Способ получения полимерной агарозы из экстракта морских водорослей

Настоящее изобретение относится к получению полисахаридов. Способ предусматривает центрифугирование подвергнутого щелочной обработке экстракта морских водорослей температурой 70-80°C при 10000-14000 об/мин в течение 5-15 минут. Смешивают горячий экстракт с 2-5% поверхностно-активных веществ при температуре в диапазоне 60-100°C при непрерывном перемешивании и обеспечивают выстаивание в течение 1-10 часов при температуре в диапазоне 25-35°C для осаждения твердой массы агарозы. Декантируют жидкий супернатант и промывают упомянутую массу водой для удаления остаточных поверхностно-активных веществ в твердом веществе. Повторно растворяют полученную влажную массу в минимальном количестве воды в диапазоне от 7 до 10% (масс./масс.) в расчете на массу агарозного продукта и обрабатывают минимальным количеством изопропанола. Соотношение между количествами золя агарозы и изопропанола находится в диапазоне от 1:0,5 до 1:1,5 (масс./масс.) для осаждения агарозы. Далее выделяют твердый продукт и высушивают в подходящей сушилке для получения порошкообразной агарозы. Полученный порошок агарозы соответствует номеру сита по американскому стандарту в диапазоне от 200 до 300. Использующиеся морские водоросли выбирают из видов Gracilaria и Gelidiella, предпочтительно из видов Gracilaria dura и Gelidiella acerosa, из вод Индийского океана, которые получали на морских побережьях Гуджарата и Тамилнада. Указанное поверхностно-активное вещество является неионным поверхностно-активным веществом. Его выбирают из коммерчески доступных октилфенолэтоксилата (Triton Х-100) и нонилфенолэтоксилата (Synperonic 91/6). Причем указанное поверхностно-активное вещество индуцирует флоккулирование только при уровне содержания сульфата у агарозы <0,82% (масс./масс.), предпочтительно <0,5% (масс./масс.), а еще более предпочтительно <0,25%. Изобретение позволяет получить агарозу высокого качества и снизить энергоемкость и трудоемкость способа. 6 з.п. ф-лы, 3 ил., 5 табл., 28 пр.

 

Область техники

Изобретение относится к улучшенному способу выделения агарозы из экстракта видов Gracilaria и Gelidiella, а говоря более конкретно, экстрактов морских водорослей Gracilaria dura и Gelidiella acerosa из вод Индийского океана, которые получали на морских побережьях Гуджарата и Тамилнада.

Уровень техники

Ссылка может быть сделана на публикацию авторов Selby и Wynne (in R.L. Whistler (ed.): Polysaccharides and Their Derivatives, 2nd ed., Academic Press, New York 1973, pp. 29-48), где утверждалось то, что большинство коммерческих агаров получали в результате горячего водного экстрагирования. Возможными являются и другие способы, такие как экстрагирование глицерином, безводным аммиаком или другими растворителями, но больше всего рекомендуется традиционный способ, использующий горячую воду (www.marinalg.org). Методики экстрагирования агара варьируются в соответствии с подвергаемым обработке ассортиментом морских водорослей. В общем случае они соответствуют проведению трех стадий в виде (1) экстрагирования, (2) очистки, (3) обезвоживания, как это описывается ниже: сначала морские водоросли тщательно промывают водой для исключения морской соли и инородного материала, такого как песок. Экстрагирование проводят горячей водой под давлением или в открытом резервуаре при проведении щелочной обработки морских водорослей. Данный последний способ в основном реализуют для морских водорослей Gracilaria в целях уменьшения уровня содержания сульфата у получающегося в результате агара. Проэкстрагированный сок, образованный из 99% воды и 1% агара, отфильтровывают в горячих условиях, а после этого охлаждают до комнатной температуры. Получающийся в результате гель обезвоживают в результате приложения механического давления или проведения замораживания-оттаивания. При обезвоживании под давлением для продавливания геля через интеркалированные фильтры прикладывают давление 49-98 н/см². Вода проходит через фильтры, а молекулы агара задерживаются в виде осадка на фильтре. Замораживание геля проводят при -18°C. При данной температуре молекулы агара селективно исключаются из сетки льда и образуют полоски. Стадия оттаивания расплавляет лед и полоски агара селективно извлекают. Данные две операции обезвоживания, взятые индивидуально, удаляют приблизительно 70% от первоначального уровня содержания воды. После этого часть остаточной влаги исключают в результате высушивания горячим воздухом. Чешуйки сухого агара размалывают для получения конечного продукта в порошкообразной форме, соответствующей различным номерам сита по американскому стандарту.

Ссылка может быть сделана на патент авторов Lebbar Thami, Lebbar Rachid и Riad Abdelwahab (патент США 5496936), где описывается переработка агар-агара, агар-агар экстрагировали из морских водорослей на стадии экстрагирования, а после этого обезвоживали на стадии обезвоживания для получения гелеобразного или порошкообразного агар-агара, где обезвоживание проводили в результате замораживания-оттаивания или механического прессования или в результате перепускания через одночервячный или двухчервячный экструдер. Данному способу свойственен недостаток, заключающийся в использовании энергоемкого способа замораживания-оттаивания или в противном случае обременительных способов механического прессования, требующих использования усложненного аппаратного обеспечения.

Ссылка может быть сделана на патент авторов D. Du, Z. Zhuang и С. Zhuang (CN 1587284-A, March 2, 2005; CN 1296390-C, January 24, 2007), где агар получали в соответствии со «способом получения, включающим вымачивание, нейтрализацию, отбеливание и экстрагирование желатина. Материал вымачивают в щелочном растворе низкой концентрации при высокой температуре в условиях повышенного давления и в результате последующих фильтрования, водного промывания, регулирования значения рН кислотой, отбеливания гипохлоритом натрия, добавления вспомогательного вещества, кипячения для экстрагирования желатина, фильтрования под давлением для обезвоживания и высушивания получают агар». Недостаток данного способа заключается в том, что в нем используют «фильтрование под давлением для обезвоживания и высушивания агара», что требует использования усложненного аппаратного обеспечения.

Ссылка может быть сделана на публикацию Sigma Catalog (2006-2007; pages 269-270), где утверждается то, что «Агароза представляет собой очищенный линейный галактановый гидроколлоид, выделенный из агара или агарсодержащих морских водорослей. Агароза образует гелеобразную матрицу, которая является почти что идеальной для диффундирования и электрокинетических перемещений биополимеров. Поэтому она является подходящей для электрофореза, иммуноэлектрофореза и имунодиффузии». Кроме того, как упоминается в данной публикации, различные марки агароз характеризуются уровнем содержания сульфата в диапазоне от 0,10 до 0,35%, что является подходящим для использования в молекулярной биологии, электрофорезе белков и культивировании клеток.

Ссылка может быть сделана на несколько отчетов, где утверждается то, что агароза представляет собой очищенный линейный галактановый гидроколлоид, выделенный из агара или извлеченный непосредственно из агарсодержащих морских водорослей, таких как красные водоросли. Роды, из которых экстрагируют агарозу, включают Gelidium, Gracilaria, Acanthopeltis, Ceramium, Pterocladia и Campylaephora. Как сообщал автор Grabar (1957), агар экстрагируют из красных водорослей в результате кипячения в воде, а после этого выделяют в результате отфильтровывания частиц, гелеобразования и замораживания-оттаивания коллоида для удаления растворимых в воде примесей и осаждения этанолом (Methods Biochem. Anal. 7 (1957) 1-38). Получающийся в результате продукт представляет собой смесь полисахаридов, которые представляют собой чередующиеся сополимеры 1,4-соединенной 3,6-ангидро-α-L-галактозы и 1,3-соединенной β-D-галактозы. Повторяющийся дисахарид называют агаробиозой (Araki, Proceedings 5th International Seaweed Symposium. Halifax, 1965, pp. 3-17). Само собой разумеется то, что это идеализированная структура, поскольку даже очищенная агароза содержит ощутимые количества следующих далее заместителей: сульфатные, пируватные и метоксильные группы. Сульфат в общем случае образует сложноэфирную связь с гидроксилом в положении С-4 β-D-галактопиранозы и в положениях С-2 и С-6 3,6-ангидро-α-L-галактозы. Пируват соединяется в положениях как С-4, так и С-6 некоторых остатков β-D-галактопиранозы. Получающееся в результате соединение авторами Duckworth и Yaphe (Carbohydr. Res. 16, 1971, 189-197) называется 4,6-O-карбоксиэтилиденом.

Ссылка может быть сделана на публикацию «Isolation of partially purified agarose with a quaternary base» авторов Craigie и Leigh (in Handbook of Phycological Methods, edited by J.A. Hellebust and J.S. Craigie, Cambridge University Press, Cambridge, 1978; pp. 126), где 250 мг сырого агара растворяли в 100 мл кипящей дистиллированной воды. Добавляли 25 мг лямбда-каррагенана и в раствор при 80-100°C добавляли 10 мл 2%-ного реагента Cetavlon (хлорида цетилпиридиния). Горячий экстракт отфильтровывали на целите и отфильтровывали под давлением через мембрану (0,8 микрона) с последующими замораживанием и оттаиванием продукта для получения частично очищенной агарозы, но недостаток данного способа заключается в отделении полимерной агарозы от горячего экстракта по способу замораживания-оттаивания, который является энергоемким.

Ссылка может быть сделана на страницу в интернете www.ncbi.nlm.nih.gov Национального центра биологической информации (НЦБИ), США, где морские водоросли Gracilaria dura из вод Индийского океана, которые использовали в настоящем изобретении, имеют номер доступа генетического банка DQ399795 для гена рибосомальной РНК 18S.

Ссылка может быть сделана на публикации авторов Siddhanta, А.K., et al. (РСТ 2005/118830; US 20050267296 A1), где охватывается предшествующий уровень техники получения агара и агарозы по различным способам. Изобретатели дополнительно описывают улучшенный способ получения агарозы, характеризующейся высокой прочностью геля и низкой температурой гелеобразования, из вида Gracilaria dura, при этом упомянутый способ включает стадии предварительной обработки сухих морских водорослей щелочью; прополаскивания подвергнутых предварительной обработке морских водорослей вплоть до демонстрации промывными водами значения рН в диапазоне от 7 до 8; добавления воды и автоклавирования для получения экстракта; обработки горячего экстракта древесным углем и целитом для получения горячего экстракта; вакуумного фильтрования горячего экстракта на слое целлита; замораживания фильтрата для получения массы и оттаивания массы; повторного растворения массы в воде в результате нагревания в автоклаве, повторения цикла замораживания-оттаивания, растяжения продукта для удаления оттаянной жидкости, а после этого сжатия для вытеснения остаточной жидкости в степени, возможной для получения агарозы, и его агарозу, недостаток данного способа заключается в охлаждении горячего экстракта до менее чем -15°C в течение 15 часов, что является очень времязатратным и энергоемким вариантом. Кроме того, повторение цикла замораживания-оттаивания в данном способе делает его более восприимчивым к затратам.

Ссылка также может быть сделана на статью авторов Meena, et al. {Carbohydrate Polymers 69: 179-188, 2007), где характеризовали ту же самую агарозу и ее эксплуатационные характеристики сопоставляли с тем, что имеет место в случае коммерчески доступной агарозы.

Ссылка может быть сделана на публикацию «Purification of agar», Kiyoshi Arai et al. (JP 7017,130, January 13, 1970; Chemical Abstr. 74, 32889r, 1971), где сообщается об экстрагировании сырого агара диметилформамидом (ДМФА) для отделения высокочистой агарозы. 10 г агара смешивали с 500 мл ДМФА при перемешивании, погружали на 10 часов в горячую воду, центрифугировали, супернатант выливали в 2 литра ацетона, а осадки перепускали через стеклянный фильтр, промывали при использовании 500 мл ацетона, растворяли в горячей воде и отфильтровывали для получения порошкообразной агарозы.

Ссылка может быть сделана на публикацию «Agarose purification method using glycol», R.B. Provonchee (US 4,990,611, February 1991), где очищенную агарозу извлекали из агара или загрязненной агарозы в результате растворения при повышенной температуре агара или агарозы в низшем алкиленгликоле, где в гликоле растворяли достаточные количества агара или агарозы для получения гликолевого раствора, содержащего, по меньшей мере, приблизительно 0,1% (масс.) агара или агарозы, охлаждения гликолевого раствора, содержащего агар или агарозу, для индуцирования осаждения очищенного агарозного продукта и извлечения осажденного агарозного продукта.

Ссылка также может быть сделана на патент США №4983268, Kirkpatrick et al., в котором описывается получение очищенной агарозы, подходящей для быстрого электрофореза и характеризующейся уровнем содержания сульфата, меньшим чем 0,2% (масс.), и прочностью геля, равной, по меньшей мере, 1200 г/см² (1%). Агарозу очищают в результате растворения агарозы или агара, модифицированного щелочью, в водной среде, забуферированной при значении рН в диапазоне от 6,0 до 8,0 и содержащей не более чем 2,0 нмоль/л соли в виде хлорида, и осаждения агарозы в результате введения в контакт с низшим алканолом следующим далее образом: «Агарозу еще раз отфильтровывали, после этого повторно суспендировали в воде до совокупной массы 1000 г и растворяли в результате кипячения, таким образом получая 2%-ный раствор. Его охлаждали до 74°C и перемешивали с двумя литрами азеотропного изопропилового спирта (ИПС) (87,7% (масс.) ИПС)».

Ссылка также может быть сделана на работу автора Alfred Polson (Chemical Abstract 65: p5865a; 1965), где для получения агарозы описывали фракционирование смеси агарозы и агаропектина. Смесь подвергают обработке водным раствором полиэтиленгликоля, имеющего молекулярную массу 300, получая осадок, обогащенный агарозой. В данном способе 80 г реагента Ion agar No. 2 растворяли в 2 литрах воды. К горячему раствору (80°C) добавляли 2 литра раствора полиэтиленгликоля, имеющего молекулярную массу 6000, с концентрацией 40% (масс./об.), а получающийся в результате осадок отделяли в результате фильтрования через найлоновую ткань, соответствующую номеру сита по американскому стандарту 110. После этого осадок промывали при 40°C в течение 2-3 минут, суспендировали в воде при 15°C, перемешивали в течение ночи в 5 литрах воды, собирали на найлоновой сетке, промывали ацетоном и высушивали в теплом воздухе.

Ссылка может быть сделана на статью авторов Prasad et al. (Int. J. Biol. Macromol. 35, 135-144, 2005), где согласно сообщению ионные и неионные поверхностно-активные вещества различным образом модифицируют реологические и термические свойства золя и геля агара. В статье также описываются и другие варианты предшествующего уровня техники, где используют поверхностно-активные вещества.

Вследствие использования больших количеств нескольких органических растворителей на вышеупомянутом предшествующем уровне техники сохраняется проблема энергоемкости выделения агара из экстракта морских водорослей. Однако не в вышеупомянутой статье, не в любых других источниках предшествующего уровня техники не описывается использование поверхностно-активных веществ для осаждения агарозы из водного экстракта морских водорослей в условиях окружающей среды без использования какого-либо органического растворителя, что является основной целью настоящего изобретения.

Как с очевидностью следует из предшествующего уровня техники, агар/агарозу выделяют из водного экстракта морских водорослей по способу замораживания-оттаивания, а в других случаях в результате синерезиса под давлением. Продукты впоследствии очищают в результате осаждения из растворителя или хроматографического фракционирования. Способы, которым следовали для выделения продукта из экстракта, поэтому являются высокоэнергоемкими или требуют использования усложненного аппаратного обеспечения, и желательно выявить улучшенный способ выделения продукта из экстракта.

Цели изобретения

Основная цель настоящего изобретения заключается в разработке улучшенного способа выделения агарозы из разбавленных водных экстрактов морских водорослей, который обходится без потребности прибегать к замораживанию-оттаиванию или механическому прессованию или добавлению больших количеств растворителя в экстракт.

Еще одна цель настоящего изобретения заключается в индуцировании коагулирования агарозы из водного экстракта при использовании неионных поверхностно-активных веществ в качестве коагулянтов.

Еще одна цель настоящего изобретения заключается в демонстрации особенной эффективности способа коагулирования в случае агарозы, которая обычно содержит ≤0,3% (масс./масс.) сульфата.

Еще одна цель настоящего изобретения заключается в использовании экстрактов видов Gracilaria dura и Gelidiella acerosa для вышеупомянутой цели.

Еще одна цель настоящего изобретения заключается в обработке морских водорослей щелочью для уменьшения уровня содержания сульфата у агара/агарозы и придания им способности поддаваться коагулированию по способу настоящего изобретения помимо увеличения прочности их геля, как это описывалось на предшествующем уровне техники.

Еще одна цель заключается в центрифугировании горячего экстракта для удаления всего суспендированного вещества до добавления поверхностно-активного вещества.

Еще одна цель настоящего изобретения заключается в удалении остаточного поверхностно-активного вещества в коагулированной агарозе просто в результате промывания продукта водой.

Еще одна цель заключается в придании агарозе легкой диспергируемости.

Еще одна цель заключается в достижении такой легкой диспергируемости в результате повторного растворения продукта в горячей воде до концентрации, доходящей вплоть до 7% (масс./об.), и проведения обработки раствора изопропиловым спиртом для получения желательного продукта при минимальном использовании растворителя.

Еще одна цель заключается в отправлении на рецикл и повторном использовании растворителя и поверхностно-активного вещества.

Еще одна цель заключается в демонстрации подобия агарозы настоящего изобретения агарозе, полученной по способу предшествующего уровня техники.

Краткое изложение изобретения

Настоящее изобретение относится к улучшенному способу получения агарозы из разбавленных экстрактов морских водорослей, полученных из видов Gracilaria и Gelidiella. Морские водоросли подвергают (i) щелочной обработке для уменьшения уровня содержания сульфата, (ii) промыванию водой для удаления щелочи, а после этого (iii) варке в воде для получения разбавленного экстракта. Затем материал подвергают (iv) гомогенизации и (v) центрифугированию в горячем состоянии для получения прозрачного экстракта морских водорослей, свободного от нерастворимых примесей. После этого горячий экстракт подвергают (vi) обработке растворимым в воде неионным поверхностно-активным веществом при интенсивном перемешивании и (vii) содержимое оставляют выстаиваться для охлаждения до комнатной температуры, после чего осаждается агароза, которую после этого (viii) отделяют в результате центрифугирования и (ix) промывают водой для удаления пристающего поверхностно-активного вещества. Затем (х) влажную массу агарозы повторно диспергируют в горячем состоянии в минимальном объеме воды и (xi) подвергают обработке равным объемом изопропилового спирта для обезвоживания массы агарозы, которая после (xii) фильтрования и высушивания позволяет получить рафинированный и легко диспергируемый продукт, подходящий для гель-электрофореза ДНК.

В соответствии с этим настоящее изобретение предлагает улучшенный способ очистки агарозы из водного экстракта морских водорослей при использовании поверхностно-активных веществ, при этом упомянутый способ включает стадии:

(a) центрифугирования подвергнутого щелочной обработке горячего экстракта морских водорослей (70-80°C) при 10000-14000 об/мин в течение 5-15 минут;

(b) смешивания горячего экстракта морских водорослей, полученного на стадии (а), с 2-5%-ми поверхностно-активных веществ при температуре в диапазоне 60-100°C при непрерывном перемешивании;

(c) обеспечения выстаивания содержимого, полученного на стадии (b), в течение 1-10 часов при температуре в диапазоне 25-35°C для осаждения твердой массы агарозы;

(d) декантирования жидкого супернатанта и промывания упомянутой массы водой для удаления остаточных поверхностно-активных веществ в твердом веществе;

(e) повторного растворения влажной массы, полученной на стадии (d), в минимальном количестве воды в диапазоне от 7 до 10% (масс./масс.) в расчете на массу агарозного продукта и обработки минимальным количеством изопропанола, где соотношение между количествами золя агарозы и изопропанола находится в диапазоне от 1:0,5 до 1:1,5 (масс./масс.), для осаждения агарозы;

(f) выделения твердого продукта и высушивания в подходящей сушилке для получения порошкообразной агарозы, соответствующей номеру сита по американскому стандарту в диапазоне от 200 до 300.

Краткое описание фигур

На фигуре 1.1 показан гель-электрофорез ДНК для продукта, амплифицированного по способу ПЦР, на образцах геля агарозы из вида Gracilaria dura. Образец геля агарозы настоящего изобретения указан на фигуре 1.1а, в то время как образцы геля агарозы предшествующих изобретений (РСТ 2005/118830; US 2005/0267296 A1) продемонстрированы при помощи фигуры 1.1b. Фигуры а и b состоят из подобных дорожек, они представляют собой:

Дорожка 1: лесенка в 1 т.п.н.

Дорожка 2, 3: продукт ПЦР в 1,2 т.п.н.

Дорожка 4, 5: продукт ПЦР в 1,4 т.п.н.

На фигуре 1.2 показан гель-электрофорез для ДНК, элюированной из гелей фигуры 1.1, на образцах геля агарозы из вида Gracilaria dura. Образец геля агарозы настоящего изобретения представлен на фигуре 1.2а, в то время как образцы геля агарозы предшествующих изобретений (РСТ 2005/118830; US 2005/0267296 A1) указаны на фигуре 1.2b. Фигуры а и b состоят из подобных дорожек, они представляют собой:

Дорожка 1: лесенка в 100 п.о.

Дорожка 2: элюированный продукт в 1,2 т.п.н. из геля (1.1b).

Дорожка 3: элюированный продукт в 1,4 т.п.н. из геля (1.1b).

Дорожка 4: элюированный продукт в 1,2 т.п.н. из геля (1.1а).

Дорожка 5: элюированный продукт в 1,4 т.п.н. из геля (1.1а).

На фигуре 1.3 показан гель-электрофорез для продукта, амплифицированного ПЦР, при использовании элюированного продукта в качестве матрицы (полученного с фигуры 1.1) на образцах геля агарозы из вида Gracilaria dura. Образец геля агарозы настоящего изобретения продемонстрирован на фигуре 1.3а, в то время как образцы геля агарозы предшествующих изобретений (РСТ 2005/118830; US 2005/0267296 A1) указаны на фигуре 1.3b. Фигуры а и b состоят из подобных дорожек, они представляют собой:

Дорожка 1: лесенка в 1 т.п.н.

Дорожка 2: негативный контроль.

Дорожка 3, 4: продукт ПЦР в 1,0 т.п.н. из элюированного продукта из геля (1.1b) и (1.1а).

Дорожка 5: негативный продукт.

Дорожка 6, 7: продукт ПЦР в 1,4 т.п.н. из элюированного продукта из геля (1.1b) и (1.1а).

Подробное описание изобретения

Настоящее изобретение относится к новому прямому и экономически целесообразному способу получения агарозы, характеризующейся высокой прочностью геля и высокими и низкими температурами гелеобразования, из видов Gracilaria и Gelidiella, говоря более конкретно, Gracilaria dura и Gelidiella acerosa, при этом упомянутый способ включает стадии предварительной обработки (i) сухих морских водорослей щелочью для уменьшения уровня содержания сульфата, (ii) промывания водой для удаления щелочи и после этого (iii) варки в воде для получения разбавленного экстракта. Затем материал подвергают (iv) гомогенизации и (v) центрифугированию в горячем состоянии для получения прозрачного экстракта морских водорослей, свободного от нерастворимых примесей. После этого горячий экстракт подвергают (vi) обработке растворимым в воде неионным поверхностно-активным веществом при интенсивном перемешивании и (vii) содержимое оставляют выстаиваться для охлаждения до комнатной температуры, после чего осаждается агароза, которую после этого (viii) отделяют в результате центрифугирования и (ix) промывают водой для удаления пристающего поверхностно-активного вещества. Затем (х) влажную массу агарозы повторно диспергируют в горячем состоянии в минимальном объеме воды и (xi) подвергают обработке равным объемом изопропилового спирта для обезвоживания массы агарозы, которая после (xii) фильтрования и высушивания позволяет получить рафинированный и легко диспергируемый продукт, подходящий для гель-электрофореза ДНК. Кроме того, качество полученной агарозы способно сохраняться в контейнерах из пластика, по меньшей мере, вплоть до 1 года без какого-либо ухудшения.

В настоящем изобретении описывается «улучшенный способ получения полимерной агарозы из экстракта морских водорослей» - полимерной агарозы, характеризующейся высококлассными областями применения, высокими прочностями геля, низкими и высокими температурами гелеобразования, из видов Gracilaria dura и Gelidiella acerosa соответственно по новому способу, который включает

(i) предварительную обработку 35 частей для видов Gracilaria и 20 частей для видов Gelidiella соответственно (об./масс.) водной щелочью в концентрационном диапазоне от 1 до 15% щелочи при температуре в диапазоне 25-95°C и в течение периода в диапазоне от 0,5 до 5,0 часа,

(ii) тщательное прополаскивание водой подвергнутых предварительной обработке морских водорослей для удаления избыточной щелочи вплоть до демонстрации промывными водами значения рН в диапазоне от 7 до 9,

(iii) добавление приблизительно 35 частей для видов Gracilaria и 20 частей для видов Gelidiella соответственно (об./масс.) воды на каждую одну часть первоначальных морских водорослей и автоклавирование в диапазоне 100-125°C в течение продолжительности времени в диапазоне от 1,0 до 2,5 часа для получения экстракта,

(iv) гомогенизацию горячего экстракта до центрифугирования,

(v) центрифугирование горячего экстракта при 10000-14000 об/мин в течение 5-15 мин,

(vi) обработку экстракта приблизительно 2-5%-ми поверхностно-активных веществ при непрерывном перемешивании при температуре в диапазоне от 60 до 100°C,

(vii) выдерживание экстракта совместно с поверхностно-активным веществом при комнатной температуре (25-35°C) для обеспечения коагулирования твердой массы из экстракта морских водорослей в течение периода времени в диапазоне от 1 до 10 часов,

(viii) отделение твердой массы агарозы от жидкости в результате центрифугирования,

(ix) удаление остаточного поверхностно-активного вещества в результате простого промывания или при использовании диализа вплоть до демонстрации конечными промывными водами поверхностного натяжения, подобного тому, что и у воды,

(x) необязательно повторное растворение влажной массы в минимальном количестве воды в диапазоне от 7 до 10% (масс./масс.),

(xi) обезвоживание влажной массы в минимальном количестве изопропанола в диапазоне от 50 до 150 г ИПС на 100 г дисперсии агарозы и

(xii) фильтрование, высушивание и размалывание для получения легко диспергируемого агарозного продукта, подходящего для гель-электрофореза ДНК.

Прочность геля агарозы настоящего изобретения измеряли при использовании прибора для испытания геля Nikkansui type у 1,0%-ного и 1,5%-ного гелей агароз при 20°C. Термогравиметрический анализ (ТГА) проводили при использовании установки STAR-Toledo TGA machine, Швейцария. Определение молекулярной массы проводили в результате измерения характеристической вязкости на вискозиметре Оствальда (смотрите публикацию С. Rochas and М. Lahaye. Carbohydrate Polymers 1989, 10:289). Температуры гелеобразования и плавления измеряли в соответствии с методом, описанным авторами Craigie et al. (Hand Book of Phycological Methods, 1978 (Eds. Hellebust. J.A. and Craigie J.S., Cambridge University Press; pp. 127), зольный остаток измеряли в результате сжигания твердого вещества при 800°C в течение 6 часов, уровень содержания сульфата оценивали в результате проведения обработки золы концентрированной азотной кислотой, упаривания до сухости, растворения остатка в воде, фильтрования и проведения анализа по методу индуктивно связанной плазмооптической эмиссионной спектроскопии (ИСП-ОЭС) для определения уровня содержания серы.

В одном варианте осуществления настоящего изобретения агароза может быть получена из видов Gracilaria и Gelidiella, а говоря более конкретно, из видов Gracilaria dura и Gelidiella acerosa из вод Индийского океана, которые получали на морских побережьях Гуджарата и Тамилнада.

В еще одном варианте осуществления настоящего изобретения стадии i-iv проводят в соответствии с практикой предшествующего уровня техники.

В еще одном другом варианте осуществления настоящего изобретения поверхностно-активные вещества могут быть добавлены к горячему экстракту в температурном диапазоне от 60 до 90°C, а говоря более конкретно, 70-80°C, и при центрифугировании горячего экстракта в диапазоне от 10000 до 14000 об/мин в течение 5-15 минут.

В еще одном дополнительном варианте осуществления настоящего изобретения поверхностно-активные вещества могут быть добавлены к горячему экстракту в количестве, находящемся в диапазоне от 2% до 5% (масс./масс.), а говоря более конкретно, равном 3% (масс./масс.), при непрерывном перемешивании при температуре в диапазоне 60-100°C.

В еще одном другом варианте осуществления настоящего изобретения полимерная агароза может быть скоагулирована после выстаивания экстракта, содержащего поверхностно-активное вещество, при температуре окружающей среды (25-35°C) в течение 1-10 часов, а говоря более конкретно, 3-4 часов.

В еще одном дополнительном варианте осуществления настоящего изобретения сырая агароза после осаждения может быть отделена в результате центрифугирования при температуре окружающей среды.

В еще одном другом варианте осуществления настоящего изобретения остаточное поверхностно-активное вещество в сырой агарозе может быть удалено в результате простого водного промывания или в результате проведения диализа для повторно диспергированной сырой агарозы.

В еще одном варианте осуществления настоящего изобретения влажную массу агарозы повторно диспергируют в горячей воде (120°C) при одновременном выдерживании концентрации агарозы, находящейся в диапазоне от 7% до 10%, а говоря более конкретно, равной 7%.

В еще одном дополнительном варианте осуществления настоящего изобретения концентрированную массу агарозы подвергают обработке равным объемом изопропанола для обезвоживания массы агарозы и легкого диспергирования.

В еще одном другом варианте осуществления настоящего изобретения выделение твердого продукта и высушивание проводили в подходящей сушилке для получения порошкообразной агарозы, соответствующей номерам сита по американскому стандарту в диапазоне от 200 до 300.

В еще одном дополнительном варианте осуществления настоящего изобретения экстракт получали по известному способу, включающему стадии обработки сухих морских водорослей 20-35 частями (масс./масс.) водного раствора гидроксида натрия с концентрацией 1-15% (масс./масс.) при 25-95°C в течение 0,5-5 часов с последующими промыванием для доведения значения рН до величины в диапазоне 7-9, после этого добавлением деминерализованной воды к промытым морским водорослям и автоклавированием при температуре в диапазоне 100-125°C в течение 1-2,5 часов.

В еще одном другом варианте осуществления настоящего изобретения использующимися поверхностно-активными веществами являются растворимые в воде неионные поверхностно-активные вещества, а говоря более конкретно, Triton Х-100 и Synperonic 91/6.

В еще одном другом варианте осуществления настоящего изобретения, где количество операций промывания может находиться в диапазоне от 5 до 20, говоря более конкретно, от 6 до 10, операций, продолжительность времени промывания может находиться в диапазоне 10-30 минут для каждой операции промывания.

В еще одном дополнительном варианте осуществления настоящего изобретения могут быть использованы другие полисахариды, если уровень содержания сульфата и зольный остаток будут подобными или меньшими, чем 0,3% и 1,0% соответственно, которые были бы поддающимися воздействию данного способа.

В еще одном варианте осуществления настоящего изобретения уровень содержания сульфата у агарозы в горячем экстракте может находиться в диапазоне от 0,20% до 0,25% для морских водорослей Gracilaria и Gelidiella соответственно.

В еще одном дополнительном варианте осуществления настоящего изобретения использующиеся поверхностно-активные вещества индуцируют флоккулирование только при уровне содержания сульфата у агарозы <1% (масс./масс.), предпочтительно <0,5% (масс./масс.), а еще более предпочтительно <0,25%.

В еще одном дополнительном варианте осуществления настоящего изобретения полисахариды могут быть химически или биохимически десульфатированы для получения уровня содержания сульфата, приблизительно равного или меньшего 0,3%.

В еще одном другом варианте осуществления настоящего изобретения полимерные агарозы, которые могут быть выделены из экстракта морских водорослей, являлись подходящими для гель-электрофореза ДНК на агарозе, демонстрирующего удовлетворительные эксплуатационные характеристики по разрешению при пониженных концентрациях, например при концентрации ≤0,8%.

В еще одном дополнительном варианте осуществления настоящего изобретения качество и количество ДНК были подобны после извлечения из гелей агароз.

В еще одном дополнительном варианте осуществления настоящего изобретения в случае гелей агароз, полученных из агарозы, полученной в настоящем изобретении, разделение сегментов ДНК было хорошим.

В дополнительном варианте осуществления настоящего изобретения качество полученной агарозы способно сохраняться в контейнерах из пластика, по меньшей мере, вплоть до 1 года без какого-либо ухудшения.

Следующие далее примеры приведены в порядке иллюстрирования и поэтому не должны восприниматься в качестве ограничения объема настоящего изобретения. Примеры 1-6 в данном изобретении выполнены в соответствии со способом замораживания-оттаивания, упомянутым на предшествующем уровне техники. Но основная цель изобретения заключается в примерах от 7 до 11, которые не используют способ замораживания-оттаивания.

Пример 1

Морские водоросли Gracilaria dura (25 г) вымачивали в водопроводной воде в течение 1 часа при 35°C, а после этого вымачивали при 85°C в отсутствие гидроксида натрия (NaOH) в течение 2 часов. Затем подвергнутые вымачиванию морские водоросли переводили в дистиллированную воду (морские водоросли : вода = 1:35 (масс./масс.)) и автоклавировали при 120°C в течение 1,5 часов. Экстракт гомогенизировали и центрифугировали для получения прозрачного экстракта, удаляя примеси, нерастворимые в воде. Горячий экстракт выливали в лотки из нержавеющей стали и ему давали охладиться до комнатной температуры. Лотки, содержащие гелеобразующий экстракт, хранили в холодильнике при -20°C в течение 20 часов. После этого замороженный гель оттаивали при комнатной температуре. Оттаянный гель отжимали для удаления пристающей жидкости, после чего его промывали деминерализованной водой и в заключение отжимали для удаления пристающей воды. Нативный агар высушивали на воздухе с последующим высушиванием в печи при 50°C в течение 2 часов.

Выход: 6,5 г (26,0%) в расчете на количество абсолютно сухих морских водорослей; прочность геля (1%-ный гель): 250 г-см^-2 при 20°C; температура гелеобразования: 34,0°C; зольный остаток: ≤8,06%; сульфат: ≤3,26%.

Пример 2

Морские водоросли Gelidiella acerosa (25 г) вымачивали в водопроводной воде в течение 1 часа при 35°C, а после этого - при 85°C в отсутствие NaOH в течение 2 часов. Затем подвергнутые вымачиванию морские водоросли переводили в дистиллированную воду (морские водоросли : вода = 1:35 (масс./масс.)) и автоклавировали при 120°C в течение 1,5 часов. Экстракт гомогенизировали и центрифугировали для получения прозрачного экстракта, удаляя примеси, нерастворимые в воде. Горячий экстракт выливали в лотки из нержавеющей стали и ему давали охладиться до комнатной температуры. Лотки, содержащие гелеобразующий экстракт, хранили в холодильнике при -20°C в течение 20 часов. После этого замороженный гель оттаивали при комнатной температуре. Оттаянный гель отжимали для удаления пристающей жидкости, после чего его промывали деминерализованной водой и в заключение отжимали для удаления пристающей воды. Полимерный нативный агар высушивали на воздухе с последующим высушиванием в печи при 50°C в течение 2 часов.

Выход: 5,5 г (22,0%) в расчете на количество абсолютно сухих морских водорослей; прочность геля (1,5%-ный гель): 300 г-см^-2 при 20°C; температура гелеобразования: 41,0°C; зольный остаток: ≤4,56%; сульфат: ≤2,60%.

Пример 3

Морские водоросли Gracilaria edulis (25 г) вымачивали в водопроводной воде в течение 1 часа при 35°C, а после этого - при 85°C в отсутствие NaOH в течение 2 часов. Затем подвергнутые вымачиванию морские водоросли переводили в дистиллированную воду (морские водоросли : вода = 1:35 (масс./масс.)) и автоклавировали при 120°C в течение 1,5 часов. Экстракт гомогенизировали и центрифугировали для получения прозрачного экстракта, удаляя примеси, нерастворимые в воде. Горячий экстракт выливали в лотки из нержавеющей стали и ему давали охладиться до комнатной температуры. Лотки, содержащие гелеобразующий экстракт, хранили в холодильнике при -20°C в течение 20 часов. После этого замороженный гель оттаивали при комнатной температуре. Оттаянный гель отжимали для удаления пристающей жидкости, после чего его промывали деминерализованной водой и в заключение отжимали для удаления пристающей воды. Полимерный нативный агар высушивали на воздухе с последующим высушиванием в печи при 50°C в течение 2 часов.

Выход: 5,0 г (20,0%) в расчете на количество абсолютно сухих морских водорослей; прочность геля (1,5%-ный гель): <100 г-см^-2 при 20°C; температура гелеобразования: 40,0°C; зольный остаток: ≤6,56%; сульфат: ≤5,60%.

Пример 4

Морские водоросли Gracilaria dura и Gelidiella acerosa (25 г в каждом случае) из примеров 1 и 2 вымачивали в водопроводной воде в отдельных экспериментах в течение 1 часа при 35°C; промывные воды отбрасывали, а влажные морские водоросли подвергали обработке 2%-ным NaOH при 85°C в течение 2 часов с последующим промыванием морских водорослей водой для удаления избыточной щелочи. После этого подвергнутые предварительной обработке морские водоросли переводили в дистиллированную воду (морские водоросли : вода = 1:35 или 1:20 (масс./масс.)) и автоклавировали при 120°C в течение 1,5 часов. Экстракты из видов Gracilaria dura и Gelidiella acerosa гомогенизировали и центрифугировали для получения прозрачных экстрактов, свободных от примесей, нерастворимых в воде, и характеризующихся уровнями содержания сульфата ≤1,87% и ≤1,76% соответственно. Данные экстракты подвергали обработке двумя неионными [Triton Х-100 (S.D. Fine Chemicals, Индия); Synperonic 91/6 (ICI Uniqema, Индия)] поверхностно-активными веществами (3% (масс./масс.) в расчете на количество экстракта). Поверхностно-активное вещество добавляли постепенно в беспримесной форме при интенсивном перемешивании. После завершения добавления поверхностно-активного вещества перемешивание прекращали и содержимому давали возможность выстаиваться при комнатной температуре в течение 5 часов. Ни в каком из случаев какого-либо осаждения не наблюдали.

Агароза из вида Gracilaria dura: Выход: 18%; прочность геля: 530 г-см^-2; сульфат: ≤1,87%.

Агароза из вида Gelidiella acerosa: Выход: 14%; прочность геля: 850 г-см^-2; сульфат: ≤1,76%.

Пример 5

Морские водоросли Gracilaria dura и Gelidiella acerosa из примеров 1 и 2 вымачивали в водопроводной воде в отдельных экспериментах в течение 1 часа при 35°C; промывные воды отбрасывали, а влажные морские водоросли подвергали обработке 3,5%-ным NaOH при 85°C в течение 2 часов с последующим промыванием морских водорослей водой для удаления избыточной щелочи. После этого морские водоросли, подвергнутые предварительной обработке при использовании 3,5% NaOH, переводили в дистиллированную воду (морские водоросли : вода = 1:35 или 1:20 (масс./масс.)) и автоклавировали при 120°C в течение 1,5 часов. Экстракты из видов Gracilaria dura и Gelidiella acerosa гомогенизировали и центрифугировали для получения прозрачных экстрактов, свободных от примесей, нерастворимых в воде, и характеризующихся уровнями содержания сульфата ≤1,22% и ≤1,47% соответственно. Данные экстракты подвергали обработке двумя неионными [Triton Х-100 (S.D. Fine Chemicals, Индия); Synperonic 91/6 (ICI Uniqema, Индия)] поверхностно-активными веществами (3% (масс./масс.) в расчете на количество экстракта). Поверхностно-активное вещество добавляли постепенно в беспримесной форме при интенсивном перемешивании. После завершения добавления поверхностно-активного вещества перемешивание прекращали и содержимому давали возможность выстаиваться при комнатной температуре в течение 5 часов. Ни в каком из случаев какого-либо осаждения не наблюдали.

Агароза из вида Gracilaria dura: Выход: 16%; прочность геля: 820 г-см^-2; сульфат: ≤1,02%.

Агароза из вида Gelidiella acerosa: Выход: 14%; прочность геля: 980 г-см^-2; сульфат: ≤1,47%.

Пример 6

Морские водоросли Gracilaria dura и Gelidiella acerosa из примеров 1 и 2 вымачивали в водопроводной воде в отдельных экспериментах в течение 1 часа при 35°C; промывные воды отбрасывали, а влажные морские водоросли подвергали обработке 4%-ным NaOH при 85°C в течение 2 часов с последующим промыванием морских водорослей водой для удаления избыточной щелочи. После этого морские водоросли, подвергнутые предварительной обработке при использовании 4% NaOH, переводили в дистиллированную воду (морские водоросли : вода = 1:35 или 1:20 (масс./масс.)) и автоклавировали при 120°C в течение 1,5 часов. Экстракты из видов Gracilaria dura и Gelidiella acerosa гомогенизировали и центрифугировали для получения прозрачных экстрактов, свободных от примесей, нерастворимых в воде, и характеризующихся уровнями содержания сульфата ≤0,72% и ≤1,38% соответственно. Данные экстракты подвергали обработке двумя неионными [Triton Х-100 (S.D. Fine Chemicals, Индия); Synperonic 91/6 (ICI Uniqema, Индия)] поверхностно-активными веществами (3% (масс./масс.) в расчете на количество экстракта). Поверхностно-активное вещество добавляли постепенно в беспримесной форме при интенсивном перемешивании. После завершения добавления поверхностно-активного вещества перемешивание прекращали и содержимому давали возможность выстаиваться при комнатной температуре в течение 5 часов. В экстрактах, полученных из вида Gracilaria dura и содержащих ≤0,82% сульфата, в случае неионных поверхностно-активных веществ наблюдали осаждение. В экстракте, полученном из вида Gelidiella acerosa и содержащем ≤1,38% сульфата, в случае любого из вышеупомянутых поверхностно-активных веществ какого-либо осаждения не наблюдали.

Агароза из вида Gracilaria dura: Выход: 15%; прочность геля: 1300 г-см^-2; сульфат: ≤0,82%.

Агароза из вида Gelidiella acerosa: Выход: 13%; прочность геля: 1020 г-см^-2; сульфат: ≤1,38%.

Пример 6 приводит к заключению о том, что неионные поверхностно-активные вещества будут подходящими для использования при коагулировании агарозы из горячих экстрактов морских водорослей в случае уровня содержания сульфата ≤0,82% от полисахарида, поэтому способ настоящего изобретения идеально применим для получения агара или агарозы, характеризующихся низким уровнем содержания сульфата.

Пример 7

Морские водоросли Gracilaria dura и Gelidiella acerosa из примеров 1 и 2 вымачивали в водопроводной воде в отдельных экспериментах в течение 1 часа при 35°C; промывные воды отбрасывали, а влажные морские водоросли подвергали обработке 5%-ным NaOH при 85°C в течение 2 часов с последующим промыванием морских водорослей водой для удаления избыточной щелочи. После этого морские водоросли, подвергнутые предварительной обработке при использовании 5% NaOH, переводили в дистиллированную воду (морские водоросли : вода =1:35 (масс./масс.)) и автоклавировали при 120°C в течение 1,5 часов. Экстракты гомогенизировали и центрифугировали для получения прозрачных экстрактов, свободных от примесей, нерастворимых в воде, и характеризующихся уровнями содержания сульфата ≤0,50% и ≤1,08% соответственно. Данные экстракты подвергали обработке двумя неионными [Triton Х-100 (S.D. Fine Chemicals, Индия); Synperonic 91/6 (ICI Uniqema, Индия)] поверхностно-активными веществами (3% (масс./масс.) в расчете на количество экстракта). Поверхностно-активное вещество добавляли постепенно в беспримесной форме при интенсивном перемешивании. После завершения добавления поверхностно-активного вещества перемешивание прекращали и содержимому давали возможность выстаиваться при комнатной температуре в течение 5 часов. В экстрактах, полученных из вида Gracilaria dura и содержащих ≤0,5% сульфата, наблюдали осаждение. В экстракте, полученном из вида Gelidiella acerosa и содержащем ≤1,08% сульфата, какого-либо осаждения не наблюдали.

Агароза из вида Gracilaria dura: - Выход: 14%; прочность геля: 1600 г-см^-2; сульфат: ≤0,50%.

Агароза из вида Gelidiella acerosa: - Выход: 13%; прочность геля: 1140 г-см^-2; сульфат: ≤1,08%.

Пример 7 приводит к заключению о том, что неионные поверхностно-активные вещества будут подходящими для использования при полном коагулировании агарозы из горячих экстрактов морских водорослей в случае уровня содержания сульфата ≤0,50%.

Пример 8

Морские водоросли Gracilaria dura и Gelidiella acerosa из примеров 1 и 2 вымачивали в водопроводной воде в отдельных экспериментах в течение 1 часа при 35°C; промывные воды отбрасывали, а влажные морские водоросли подвергали обработке 7%-ным NaOH при 85°C в течение 2 часов с последующим промыванием морских водорослей водой для удаления избыточной щелочи. После этого морские водоросли, подвергнутые предварительной обработке при использовании 5% NaOH, переводили в дистиллированную воду (морские водоросли : вода = 1:35 (масс./масс.)) и автоклавировали при 120°C в течение 1,5 часов. Экстракты гомогенизировали и центрифугировали для получения прозрачных экстрактов, свободных от примесей, нерастворимых в воде, и характеризующихся уровнями содержания сульфата ≤0,50% и ≤1,08% соответственно. Данные экстракты подвергали обработке двумя неионными [Triton Х-100 (S.D. Fine Chemicals, Индия); Synperonic 91/6 (ICI Uniqema, Индия)] поверхностно-активными веществами (3% (масс./масс.) в расчете на количество экстракта). Поверхностно-активное вещество добавляли постепенно в беспримесной форме при интенсивном перемешивании. После завершения добавления поверхностно-активного вещества перемешивание прекращали и содержимому давали возможность выстаиваться при комнатной температуре в течение 5 часов. В экстрактах, полученных из вида Gracilaria dura и содержащих ≤0,5% сульфата, наблюдали осаждение. В экстракте, полученном из вида Gelidiella acerosa и содержащем ≤0,80% сульфата, какого-либо осаждения не наблюдали.

Агароза из вида Gracilaria dura: - Выход: 13%; прочность геля: 1800 г-см^-2; сульфат: ≤0,38%.

Агароза из вида Gelidiella acerosa: - Выход: 12%; прочность геля: 1550 г-см^-2; сульфат: ≤0,80%.

Пример 8 дополнительно приводит к заключению о том, что неионные поверхностно-активные вещества будут подходящими для использования при полном коагулировании агарозы из горячих экстрактов морских водорослей в случае уровня содержания сульфата ≤0,80%.

Пример 9

Морские водоросли Gracilaria dura (в каждом случае 25 г), как и в примере 1, вымачивали в водопроводной воде в течение 1 часа при 35°C и после этого воду отбрасывали, а влажные морские водоросли подвергали обработке при использовании 10% NaOH при 85°C в течение 2 часов с последующим промыванием морских водорослей водой для удаления избыточной щелочи. Затем подвергнутые предварительной обработке морские водоросли переводили в дистиллированную воду (морские водоросли : вода = 1:35 (масс./масс.)) и автоклавировали при 120°C в течение 1,5 часов. Экстракт гомогенизировали и центрифугировали для получения прозрачного экстракта, свободного от примесей, нерастворимых в воде. Горячий экстракт выливали в лотки из нержавеющей стали и ему давали охладиться до комнатной температуры. Лотки, содержащие гелеобразующий экстракт, хранили в холодильнике при -20°C в течение 20 часов. После этого замороженный гель оттаивали при комнатной температуре. Оттаянный гель отжимали для удаления пристающей жидкости, после чего его промывали деминерализованной водой и в заключение отжимали для удаления пристающей воды. Полимерный нативный агар высушивали на воздухе с последующим высушиванием в печи при 50°C в течение 2 часов.

Выход: 5,0 г (20,0%) в расчете на количество абсолютно сухих морских водорослей; прочность геля (1,0%-ный гель): >1900 г-см^-2 при 20°C; температура гелеобразования: 35,0°C; зольный остаток: ≤1,0%; сульфат: ≤0,25%.

Пример 10

Морские водоросли Gelidiella acerosa (G. acerosa) (25 г), как и в примере 2, вымачивали в водопроводной воде в течение 1 часа при 35°C и после этого воду отбрасывали, а влажные морские водоросли подвергали обработке при использовании 10% NaOH при 85°C в течение 2 часов с последующим промыванием морских водорослей водой для удаления избыточной щелочи. Затем подвергнутые предварительной обработке морские водоросли переводили в дистиллированную воду (морские водоросли : вода = 1:35 (масс./масс.)) и автоклавировали при 120°C в течение 1,5 часов. Экстракт гомогенизировали и центрифугировали для получения прозрачного экстракта, свободного от примесей, нерастворимых в воде. Горячий экстракт выливали в лотки из нержавеющей стали и ему давали охладиться до комнатной температуры. Лотки, содержащие гелеобразующий экстракт, хранили в холодильнике при -20°C в течение 20 часов. После этого замороженный гель оттаивали при комнатной температуре. Оттаянный гель отжимали для удаления пристающей жидкости, после чего его промывали деминерализованной водой и в заключение отжимали для удаления пристающей воды. Полимерный нативный агар высушивали на воздухе с последующим высушиванием в печи при 50°C в течение 2 часов.

Выход: 3,5 г (14,0%) в расчете на количество абсолютно сухих морских водорослей; прочность геля (1,5%-ный гель): ≥2000 г-см^-2 при 20°C; температура гелеобразования: 41,0°C; зольный остаток: ≤ 1,1%; сульфат: ≤ 0,30%.

Пример 11

Морские водоросли Gracilaria edulis (G. edulis) (25 г), как и в примере 3, вымачивали в водопроводной воде в течение 1 часа при 35°C и после этого воду отбрасывали, а влажные морские водоросли подвергали обработке при использовании 10% NaOH при 85°C в течение 2 часов с последующим промыванием морских водорослей водой для удаления избыточной щелочи. Затем подвергнутые предварительной обработке морские водоросли переводили в дистиллированную воду (морские водоросли : вода = 1:35 (масс./масс.)) и автоклавировали при 120°C в течение 1,5 часов. Экстракт гомогенизировали и центрифугировали для получения прозрачного экстракта, свободного от примесей, нерастворимых в воде. Горячий экстракт выливали в лотки из нержавеющей стали и ему давали охладиться до комнатной температуры. Лотки, содержащие гелеобразующий экстракт, хранили в холодильнике при -20°C в течение 20 часов. После этого замороженный гель оттаивали при комнатной температуре. Оттаянный гель отжимали для удаления пристающей жидкости, после чего его промывали деминерализованной водой и в заключение отжимали для удаления пристающей воды. Полимерный нативный агар высушивали на воздухе с последующим высушиванием в печи при 50°C в течение 2 часов.

Выход: 3,0 г (12,0%) в расчете на количество абсолютно сухих морских водорослей; прочность геля (1,5%-ный гель): ≥400 г-см^-2 при 20°C; температура гелеобразования: 40,0°C; зольный остаток: ≤2,56%; сульфат: ≤1,90%.

Пример 12

Горячие (70°C) экстракты агара из морских водорослей Gracilaria dura, Gelidiella acerosa и Gracilaria edulis, полученных в примерах 1, 2 и 3 и характеризующихся уровнями содержания сульфата (% (масс./масс.)) 3,26, 2,60 и 5,60 соответственно, подвергали обработке двумя катионными [бромид цетилтриметиламмония (БЦТА) и хлорид цетилпиридиния (ХЦП)], тремя анионными [лаурилсульфат натрия (ЛСН); SC-896 (ICI Uniqema, Индия) и SC-229 (ICI Uniqema, Индия)] и пятью неионными [Triton Х-100 (S.D. Fine Chemicals, Индия); Synperonic 91/6 (ICI Uniqema, Индия); SC-892 (ICI Uniqema, Индия); Tween-80 (ICI Uniqema) и Atplus 245 (ICI Uniqema, Индия)] поверхностно-активными веществами. Поверхностно-активное вещество добавляли постепенно в беспримесной форме при интенсивном перемешивании. Концентрация взятого поверхностно-активного вещества составляла 3% (масс./масс.) в расчете на количество экстракта. После завершения добавления поверхностно-активного вещества перемешивание прекращали и содержимому давали возможность выстаиваться при комнатной температуре в течение 5 часов. Ни в каком из случаев какого-либо осаждения не наблюдали.

Пример 13

Эксперименты из примера 12 повторяли при использовании горячих (70°C) экстрактов подвергнутых щелочной обработке морских водорослей из примеров 9, 10 и 11, содержащих агарозу, характеризующуюся уровнями содержания сульфата 0,25, 0,30 и 1,90 соответственно. Наблюдения суммарно представлены в таблице 4. Как можно видеть, в то время как горячие экстракты из примеров 9 и 10 приводили к осаждению в случае неионных поверхностно-активных веществ, взятых с концентрацией 3%, никакого такого осаждения не наблюдали в случае ионных поверхностно-активных веществ при любой концентрации. Кроме того, экстракт из примера 11 не приводил к получению какого-либо осадка даже в случае неионных поверхностно-активных веществ. В то время как все неионные поверхностно-активные вещества индуцировали осаждение в случае горячих экстрактов примеров 9 и 10, реагенты Triton Х-100 и Synperonic 91/6 приводили к полному осаждению при меньшей концентрации в 3% (масс./масс.) и были выбраны для дальнейших способов настоящего изобретения.

Примеры 12 и 13 приводят к заключению о том, что неионные поверхностно-активные вещества будут подходящими для использования при коагулировании агарозы из горячего экстракта морских водорослей в случае низкого уровня содержания сульфата у полисахарида, как это имеет место в случае с агарозой, поэтому способ настоящего изобретения идеально применим для получения агарозы.

Как указывают результаты примера 12, коагулирование или осаждение нативного агара из экстрактов морских водорослей Gracilaria dura, Gelidiella acerosa и Gracilaria edulis не происходили в присутствии ионных и неионных поверхностно-активных веществ в случае наличия у нативных агаров высоких уровней содержания сульфата, больших чем 3%.

Как демонстрирует пример 13 (таблица 4), коагулирование или осаждение агарозы не происходило в присутствии катионных и анионных поверхностно-активных веществ из экстрактов морских водорослей, полученных из видов Gracilaria dura, Gelidiella acerosa и Gracilaria edulis, даже в случае уровней содержания сульфата в полимерной агарозе, равных приблизительно 1%. Пример 13 (таблица 4) дополнительно приводит к заключению о том, что полные коагулирование или осаждение агарозы происходят в присутствии неионных поверхностно-активных веществ из экстрактов морских водорослей, которые получали только из подвергнутых щелочной обработке видов Gracilaria dura и Gelidiella acerosa в случае наличия у агароз уровней содержания сульфата 0,25 и 0,3% соответственно. В случае экстракта морских водорослей Gracilaria edulis, которые характеризовались относительно высоким уровнем содержания сульфата (1,9%), даже после проведения щелочной обработки осаждение полимерного агара после добавления неионного поверхностно-активного вещества не происходило. Согласно заключению данное явление осаждения агара, индуцированного (неионным) поверхностно-активным веществом, хорошо срабатывает только при достаточно низком уровне содержания сульфата в агаре (<1%).

Пример 14

Горячие (70°C) экстракты агарозы из морских водорослей Gracilaria dura и Gelidiella acerosa, полученных в примерах 9 и 10 и характеризующихся уровнями содержания сульфата (% (масс./масс.)) 0,25 и 0,30 соответственно, подвергали обработке двумя неионными [Triton Х-100 (S.D. Fine Chemicals, Индия) и Synperonic 91/6 (ICI Uniqema, Индия)] поверхностно-активными веществами. Концентрация взятого поверхностно-активного вещества составляла 3% (масс./масс.) в расчете на количество экстракта. После завершения добавления поверхностно-активного вещества перемешивание прекращали и содержимому давали возможность выстаиваться при комнатной температуре в течение 5 часов. Полное осаждение полимерной агарозы происходило в присутствии обоих неионных поверхностно-активных веществ. После осаждения полимерной агарозы из экстрактов осажденный полимер собирали в результате центрифугирования. Избыточное поверхностно-активное вещество из полимерной агарозы удаляли в результате неоднократного промывания водой (6×1 литр), при этом каждую операцию промывания проводили в результате перемешивания смеси вода-полимер в течение 15 минут или в результате диализа после повторного диспергирования сырой массы агарозы, после этого отделения массы агарозы при удалении промывных вод в ходе центрифугирования. Влажную массу агарозы, свободную от поверхностно-активного вещества, повторно растворяли в горячей воде для получения концентрированного раствора (7% (масс./масс.)). После этого проводили его обработку изопропиловым спиртом в равном количестве для обезвоживания, что приводило к получению легко диспергируемой агарозы.

Технические характеристики полимерных агарозных продуктов, полученных из экстрактов морских водорослей Gracilaria dura и Gelidiella acerosa после обработки неионными поверхностно-активными веществами Triton Х-100 и Synperonic 91/6, представляют собой далее следующее.

Агароза из вида Gracilaria dura: Выход: 3,15 г (14,0%) в расчете на количество абсолютно сухих морских водорослей; прочность геля (1%-ный гель): ≥1900 г-см^-2 при 20°C; температура гелеобразования: 35,0°C; зольный остаток: ≤0,80%; сульфат: ≤0,20%.

Агароза из вида Gelidiella acerosa: Выход: 2,47 г (11,0%) в расчете на количество абсолютно сухих морских водорослей; прочность геля (1,5%-ный гель): ≥1900 г-см^-2 при 20°C; температура гелеобразования: 41,0°C; зольный остаток: ≤0,95%; сульфат: ≤0,25%.

Пример 15

Полимерные агарозы, полученные из видов Gracilaria dura и Gelidiella acerosa в примере 14, анализировали по методу спектрофотометрии с индуктивно-связанной плазмой (ИСП) на установке Perkin-Elmer ICP-OES Optima 2000DV machine для выявления их уровней содержания ионов металлов в соответствии с методом, описанным в публикации Wolnik, K.A. (Methods Enzymol., 158: 190-205, 1988). Результаты сопоставляли со значениями, сообщенными для агарозы от компании Fluka (Cat. No. 05068, 2003/2004) (таблица 5). Как представляется, агарозы данного изобретения были бы подходящими для использования при работе с электрофорезом.

Пример 16

Сравнительную оценку гелей агарозы из вида Gracilaria dura [прочность геля: ≥1900 г-см^-2 в 1%-ном геле] настоящего изобретения (пример 14) и предшествующих изобретений (РСТ 2005/118830; US 2005/0267296 A1) проводили в идентичных экспериментальных условиях, при этом концентрации геля составляют 0,8% для обоих гелей при гель-электрофорезе. Надлежащие количества данных двух образцов агарозы растворяли в 50 мл 1 × буфера ТВЕ (10,8 г трис-основания, 5,5 г борной кислоты, 0,744 г Na₂ЭДТУ) при использовании микроволновой печи при 90°C. Растворы агарозы охлаждали до 60°C и добавляли 2 мкл раствора бромида этидия (10 мг на один мл) и в лотке для геля отливали гели.

На оба геля загружали лесенку ДНК и два различных образца ДНК (1,2 т.п.н. и 1,5 т.п.н.) и проводили электрофорез при использовании 1 × буфера ТВЕ при 50 В в течение 90 минут. После прохождения образца по гелю кусок геля, содержащий ДНК, отрезали от геля и ДНК экстрагировали при использовании комплекта для экстрагирования из геля QIA-quick Gel Extraction Kit (Qiagen USA) в 50 мкл стерилизованной воды. После элюирования в свежеотлитый гель загружали 5 мкл ДНК для выявления концентрации и качества элюированной ДНК.

Элюированную ДНК еще раз амплифицировали при использовании геноспецифических затравок в стандартных условиях ПЦР (25 нг матрицы ДНГ, 1 × буфер полимеразы Taq, 150 нг затравок для ПЦР, 200 мкмоль/л дНТФ и 2,5 ед. ферментов полимеразы Taq в 50 мкл реакционного объема). Условия ПЦР представляли собой 94°C в течение 5 мин; 55°C в течение 1 мин и 72°C в течение 1 мин для 35 циклов. ДНК, амплифицированную по способу ПЦР, повторно проверяли по методу электрофореза при использовании 0,8%-ных новых и старых гелей агарозы. Гели визуализировали под действием УФ-света (УФ-трубка 8 Вт, 312 нм; Bangalore Genei, Индия).

Для проверки качества и эксплуатационных характеристик геля агарозы (гель a на фигурах 1.1, 1.2 и 1.3), полученного в данном изобретении, проводили гель-электрофорез ДНК, сопоставляя результаты с результатами для геля агарозы (гель b фигур 1.1, 1.2 и 1.3) предшествующего изобретения (РСТ 2005/118830; US 2005/0267296 A1). На фигуре 1.1 проанализировали ДНК, амплифицированную по способу ПЦР, и продукты ДНК элюировали из данных гелей и повторно анализировали по методу гель-электрофореза ДНК (фигура 1.2). Амплификацию по способу ПЦР проводили при использовании продукта ДНК, элюированного из гелей фигуры 1.1, а качество амплифицированных продуктов ДНК проверяли по методу гель-электрофореза ДНК (фигура 1.3). Разделение образцов ДНК, а также качество элюированной ДНК, как было установлено, были подобными у обоих образцов геля, то есть у гелей a и b на всех фигурах (фигурах 1.1, 1.2 и 1.3).

Пример 16 приводит к заключению о том, что способ настоящего изобретения обеспечивает получение агарозы подобного качества в сопоставлении с агарозой, полученной из вида Gracilaria dura предшествующего уровня техники.

Пример 17

Экстракты морских водорослей Gracilaria dura и Gelidiella acerosa, полученные в Примерах 4 и 5 и имеющие содержание сульфатов (% масс./масс.) 0,25 и 0,30 соответственно, обрабатывали неионным [SC 892 (S.D. Fine Chemicals, Индия) поверхностно-активным веществом. Концентрация поверхностно-активного вещества составляла 4% (масс./масс.) относительно экстракта. После завершения добавления поверхностно-активного вещества прекращали перемешивание и оставляли содержимое при комнатной температуре на 5 часов. Полное осаждение агарозного полимера состоялось в присутствии обоих неионных поверхностно-активных веществ. После осаждения агарозного полимера из экстрактов осажденный полимер собирали центрифугированием. Избыток поверхностно-активного вещества удаляли из агарозного полимера повторными промывками водой (6×1 литр), каждая из операций промывки проводилась при перемешивании водно-полимерной смеси в течение 15 минут или диализом после повторного диспергирования неочищенной агарозной массы, отделяя после этого агарозную массу путем удаления промывки центрифугированием. Влажную агарозу без поверхностно-активного вещества повторно растворяли в горячей воде для получения концентрированного раствора (7% масс./масс.). Затем обрабатывали изопропиловым спиртом в равном количестве для обезвоживания, обеспечивающего легко диспергируемую агарозу. Характеристики продуктов агарозного полимера, полученных из экстрактов морских водорослей Gracilaria dura и Gelidiella acerosa, после обработки SC 892 являются следующими. Агароза из Gracilaria dura: выход: 3,0 г (13,3%) в отношении абсолютного сухой водоросли; прочность геля (1% гель): >1800 г-см^-2 при 20°C; температура гелеобразования: 35,0°C; зола: <0,80%; сульфат: <0,23%.

Агароза из Gelidiella acerosa: Выход: 2,5 г (11,1%) относительно полностью высушенной водоросли; Прочность геля (1,5% гель): >1700 г см^-2 при 20°C; температура гелеобразования: 41,0°C; зола: <0,95%; сульфат: <0,27%.

Пример 18

Экстракты водорослей Gracilaria dura и Gelidiella acerosa, полученные, как описано в Примерах 4 и 5, и имеющие содержание сульфатов (% масс./масс.) 0,25 и 0,30 соответственно, обрабатывали неионным [Tween 80 (S.D. Fine Chemicals, Индия) поверхностно-активным веществом. Концентрация поверхностно-активного вещества составляла 4% (масс./масс.) относительно экстракта. После завершения добавления поверхностно-активного вещества прекращали перемешивание и оставляли содержимое при комнатной температуре на 5 часов. Полное осаждение агарозного полимера состоялось в присутствии обоих неионных поверхностно-активных веществ. После осаждения агарозного полимера из экстрактов осажденный полимер собирали центрифугированием. Избыток поверхностно-активного вещества удаляли из агарозного полимера повторными промывками водой (6×1 литр), каждая из операций промывки проводилась при перемешивании водно-полимерной смеси в течение 15 минут или диализом после повторного диспергирования неочищенной агарозной массы, отделяя после этого агарозную массу путем удаления промывки центрифугированием. Влажную агарозу без поверхностно-активного вещества повторно растворяли в горячей воде для получения концентрированного раствора (7% масс./масс.). Затем обрабатывали изопропиловым спиртом в равном количестве для обезвоживания, обеспечивающего легко диспергируемую агарозу. Характеристики продуктов агарозного полимера, полученных из экстрактов морских водорослей Gracilaria dura и Gelidiella acerosa после обработки неионного поверхностно-активного вещества Tween 80 являются следующими.

Агароза из Gracilaria dura: выход: 3,1 г (14,2%) в отношении абсолютно сухой водоросли; прочность геля (1% гель): >1700 г см^-2 при 20°C; температура гелеобразования: 35,0°C; зола: <0,80%; сульфат: <0,28%.

Агароза из Gelidiella acerosa: выход: 2,5 г (11,1%) относительно полностью высушенной водоросли; прочность геля (1,5% гель): >1600 г см^-2 при 20°C; температура гелеобразования: 41,0°C; зола: <0,95%; сульфат: <0,29%.

Пример 19

Экстракты морских водорослей Gracilaria dura и Gelidiella acerosa, полученные в Примерах 4 и 5, и имеющие содержание сульфатов (% масс./масс.) 0,25 и 0,30 соответственно, обрабатывали неионным [Atplus 245 (ICI Uniqema, Индия)] поверхностно-активным веществом. Концентрация поверхностно-активного вещества составляла 4% (масс./масс.) относительно экстракта. После завершения добавления поверхностно-активного вещества прекращали перемешивание и оставляли содержимое при комнатной температуре на 5 часов. Полное осаждение агарозного полимера состоялось в присутствии обоих неионных поверхностно-активных веществ. После осаждения агарозного полимера из экстрактов осажденный полимер собирали центрифугированием. Избыток поверхностно-активного вещества удаляли из агарозного полимера повторными промывками водой (6×1 литр), каждая из операций промывки проводилась при перемешивании водно-полимерной смеси в течение 15 минут или диализом после повторного диспергирования неочищенной агарозной массы, отделяя после этого агарозную массу путем удаления промывки центрифугированием. Влажную агарозу без поверхностно-активного вещества повторно растворяли в горячей воде для получения концентрированного раствора (7% масс./масс.). Затем обрабатывали изопропиловым спиртом в равном количестве для обезвоживания, обеспечивающего легко диспергируемую агарозу. Характеристики продуктов агарозного полимера, полученных из экстрактов морских водорослей Gracilaria dura и Gelidiella acerosa, после обработки Atplus 245 являются следующими.

Агароза из Gracilaria dura: выход: 2,7 г (12,0%) в отношении абсолютно сухой водоросли; прочность геля (1% гель): >1600 г см^-2 при 20°C; температура гелеобразования: 35,0°C; зола: <0,80%; сульфат: <0,25%.

Агароза из Gelidiella acerosa: выход: 2,3 г (10,2%) относительно полностью высушенной водоросли; прочность геля (1,5% гель): >1550 г см^-2 при 20°C; температура гелеобразования: 41,0°C; зола: <0,95%; сульфат: <0,28%.

Пример 20

Экстракты морских водорослей Gracilaria dura и Gelidiella acerosa, полученные в Примерах 4 и 5 с помощью 10 раствора NaOH при 60°C и имеющие содержание сульфатов (% масс./масс.) 0,29 и 0,41 соответственно, обрабатывали неионным [Triton X 100 (S.D. Fine Chemicals, Индия)] поверхностно-активным веществом. Концентрация поверхностно-активного вещества составляла 3% (масс./масс.) относительно экстракта. После завершения добавления поверхностно-активного вещества прекращали перемешивание и оставляли содержимое при комнатной температуре на 5 часов. Осаждение агарозного полимера состоялось в присутствии неионного поверхностно-активного вещества. После осаждения агарозного полимера из экстрактов осажденный полимер собирали центрифугированием. Избыток поверхностно-активного вещества удаляли из агарозного полимера повторными промывками водой (6×1 литр), каждая из операций промывки проводилась при перемешивании водно-полимерной смеси в течение 15 минут или диализом после повторного диспергирования неочищенной агарозной массы, отделяя после этого агарозную массу путем удаления промывки центрифугированием. Влажную агарозу без поверхностно-активного вещества повторно растворяли в горячей воде для получения концентрированного раствора (7% масс./масс.). Затем обрабатывали изопропиловым спиртом в равном количестве для обезвоживания, обеспечивающего легко диспергируемую агарозу.

Характеристики продуктов агарозного полимера, полученных из экстрактов морских водорослей Gracilaria dura и Gelidiella acerosa после обработки Triton X 100 являются следующими.

Агароза из Gracilaria dura: выход: 3,2 г (14,2%) в отношении абсолютно сухой водоросли; прочность геля (1% гель): >1400 г см^-2 при 20°C; температура гелеобразования: 35,0°C; зола: <0,80%; сульфат: <0,29%.

Агароза из Gelidiella acerosa: выход: 2,8 г (12,4%) относительно полностью высушенной водоросли; прочность геля (1,5% гель): >1200 г см^-2 при 20°C; температура гелеобразования: 41,0°C; зола: <1,2%; сульфат: <0,41%.

Пример 21

Экстракты морских водорослей Gracilaria dura и Gelidiella acerosa, полученные в Примерах 4 и 5 с помощью 10 раствора NaOH при 90°C и имеющие содержание сульфатов (% масс./масс.) 0,20 и 0,30 соответственно, обрабатывали неионным [Triton X 100 (S.D. Fine Chemicals, Индия)] поверхностно-активным веществом. Концентрация поверхностно-активного вещества составляла 3% (масс./масс.) относительно экстракта. После завершения добавления поверхностно-активного вещества прекращали перемешивание и оставляли содержимое при комнатной температуре на 5 часов. Осаждение агарозного полимера состоялось в присутствии неионного поверхностно-активного вещества. После осаждения агарозного полимера из экстрактов осажденный полимер собирали центрифугированием. Избыток поверхностно-активного вещества удаляли из агарозного полимера повторными промывками водой (6×1 литр), каждая из операций промывки проводилась при перемешивании водно-полимерной смеси в течение 15 минут или диализом после повторного диспергирования неочищенной агарозной массы, отделяя после этого агарозную массу путем удаления промывки центрифугированием. Влажную агарозу без поверхностно-активного вещества повторно растворяли в горячей воде для получения концентрированного раствора (7% масс./масс.). Затем обрабатывали изопропиловым спиртом в равном количестве для обезвоживания, обеспечивающего легко диспергируемую агарозу.

Характеристики продуктов агарозного полимера, полученных из экстрактов морских водорослей Gracilaria dura и Gelidiella acerosa, после обработки Triton X 100 являются следующими.

Агароза из Gracilaria dura: выход: 2,4 г (10,6%) в отношении абсолютно сухой водоросли; прочность геля (1% гель): >1900 г см^-2 при 20°C; температура гелеобразования: 35,0°C; зола: <0,80%; сульфат: <0,20%.

Агароза из Gelidiella acerosa: выход: 2,1 г (9,3%) относительно полностью высушенной водоросли; прочность геля (1,5% гель): >1800 г см^-2 при 20°C; температура гелеобразования: 41,0°C; зола: <1,2%; сульфат: <0,30%.

Пример 22

Экстракты морских водорослей Gracilaria dura и Gelidiella acerosa, полученные в Примерах 4 и 5 и имеющие содержание сульфатов (% масс./масс.) 0,21 и 0,30 соответственно, обрабатывали неионным [Triton X 100 (S.D. Fine Chemicals, Индия)] поверхностно-активным веществом при 60°C. Концентрация поверхностно-активного вещества составляла 3% (масс./масс.) относительно экстракта. После завершения добавления поверхностно-активного вещества прекращали перемешивание и оставляли содержимое при комнатной температуре на 5 часов. Осаждение агарозного полимера состоялось в присутствии неионного поверхностно-активного вещества. После осаждения агарозного полимера из экстрактов осажденный полимер собирали центрифугированием. Избыток поверхностно-активного вещества удаляли из агарозного полимера повторными промывками водой (6×1 литр), каждая из операций промывки проводилась при перемешивании водно-полимерной смеси в течение 15 минут или диализом после повторного диспергирования неочищенной агарозной массы, отделяя после этого агарозную массу путем удаления промывки центрифугированием. Влажную агарозу без поверхностно-активного вещества повторно растворяли в горячей воде для получения концентрированного раствора (7% масс./масс.). Затем обрабатывали изопропиловым спиртом в равном количестве для обезвоживания, обеспечивающего легко диспергируемую агарозу.

Характеристики продуктов агарозного полимера, полученных из экстрактов морских водорослей Gracilaria dura и Gelidiella acerosa, после обработки Triton X 100 являются следующими.

Агароза из Gracilaria dura: выход: 2,9 г (12,8%) в отношении абсолютно сухой водоросли; прочность геля (1% гель): >1900 г см^-2 при 20°C; температура гелеобразования: 35,0°C; зола: <0,86%; сульфат: <0,22%.

Агароза из Gelidiella acerosa: выход: 2,4 г (10,6%) относительно полностью высушенной водоросли; прочность геля (1,5% гель): >1800 г см^-2 при 20°C; температура гелеобразования: 41,0°C; зола: <1,0%; сульфат: <0,32%.

Пример 23

Экстракты морских водорослей Gracilaria dura и Gelidiella acerosa, полученные в Примерах 4 и 5 и имеющие содержание сульфатов (% масс./масс.) 0,20 и 0,30 соответственно, обрабатывали неионным [Triton X 100 (S.D. Fine Chemicals, Индия)] поверхностно-активным веществом при 90°C. Концентрация поверхностно-активного вещества составляла 3% (масс./масс.) относительно экстракта. После завершения добавления поверхностно-активного вещества прекращали перемешивание и оставляли содержимое при комнатной температуре на 5 часов. Осаждение агарозного полимера состоялось в присутствии неионного поверхностно-активного вещества. После осаждения агарозного полимера из экстрактов осажденный полимер собирали центрифугированием. Избыток поверхностно-активного вещества удаляли из агарозного полимера повторными промывками водой (6×1 литр), каждая из операций промывки проводилась при перемешивании водно-полимерной смеси в течение 15 минут или диализом после повторного диспергирования неочищенной агарозной массы, отделяя после этого агарозную массу путем удаления промывки центрифугированием. Влажную агарозу без поверхностно-активного вещества повторно растворяли в горячей воде для получения концентрированного раствора (7% масс./масс.). Затем обрабатывали изопропиловым спиртом в равном количестве для обезвоживания, обеспечивающего легко диспергируемую агарозу.

Характеристики продуктов агарозного полимера, полученных из экстрактов морских водорослей Gracilaria dura и Gelidiella acerosa, после обработки Triton X 100 являются следующими.

Агароза из Gracilaria dura: выход: 3,1 г (13,7%) в отношении абсолютно сухой водоросли; прочность геля (1% гель): >1900 г-см^-2 при 20°C; температура гелеобразования: 35,0°C; зола: <0,80%; сульфат: <0,20%.

Агароза из Gelidiella acerosa: выход: 2,5 г (11,1%) относительно полностью высушенной водоросли; прочность геля (1,5% гель): >1800 г см^-2 при 20°C; температура гелеобразования: 41,0°C; зола: <1,0%; сульфат: <0,29%.

Пример 24

Экстракт морских водорослей Gelidiella acerosa, полученный в примере 5 с помощью 8% раствора NaOH и имеющий содержание сульфатов (% масс./масс.) 0,84 соответственно, обрабатывали неионным [Triton X 100 (S.D. Fine Chemicals, Индия)] поверхностно-активным веществом. Концентрация поверхностно-активного вещества составляла 3% (масс./масс.) относительно экстракта. После завершения добавления поверхностно-активного вещества прекращали перемешивание и оставляли содержимое при комнатной температуре на 5 часов. Осаждение агарозного полимера состоялось в присутствии неионного поверхностно-активного вещества. После осаждения агарозного полимера из экстрактов осажденный полимер собирали центрифугированием. Избыток поверхностно-активного вещества удаляли из агарозного полимера повторными промывками водой (6×1 литр), каждая из операций промывки проводилась при перемешивании водно-полимерной смеси в течение 15 минут или диализом после повторного диспергирования неочищенной агарозной массы, отделяя после этого агарозную массу путем удаления промывки центрифугированием. Влажную агарозу без поверхностно-активного вещества повторно растворяли в горячей воде для получения концентрированного раствора (7% масс./масс.). Затем обрабатывали изопропиловым спиртом в равном количестве для обезвоживания, обеспечивающего легко диспергируемую агарозу.

Характеристики продуктов агарозного полимера, полученных из экстракта морских водорослей Gelidiella acerosa, после обработки Triton X 100 являются следующими.

Агароза из Gelidiella acerosa: выход: 2,2 г (9,7%) относительно полностью высушенной водоросли; прочность геля (1,5% гель): >950 г-см^-2 при 20°C; температура гелеобразования: 41,0°C; зола: <1,8%; сульфат: <0,82%.

Пример 25

Экстракт морских водорослей Gelidiella acerosa, полученный в Примерах 4 и 5 с помощью 6% раствора NaOH при 80°C и имеющий содержание сульфатов 0,91% (масс./масс.) соответственно, обрабатывали пятью неионными [Triton X 100 (S.D. Fine Chemicals, Индия); Synperonic 91/6 (ICI Uniqema, Индия); SC-892 (ICI Uniqema, Индия); Tween-80 (ICI Uniqema) и Atplus 245 (ICI Uniqema, Индия)] поверхностно-активными веществами. После завершения добавления поверхностно-активного вещества прекращали перемешивание и оставляли содержимое при комнатной температуре на 5 часов. В присутствии неионных поверхностно-активных веществ надлежащего осаждения агарозного полимера не состоялось.

Этот пример показал, что надлежащее осаждение не наблюдается, если содержание сульфатов в экстрактах водорослей составляет 0,91% (масс./масс.).

Пример 26

Экстракт морских водорослей Gelidiella acerosa, полученный в Примерах 4 и 5 с помощью 4% раствора NaOH при 80°C и имеющий содержание сульфатов 1,17% (масс./масс.) соответственно, обрабатывали пятью неионными [Triton X 100 (S.D. Fine Chemicals, Индия); Synperonic 91/6 (ICI Uniqema, Индия); SC-892 (ICI Uniqema, Индия); Tween-80 (ICI Uniqema) и Atplus 245 (ICI Uniqema, Индия)] поверхностно-активными веществами. После завершения добавления поверхностно-активного вещества прекращали перемешивание и оставляли содержимое при комнатной температуре на 5 часов. В присутствии неионного поверхностно-активного вещества осаждение агарозного полимера не состоялось.

Этот пример показал, что надлежащее осаждение не наблюдается, если содержание сульфатов составляет 1,17% (масс./масс.) в экстрактах водорослей.

Пример 27

Морские водоросли Gracilaria corticata, Gracilaria foliifera и Gracilaria milardetii (по 25 г каждой) замачивали в водопроводной воде на 1 ч при 35°C и затем при 80°C в NaOH на 2 ч. Обработанные щелочью морские водоросли отмывали водой, а затем помещали в дистиллированную воду (морские водоросли : вода 1:35 масс./масс.) и автоклавировали при 120°C в течение 1,5 ч. Экстракт гомогенизировали и центрифугировали для получения экстракта, свободного от нерастворимых примесей. Горячий экстракт морских водорослей Gracilaria corticata, Gracilaria foliifera и Gracilaria milardetii, имеющий содержание сульфатов в диапазоне 3-6% (масс./масс.), обрабатывали двумя катионными [цетилтриметиламмонийбромид (СТАВ) и цетилпиридинийхлорид (СРС)], тремя анионными [лаурилсульфат натрия (SLS); SC-896 (ICI Uniqema, Индия) и SC-229 (ICI Uniqema, Индия)] и пятью неионными [Тритон Х-100 (С.D. Fine Chemicals, Индия); Synperonic 91/6 (ICI Uniqema, Индия); SC-892 (ICI Uniqema, Индия); Tween-80 (ICI Uniqema) и Atplus 245 (ICI Uniqema, Индия)] поверхностно-активными веществами. Поверхностно-активное вещество добавляли постепенно в неразбавленном виде при интенсивном перемешивании. Концентрация взятого поверхностно-активного вещества составляла 5% (масс./масс.) относительно экстракта. После завершения добавления поверхностно-активного вещества прекращали перемешивание и оставляли содержимое при комнатной температуре на 5-10 часов. Не наблюдали осадок ни в одном из этих случаев.

Пример 28

Выросшие естественным образом в воде Индийского океана морские водоросли Gelidium pusillum (25 г) замачивали в водопроводной воде на 1 ч при 35°C и затем при 80°C в NaOH на 2 ч. Обработанные щелочью морские водоросли отмывали водой, а затем помещали в дистиллированную воду (морские водоросли : вода 1:35 масс./масс.) и автоклавировали при 120°C в течение 1,5 ч. Экстракт гомогенизировали и центрифугировали для получения экстракта, свободного от нерастворимых примесей. Горячий экстракт морских водорослей Gelidium pusillum, имеющий содержание сульфатов в диапазоне 0,5% (масс./масс.), обрабатывали двумя катионными [цетилтриметиламмонийбромид (СТАВ) и цетилпиридинийхлорид (СРС)], тремя анионными [лаурилсульфат натрия (SLS); SC-896 (ICI Uniqema, Индия) и SC-229 (ICI Uniqema, Индия)] и пятью неионными [Тритон Х-100 (С.D. Fine Chemicals, Индия); Synperonic 91/6 (ICI Uniqema, Индия); SC-892 (ICI Uniqema, Индия); Tween-80 (ICI Uniqema) и Atplus 245 (ICI Uniqema, Индия)] поверхностно-активными веществами. Концентрация поверхностно-активного вещества составляла 4% (масс./масс.) относительно экстракта. После завершения добавления поверхностно-активного вещества прекращали перемешивание и оставляли содержимое при комнатной температуре на 5 часов. Осаждение агарозного полимера состоялось в присутствии пяти неионных поверхностно-активных веществ. После осаждения агарозного полимера из экстрактов, осажденный полимер собирали центрифугированием. Избыток поверхностно-активного вещества удаляли из агарозного полимера повторными промывками водой (6×1 литр), каждая из операций промывки проводилась при перемешивании водно-полимерной смеси в течение 15 минут или диализом после повторного диспергирования неочищенной агарозной массы, отделяя после этого агарозную массу путем удаления промывки центрифугированием. Влажную агарозу без поверхностно-активного вещества повторно растворяли в горячей воде для получения концентрированного раствора (7% масс./масс.). Затем обрабатывали изопропиловым спиртом в равном количестве для обезвоживания, обеспечивающего легко диспергируемую агарозу. Осаждение не наблюдалось в присутствии двух катионных и трех анионных поверхностно-активных веществ. Агароза осаждалась в присутствии пяти неионных поверхностно-активных веществ.

Характеристики продуктов агарозного полимера, полученных из экстрактов растущих естественным образом Gelidium pusillum, после обработки Triton X 100, Synperonic 91/6, SC-892, Tween-80 и Atplus 245 являются следующими.

Характеристики агарозы с Triton Х-100/Synperonic 91/6: выход: 1,5 г (6,5%) относительно полностью высушенной водоросли; прочность геля (1,5% гель): >900 г см^-2 при 20°C; температура гелеобразования: 34,0°C; зола: <1,0%; сульфат: <0,50%.

Характеристики агарозы с SC 892/Tween 80/Atplus 245: выход: 1,66 г (7,3%) относительно полностью высушенной водоросли; прочность геля (1,5% гель): >850 г см^-2 при 20°C; температура гелеобразования: 34,0°C; зола: <1,0%; сульфат: <0,62%.

Преимущества настоящего изобретения

Основное преимущество настоящего изобретения заключается в возможности получения агарозы, демонстрирующей желательные технические характеристики, из видов Gracilaria dura и Gelidiella acerosa из вод Индийского океана по способу, который является менее капиталоемким и более удобным для реализации в сопоставлении с тем, что имело место на предшествующем уровне техники и тем не менее приводит к получению продукта сопоставимого качества.

Еще одно преимущество заключается в получении агарозы по более энергоэффективному способу, позволяющему обойтись без операции замораживания-оттаивания.

Еще одно преимущество заключается в осветлении горячего экстракта морских водорослей в результате центрифугирования, где данный способ обходится без потребности в целите и древесном угле в качестве осветляющих средств.

Еще одно преимущество заключается в растворимости в воде всех неионных поверхностно-активных веществ, использующихся в настоящем изобретении, что делает возможным их легкое удаление из продукта в результате простого водного промывания.

Еще одно преимущество заключается в возможности отправления поверхностно-активного вещества на рецикл.

Еще одно преимущество заключается в том, что продукт после коагулирования из экстракта и промывания делается легче диспергируемым в воде благодаря получению высокой концентрации водной дисперсии и осаждению минимальным количеством спирта с образованием продукта, характеризующегося желательным диапазоном размеров частиц, что тем самым позволяет обойтись без потребности в каком-либо измельчении в порошок.

Еще одно преимущество заключается в пригодности такого рафинированного продукта для гель-электрофореза ДНК при концентрациях, меньших, чем требующиеся для хорошо известных коммерческих продуктов.

Еще одно преимущество заключается в способности качества полученной агарозы сохраняться в контейнерах из пластика, по меньшей мере, вплоть до 1 года без какого-либо ухудшения.

1. Способ очистки агарозы из водного экстракта морских водорослей с использованием поверхностно-активных веществ, который включает стадии:
a. центрифугирования подвергнутого щелочной обработке горячего экстракта морских водорослей (70-80°C) при 10000-14000 об/мин в течение 5-15 минут;
b. смешивания горячего экстракта морских водорослей (70-80°C), полученного на стадии (а), с 2-5% поверхностно-активных веществ при температуре в диапазоне 60-100°C при непрерывном перемешивании;
c. обеспечения выстаивания содержимого, полученного на стадии (b), в течение 1-10 часов при температуре в диапазоне 25-35°C для осаждения твердой массы агарозы;
d. декантирования жидкого супернатанта и промывания упомянутой массы водой для удаления остаточных поверхностно-активных веществ в твердом веществе;
e. повторного растворения влажной массы, полученной на стадии (d), в минимальном количестве воды в диапазоне от 7 до 10% (масс./масс.) в расчете на массу агарозного продукта и обработки минимальным количеством изопропанола, где соотношение между количествами золя агарозы и изопропанола находится в диапазоне от 1:0,5 до 1:1,5 (масс./масс.), для осаждения агарозы;
f. выделения твердого продукта и высушивания в подходящей сушилке для получения порошкообразной агарозы, соответствующей номеру сита по американскому стандарту в диапазоне от 200 до 300,
где морские водоросли, использующиеся для получения экстракта, выбирают из видов Gracilaria и Gelidiella, предпочтительно из видов Gracilaria dura и Gelidiella acerosa из вод Индийского океана, которые получали на морских побережьях Гуджарата и Тамилнада,
указанное поверхностно-активное вещество является неионным поверхностно-активным веществом, выбираемым из коммерчески доступных октилфенолэтоксилата (Triton Х-100) и нонилфенолэтоксилата (Synperonic 91/6), и указанное поверхностно-активное вещество индуцирует флоккулирование только при уровне содержания сульфата у агарозы <0,82% (масс./масс.), предпочтительно <0,5% (масс./масс.), а еще более предпочтительно <0,25%.

2. Способ по п.1, где экстракт морских водорослей получали согласно способу, включающему стадии обработки сухих морских водорослей 20-35 частями (масс./масс.) водного раствора гидроксида натрия с концентрацией 1-15% (масс./масс.) при 25-95°C в течение 0,5-5 часов с последующим промыванием для доведения значения рН до величины в диапазоне 7-9, после этого добавлением деминерализованной воды к промытым морским водорослям и автоклавированием при температуре в диапазоне 100-125°C в течение 1-2,5 часов.

3. Способ по п.1, где стадию промывания или диализа на стадии (d) проводят в условиях окружающей среды вплоть до получения поверхностного натяжения промывных вод, того же самого, что и у воды.

4. Способ по п.1, где поверхностно-активное вещество отправляют на рецикл из отработанного экстракта и промывных вод.

5. Способ по п.1, который является подходящим для использования при очистке тех полисахаридов, которые или по самой своей природе характеризуются низким уровнем содержания сульфата и/или могут быть подвергнуты химическому или биохимическому десульфатированию до такого низкого уровня содержания сульфата.

6. Способ по п.1, где полученная полимерная агароза является подходящей для гель-электрофореза ДНК.

7. Способ по п.1, где качество полученной агарозы способно сохраняться в контейнерах из пластика, по меньшей мере, вплоть до 1 года без какого-либо ухудшения.