Способ экстрагирования говяжьего пепсина

Авторы патента:

Абрамов Дмитрий Васильевич (RU)

Мурунова Галина Васильевна (RU)

Муничева Татьяна Эдуардовна (RU)

Свириденко Юрий Яковлевич (RU)

C12N9/64 - получаемые из животной ткани, например реннин

Владельцы патента RU 2541639:

Федеральное государственное бюджетное научное учреждение "Всероссийский научно-исследовательский институт маслоделия и сыроделия" (ФГБНУ ВНИИМС) (RU)

Изобретение относится к области биотехнологии. Предложен способ экстрагирования говяжьего пепсина. Готовят кислотный экстракт слизистых оболочек сычугов КРС. Фермент экстрагируют одновременно с размораживанием замороженных блоков слизистых оболочек сычугов КРС однократно раствором соляной кислоты с pH 1,3-1,5 при медленном периодическом перемешивании. Экстракт отделяют от сырья и фильтруют под давлением 0,015-0,02 МПа. Преимуществом способа является упрощение и сокращение продолжительности технологического процесса и повышение качества получаемого фермента. 2 пр.

Изобретение относится к получению говяжьего пепсина из слизистых оболочек сычугов крупного рогатого скота (КРС), которые являются источником молокосвертывающих ферментов, и может быть использовано в пищевой промышленности при производстве молокосвертывающих ферментных препаратов, а также в ветеринарии, микробиологической промышленности и медицине.

Известен способ получения молокосвертывающего ферментного препарата (Патент на изобретение №2392320, МПК C12N 9/00 (2006.01) / Способ производства молокосвертывающего ферментного препарата / Ельчанинов В.В., Белов А.Н., Коваль А.Д.).

Способ осуществляется следующим образом:

Исходное сырье - замороженные сычуги телят, ягнят или козлят - гомогенизируют и экстрагируют подкисленным водным раствором. Для этого их размораживают, промывают проточной холодной водой и измельчают на мясорубке. Полученный фарш заливают 2-4 объемами дистиллированной воды и перемешивают в течение 30-60 мин. В полученную смесь вносят 2,0 М соляную кислоту до pH 2,0-2,5, перемешивают в течение 30-60 мин, контролируют pH и оставляют на 12 часов для экстрагирования молокосвертывающего фермента. Процесс экстракции на первой стадии ведут при температуре 18-22°С. Затем следует внесение в полученный экстракт сульфата аммония, отстаивание полученной смеси до разделения ее на жидкую фазу и осадок, выделение молокосвертывающего фермента, его сушка и последующая обработка.

К недостаткам прототипа относится, в первую очередь, подготовка сырья:

- размораживание блоков слизистых оболочек сычугов КРС в течение суток на воздухе при температуре не выше 30°C, что приводит к неконтролируемому росту микрофлоры и вытеканию жидкости, содержащей ферменты;

- промывка слизистых оболочек приводит к дальнейшим потерям ферментов;

- последующее измельчение слизистых оболочек приводит к повышенному выходу в экстракт посторонних (нецелевых) белков (коллагена, гемоглобина, миоглобина и др.), усложняющих очистку и снижающих качество конечного продукта;

- указанные посторонние белки расщепляются пепсином в ходе технологического процесса, что создает дополнительные проблемы с очисткой препарата. Известно, что в технологии производства пепсина лимитирующим является этап фильтрования: большое количество белковых веществ различной степени фрагментированности быстро приводит к забиванию фильтров. Конечный продукт содержит большое количество (несколько процентов) балластных веществ - нерастворимого остатка, а это приводит к появлению горечи и снижению качества молочных продуктов, в частности сыров, выработанных с таким препаратом. В этом самый большой порок отечественных молокосвертывающих препаратов.

В то же время не учитывается, что пепсин является экзоферментом (выделяется наружу, во внеклеточное пространство) и разрушение клеток слизистой не является необходимым условием экстрагирования фермента. При промывании слизистой пепсин смывается водой и теряется безвозвратно. Этому факту не придавали значения, поскольку при нейтральной реакции воды фермент присутствует в форме неактивного предшественника - пепсиногена.

Задачей, на решение которой направлено заявляемое изобретение, является упрощение и сокращение продолжительности технологического процесса посредством исключения стадии размораживания блоков слизистых оболочек сычугов КРС, снижение содержания примесей в экстракте и связанное с этим ускорение (облегчение) фильтрования, снижение энергоемкости и удешевление процесса, так как размораживание и экстрагирование осуществляется без дополнительного подведения энергии, полное отсутствие в экстракте нерастворимого остатка и подавление развития микрофлоры при размораживании по причине неблагоприятной для нее величины pH.

Техническим результатом, достигаемым при осуществлении предлагаемого изобретения, является оптимизация технологических режимов процесса получения говяжьего пепсина для повышения его качества, упрощение, удешевление и ускорение технологического процесса (за счет сокращения его длительности и энергоемкости).

Указанный технический результат достигается тем, что в способе экстрагирования говяжьего пепсина, включающем экстракцию фермента раствором соляной кислоты, отделение жидкой фазы, фильтрование, согласно изобретению экстракцию фермента проводят одновременно с размораживанием замороженных блоков слизистых оболочек сычугов КРС однократно раствором соляной кислоты с pH 1,3-1,5 при температуре 4-20°C в течение 24-48 часов и медленном периодическом перемешивании без дополнительного доведения pH, экстракт отделяют от сырья, фильтруют под давлением 0,015-0,02 МПа при температуре 20-25°C.

Для более полного извлечения фермента возможно повторное экстрагирование. Вторую экстракцию проводят раствором соляной кислоты в тех же условиях, при этом объем раствора соляной кислоты снижают втрое во избежание разбавления препарата.

Предлагаемое изобретение реализуется следующим образом:

Замороженные блоки слизистых оболочек сычугов КРС заливают раствором соляной кислоты с pH 1,3-1,5 с температурой 18-20°C. Для этого используют 5-10 дм³ раствора на 1 кг слизистой. Смесь оставляют на 24-48 часов при температуре 4-20°C для размораживания и одновременной экстракции пепсина. Процесс не требует дополнительного доведения pH.

В процессе экстрагирования содержимое экстрактора периодически медленно перемешивают. После завершения экстракции экстракт (надосадочную жидкость) сливают через фильтрующий материал (лавсан или 3-4 слоя марли) в отдельную емкость.

Отработанную массу слизистой по завершении экстрагирования направляют на промышленную переработку (например, для производства гидролизатов белка).

Замеряют объем экстракта, затем фильтруют на фильтр-прессе с использованием в качестве фильтрующей перегородки фильтровальной бумаги и фильтровальной ткани под давлением 0,015-0,02 МПа при температуре 20-25°С. Низкие температуры замедляют фильтрование.

Для получения готового препарата пепсин концентрируют известными способами (осаждение и сушка или концентрирование).

Определяют молокосвертывающую активность и при необходимости ферментный состав готового экстракта для квалификации его кондиционности по методикам ГОСТ Р 52688-2006.

Сопоставительный анализ заявляемого решения с прототипом показывает, что отличительными признаками от прототипа являются следующие:

- однородный жидкий экстракт пепсина;

- полное отсутствие в экстракте нерастворимого остатка (0%);

- упрощение и ускорение технологического процесса посредством оптимизации его параметров:

за счет одновременного проведения процесса размораживания и процесса экстрагирования слизистых оболочек сычугов;

за счет ускорения фильтрации экстракта, содержащего пониженное по сравнению с прототипом количество посторонних белков;

- снижение энергоемкости и удешевление процесса, так как процесс экстрагирования идет без дополнительного расхода энергии на подогрев или охлаждение.

Пример 1

2 кг замороженных слизистых оболочек сычугов КРС заливают раствором соляной кислоты с pH 1,5 в объеме 10 л и оставляют на сутки при температуре в помещении 20°C, периодически медленно перемешивают. Через 24 часа отцеживают экстракт через лавсан, получают 9,350 л экстракта с pH 2,47. Фильтруют на фильтр-прессе с использованием в качестве фильтрующей перегородки фильтровальной бумаги и фильтровальной ткани под давлением 0,02 МПа при температуре 20°C.

Молокосвертывающая активность экстракта равна 1400 усл. ед./мл. Суммарный выход активности находят, умножив активность одного миллилитра экстракта на его объем. Разделив суммарный выход активности на вес слизистой, взятый для экстракции, находят выход молокосвертывающей активности из 1 г сырья.

В результате выход молокосвертывающей активности из 1 г сырья составил 6500 усл. ед. (в контроле, выработанном по действующей технологии, 6480 усл. ед.).

Скорость фильтрования через фильтровальную бумагу в варианте по прототипу была ниже в несколько (15-20) раз.

Пример 2

1,103 кг замороженных слизистых оболочек сычугов КРС заливают раствором соляной кислоты с pH 1,3 в объеме 5,5 л и оставляют на сутки при температуре в помещении 18°C, периодически медленно перемешивают. Через 24 часа отцеживают экстракт через лавсан, получают 5,5 л экстракта с pH 1,73. Фильтруют на фильтр-прессе с использованием в качестве фильтрующей перегородки фильтровальной бумаги и фильтровальной ткани под давлением 0,02 МПа при температуре 20°C.

Молокосвертывающая активность экстракта равна 1540 усл. ед./мл. Суммарный выход активности находят, умножив активность одного миллилитра экстракта на его объем. Разделив суммарный выход активности на вес слизистых оболочек сычугов, взятый для экстракции, находят выход молокосвертывающей активности из 1 г сырья.

В результате выход молокосвертывающей активности из 1 г сырья составил 7600 усл. ед., тогда как в контроле, выработанном по действующей технологии, выход активности равнялся 7300 усл. ед. рН экстракта была на уровне 1,73 ед. рН.

Скорость фильтрования через фильтровальную бумагу в варианте по прототипу была ниже в 5 раз.

Таким образом, предлагаемый способ экстрагирования говяжьего пепсина позволяет повысить качество экстракта за счет снижения количества примесей, сократить продолжительность процесса за счет совмещения размораживания и экстрагирования, а также обеспечить существенное ускорение фильтрования без снижения выхода активного фермента.

Способ экстрагирования говяжьего пепсина, включающий экстракцию фермента раствором соляной кислоты, отделение жидкой фазы, фильтрование, отличающийся тем, что экстракцию фермента проводят одновременно с размораживанием замороженных блоков слизистых оболочек сычугов КРС однократно раствором соляной кислоты с pH 1,3-1,5 при температуре 4-20°C в течение 24-48 часов и медленном периодическом перемешивании без дополнительного доведения pH, экстракт отделяют от сырья, фильтруют под давлением 0,015-0,02 МПа при температуре 20-25°C.

Группа изобретений относится к области медицины, в частности к лечению гемофилии. Конъюгаты фактора IX модифицированы для включения биосовместимого полимерного фрагмента.

Способ производства молокосвертывающего ферментного препарата // 2467068

Изобретение относится к способам производства ферментных препаратов, главным образом из сырья животного происхождения, и может быть использовано на предприятиях по переработке животного сырья, например для приготовления применяемых в сыроделии молокосвертывающих ферментных препаратов.

Модифицированный коагулирующий фактор viia с продленным временем полужизни // 2466141

Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к получению слитых с альбумином полипептидов фактора VII (FVII) и фактора VIIa (FVIIa), и может быть использовано в медицине.

Способ производства сычужного фермента // 2425878

Изобретение относится к производству сычужного фермента из сычугов телят, ягнят и козлят-молочников и может быть использовано в молочной промышленности при производстве молокосвертывающих ферментных препаратов, а также в ветеринарии, микробиологической промышленности и медицине.

Клетка-хозяин, содержащая вектор для продуцирования белков, требующих гамма-карбоксилирования // 2415934

Способ получения ферментативного комплексного препарата, обладающего коллагеназной активностью // 2412997

Способ получения ингибитора коллагеназ с антикоагулянтным действием из гепатопанкреаса камчатского краба // 2403284

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к получению высокоочищенных высокоактивных препаратов ингибиторов, которые могут быть использованы в биохимии, медицине, фармакологии, патофизиологии, для терапии тромбоэмболических заболеваний, а также для исследовательских целей.

Эукариотическая клетка-хозяин для экспрессии витамин к-зависимого белка, вектор экспрессии в эукариотических клетках, способ получения гамма-карбоксилированного витамин к-зависимого белка и способ получения фармацевтической композиции для индукции свертывания крови или стимулирования повышения или понижения коагуляции // 2372401

Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к получению гамма-карбоксилированного белка, и может быть использовано в медицине. .

Способ получения, способ очистки и способ стабилизации полипептидов фактора vii, ix и x // 2364626

Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к выделению сериновых протеаз, содержащих GLA-остаток, и может быть использовано в медицине. .

Конъюгат полипептида фактора vii, способ его получения, его применение и содержащая его фармацевтическая композиция // 2362807

Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к получению полипептидов фактора VII, и может быть использовано в медицине. .

Способ получения рекомбинантного ингибитора сериновых протеиназ камчатского краба // 2560264

Изобретение относится к области биотехнологии и представляет собой способ получения рекомбинантного ингибитора сериновых протеиназ из гепатопанкреаса камчатского краба, заключающийся в том, что из гепатопанкреаса камчатского краба Paralithodes camtchaticus выделяют РНК и осуществляют синтез кДНК ингибитора PC из суммарной РНК методом обратной транскрипции, которую амплифицируют методом полимеразной цепной реакции с праймерами, полученный ПЦР-продукт, содержащий ген ингибитора PC, кодирующий ингибитор PC c аминокислотной последовательностью, показанной на фиг. 2, клонируют в экспрессионный вектор, с последующей трансформацией в клетки E. coli, полученные при этом рекомбинантные штаммы E. coli культивируют в течение не более 20 час при 37°C, а полученную биомассу подвергают центрифугированию, отмывают от остатков среды, ресуспендируют в буфере лизиса и лизируют, выделяют тельца включения из полученной биомассы разрушением ультразвуком, лизат ресуспендируют в буфере промывки и снова осаждают тельца включения, полученные тельца включения растворяют в 8 М мочевине и повергают предварительной очистке на сорбенте с градиентной элюцией буфером, содержащем 8 М мочевину и 0,7 М NaCl, после чего проводят ренатурацию растворенного ингибитора, методом снижения концентрации денатуранта в буфере 20 мМ MES-NaOH pH 6.0 или 20 мМ MES-NaOH pH 6.0, 2 М NaCl, 0,05% PEG 6000 и последующую очистку препарата ионообменной хроматографией. Изобретение позволяет получить ингибитор сериновых протеиназ, обладающий улучшенными ингибиторными свойствами по отношению к коллагеназе, трипсину и субтилизину. 5 з.п. ф-лы, 8 ил., 1 табл., 2 пр.

Композиции и способы получения энтерокиназы в дрожжах // 2560577

Изобретение относится к биотехнологии и представляет собой полинуклеотидную молекулу с SEQ ID №4 или 6, кодирующую легкую цепь энтерокиназы. Изобретение относится также к дрожжевому экспрессионному конструкту, содержащему указанную последовательность, а также к дрожжевой клетке, трансформированной конструктом. Изобретение касается также способа продуцирования энтерокиназы с использованием такой клетки. Изобретение позволяет эффективно получать энтерокиназу. 4 н. и 9 з.п. ф-лы, 1 ил., 3 табл., 6 пр.

Способ очистки витамин к-зависимых белков, таких как коагуляционный фактор ix // 2590726

Настоящее изобретение относится к биотехнологии. Предложен способ очистки коагуляционного фактора IX (FIX). Способ включает хроматографию с использованием мультимодальной смолы, при которой осуществляется контакт фракции, содержащей FIX, с мультимодальной смолой, промывка промывочным буфером для удаления примесей и элюирование FIX с мультимодальной смолы буфером, содержащим аргинин, с последующим сбором фракций, содержащих FIX, в очищенной или обогащенной форме. Предложенный способ дает возможность дальнейшего использования стадии очистки целевого белка, связанного с мультимодальной смолой, перед элюированием, а также возможность проведения элюирования в мягких условиях. Предложенный способ может быть использован в биохимии для очистки коагуляционного фактора IX. 15 з.п. ф-лы, 1 ил., 17 табл., 7 пр.

Ферменты жидкости икринок, получаемой при вылуплении, и их применение // 2595399

Изобретение относится к биохимии. Описаны полипептиды из жидкости икринок, получаемой при вылуплении. Представлены кодирующие их последовательности нуклеиновых кислот, фармацевтические композиции, включающие указанные полипептиды и молекулы нуклеиновых кислот. Описано применение указанных полипептидов в различных медицинских и косметических применениях на коже, особенно для увлажнения кожи и/или для отшелушивания рогового слоя кожи для лечения или профилактики расстройств или состояний кожи у животного. Изобретение расширяет арсенал средств для увлажнения кожи и лечения заболеваний, требующих увлажнения и/или отшелушивания рогового слоя кожи. 25 н. и 15 з.п. ф-лы, 3 ил., 4 пр., 1 табл.

Способ получения протеолитического препарата для медицинского применения // 2610669

Изобретение относится к биотехнологии. Предложен способ извлечения протеолитических ферментов из пищеварительных органов рыб. Способ включает гомогенизацию тканей в буфере, выделение ферментов в присутствии сульфата аммония, причем до осаждения белков в сульфате аммония нуклеиновые кислоты и липидно-белковые комплексы удаляют из экстракта обработкой раствором полиэтиленимина, который добавляют до его конечной концентрации в экстракте от 0,1 до 0,01 вес.%. Отделение остаточных пирогенов осуществляют на гидрофобном сорбенте Сфероцелл С-80 с дальнейшим повторным обессоливанием экстракта. Раствор ферментов стерилизуют фильтрацией через мембрану с размером пор 0,2 мкм с последующим приготовлением лиофилизированной готовой формы ферментного препарата. Изобретение позволяет получить протеолитические ферменты с повышенной коллагенолитической активностью. 5 з.п. ф-лы, 1 ил., 1 табл., 7 пр.

Способ приготовления закваски, используемой при производстве сыра // 2614599

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано при производстве мягких и твердых сычужных сыров с низкой температурой второго нагревания. Способ предусматривает приготовление закваски с использованием сычуга молодняка жвачных животных, квасцов, обеспечивающих стойкость сыров при созревании, изюма, обеспечивающего обогащение закваски витаминами и микро- и макроэлементами, сыворотки молока для длительного существования фермента, поваренной соли в качестве консерванта и сахара. Подобрано количественное соотношение компонентов закваски. 2 пр.

Олигопептиды металлопротеиназы-9 и их терапевтическое применение // 2628702

Настоящее изобретение относится к биохимии, в частности к композиции для лечения заболевания и способам лечения заболевания, сопровождающегося повышенной экспрессией матриксной металлопротеиназы MMP-9. Для приготовления указанной композиции используют олигопептиды с SEQ ID NO:7, 11, 12, 18 или 19. Указанные олигопептиды связываются с антителами для создания иммунного ответа у субъекта млекопитающего против матриксной металлопротеиназы MMP-9. Настоящее изобретение позволяет повысить эффективность блокирования расщепления внеклеточного матрикса молекулами металлопротеиназы MMP-9 и, таким образом, повысить эффективность лечения онкологических и других заболеваний. 3 н. и 13 з.п. ф-лы, 14 ил., 8 табл.

Гидролизат для обогащения мясных функциональных продуктов и способ его производства // 2630498

Изобретение относится к мясной промышленности, к диетологии, а именно к производству гидролизата, используемого при производстве функциональных мясных продуктов для питания людей с заболеваниями желудочно-кишечного тракта. Сычуг КРС измельчают с выходным диаметром решетки измельчителя 2-50 мм, в полученную массу добавляют 0,5-10 частей раствора хлорида натрия с концентрацией 0,1%-1,0%. Смесь нагревают до температуры 50-90°С, выдерживают при этой температуре 1-60 мин, измельчают до пюреобразного состояния, добавляют обезжиренную поджелудочную железу свиней в количестве 0,5-10% к массе сырья, после чего сырье доводят до температуры 30-70°С и выдерживают при этой температуре в течение 1-24 ч. После выдержки массу прогревают до температуры 70-95°С и выдерживают при этой температуре в течение 10-40 мин, охлаждают и упаковывают. Сычуг КРС предварительно замораживают до температуры минус 5-минус 20°С и размораживают. Обеспечивается получение готового продукта, содержащего целевые низкомолекулярные белковые фракции, обладающие тканеспецифическим противовоспалительным регенерирующим действием на слизистую желудка. 1 з.п. ф-лы, 1 табл., 4 пр.

Аналоги фактора комплемента в и их применения // 2639521

Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к аналогам фактора комплемента B, и может быть использовано в медицине для лечения заболевания, опосредованного активацией альтернативного пути комплемента. Получают полипептид, состоящий из hfB3-292S (аминокислоты 1-764 или 26-764 в SEQ ID NO: 2), hfB3-292SN480 (аминокислоты 1-480 или 26-480 в SEQ ID NO: 2) или hfB3-292S-Fc (аминокислоты 1-990 или 26-990 в SEQ ID NO: 22). Изобретение позволяет эффективно ингибировать активность альтернативного пути комплемента при использовании полученного полипептида, кодирующей его нуклеиновой кислоты или вектора экспрессии. 5 н. и 7 з.п. ф-лы, 14 ил., 6 табл., 19 пр.

Вакцина // 2640258

Группа изобретений относится к области биотехнологии. Представлена вакцина для снижения уровня холестерина, включающая два фрагмента пропротеинконвертазы субтилизин/кексин типа 9 (PCSK9), соединенных с фармацевтически приемлемым носителем, в которой указанные два фрагмента представляют собой: PEEDGTRFHRQA и SIPWNLERITP; EEDGTRFHRQASK и SIPWNLERITP; EEDGTRFHRQASK и SIPWNLERIT; или EEDGTRFHRQAS и SIPWNLERIT. Представлено применение указанной вакцины при лечении и/или предупреждении нарушений, вызываемых гиперлипидемией, гиперхолестеринемией и/или атеросклерозом, предпочтительно сердечно-сосудистых заболеваний, инсульта или заболеваний периферических сосудов. Группа изобретений позволяет снижать уровень общего холестерина при использовании указанных комбинаций фрагментов более эффективно, чем при использовании каждого такого фрагмента по отдельности. 2 н. и 6 з.п. ф-лы, 2 ил., 4 табл., 3 пр.