Средство внутриклеточной доставки биологически активного высокомолекулярного соединения на основе наночастиц и способ его получения


 


Владельцы патента RU 2541121:

Общество с ограниченной ответственностью "НаноФарм-про" (RU)

Изобретение относится к фармацевтической промышленности и представляет собой средство внутриклеточной доставки биологически активного высокомолекулярного соединения, содержащее высокомолекулярное соединение, выбранное из белка сыворотки молока, пептидных фрагментов белка сыворотки молока, белка вируса трансмиссивного гастроэнтерита свиней, термостабильного белка туберкулина, выделенного из микобактерии Mycobacterium bovi, белка M1 вируса гриппа штамма PR8, белка вируса ящура VP1, наночастицы - коллоидный селен, дистиллированную воду, причем компоненты в средстве находятся в определенном соотношении в мас.%. Изобретение обеспечивает создание нетоксичного и эффективного средства внутриклеточной доставки биологически активных веществ. 2 н. и 2 з.п. ф-лы, 1 табл., 6 пр.

 

Изобретение относится к области фармацевтики и медицины, в том числе ветеринарной фармакологии и фармацевтике, и может быть использовано как эффективное средство внутриклеточной доставки лекарственных веществ и биологически активных молекул при лечении заболеваний различного генеза, в том числе - при лечении злокачественных новообразований.

В качестве корпускулярных систем для конъюгирования с биологически активными веществами используются такие структуры, как фуллерены, дендримеры, липосомы, полиакрилатные частицы, мицеллы, коллоидное золото и другие.

Наиболее перспективными разработками в данной области являются липидсодержащие (липосомальные) наносистемы, полимерные наночастицы, коллоидные частицы, а также наноносители из пористого кремния.

Данные транспортные наносистемы несовершенны и имеют ряд недостатков (в частности недостаточная стабильность и высокая сложность технологии производства, и, соответственно, чрезвычайно высокая стоимость), чем и объясняется отсутствие «адресных» лекарств в практической медицине.

В частности, липосомальные наносистемы в большинстве случаев предлагаются в виде растворов, содержащих частицы, составляющие более 100 нм. Липосомы используются в качестве «контейнера» для доставки лекарственных средств к органам мишеням.

Частицы такого размера, как правило, не стабильны и соответственно, не представляется возможным контролировать размер частиц при их формировании. Кроме того, при введении в организм липосомы быстро выводятся из кровотока ретикуло-эндотелиальной системой, что приводит к снижению эффективности препаратов.

Подобные недостатки присущи следующей разработке - «Иммунолипосомальная наносистема адресной доставки к коннексин-43 положительным опухолевым клеткам» (патент РФ 2422154 по кл. МПК A61K 39/00, опуб. 27.02.2011). Система включает биотинилированные моноклональные антитела к экстраклеточному фрагменту коннексина-43 (первый компонент) и ПЭГилированные липосомальные контейнеры диаметром 70-100 нм, ковалентно связанные со стрептавидином (второй компонент). Последовательное введение в живую систему первого и второго компонентов бинарной системы приводит к селективной доставке липосом к Сх-43-положительным клеткам путем специфического связывания биотинилированных антител с экстраклеточным фрагментом Сх-43 на цитолемме глиомных клеток и последующим образованием стрептавидин-биотинового комплекса.

Однако данная наносистема имеет существенный недостаток, связанный с дробным введением препарата, что приводит к повышению дозировки вводимых компонентов и воздействию на иммунную систему как первого, так и второго компонента. Кроме того, существенным недостатком данной системы является низкая стабильность липосом при хранении.

Известна также лекарственная форма доставки водонерастворимых и плохорастворимых лекарственных средств в виде наночастиц и способ получения системы доставки лекарственной формы (см. заявку №2006123043 по кл. МПК A61K 31/00, опуб. 20.01.2008). Способ предусматривает лиофилизацию водонерастворимых и плохорастворимых биологически активных веществ с образованием в результате этого частиц в виде сферических наноразмерных структур. Лиофилизацию осуществляют липосомами, состоящими из липидов, которые образуют при ассоциации векторное окружение вокруг ядра - липосомальную мембрану. Наночастицы имеют размеры от 5 до 1500 нм.

В качестве плохорастворимых и водонерастворимых биологически активных веществ система содержит снотворные, успокаивающие, противосудорожные средства, транквилизаторы, анальгезирующие, противовоспалительные, сердечно-сосудистые, гормональные препараты, витамины, ферментные и стимулирующие метаболические процессы средства, противогрибковые, противоопухолевые, биологически активные пептиды и белки.

Однако существенным недостатком данной системы является низкая стабильность при хранении и невозможность контролировать размер частиц при формировании системы.

Наиболее стабильной является высокодисперсная наносистема, предложенная в 2011 г. НИИ биомедицинской химии имени В.Н. Ореховича (ИБМХ РАМН). Данная система получена на основе соевого фосфолипида и представляет собой систему для транспорта как жирорастворимых (гидрофобных), так и водорастворимых (гидрофильных) биологически активных соединений. Авторами разработки, на основании скрининга лекарственных субстанций разного спектра действия была проанализирована их способность встраивания в фосфолипидную транспортную наносистему, а также проведены предварительные испытания in vitro и in vivo. По результатам указанных тестов в качестве наиболее перспективных для промышленного выпуска были выбраны препараты, содержащие низкокомолекулярные соединения лекарственных веществ доксорубицин (препарат «Доксолип») и индометацин (препарат «Индолип»), снабженные фосфолипидной транспортной наносистемой. Проведены доклинические исследования этих нанолекарств, разработан полный комплект нормативно-технической документации, необходимой для их выпуска, подготовлены документы для подачи в Министерство Здравоохранения РФ для получения разрешения на проведение клинических испытаний.

Предложенная технология позволяет получать нанолекарства в виде лиофилизированного порошка, что увеличивает их срок хранения до 5 лет, предохраняет фосфолипиды от агрегации. Однако технологический процесс, требующий наличия уникального оборудования, весьма сложный и трудоемкий. Он включает в себя получение стабильной наноэмульсии фосфолипидных частиц с включенной лекарственной субстанцией (гомогенизация высокого давления) и последующее лиофильное высушивание получаемых эмульсий. Данный фактор негативно сказывается на себестоимости готовой продукции.

Наноносители из пористого кремния представлены следующими разработками:

- «Способ получения наноразмерной системы доставки лекарственных средств на основе диоксида кремния» (патент РФ №2372890 по кл. МПК A61J 3/00, A61K 47/04, A61K 38/33, опуб. 20.11.2009)

- «Фармпрепараты с наноносителями. Производство фармпрепаратов с наноносителями из пористого кремния» (разработчики - Nanolek Holding Limited (Кипр) и ООО «Нанолек» Россия)

Наиболее близким из них к заявляемому является способ получения наноразмерной системы доставки лекарственных средств на основе диоксида кремния (см. патент РФ №2372890 по кл. МПК A61J 3/00, A61K 47/04, A61K 38/33, опуб. 20.11.2009), а именно - мет-энкефалина на гидрозоле наночастиц SiO2. Способ включает смешивание дистиллированной воды, соляной кислоты и тетраэтоксисилана, добавление приготовленного раствора в NaOH, упаривание и фильтрацию с получением гидрозоля SiO2, ультразвуковую обработку полученного гидрозоля SiO2, добавление мет-энкефалина и раствора ПАВ в количестве 0,5-2% от общего объема полученной системы. Система доставки мет-энкефалина способна преодолеть гематоэнцефалический барьер и доставлять лекарственное средство к клеткам головного мозга. Способ позволяет создать наночастицы с диаметром 6-10 нм. Данный препарат и система его доставки имеют узконаправленное действие - предназначено только для преодоления гематоэнцефалического барьера.

Как следует из описания проекта «Фармпрепараты с наноносителями. Производство фармпрепаратов с наноносителями из пористого кремния» (разработчики - Nanolek Holding Limited (Кипр) и ООО «Нанолек» Россия) - технология адресной доставки наноносителей из пористого кремния предполагает обеспечение пролонгации биологически активного вещества за счет сорбирования его на наночастицах пористого кремния, которые выполняют транспорт активного вещества, обеспечивая постепенное выделение из пор размером около 10 нм. На данном принципе планируется разработка группы твердых лекарственных форм, включающих препараты для лечения сердечно-сосудистых заболеваний, противораковые и противовирусные препараты. Действие уже известных активных веществ в этих препаратах продлевается за счет их сорбирования на наночастицах пористого кремния.

Как следует из описания, данная наносистема не подразумевает адресную доставку, а только пролонгацию действия активных веществ. Кроме того, данная система не рассчитана на перенос высокомолекулярных веществ. Неясным остается вопрос о скорости высвобождения данных веществ из пор наночастиц. Так же сомнительна вероятность дальнейшей утилизации (биодеградации) достаточно крупной кремниевой частицы (более 150 нм), находящейся в кровеносном русле. Не исключается, что данные наночастицы могут оказывать раздражающее действие на иммунную систему, что может привести впоследствии к аллергическим и аутоиммунным заболеваниям.

Следует отметить, что основным недостатком применяемых в настоящее время наночастиц является их высокая токсичность по сравнению с макрочастицами. Они способны проникать в неизмененном виде через клеточные барьеры, через гематоэнцефалический барьер в центральную нервную систему, циркулировать и накапливаться в органах и тканях, вызывая более выраженные патоморфологические поражения внутренних органов (например, образование гранулем в легких, цирроз печени, гломерулонефроз), а также, обладая длительным периодом полувыведения.

Токсичность наночастиц определяется их формой и размерами, при этом мельчайшие наночастицы веретенообразной формы вызывают более разрушительные эффекты в организме, нежели подобные им частицы сферической формы. При воздействии наночастиц на организм отчетливо прослеживается зависимость «доза-эффект». Клинические проявления определяются содержанием того или иного химического элемента в составе каждой конкретной наночастицы, однако при этом наблюдается значительное усиление токсического эффекта.

Кроме этого, наночастицы могут оказывать раздражающее действие на иммунную систему. Поскольку выведение наночастиц из организма происходит длительное время, то постоянная миграция наноструктур по организму в малых количествах может привести к дестабилизации иммунной системы и, в дальнейшем, к аллергическим и аутоиммунным заболеваниям.

Изобретение направлено на решение задачи создания нетоксичного и эффективного средства внутриклеточной доставки биологически активных высокомолекулярных соединений (пептидов, белков, ДНК и др.) и способа его получения за счет способности вводимых наночастиц проникать через клеточную мембрану во внутриклеточное пространство и возможности самодеградации наночастиц в организме.

Для решения поставленной задачи средство внутриклеточной доставки биологически активного высокомолекулярного соединения содержит высокомолекулярное соединение, в качестве наночастиц - коллоидный селен, и дистиллированную воду, при следующем соотношении компонентов, мас.%:

Биологически активное высокомолекулярное соединение 0,001-5,0%
Коллоидный селен 0,0001-1,0%
Дистиллированная вода Остальное

В качестве биологически активного высокомолекулярного природного соединения содержит, в частности - белок сыворотки молока, пептидные фрагменты белка сыворотки молока, белок вируса трансмиссивного гастроэнтерита свиней, термостабильный белок туберкулина выделенного из микобактерии Mycobacterium bovi, белок M1 вируса гриппа штамма PR8, белок вируса ящура VP1.

Способ получения средства внутриклеточной доставки природного высокомолекулярного соединения, согласно изобретению, с использованием в качестве наночастиц коллоидного селена, полученного при смешении раствора селенсодержащего вещества с восстановителем в соотношении 1:4, при этом природное высокомолекулярное соединение используют в виде раствора с концентрацией 10-15 г/л, в раствор природного высокомолекулярного соединения вносят раствор селенсодержащего вещества с восстановителем в течение 30-60 секунд от момента смешивания вещества и восстановителя, добавляют дистиллированную воду до 100% и доводят полученное средство до pH 7,2-7,4, проводят очистку средства путем диализа в течение 24-36 часов при температуре 2-8°C.

Раствор биологически активного вещества с концентрацией 10-15 г/л приготовлена путем добавления к биологически активному веществу буферный раствор.

В качестве селенсодержащего вещества используют селенит натрия, а в качестве восстановителя - гидразин.

Доведение полученного средства до pH 7,2-7,4 осуществляют путем добавления однонормального раствора NaOH.

В известных авторам источниках патентной и научно-технической информации не описано способов получения, в котором в качестве носителя (наноплатформы) используют коллоидный селен, с которым проводится неспецифическое связывание ряда биологически активных молекул (пептиды, белки, ДНК и т.д.).

Известно использование селена в качестве терапевтического средства, т.е. препарата, способного участвовать в окислительно-восстановительных процессах клеток организма (см., например, патенты РФ №2394583, №2426444, сайты http://fitoapteka.com/read/ru; http://www.naturoprof.ru, http://bezvreda.com/selen-v-pitanii/). Селен нормализует обмен протеинов и нуклеиновых кислот; регулирует специфический и неспецифический иммунитет за счет активизации функции нейтрофилов, пролифирации Т-, В-лимфоцитов, генерирование продукции антител, лимфокинов; улучшает адаптацию организма; уменьшает токсичное влияние веществ, солей тяжелых металлов, лекарств, других различных антибиотиков; предотвращает развитие окислительного процесса, свободно-радикальных болезней, в том числе атеросклероза и его осложнений, некрозов печени, панкреатитов, рассеянного склероза, паркинсонизма, других заболеваний.

Общепризнано, что микроэлемент селен (Se) - необходимый нутриент для нормального функционирования организма человека и животных, так как он входит в состав большинства гормонов и ферментов, активно участвуя в обмене веществ. Он выполняет в организме каталитическую, структурную и регуляторную функции; взаимодействует с витаминами, ферментами и биологическими мембранами; участвует в окислительно-восстановительных процессах, клеточном дыхании, обмене жиров, белков и углеводов. Роль селена в организме во многом определяется его включением в состав одного из важнейших ферментов - глутатионпероксидазы, защищающей клетки от продуктов перекисного окисления. Таким образом, селен и его соединения проявляют значительную антиоксидантную активность. Данный элемент входит в состав и других ферментов, участвует в детоксикации ксенобиотиков, регулирует функции щитовидной и поджелудочной желез, проявляет гепатозащитный эффект, стимулирует антитоксическую защиту организма, положительно влияет на систему репродукции, обладает радиопротекторным действием.

Однако применение коллоидного селена в качестве наноносителя для доставки высокомолекулярных биологически активных веществ до настоящего времени неизвестно.

Преимуществом способа получения средства внутриклеточной доставки природных высокомолекулярных соединений является возможность разработать средство, обладающее внутриклеточным проникновением, имеющее в качестве носителя наночастицы коллоидного селена с конъюгированными на нем лекарственными веществами. При этом, биодинамика биологически активных молекул, конъюгированных с коллоидным селеном, происходит лимфогенным путем и в меньшей степени подвергается ферментной деградации и нейтрализации печенью.

Так же определенным преимуществом служит то, что сам коллоидный селен является частью метаболической цепочки организма и способен усваиваться во внутриклеточном пространстве. Тем самым устраняются нежелательные последствия, связанные с «утилизацией» организмом самого носителя.

Сказанное позволяет сделать вывод о наличии в заявляемом изобретении критерия «изобретательский уровень».

Полученное данным способом средство представляет собой прозрачный раствор, цвет которого варьируется от кирпично-красного до оранжевого, слегка опалесцирующий. Средство хранят при температуре от +2 до +20°C в темном месте. Срок хранения - 1 год.

Средство внутриклеточной доставки высокомолекулярных биологически активных веществ готовят следующим образом:

Готовят взвесь биологически активного вещества (например, белка) с концентрацией 10-15 г/л путем добавления буферного раствора (например, 0,01 М фосфатно-солевого буфера).

Отдельно смешивают селенсодержащее вещество (например, селенит натрия) с восстановителем (например, гидразином) в соотношении 1:4, в результате чего происходит восстановление элементарного селена, который не стабилен и очень быстро выпадает в осадок в виде крупных частиц. Для стабилизации селена и, как следствие, получения коллоидного селена в течение 30-60 секунд вносят раствор селенита натрия с гидразином в раствор с природным высокомолекулярным соединением (белком), добавляют дистиллированную воду до достижения объема 100%, доводят полученное средство до pH 7,2-7,4 путем добавления однонормального раствора NaOH, после чего проводят очистку средства путем диализа в течение 24-36 часов при температуре 2-8°C.

Доведение pH 7,2-7,4 обусловлено необходимостью создания стабильной системы, поскольку значения кислотности выше или ниже указанных пределов приведет к разрушению коллоидного раствора.

Кроме этого, данная кислотность необходима для соблюдения соответствия физическим параметрам инъекционных растворов.

Предпочтительный путь введения средства парентеральный. Доза рассчитывается в зависимости от концентрации биологически активного вещества, используемого в системе, из расчета 0,1-7 мг на килограмм массы тела биологического организма.

Выбор граничных значений раствора природного высокомолекулярного соединения (10-15 г/л) обусловлен необходимостью соответствия решаемой задачи. При значениях выше или ниже указанных пределов происходит расслоение получаемого средства, оно становится неоднородным и нарушается его стабильность.

Пример 1

Берут 20 мг лиофилизированного лактоферрина, доводят дистиллированной водой до 2 мл (вместо дистиллированой воды можно использовать буферный раствор, например 0.01 М фосфатно-солевой буфер), получают раствор белка (лактоферрина) с концентрацией 10 г/л.

Готовят раствор лактоферрина с концентрацией не менее 10 г/л.

Отдельно смешивают 0,5 мл 1 М солянокислого гидразина с 0,125 мл 1 М селенита натрия (0,0098 г селена), вносят это в белковый раствор, перемешивают в течение 30-60 мин. (Пропорция селенит натрия-гидразин всегда одинакова для восстановления селена).

Доводят объем полученного раствора до 5 мл.

В полученный раствор по каплям добавляют однонормальный NaOH до достижения pH 7,2, после чего полученную смесь диализуют против 0,01 М фосфатно-солевого буфера (любого другого буферного раствора с pH 7,2-7,4) в течение 24 часов при температуре +4°C.

Итого в данном растворе получают:

Белок - 0,02 г

Коллоидный селен - 0,0098 г

В процентном соотношении от общего объема (5 мл) состав средства будет следующим, мас.%:

Белок - 0,4%

Коллоидный селен - 0,2%

Дистиллированная вода до 100%

Пример 2

Берут 8 мл раствора белка вируса трансмиссивного гастроэнтерита свиней (ТГЭС), измеряют концентрацию белка. Если концентрация белка выше 10 г/л, доводят разбавлением дистиллированной водой (можно использовать буферный раствор) до 10 г/л. При этом, при приготовлении конечного препарата необходимо соблюдать определенную концентрацию вещества для того, чтобы знать его содержание в продукте.

Отдельно смешивают 0,5 мл 1 М солянокислого гидразина с 0,125 мл 1 М селенита натрия (0,0098 г селена), вносят это в белковый раствор в течение 30-60 мин. (Пропорция селенит натрия-гидразин всегда одинакова для восстановления селена).

Доводят объем полученного раствора до 5 мл.

В полученный раствор по каплям добавляют однонормальный NaOH до достижения pH 7,2, после чего полученную смесь диализуют против 0,01 М фосфатно-солевого буфера (любого другого буферного раствора с pH 7,2-7,4) в течение 24 часов при температуре +4°C.

Итого в данном растворе получают:

Белок вируса ТГЭС - 0,04 г

Коллоидный селен - 0,0098 г

В процентном соотношении от общего объема (5 мл) состав средства будет следующим, мас.%:

Белок вируса ТГЭС - 0,8%

Коллоидный селен - 0,2%

Дистиллированная вода до 100%

Пример 3

Берут 8 мл термостабильного белка туберкулина, выделенного из микобактерии Mycobacterium bovi, измеряют концентрацию белка. Если концентрация белка выше 10 г/л, доводят разбавлением дистиллированной водой (можно использовать буферный раствор) до 10 г/л. При этом, при приготовлении конечного препарата необходимо соблюдать определенную концентрацию вещества для того, чтобы знать его содержание в продукте.

Отдельно смешивают 0,5 мл 1 М солянокислого гидразина с 0,125 мл 1 М селенита натрия (0,0098 г селена), вносят это в белковый раствор в течение 30-60 мин. (Пропорция селенит натрия-гидразин всегда одинакова для восстановления селена).

Доводят объем полученного раствора до 5 мл.

В полученный раствор по каплям добавляют однонормальный NaOH до достижения pH 7,2, после чего полученную смесь диализуют против 0,01 М фосфатно-солевого буфера (любого другого буферного раствора с pH 7,2-7,4) в течение 24 часов при температуре +4°C.

Итого в данном растворе получают:

Белок туберкулин - 0,04 г

Коллоидный селен - 0,0098 г

Дистиллированная вода - остальное

В процентном соотношении от общего объема (5 мл) состав средства будет следующим, мас.%:

Белок туберкулин - 0,8%

Коллоидный селен - 0,2%

Дистиллированная вода до 100%

Пример 4

Берут 8 мл антигена, приготовленного из лиофилизированного белка вируса ящура VP1, длина белка которого составляет 25 аминокислот, с последовательностью KYSAGGMGRRGDLEPLAARVAAQLP, брутто-формула - C111H186N36O33S1, молекулярная масса - 2584.96 Da с учетом естественного содержания изотопов, изоэлектрическая точка - pI=10.32). Данный антиген растворяли в 0,01 М фосфатно-солевом буфере pH 7,2 до концентрации 1 г/мл.

Конъюгацию с селеном проводили по следующей схеме: к 1 мл раствора антигена добавляли 25 мкл 1 М раствор солянокислого гидразина и 6,25 мкл 1 М раствора неорганических соединений селена (селенит натрия). Доводили общий объем раствора до 2 мл дистиллированной водой. Останавливали реакцию доведением pH раствора до 7,2 1 М раствором гидроксида натрия (100 мкл). Препарат освобождали от низкомолекулярных соединений диализом против фосфатно-солевого буфера pH 7,2.

Итого в данном растворе получают:

Белок VP1 - 0,004 г

Коллоидный селен - 0,0098 г

В процентном соотношении от общего объема (5 мл) состав средства будет следующим, мас.%:

Белок VP 1-0,08%

Коллоидный селен - 0,2%

Дистиллированная вода до 100%

Пример 5

Берут 8 мл белка M1 белком вируса гриппа штамма PR8. Если концентрация белка выше 10 г/л, доводят разбавлением дистиллированной водой (можно использовать буферный раствор), до 10 г/л. При этом, при приготовлении конечного препарата необходимо соблюдать определенную концентрацию вещества для того, чтобы знать его содержание в продукте.

Отдельно смешивают 0,5 мл 1 М солянокислого гидразина с 0,125 мл 1 М селенита натрия (0,0098 г селена), вносят это в белковый раствор в течение 30-60 мин. (Пропорция селенит натрия-гидразин всегда одинакова для восстановления селена).

Доводят объем полученного раствора до 5 мл.

В полученный раствор по каплям добавляют однонормальный NaOH до достижения pH 7,2, после чего полученную смесь диализуют против 0,01 М фосфатно-солевого буфера (любого другого буферного раствора с pH 7,2-7,4) в течение 24 часов при температуре +4°C.

Итого в данном растворе получают:

Белок M1 - 0,04 г

Коллоидный селен - 0,0098 г

В процентном соотношении от общего объема (5 мл) состав средства будет следующим, мас.%:

Белок M1 - 0,8%

Коллоидный селен - 0,2%

Дистиллированная вода до 100%

Пример 6

Берут 100 мг лиофилизированного лактоферрина, растворяют в 20 мл дистиллированной воды, добавляют 2 мг пепсина и оставляют в термостате при 37°C на 3 часа, в результате чего получают протеолитические фрагменты лактоферрина. Полученный раствор диализуют против 0,01 М фосфатно-солевого буфера (любого другого буферного раствора с pH 7,2-7,4). Определяют концентрацию белка. Если концентрация белка выше 15 г/л, то осуществляют разведение дистиллированной водой (можно использовать буферный раствор) до 15 г/л.

Если концентрация белка во взвеси менее 10 г/л, проводят обезвоживание раствора против полиэтиленгликоля 40000. Затем замеряют концентрацию белка и при необходимости доводят ее до 15 г/л дистиллированной водой (буферным раствором).

Отдельно смешивают 5 мл 1 М солянокислого гидразина с 1,25 мл 1 М селенита натрия (0,098 г селена), вносят это в белковый раствор в течение 30-60 сек. (Пропорция селенит натрия-гидразин всегда одинакова для восстановления селена).

Доводят объем полученного раствора до 100 мл.

В полученный раствор по каплям добавляют однонормальный NaOH до достижения pH 7,2, после чего полученную смесь диализуют против 0,01 М фосфатно-солевого буфера (любого другого буферного раствора с pH 7,2-7,4) в течение 24 часов при температуре +4°C.

Итого в данном растворе получают:

Протеолитические фрагменты лактоферрина - 0,75 г

Коллоидный селен - 0,098 г

В процентном соотношении от общего объема (100 мл) состав средства будет следующим, в масс %:

Протеолитические фрагменты лактоферрина - 0,75%

Коллоидный селен - 0,098%

Дистиллирования вода до 100%

Для определения равномерности и однородности распределения компонентов полученного средства определяли спектр в диапазонах длин волн от 200 до 1000 нм, с шагом 1 нм. Результаты спектрального анализа показали, что препарат имеет достаточно однородную среду поглощения света в диапазоне от 200 до 650 нм. Это указывает на то, что частицы селена равномерно конъюгированы с белком и имеют практически одинаковый размер.

Способы получения данного средства обеспечивают возможность регулирования размеров наночастиц получаемой коллоидной системы.

Размер частиц полученного препарата изучали с использованием электронной микроскопии, результаты которой показали, что средство содержит частицы селена от 60 до 100 нм.

Изучали биодинамику полученных данных способом биологически активных веществ путем оценки проникающей способности коллоидных частиц селена внутрь клетки.

Использовали препарат, полученный в соответствии с примерами 1-3.

Осуществляли маркирование препарата флуоресцентным красителем (ФИТЦ) по методике, описанной, например, в книге: Иммунологические методы / Под редакцией Г. Фримель, Перевод с немецкого А.П. Тарасова. - М.: Медицина, 1987, с.130.

Объектом исследований служили белые мыши массой 20 г.

Все животные были разбиты на группы: первой группе мышей (n=3) препарат, меченный ФИТЦ, вводили внутримышечно в дозе 0,1 мл; второй - внутрибрюшинно в дозе 0,2 мл, третьей - орально в дозе 0,2 мл. Одна мышь была контрольной.

Через 2, 6 и 24 часа постмортально были получены отпечатки печени, почек, селезенки, костного мозга и мазок цельной крови.

Результаты исследований представлены в таблице.

Как видно из таблицы, комплекс коллоидного селена с лактоферрином в организме животных находится внутри структурных элементов, имеющих оболочку, т.е. внутри иммунокомпетентных клеток. При этом, средство чаще всего проникает в клетки селезенки. Препарат достаточно быстро всасывается в желудочно-кишечном тракте.

Однако при оральном введении препарата в клеточные элементы крови он попадает значительно позднее, чем при парентеральном введении. Вместе с этим, при парентеральном введении препарат достигает печени и селезенки позднее, чем при оральном.

Представленные данные свидетельствуют о проникновении препарата в клеточные элементы иммунокомпетентных органов, где и происходит его метаболизация. Отсутствие препарата в межклеточном пространстве указывает на его полную биодеградацию клеточными элементами.

Таким образом, средство не подвергается ферментной деградации и нейтрализации печенью, т.е. оно полностью проникает во внутриклеточное пространство.

Сам коллоидный селен, являясь частью метаболической цепочки организма, усваивается во внутриклеточном пространстве, т.е. в данном изобретении решена задача «утилизации» в организме самого носителя.

Определяли острую токсичность препарата - методом Кербера.

Для этого использовали белых беспородных мышей в количестве 10 голов живой массой 20-25 г.

Препарат (также на основе лактоферрина) вводили мышам внутрибрюшинно в максимально возможной дозе - 0,5 мл. Препарат вводили в течение суток через каждые 3-4 часа.

В течение первых суток за мышами вели тщательное наблюдение, отмечая поведение, потребление пищи, воды, а также общее состояние.

Всего наблюдения вели в течение 2-х недель, гибели мышей не наблюдали. Таким образом, можно констатировать, что препарат относится к группе нетоксичных соединений.

Вышеизложенные эксперименты доказывают, что разработанная композиция по примерам 1-3 обладает низкой токсичностью и высокой биодоступностью.

Кроме того, биодинамика лекарственных веществ и биологически активных молекул, конъюгированных с коллоидным селеном, происходит лимфогенным путем и в меньшей степени подвергается ферментной деградации и нейтрализации печенью, при этом биологически активные высокомолекулярные вещества проявляют свое действие непосредственно в патологическом очаге.

1. Средство внутриклеточной доставки биологически активного высокомолекулярного соединения, содержащее высокомолекулярное соединение, выбранное из белка сыворотки молока, пептидных фрагментов белка сыворотки молока, белка вируса трансмиссивного гастроэнтерита свиней, термостабильного белка туберкулина, выделенного из микобактерии Mycobacterium bovi, белка M1 вируса гриппа штамма PR8, белка вируса ящура VP1, наночастицы - коллоидный селен, дистиллированную воду, при следующем соотношении компонентов, мас.%:

Биологически активное высокомолекулярное соединение 0,001-5,0%
Коллоидный селен 0,0001-1,0%
Дистиллированная вода Остальное

2. Способ получения средства внутриклеточной доставки биологически активного высокомолекулярного соединения по п.1, заключающийся в получении наночастиц, смешивании их с биологически активным высокомолекулярным соединением, выбранным из белка сыворотки молока, пептидных фрагментов белка сыворотки молока, белка вируса трансмиссивного гастроэнтерита свиней, термостабильного белка туберкулина, выделенного из микобактерии Mycobacterium bovi, белка M1 вируса гриппа штамма PR8, белка вируса ящура VP1, где в качестве наночастиц используют коллоидный селен, полученный при смешении раствора селенита натрия с гидразином в соотношении 1:4, биологически активное высокомолекулярное соединение используют в виде раствора с концентрацией 10-15 г/л, в полученную смесь с раствором природного высокомолекулярного соединения вносят раствор селенита натрия с гидразином в течение 30-60 секунд от момента смешивания селенита натрия и гидразина, добавляют дистиллированную воду до 100% и доводят полученное средство до pH 7,2-7,4, проводят очистку средства путем диализа в течение 24-36 часов при температуре 2-8°C.

3. Способ получения средства внутриклеточной доставки биологически активного высокомолекулярного соединения по п.2, отличающийся тем, что раствор природного высокомолекулярного соединения с концентрацией 10-15 г/л готовят путем добавления к высокомолекулярному соединению буферного раствора.

4. Способ получения средства внутриклеточной доставки биологически активного высокомолекулярного соединения по п.2, отличающийся тем, что доведение до pH 7,2-7,4 осуществляют путем добавления однонормального раствора NaOH.



 

Похожие патенты:
Изобретение относится к облегченному резинополимерному материалу для изготовления защитной одежды и способу его изготовления. Заявленный материал включает хлорсульфированный полиэтилен, наполнители (каолин, диоксид титана), антипирен (декабромдифенилоксид), вулканизующие агенты (оксид магния, оксид цинка), ускорители вулканизации (тиурам Д, каптакс), дополнительно содержит флуралит (нанополитетрафторэтилен), нанодобавку «Cloisite 30B», полихлоропрен, хлорпарафин-470, трехокись сурьмы, канифоль, смесь нефраса и этилацетата в соотношении 1:1 и текстильную основу - ткань техническую полиэфирную, или ткань хлопкополиэфирную, или стекловолоконную ткань.

Изобретение относится к пористым высококремнеземистым стеклам. Технический результат изобретения заключается в получении пористых стекол в форме массивных изделий толщиной 0,1÷2 мм с размерами кристаллитов 5÷20 нм.

Изобретение относится к способу получения пористых стекол. Технический результат изобретения заключается в получении пористого стекла с размером пор в интервале от 10 нм до 4 мкм.

Изобретение относится к области нанотехнологий и может быть использовано в медицине, фармацевтике, косметологии. Наночастицы платиновых металлов получают в прозрачной жидкости на водной основе 7 при разрушении мишени 6 из платинового металла или сплава кавитацией, возникающей путем доставки лазерного излучения 2, представленного в виде импульсов сфокусированного излучения лазера на парах меди 1 с величиной энергии импульса 1-5 мДж и длительностью импульса 20 нс, с частотой следования импульсов 10-15 кГц и плотностью мощности 5,7 ГВт/см2, через прозрачное дно кюветы 5 к мишени 6, помещенной в кювету 5 с прозрачной жидкостью на водной основе 7.

Изобретение относится к способу получения биосовместимых высокодисперсных полилактидных частиц для in situ изготовления диагностических средств для позитронно-эмиссионной томографии посредством объединения указанных частиц с раствором, содержащим катионы галлия-68 (III).

Группа изобретений относится к полупроводниковой технике на основе нитридов, а именно к способу формирования темплейта для светоизлучающего устройства, а также к конструкции самого прибора.

Изобретение может быть использовано при изготовлении люминесцентных материалов для лазеров, светодиодов, солнечных батарей и биометок. В реактор загружают 2,5-5% раствор желатина в дистиллированной воде при температуре 20-30°C, нагревают его до 40-90°C и заливают 96%-этанол в количестве 2,5% от объема раствора желатина.
Изобретение относится к области фитопатологии, сельского хозяйства и экологии. Способ включает предпосевную обработку семян пшеницы мягкой диспергированной суспензией.

Микролинза может быть использована в изображающих планарных устройствах, устройствах интегральной оптики, для соединения оптических волноводов, для ввода излучения в фотонно-кристаллические и планарные волноводы и т.д.

Изобретение относится к измерительной технике, представляет собой зонд на основе полевого транзистора с наноразмерным каналом и может быть использовано при определении физико-химических и электрических параметров наноразмерных объектов физической, химической и биологической природы.

Группа изобретений относится к области нанотехнологий, в частности к технологиям получения углеродных наноструктур и наноматериалов для применения в качестве подложек для нанесенных катализаторов, высокопрочных наполнителей, и касается полых углеродных наночастиц, углеродного наноматериала и способа его получения.

Изобретение относится к биотехнологии. Описываются самоорганизующиеся пептидные наночастицы (SAPN), включающие эпитопы Т-клеток и/или эпитопы В-клеток.

Изобретение относится к области нанотехнологий и может быть использовано в медицине, фармацевтике, косметологии. Наночастицы платиновых металлов получают в прозрачной жидкости на водной основе 7 при разрушении мишени 6 из платинового металла или сплава кавитацией, возникающей путем доставки лазерного излучения 2, представленного в виде импульсов сфокусированного излучения лазера на парах меди 1 с величиной энергии импульса 1-5 мДж и длительностью импульса 20 нс, с частотой следования импульсов 10-15 кГц и плотностью мощности 5,7 ГВт/см2, через прозрачное дно кюветы 5 к мишени 6, помещенной в кювету 5 с прозрачной жидкостью на водной основе 7.

Изобретение относится к области нанотехнологии и наноэлектроники. Способ формирования наноразмерной пленки карбида вольфрама включает нанесение на полупроводниковую или диэлектрическую подложку в процессе импульсно-плазменного осаждения на двуканальной установке импульсного осаждения электроэрозионной дуговой плазмы двухслойной структуры покрытия суммарной толщиной 5 нм, состоящей из пленки вольфрама и пленки углерода, и карботермический синтез в вакууме при давлении не выше 5·10-4 Па и температуре не более 450°C не более 10 мин со скоростью нагрева и охлаждения не менее 25 град/мин при соотношении толщин пленок вольфрама и углерода 5:1 и 3,5:1.

Изобретение относится к медицине. Описана композиция для получения антимикробного покрытия, включающая наноразмерные частицы неорганического вещества, активное вещество, связующее и растворитель, при этом в качестве неорганического вещества содержит диоксид кремния, в качестве активного вещества содержит смесь четвертичного аммонийного соединения и хлоргексидина, в качестве растворителя содержит смесь этилцеллозольв и бутилцеллозолв, а в качестве связующего содержит смесь смолы полиметилфенилсилоксановой и сополимера бутилметакрилата и метилметакрилата при следующем соотношении компонентов, масс.%: сополимер бутилметакрилата и метилметакрилата 1,70-10,0, смола полиметилфенилсилоксановая 5,0-20,0, диоксид кремния 0,5-3,0, хлоргексидин (водный 20%) 3,0-8,0, четвертичное аммонийное соединение 0,5-3,0, этилцеллозольв 20,0-50,0, бутилцеллозолв до 100%.

Изобретение относится к технологии получения монолитных интегральных схем на основе полупроводниковых соединении AIIIBV, в частности к созданию сверхвысокочастотных транзисторов, в которых минимизировано содержание драгоценных металлов.

Изобретение относится к области химико-фармацевтической промышленности, в частности к созданию аэрозольной композиции, используемой для введения лекарственных средств с помощью ингаляции.

Изобретение относится к области химико-фармацевтической промышленности, в частности к созданию аэрозольной композиции, используемой для введения лекарственных средств с помощью ингаляции.

Заявленная группа изобретений относится к области биотехнологии. Заявлен биокатализатор для переэтерификации растительных масел, содержащий в качестве ферментативно-активной субстанции частично разрушенные клетки или клеточные лизаты рекомбинантного штамма-продуцента rE.

Изобретение может быть использовано при дуговой сварке и наплавке металлических деталей. На внешней и/или внутренней поверхности металлической оболочки порошковой проволоки выполнено нанокомпозиционное покрытие в виде металлической матрицы с распределенной в ней смесью наноразмерных частиц фторида металла и редкоземельных металлов.
Изобретение относится к медицине, в частности к способу доставки активных субстанций (АС) через эпидермальный барьер. Заявленный способ включает использование трансдермального пластыря матричного типа, содержащего подложку, защитную ленту и полимерный слой, и характеризуется тем, что в полимерный слой трансдермального пластыря вносят 10% ниосом на основе ПЭГ-12 диметикона и затем полимерный слой наносят на подложку.
Наверх