Способ экстрагирования говяжьего пепсина


 


Владельцы патента RU 2541639:

Федеральное государственное бюджетное научное учреждение "Всероссийский научно-исследовательский институт маслоделия и сыроделия" (ФГБНУ ВНИИМС) (RU)

Изобретение относится к области биотехнологии. Предложен способ экстрагирования говяжьего пепсина. Готовят кислотный экстракт слизистых оболочек сычугов КРС. Фермент экстрагируют одновременно с размораживанием замороженных блоков слизистых оболочек сычугов КРС однократно раствором соляной кислоты с pH 1,3-1,5 при медленном периодическом перемешивании. Экстракт отделяют от сырья и фильтруют под давлением 0,015-0,02 МПа. Преимуществом способа является упрощение и сокращение продолжительности технологического процесса и повышение качества получаемого фермента. 2 пр.

 

Изобретение относится к получению говяжьего пепсина из слизистых оболочек сычугов крупного рогатого скота (КРС), которые являются источником молокосвертывающих ферментов, и может быть использовано в пищевой промышленности при производстве молокосвертывающих ферментных препаратов, а также в ветеринарии, микробиологической промышленности и медицине.

Известен способ получения молокосвертывающего ферментного препарата (Патент на изобретение №2392320, МПК C12N 9/00 (2006.01) / Способ производства молокосвертывающего ферментного препарата / Ельчанинов В.В., Белов А.Н., Коваль А.Д.).

Способ осуществляется следующим образом:

Исходное сырье - замороженные сычуги телят, ягнят или козлят - гомогенизируют и экстрагируют подкисленным водным раствором. Для этого их размораживают, промывают проточной холодной водой и измельчают на мясорубке. Полученный фарш заливают 2-4 объемами дистиллированной воды и перемешивают в течение 30-60 мин. В полученную смесь вносят 2,0 М соляную кислоту до pH 2,0-2,5, перемешивают в течение 30-60 мин, контролируют pH и оставляют на 12 часов для экстрагирования молокосвертывающего фермента. Процесс экстракции на первой стадии ведут при температуре 18-22°С. Затем следует внесение в полученный экстракт сульфата аммония, отстаивание полученной смеси до разделения ее на жидкую фазу и осадок, выделение молокосвертывающего фермента, его сушка и последующая обработка.

К недостаткам прототипа относится, в первую очередь, подготовка сырья:

- размораживание блоков слизистых оболочек сычугов КРС в течение суток на воздухе при температуре не выше 30°C, что приводит к неконтролируемому росту микрофлоры и вытеканию жидкости, содержащей ферменты;

- промывка слизистых оболочек приводит к дальнейшим потерям ферментов;

- последующее измельчение слизистых оболочек приводит к повышенному выходу в экстракт посторонних (нецелевых) белков (коллагена, гемоглобина, миоглобина и др.), усложняющих очистку и снижающих качество конечного продукта;

- указанные посторонние белки расщепляются пепсином в ходе технологического процесса, что создает дополнительные проблемы с очисткой препарата. Известно, что в технологии производства пепсина лимитирующим является этап фильтрования: большое количество белковых веществ различной степени фрагментированности быстро приводит к забиванию фильтров. Конечный продукт содержит большое количество (несколько процентов) балластных веществ - нерастворимого остатка, а это приводит к появлению горечи и снижению качества молочных продуктов, в частности сыров, выработанных с таким препаратом. В этом самый большой порок отечественных молокосвертывающих препаратов.

В то же время не учитывается, что пепсин является экзоферментом (выделяется наружу, во внеклеточное пространство) и разрушение клеток слизистой не является необходимым условием экстрагирования фермента. При промывании слизистой пепсин смывается водой и теряется безвозвратно. Этому факту не придавали значения, поскольку при нейтральной реакции воды фермент присутствует в форме неактивного предшественника - пепсиногена.

Задачей, на решение которой направлено заявляемое изобретение, является упрощение и сокращение продолжительности технологического процесса посредством исключения стадии размораживания блоков слизистых оболочек сычугов КРС, снижение содержания примесей в экстракте и связанное с этим ускорение (облегчение) фильтрования, снижение энергоемкости и удешевление процесса, так как размораживание и экстрагирование осуществляется без дополнительного подведения энергии, полное отсутствие в экстракте нерастворимого остатка и подавление развития микрофлоры при размораживании по причине неблагоприятной для нее величины pH.

Техническим результатом, достигаемым при осуществлении предлагаемого изобретения, является оптимизация технологических режимов процесса получения говяжьего пепсина для повышения его качества, упрощение, удешевление и ускорение технологического процесса (за счет сокращения его длительности и энергоемкости).

Указанный технический результат достигается тем, что в способе экстрагирования говяжьего пепсина, включающем экстракцию фермента раствором соляной кислоты, отделение жидкой фазы, фильтрование, согласно изобретению экстракцию фермента проводят одновременно с размораживанием замороженных блоков слизистых оболочек сычугов КРС однократно раствором соляной кислоты с pH 1,3-1,5 при температуре 4-20°C в течение 24-48 часов и медленном периодическом перемешивании без дополнительного доведения pH, экстракт отделяют от сырья, фильтруют под давлением 0,015-0,02 МПа при температуре 20-25°C.

Для более полного извлечения фермента возможно повторное экстрагирование. Вторую экстракцию проводят раствором соляной кислоты в тех же условиях, при этом объем раствора соляной кислоты снижают втрое во избежание разбавления препарата.

Предлагаемое изобретение реализуется следующим образом:

Замороженные блоки слизистых оболочек сычугов КРС заливают раствором соляной кислоты с pH 1,3-1,5 с температурой 18-20°C. Для этого используют 5-10 дм3 раствора на 1 кг слизистой. Смесь оставляют на 24-48 часов при температуре 4-20°C для размораживания и одновременной экстракции пепсина. Процесс не требует дополнительного доведения pH.

В процессе экстрагирования содержимое экстрактора периодически медленно перемешивают. После завершения экстракции экстракт (надосадочную жидкость) сливают через фильтрующий материал (лавсан или 3-4 слоя марли) в отдельную емкость.

Отработанную массу слизистой по завершении экстрагирования направляют на промышленную переработку (например, для производства гидролизатов белка).

Замеряют объем экстракта, затем фильтруют на фильтр-прессе с использованием в качестве фильтрующей перегородки фильтровальной бумаги и фильтровальной ткани под давлением 0,015-0,02 МПа при температуре 20-25°С. Низкие температуры замедляют фильтрование.

Для получения готового препарата пепсин концентрируют известными способами (осаждение и сушка или концентрирование).

Определяют молокосвертывающую активность и при необходимости ферментный состав готового экстракта для квалификации его кондиционности по методикам ГОСТ Р 52688-2006.

Сопоставительный анализ заявляемого решения с прототипом показывает, что отличительными признаками от прототипа являются следующие:

- однородный жидкий экстракт пепсина;

- полное отсутствие в экстракте нерастворимого остатка (0%);

- упрощение и ускорение технологического процесса посредством оптимизации его параметров:

за счет одновременного проведения процесса размораживания и процесса экстрагирования слизистых оболочек сычугов;

за счет ускорения фильтрации экстракта, содержащего пониженное по сравнению с прототипом количество посторонних белков;

- снижение энергоемкости и удешевление процесса, так как процесс экстрагирования идет без дополнительного расхода энергии на подогрев или охлаждение.

Пример 1

2 кг замороженных слизистых оболочек сычугов КРС заливают раствором соляной кислоты с pH 1,5 в объеме 10 л и оставляют на сутки при температуре в помещении 20°C, периодически медленно перемешивают. Через 24 часа отцеживают экстракт через лавсан, получают 9,350 л экстракта с pH 2,47. Фильтруют на фильтр-прессе с использованием в качестве фильтрующей перегородки фильтровальной бумаги и фильтровальной ткани под давлением 0,02 МПа при температуре 20°C.

Молокосвертывающая активность экстракта равна 1400 усл. ед./мл. Суммарный выход активности находят, умножив активность одного миллилитра экстракта на его объем. Разделив суммарный выход активности на вес слизистой, взятый для экстракции, находят выход молокосвертывающей активности из 1 г сырья.

В результате выход молокосвертывающей активности из 1 г сырья составил 6500 усл. ед. (в контроле, выработанном по действующей технологии, 6480 усл. ед.).

Скорость фильтрования через фильтровальную бумагу в варианте по прототипу была ниже в несколько (15-20) раз.

Пример 2

1,103 кг замороженных слизистых оболочек сычугов КРС заливают раствором соляной кислоты с pH 1,3 в объеме 5,5 л и оставляют на сутки при температуре в помещении 18°C, периодически медленно перемешивают. Через 24 часа отцеживают экстракт через лавсан, получают 5,5 л экстракта с pH 1,73. Фильтруют на фильтр-прессе с использованием в качестве фильтрующей перегородки фильтровальной бумаги и фильтровальной ткани под давлением 0,02 МПа при температуре 20°C.

Молокосвертывающая активность экстракта равна 1540 усл. ед./мл. Суммарный выход активности находят, умножив активность одного миллилитра экстракта на его объем. Разделив суммарный выход активности на вес слизистых оболочек сычугов, взятый для экстракции, находят выход молокосвертывающей активности из 1 г сырья.

В результате выход молокосвертывающей активности из 1 г сырья составил 7600 усл. ед., тогда как в контроле, выработанном по действующей технологии, выход активности равнялся 7300 усл. ед. рН экстракта была на уровне 1,73 ед. рН.

Скорость фильтрования через фильтровальную бумагу в варианте по прототипу была ниже в 5 раз.

Таким образом, предлагаемый способ экстрагирования говяжьего пепсина позволяет повысить качество экстракта за счет снижения количества примесей, сократить продолжительность процесса за счет совмещения размораживания и экстрагирования, а также обеспечить существенное ускорение фильтрования без снижения выхода активного фермента.

Способ экстрагирования говяжьего пепсина, включающий экстракцию фермента раствором соляной кислоты, отделение жидкой фазы, фильтрование, отличающийся тем, что экстракцию фермента проводят одновременно с размораживанием замороженных блоков слизистых оболочек сычугов КРС однократно раствором соляной кислоты с pH 1,3-1,5 при температуре 4-20°C в течение 24-48 часов и медленном периодическом перемешивании без дополнительного доведения pH, экстракт отделяют от сырья, фильтруют под давлением 0,015-0,02 МПа при температуре 20-25°C.



 

Похожие патенты:

Группа изобретений относится к области медицины, в частности к лечению гемофилии. Конъюгаты фактора IX модифицированы для включения биосовместимого полимерного фрагмента.
Изобретение относится к способам производства ферментных препаратов, главным образом из сырья животного происхождения, и может быть использовано на предприятиях по переработке животного сырья, например для приготовления применяемых в сыроделии молокосвертывающих ферментных препаратов.

Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к получению слитых с альбумином полипептидов фактора VII (FVII) и фактора VIIa (FVIIa), и может быть использовано в медицине.

Изобретение относится к производству сычужного фермента из сычугов телят, ягнят и козлят-молочников и может быть использовано в молочной промышленности при производстве молокосвертывающих ферментных препаратов, а также в ветеринарии, микробиологической промышленности и медицине.

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к получению высокоочищенных высокоактивных препаратов ингибиторов, которые могут быть использованы в биохимии, медицине, фармакологии, патофизиологии, для терапии тромбоэмболических заболеваний, а также для исследовательских целей.

Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к выделению сериновых протеаз, содержащих GLA-остаток, и может быть использовано в медицине. .

Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к получению полипептидов фактора VII, и может быть использовано в медицине. .

Изобретение относится к области биотехнологии и представляет собой способ получения рекомбинантного ингибитора сериновых протеиназ из гепатопанкреаса камчатского краба, заключающийся в том, что из гепатопанкреаса камчатского краба Paralithodes camtchaticus выделяют РНК и осуществляют синтез кДНК ингибитора PC из суммарной РНК методом обратной транскрипции, которую амплифицируют методом полимеразной цепной реакции с праймерами, полученный ПЦР-продукт, содержащий ген ингибитора PC, кодирующий ингибитор PC c аминокислотной последовательностью, показанной на фиг. 2, клонируют в экспрессионный вектор, с последующей трансформацией в клетки E. coli, полученные при этом рекомбинантные штаммы E. coli культивируют в течение не более 20 час при 37°C, а полученную биомассу подвергают центрифугированию, отмывают от остатков среды, ресуспендируют в буфере лизиса и лизируют, выделяют тельца включения из полученной биомассы разрушением ультразвуком, лизат ресуспендируют в буфере промывки и снова осаждают тельца включения, полученные тельца включения растворяют в 8 М мочевине и повергают предварительной очистке на сорбенте с градиентной элюцией буфером, содержащем 8 М мочевину и 0,7 М NaCl, после чего проводят ренатурацию растворенного ингибитора, методом снижения концентрации денатуранта в буфере 20 мМ MES-NaOH pH 6.0 или 20 мМ MES-NaOH pH 6.0, 2 М NaCl, 0,05% PEG 6000 и последующую очистку препарата ионообменной хроматографией. Изобретение позволяет получить ингибитор сериновых протеиназ, обладающий улучшенными ингибиторными свойствами по отношению к коллагеназе, трипсину и субтилизину. 5 з.п. ф-лы, 8 ил., 1 табл., 2 пр.

Изобретение относится к биотехнологии и представляет собой полинуклеотидную молекулу с SEQ ID №4 или 6, кодирующую легкую цепь энтерокиназы. Изобретение относится также к дрожжевому экспрессионному конструкту, содержащему указанную последовательность, а также к дрожжевой клетке, трансформированной конструктом. Изобретение касается также способа продуцирования энтерокиназы с использованием такой клетки. Изобретение позволяет эффективно получать энтерокиназу. 4 н. и 9 з.п. ф-лы, 1 ил., 3 табл., 6 пр.

Настоящее изобретение относится к биотехнологии. Предложен способ очистки коагуляционного фактора IX (FIX). Способ включает хроматографию с использованием мультимодальной смолы, при которой осуществляется контакт фракции, содержащей FIX, с мультимодальной смолой, промывка промывочным буфером для удаления примесей и элюирование FIX с мультимодальной смолы буфером, содержащим аргинин, с последующим сбором фракций, содержащих FIX, в очищенной или обогащенной форме. Предложенный способ дает возможность дальнейшего использования стадии очистки целевого белка, связанного с мультимодальной смолой, перед элюированием, а также возможность проведения элюирования в мягких условиях. Предложенный способ может быть использован в биохимии для очистки коагуляционного фактора IX. 15 з.п. ф-лы, 1 ил., 17 табл., 7 пр.
Наверх