Способ длительного хранения микроводорослей



Способ длительного хранения микроводорослей
Способ длительного хранения микроводорослей
Способ длительного хранения микроводорослей
Способ длительного хранения микроводорослей
Способ длительного хранения микроводорослей

 


Владельцы патента RU 2541452:

Институт биологии южных морей им. А.О. Ковалевского (RU)

Способ длительного хранения микроводорослей относится к прикладной гидробиологии и альгологии. Предназначен для длительного хранения микроводорослей в научных и учебных учреждениях, а также может быть использован в биотехнологической промышленности для хранения штаммов музейных культур.

В способе, состоящем из перевода микроводорослей в состояние ангидробиоза, сохранения микроводорослей в обезвоженном состоянии, выведении из ангидробиоза, дегидратацию микроводорослей проводят на стадии стационарного роста при температуре 30-60°С до остаточной влажности клеток 8-14%. Реактивацию сухих одноклеточных водорослей проводят при освещенности 2 кЛк путем увлажнения питательной средой, разбавленной дистиллированной водой в соотношении 1:1, температура которой составляет 30°С, а через 2 ч к реактивируемым культурам добавляют культуральные среды той же концентрации и температуры. Обезвоженные культуры содержат в герметичной упаковке, без доступа света и при температуре окружающей среды 15-20°С.

Основное преимущество заявляемого способа длительного хранения микроводорослей заключается в простоте и надежности, а также в том, что предлагаемый метод оптимально приближён к естественным условиям, экономически выгоден и даёт возможность рекомендовать его для использования в биотехнологических, научных и учебных целях.

 

Предполагаемое изобретение относится к прикладной гидробиологии и альгологии и предназначено для длительного хранения микроводорослей в научных и учебных учреждениях, а также может быть использовано в биотехнологической промышленности для хранения штаммов музейных культур.

Надёжное сохранение культур микроводорослей и создание банков штаммов является одной из важных задач современной биологии. Практическое значение изобретения связано с возрастающей потребностью науки и биотехнологии постоянно иметь в своём распоряжении жизнеспособные и стабильные культуры, а также с проблемой сохранения биоразнообразия флоры Украины.

В альгологической практике используется широкий спектр методов, позволяющих сохранять микроводоросли в жизнеспособном состоянии. Это содержание микроводорослей на жидких средах длительного хранения [Marsalek В., Rojickova, 1988], агаре, альгинате [Chen Y.С, 2003], при помощи лиофилизации и криосохранения с использованием защитных сред и криопротекторов [Айздайчер Н.Α., Силкин В.Α., 1983]. Однако при использовании этих методов происходит изменение морфологических и функциональных свойств, а также измельчание клеток сохраняемых культур. Кроме того, поддержание культур в жизнеспособном состоянии является трудоёмким процессом и требует дорогостоящего оборудования.

Для сохранения микроорганизмов в течение длительного времени применяют высушивание (обезвоживание) - перевод клеток в состояние ангидробиоза. Ангидробиоз - глубокое и длительное торможение метаболизма, обратимое при благоприятных условиях и достаточно распространённое явление в природе. Применяемые способы длительного сохранения культур путём высушивания должны отвечать двум основным требованиям: во-первых, процесс обезвоживания не должен оказывать вредного воздействия на клетки; во-вторых, обезвоженные клетки должны длительное время сохранять свои биохимические свойства [Колесов С.Г., 1952, 1959]. Клетки различных видов микроорганизмов могут быть высушены на воздухе при комнатной или слегка повышенной температуре в стерильной почве, в кварцевом песке, на гранулированной пемзе, на тальке, на активированном угле, на зернах злаков, на дисках агара, на бумаге, на шерстяных нитках и многих других «носителях» и храниться в течение многих лет в жизнеспособном состоянии [Бекер М.Е. Обезвоживание микробной биомассы и экстрацеллюлярных метаболитов. - Рига: Зинатне, 1967. - С. 74 - 77; Бекер М.Е., Кудрявцев В.И. Лиофилизация бактерий // Методы хранения коллекций культур. - М: Наука, 1967. - С. 119 - 135.; Potts M. Desiccation tolerance of prokaryotes // Microbiol Rev. - 1994. - Vol. 58, №4. - P. 755-805]. Недостатком этих методов является то, что, они разработаны для бактерий и дрожжей. Описаний исследований по ангидробиозу микроводорослей в литературе встречается крайне мало. Единичные сведения об исследовании ангидробиоза у микроводорослей представлены (см. Нестеренко Т.В. Реактивация микроводорослей из состояния сухого анабиоза. // Вопросы управления биосинтезом низших растений. - Новосибирск: Наука, 1982. - 139 с), где рассматривается процесс реактивации клеток. Недостаток метода состоит в том, что при увлажнении клеток хлоридом натрия, с учётом концентрации растворов, которая зависит от степени обезвоживания микроводорослей, происходит потеря клеточного содержимого.

В основу изобретения «Способ длительного хранения микроводорослей» поставлена задача путём выбора условий де- и регидратации, обеспечить оптимальное сохранение жизнеспособности клеток микроводорослей длительное время.

Поставленная задача достигается тем, что в предлагаемом способе, состоящем из перевода микроводорослей в состояние ангидробиоза, сохранения микроводорослей в обезвоженном состоянии, выведении из ангидробиоза, дегидратацию микроводорослей проводят на стадии стационарного роста при температуре 30-60°С до остаточной влажности клеток 8-14%. Реактивацию сухих одноклеточных водорослей проводят при освещенности 2 кЛк путем увлажнения питательной средой, разбавленной дистиллированной водой в соотношении 1:1, температура которой составляет 30°С, а через 2 ч к реактивируемым культурам добавляют культуральные среды той же концентрации и температуры. Обезвоженные культуры содержат в герметичной упаковке, без доступа света и при температуре окружающей среды 15-20°С.

Способ поясняется иллюстрациями. На фиг.1 - Влияние температуры обезвоживания на жизнеспособность клеток микроводоросли; фиг. 2 - Влияние сроков хранения на жизнеспособность микроводоросли в состоянии ангидробиоза; фиг. 3 - Влияние условий реактивации на жизнеспособность реактивируемой культуры (1 -хлорид натрия, 2 - разбавленная среда Заррук (1: 1), 3 - среда Заррук)

В способе обезвоживают клетки микроводорослей, достигшие необходимых качественных характеристик в процессе культивирования. Известно [Далакян Т.А., Волкова Е.Р., Недосекин А.Г., 1984], что, каждая из фаз роста микроводорослей характеризуется ярко выраженной направленностью потока углерода в один из основных блоков метаболизма клеток. В логарифмической фазе синтезируется белок, в фазе замедления скорости роста - углеводы, в стационарной фазе, особенно в конце фазы, накапливаются липиды. Для максимального сохранения жизнеспособности клетки необходимо обезвоживать на стационарной стадии роста, т.к. накопленные углеводы и липиды самые эффективные источники сохранения энергии и играют жизненно важную роль в устойчивости к разным физиологическим стрессам. В предлагаемом способе культивирование микроводорослей проводят в накопительном режиме, при этом клетки находятся в стационарной фазе роста.

Экспериментальные исследования влияния условий обезвоживания клеток на их жизнеспособность, выполненные автором, позволили сделать выбор оптимальной температуры обезвоживания (см. фиг.1) и табл. 1.

Автором экспериментально определен оптимальный диапазон остаточной влажности (8-14%). Изменение остаточной влажности всего на 2% оказывалось критическим для сохранения жизнеспособности клеток в высушенном состоянии.

Разбавление среды водой и её нагревание препятствуют развитию осмотического шока у реактивируемых клеток. Стабилизирующее действие на мембраны при осмотическом шоке оказывают ионы кальция, которые присутствуют в питательных растворах. Определение оптимального режима регидратации осуществили в эксперименте на примере водоросли Spirulina platensis, выращенной на среде Заррук. Использовали три раствора: 1) хлорид натрия 0,25 М, 2) среда Заррук, разбавленная дистиллированной водой в соотношении 1:1, 3) полная среда Заррук (не разбавленная). Результаты представлены в табл. 2

Таблица 1

Наибольший процент жизнеспособных клеток отмечен при увлажнении средой Заррук (1:1), при t=30°C

Результаты исследования влияния условий реактивации на жизнеспособность реактивируемой культуры (см. фиг.3) подтверждают необходимость ее выдерживания в течение 2 ч при освещенности 2 кЛк.

Способ реализуется следующим образом. Культивируемые микроводоросли обезвоживают на стационарной стадии роста в температурном диапазоне 30-60°С до остаточной влажности клеток 8-14%. Дегидрированные культуры помещают в герметичный полиэтиленовый пакет, а затем в пластиковую емкость. Хранят в специальном помещении (боксе) без доступа света и температуре окружающей среды 15-20°С. Для реактивации обезвоженные клетки микроводорослей увлажняют питательной средой для культивирования, разбавленной дистиллированной водой в соотношении 1:1 и подогретой до 30°С.

Пример.

Про- и эукариотические микроводоросли, культивируемые на различных средах (Spirulina platensis - среда Заррук; Synechococcus sp, Phaeodactylum tricornutum, Porphyridium omentum - среда Тренкеншу), обезвоживали на стационарной стадии роста в термостате при температуре 30-60°С до остаточной влажности клеток Spirulina platensis - 9-11%, Synechococcus sp. - 8-11%, Phaeodactylum tricornutum - 12-14%, Porphyridium cruentum - 10-11%. Упаковывали дегидратированные клетки в герметичные полиэтиленовые пакеты, а затем в пластиковые емкости. Хранили в специальном помещении без доступа света и при температуре окружающей среды 15-20°С. По мере необходимости из хранилища изымали образцы микроводорослей. Их навески помещали в чашки Петри и увлажняли средой культивирования (Spirulina platensis - среда Заррук; Synechococcus sp, Phaeodactylum tricornutum, Porphyridium cruentum - среда Тренкеншу), разбавленной дистиллированной водой в соотношении 1:1 и подогретой до 30°С. Чашки Петри с увлажнёнными клетками микроводорослей выставляли на люминостат с освещённостью 2 кЛк. Через 2 часа прибавляли культуральную среду той же концентрации и температуры.

Прокариотические микроводоросли более устойчивы к обезвоживанию по сравнению с эукариотическими. Исходные размеры клеток Synechococcus sp. восстанавливались через 30 мин после начала реактивации, a Spirulina platensis - через 24 часа. У эукариотической микроводоросли Porphyridium cruentum исходные размеры восстанавливались через 10 дней, a Phaeodactylum tricornutum - в течение 1 месяца. Процесс деления после реактивации начинается: у Synechococcus sp. - через 24 часа, у Spirulina platensis - через 2 недели, у Phaeodactylum tricornutum и Porphyridium cruentum - через 1 месяц. Хранение микроводорослей в состоянии ангидробиоза от 0,6 года до 6 лет не приводило к угнетению жизнеспособности клеток (см. фиг.2).

Основное преимущество заявляемого способа длительного хранения микроводорослей заключается в простоте и надежности, а также в том, что предлагаемый метод оптимально приближён к естественным условиям, экономически выгоден и даёт возможность рекомендовать его для использования в биотехнологических, научных и учебных целях.

1. Способ длительного хранения микроводорослей, состоящий из культивирования клеток с использованием сред культивирования, перевода клеток в анабиотическое состояние путем дегидратации и реактивации, включающей увлажнение клеток, отличающийся тем, что дегидратацию микроводорослей проводят на стадии стационарного роста при температуре от 30-60°С до остаточной влажности клеток 8-14%, а реактивацию сухих одноклеточных водорослей проводят при освещенности 2 кЛк путем увлажнения питательной средой, разбавленной в соотношении 1:1 дистиллированной водой, температура которой 30°С.

2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что обезвоженные культуры содержат в герметичной упаковке, без доступа света и при температуре окружающей среды 15-20°С.



 

Похожие патенты:
Изобретение относится к области медицинской микробиологии и касается способа длительного хранения прихотливых бактерий в консервированной крови. Способ включает замораживание в холодильнике при -20˚С культур прихотливых бактерий в консервированной донорской человеческой цельной крови, содержащей гемоконсервант ЦФДА-1.

Группа изобретений относится к биотехнологии, а именно к сухой стекловидной композиции для стабилизации и защиты биологически активного материала в жестких условиях хранения и применения и к способу ее получения.

Изобретение относится к области биотехнологии и касается способа получения препарата на основе вакцинного штамма чумного микроба. Представленное изобретение предусматривает изготовление посевной нативной культуры чумного микроба, концентрирование микробной суспензии, приготовление вакцинной взвеси и получение сухой формы препарата, при этом приготовление посевной культуры включает культивирование микробов в жидкой питательной среде в бутылях в течение 48 ч при температуре 26…28˚С и непрерывной аэрации не менее 10 л·мин-1 пассированной стабилизированной стартовой культурой, полученной в результате трех последовательных пассажей через организм морских свинок и смешанной в соотношении 2:1 со стабилизирующей глицерино-лактозо-полиглюкиновой жидкостью, при приготовлении вакцинной взвеси используют оптимизированную по компонентному составу защитную среду высушивания, а лиофилизацию проводят соблюдая определенный режим.
Изобретение относится к биотехнологии, в частности к способам криоконсервации клеток фототрофных микроорганизмов. Способ предусматривает суспензирование биомассы клеток до концентрации 15-30 мас.% в растворе поливинилового спирта с концентрацией 6-9 мас.%, приготовленном на питательной среде, специфичной для выращивания конкретного фототрофного микроорганизма, замораживание и хранение аликвот полученной суспензии объемом 0,1-0,5 см3 при -80÷-70°C.

Изобретение относится к биохимии. Создают микробный консорциум из штаммов дрожжей Pichia anomala 9a или Pichia anomala P1 и штамма лактобактерий Lactobacillus acidophilus La5, в соотношении 1:0,8 соответственно.

Группа изобретений относится к области медицины и предназначена для получения клеток культур Lactobacillus reuteri, содержащих реутерин, сохраняемый внутри клеток. Способ включает ферментацию указанных клеточных культур, добавление 1,2-пропандиола или глицерина к реутерин-продуцирующим системам клеток Lactobacillus reuteri в начале ферментации, добавление глицерина к клеточным культурам Lactobacillus reuteri во время получения и сохранение клеток Lactobacillus reuteri.
Изобретение относится к микробиологии, в частности к консервированию молочнокислых бактерий Lactobacillus delbrueckii. .

Изобретение относится к области биотехнологии. .

Изобретение относится к области биологии и медицины, в частности к витрификации гамет и эмбрионов. .
Изобретение относится к медицине и фармацевтической промышленности и касается способа получения сухих биологически активных материалов сорбционно-контактным обезвоживанием.

Изобретение относится к продуктам здорового питания. Предложены гранулы пробиотиков, содержащие ядро, включающее пробиотические микроорганизмы и субстрат, в котором абсорбированы указанные микроорганизмы и по меньшей мере три слоя, включающих внутренний масляный слой, покрывающий указанное ядро, и первый внешний слой и второй внешний слой. При этом указанный первый внешний слой представляет собой слой энтеросолюбильного покрытия, содержащий pH-чувствительный полимер, выбранный из группы, включающей альгиновую кислоту, альгинат аммония, альгинат натрия, калия, магния или кальция. Указанный второй внешний слой представляет собой слой внешнего теплостойкого покрытия. Предложены способы изготовления гранул, а также пищевой продукт, содержащий вышеуказанные гранулы. Изобретение позволяет получить пробиотические гранулы, адаптированные выдерживать высокие температуры выпечки при тепловой обработке пищевых продуктов. 4 н. и 7 з.п. ф-лы, 1 ил., 5 табл., 13 пр.

Изобретение относится к области биотехнологии. Предложено применение соли угольной кислоты в качестве стабилизатора цвета в бактериальной композиции, содержащей бактериальные клетки, относящиеся к роду Bifidobacterium, и аскорбат. Изобретение позволяет снизить красное окрашивание в бактериальной композиции, содержащей клетки Bifidobacterium и аскорбат. 1 з.п. ф-лы, 2 ил., 2 пр.

Группа изобретений относится к стабильной сухой композиции, способу ее изготовления. Композиция содержит биоактивный микроорганизм или материал, два стабилизирующих агента - альгинат натрия и инулин, и два защитных агента - дисахарид и белковый гидролизат. При этом биоактивный микроорганизм или материал заключен в аморфную стекловидную матрицу. Композиция используется при кормлении животного биоактивным микроорганизмом или материалом при условии того, что биоактивный организм или материал не является гербицидом. Способ изготовления композиции включает объединение компонентов в водном растворителе, охлаждение полученной смеси до температуры выше ее температуры замерзания, осуществление первичной сушки охлажденной смеси в вакууме при температуре выше ее температуры замерзания и вторичной сушки смеси при температуре 20°C или выше в течение периода времени, достаточного для снижения активности воды Aw в смеси до 0,3 или менее. Предложена также композиция для изготовления стабильной сухой композиции, имеющая вязкость от около 10 Па·с до около 450 Па·с. Группа изобретений обеспечивает стабильность композиции при повышенной температуре и высокой влажности. 5 н. и 28 з.п. ф-лы, 11 ил, 21 пр., 4 табл.

Изобретение относится к пищевой промышленности. Описаны продукты, например продукты в виде напитка, содержащие по меньшей мере одну водную жидкость и капсулы, содержащие желатинированную смесь альгината и денатурированного белка и пробиотические бактерии, захваченные в этой желатинированной смеси. Также представлены способы приготовления таких инкапсулированных пробиотиков обеспечением смеси, содержащей альгинат натрия, денатурированный белок и активные пробиотические клетки, и объединением этой смеси с двухвалентным катионом для инициации холодного желатинирования альгината натрия и денатурированного белка для образования второй смеси, которую пропускают через отверстие, имеющее диаметр менее 1000 мкм, при этом отношение белка к альгинату равно от 1:1 до 9:1. Изобретение позволяет предотвратить разрушение пробиотических бактерий во время обработки и хранения и деградации желудочной кислотой, протеолитическими ферментами и солями желчных кислот перед выделением в ободочную кишку. 7 н. и 37 з.п. ф-лы, 15 ил., 5 табл., 9 пр.

Изобретение относится к способу контроля бактериального заражения (микробной контаминации) в процессе дрожжегенерации и хранения дрожжей при производстве спирта, пива, кваса, хлебобулочных изделий, хлебопекарных и кормовых дрожжей. Способ предусматривает на стадии культивирования S. cerevisiae внесение в суспензию коллоидного раствора наночастиц серебра, стабилизированных гуараном до концентрации частиц в среде 0,001-0,002 г/дм3. После накопления достаточного количества биомассы дрожжи подают в бродильное отделение, где происходит сбраживание крахмалсодержащего сырья. При необходимости очистки инфицированных дрожжей для повторного использования в дрожжевую суспензию вносят препарат наносеребра до концентрации частиц в среде 0,003-0,004 г/дм3. Причем обработку проводят в течение 3-6 часов при температуре 5-15°C, а обработанные дрожжи можно повторно вводить в технологический процесс. Изобретение позволяет предотвратить развитие бактериальных инфекций дрожжей S. сerevisiae в процессе культивирования и сбраживания сырья при получении продукции на основе этилового спирта. 2 з.п. ф-лы, 3 табл., 2 пр.
Наверх