

На фиг.5 представлена фотография электрофореграммы образцов ДНК бактерий, выделенных из лимфедемы правой нижней конечности II ст. пациентки хирургического кабинета.

Лунки для внесения образцов ДНК - А, треки образцов ДНК - Б, полоса ДНК, соответствующая фрагментам ДНК-маркера размером 10000 bp - а, полоса ДНК, соответствующая фрагментам ДНК-маркера размером 6000-8000 bp - б, полоса ДНК в форме «метелки», соответствующая фрагментам ДНК-маркера размером менее 750 bp - в.

При проведении научных исследований нами было обнаружено, что из соскоба с выросшей на питательном агаре культуры Pseudomonas aeruginosa, помещенного в количестве 1 бактериологической петли в 300 мкл физиологического раствора и прогретого при 99°С в течение 30 минут, выделяется ДНК, которая после горизонтального электрофореза в 2% агарозе с бромистым этидием ярко иллюминирует в ультрафиолетовом свете с образованием трех светящихся зон (полос) - рядом с лункой (а), недалеко от лунки (б) и в конце трека в виде «метелки» (в) (Фиг.1).

Был проведен сравнительный анализ образцов ДНК различных родов и штаммов бактерий, выделенной и проанализированной предлагаемым способом, но с использованием 1,2% агарозы для электрофореза. На фиг.2 представлена фотография электрофореграммы образцов ДНК следующих штаммов бактерий - Klebsiella spp.№11 (дорожка 1); Enterobacter spp.№23 (дорожка 2); Enterobacter spp.№22 (дорожка 3); Acinetobacter baumannii №18 (дорожка 4); Acinetobacter baumannii №10 (дорожка 5); Acinetobacter baumannii №51 (дорожка 6); Ps. aeruginosa №42 беспигментный штамм (дорожка 7); Ps. aeruginosa №3 (дорожка 8); Ps. aeruginosa №2 (дорожка 9); Ps. aeruginosa №1 беспигментный штамм (дорожка 10); Escherichia coli №5 (дорожка 11); Escherichia coli №6 (дорожка 12); Escherichia coli лактозонега-тивная №7 (дорожка 13); Escherichia coli №4 (дорожка 14); Proteus mirabilis №17 (дорожка 15); Proteus mirabilis №16 (дорожка 16).

Данная электрофореграмма показывает, что на дорожках с образцами ДНК различных штаммов Ps. aeruginosa как пигментообразующих (дорожки 8, 9), так и беспигментных (дорожки 7, 10) штаммов, четко выявляется одинаковое свечение в виде трех полос (а, б, в), в то время как на дорожках с образцами других родов и видов бактерий такое свечение отсутствует. Это позволило сделать вывод, что в отличие от других исследованных видов бактерий в данном эксперименте, из культуры Ps. aeruginosa предлагаемым способом выделяются молекулы ДНК различной длины, которые после горизонтального электрофореза легко идентифицируются в ультрафиолетовом свете и дают характерную картину свечения. Использование 1,2% агарозы для электрофореза (вместо 2%) привело к увеличению расстояния между полосами при 15-минутном электрофорезе и получению таким образом более четкой картины свечения, данный признак введен в формулу.

Для оценки размеров молекул ДНК Ps. aeruginosa, выявляемой предлагаемым способом и видимой на электрофореграммах в виде отдельных светящихся в ультрафиолетовом свете полос, был использован стандарт для определения длины двухцепочечных молекул ДНК - ДНК-маркер 1 kb, состоящий из 13 фрагментов ДНК в размерном диапазоне 250-10000 bp, калибровка которого представлена на Фиг.3, дорожка 3. (Производитель ДНК-маркера ООО «Лаборатория МЕДИГЕН», г. Новосибирск).

При сопоставлении полученных нами электрофореграмм образца этого ДНК-маркера (Фиг.3, дорожка 1) и образца ДНК Ps. aeruginosa (Фиг.3, дорожка 2), выделенного предлагаемым способом, со стандартной калибровкой размеров молекул ДНК (Фиг.3, дорожка 3) оказалось, что обнаруживаемые на электрофореграмме три полосы ДНК Ps. aeruginosa (а, б, в; дорожка 2) соответствуют фрагментам стандартного ДНК-маркера размерами 10000 bp, 6000-8000 bp и менее 750 bp (Фиг.3, дорожки 1 и 3), данный признак введен нами в формулу.

Таким образом, предложенный способ позволяет за 1 час идентифицировать как пигментообразующие, так и беспигментные штаммы Ps. aeruginosa, выращенные на плотной питательной среде в течение 16-18 часов, и дифференцировать их от других представителей неферментирующих грамотрицательных бактерий (Acinetobacter spp.) и от наиболее значимых родов и видов семейства Enterobacteriaceae.

Способ осуществляется следующим образом.

Забор и посев клинического материала проводят общепринятыми методами. Полученная бактериальная культура берется с поверхности простой твердой питательной среды (мясопептонный агар, среда Эндо) бактериологической петлей (одна полная петля) и помещается в пластиковую одноразовую пробирку с крышкой и замком, содержащую 300 мкл физиологического раствора. Микробную взвесь встряхивают (можно на вортексе в течение 10-15 сек) и прогревают в твердотельном термостате или водяной бане в течение 20-30 минут при 98-99°С. Если тестирование бактерийной массы откладывается на неопределенное время, пробирки замораживают при -20°С до использования. В дальнейшем содержимое пробирок размораживают, встряхивают и прогревают, как описано выше. После прогревания взвесь центрифугируют при 12000 об/мин в течение 30 секунд, добавляют краситель для электрофоретической детекции (НПО «Литех») в объеме 0,5 мкл на пробу. Забирают около 20 мкл супернатанта, который заливают в лунку размером 4 мм × 1 мм 1,2% агарозного геля, приготовленного в 20 мл ТАЕ-буфера с предварительно добавленными в гель 10 мкл 1% бромистого этидия. Для оценки структуры электрофореграмм ДНК используют стандарт для определения длины двухцепочечных молекул ДНК в интервале 250-10000 bp, используемый при электрофорезе в агарозных гелях, - ДНК-маркер 1 kb, состоящий из 13 фрагментов ДНК в диапазоне 250-10000 bp (OOO «Лаборатория МЕДИГЕН», г. Новосибирск). Стандартную ДНК в количестве 3 мкл заливают в отдельную лунку геля. Проводят горизонтальный электрофорез в течение 15-20 минут, контролируя его длительность визуально по движению полосы красителя, которая должна пройти от лунки 1,5 см. После электрофореза гель помещают на стекло УФ-трансиллюминатора и анализируют результат в проходящем ультрафиолетовом свете с длиной волны 310 нм. На электрофореграммах выявляют свечение ДНК в виде трех горизонтальных полос - рядом с лункой, что соответствует фрагментам ДНК-маркера размером 10000 bp, недалеко от лунки, что соответствует фрагментам ДНК-маркера размером 6000-8000 bp и на конце трека в форме «метелки», что соответствует фрагментам ДНК-маркера размером менее 750 bp. Наличие трех светящихся полос на электрофореграмме свидетельствует о присутствии в исследуемой бактерийной массе Pseudomonas aeruginosa. Отсутствие светящихся полос позволяет выдать отрицательный результат. На идентификацию Ps. aeruginosa в выросшей на агаре бактериальной культуре требуется около 1 часа.

Пример 1. Из раневого отделяемого пациента ожогового отделения ГКБ №1 г. Новокузнецк выделены на кровяном агаре и идентифицированы по культуральным и биохимическим тестам Proteus mirabilis, Escherichia coli, Escherichia coli лактозоотрицательная и Ps. aeruginosa. По 1 петле 18-часовых культур данных возбудителей поместили в отдельные пробирки, содержащие 300 мкл физраствора. Все пробы прогрели при 99°С в течение 30 минут, отцентрифугировали при 12000 об/мин 30 секунд, добавили краситель для электрофоретической детекции. По 20 мкл супернатанта из каждой пробирки залили в лунки размером 4 мм × 1 мм 1,2% агарозного геля, приготовленного в 20 мл ТАЕ-буфера с предварительно добавленными в гель 10 мкл 1% бромистого этидия. После электрофореза в течение 20 минут гель поместили на стекло УФ-трансиллюминатора и проанализировали результат. На электрофореграмме (Фиг.4) видно, что свечение образцов ДНК различных штаммов Ps. aeruginosa (дорожки: 1 - беспигментный клинический штамм Ps. aeruginosa; 2-5 - клинические штаммы Ps. aeruginosa с различными пигментами), выделенной предлагаемым способом, выявляется в виде трех горизонтальных полос - рядом с лункой (а), на некотором расстоянии от лунки (б) и в конце трека (в). ДНК Proteus mirabilis (дорожка 6), Escherichia coli (дорожка 7), Escherichia coli лактозоотрицательная (дорожка 8) светится сходно с ДНК Ps. aeruginosa только на конце трека. Таким образом, образец ДНК только Ps. aeruginosa, выделенной предлагаемым способом, имеет характерное свечение в УФ, состоящее из трех полос - а, б и в.

Пример 2. Больная А., 1961 г.р., обратилась в хирургический кабинет с жалобами на наличие язвы на правой голени после перенесенной буллезной формы рожи. На момент осмотра: лимфедема правой нижней конечности II ст., имеется язва, занимающая переднюю полуокружность правой голени, размеры 20×19 см, глубиной до 1,5 см, с подрытыми краями, без признаков репаративной регенерации и с обильным сецернированием лимфы. На дне язвы плотно фиксированный белый налет. На повязке отделяемое раны приобретает зеленоватый оттенок и имеется характерный сладковатый запах. Диагноз: гигантская лимфедематозная трофическая язва голени. Проведен забор отделяемого раны для микробиологического исследования в бактериологической лаборатории МЛПУ. Выявлена Klebsiella pneumonia. Для уточнения и проверки диагноза нами был произведен бактериологический посев раневого отделяемого больной А. на твердые питательные среды: кровяной агар, желточно-солевой агар и среду Эндо. При последующей стандартной идентификации выросших колоний выделена смешанная культура, состоящая из штаммов синегнойной палочки Ps. aeruginosa с лимонным пигментом и Escherichia coli. Одновременно бактериальная культура, выращенная из раневого отделяемого больной А. на твердой питательной среде, в объеме одной бактериологической петли была помещена в пробирку с 300 мкл физраствора и подвергнута процедуре прогревания, ультрацентрифугирования и электрофореза в 1,2% агарозе, в соответствии с предлагаемым способом. Раствор стандартного ДНК-маркера в количестве 3 мкл заливали в отдельную лунку геля. Результаты представлены на электрофореграмме (Фиг, 5), на которой на следующих дорожках представлены образцы: 1 - ДНК- маркер, 2 - Proteus mirabilis №5, 3 - Escherichia coli (высеяна из раны); 4 - пигментообразующий штамм Ps. aeruginosa (высеяна из раны). Видно, что ДНК на дорожке 4 иллюминирует, образуя три полосы - рядом с лункой (а, соответствует фрагментам ДНК-маркера размером 10000 bp), недалеко от лунки (б, соответствует фрагментам ДНК-маркера размером 6000-8000 bp) и на конце трека (в, соответствует фрагментам ДНК-маркера размером менее 750 bp). Таким образом, идентификация Ps. aeruginosa в материале, взятом из раны больной А, с помощью предлагаемого способа оказалась более достоверной, в сравнении с заключением клинических бактериологов.

Способ идентификации синегнойной палочки Pseudomonas aeruginosa, включающий посев исследуемого материала на твердую питательную среду, инкубирование посева в аэробных условиях при 37°С в течение 16-18 ч, отличающийся тем, что полученную бактериальную массу в количестве одной бактериологической петли помещают в 300 мкл физиологического раствора и прогревают при 98-99°С в течение 20-30 мин, центрифугируют при 12000 об/мин в течение 30 с, в супернатант добавляют краситель для электрофоретической детекции в количестве 0,5 мкл и 20 мкл вносят в лунку размером 4×1 мм 1,2% агарозного геля на ТАЕ-буфере с 10 мкл 1% бромистого этидия, параллельно в контрольную лунку вносят 3 мкл раствора стандартного ДНК-маркера 1 kb, содержащего фрагменты ДНК в диапазоне 250-10000 bp, проводят горизонтальный электрофорез в течение 15-20 мин, и при выявлении на полученной электрофореграмме исследуемой бактериальной массы трех светящихся в ультрафиолетовом свете полос, одна из которых соответствует фрагментам стандартного ДНК-маркера размером 10000 bp, вторая соответствует фрагментам стандартного ДНК-маркера размером 6000-8000 bp и третьей полосы в конце трека в форме «метелки», соответствующей фрагментам стандартного ДНК-маркера размером менее 750 bp, идентифицируют Pseudomonas aeruginosa в исследуемой бактериальной массе.