Комбинированная терапия антителами анти-cd20 типа ii в сочетании с активным агентом анти- bcl-2

Группа изобретений относится к комбинации антитела анти-СD20 типа II и анти-Всl-2 активного агента для лечения рака, прежде всего рака, экспрессирующего CD20, где указанное антитело анти-CD20 типа II является гуманизированным антителом B-Lyl и где указанный активный агент анти-Bcl-2 является ингибитором связывания белка Bcl-2, который действует посредством связывания белка Bcl-2 и таким образом разрушает комплекс Bad/Bcl-2 с IC₅₀ ингибиторной активности анти-Bcl-2 1 мкМ или менее, а также к применению антитела анти-СD20 типа II для получения лекарственного средства, предназначенного для лечения рака, прежде всего рака, экспрессирующего CD20, в комбинации с анти-Всl-2 активным агентом. Группа изобретений эффективна в лечении рака, прежде всего рака, экспрессирующего CD20, в комбинации с анти-Всl-2 активным агентом. 2 н. и 8 з.п. ф-лы, 3 ил., 2 табл., 4 пр.

 

Настоящее изобретение относится к применению антител анти-СD20 типа II для получения лекарственного средства, предназначенного для лечения рака, прежде всего опухолей, экспрессирующих CD20, в комбинации с активным агентом анти-Всl-2.

Предпосылки создания изобретения

Белок CD20 (так называемый дифференцировочный антиген созревания В-лимфоцитов или Вр35) представляет собой гидрофобный трансмембранный белок с мол. массой приблизительно 35 кДа, локализованный в предшественниках В-клеток и в зрелых В лимфоцитах (Valentine M.A. и др., J. Biol. Chem., 264(19), 11282-11287 (1989) и Einfield D.A. и др., ЕМВО J. 7(3), 711-717 (1988)). CD20 найден на поверхности более 90% В-клеток периферической крови или лимфоидных органов, экспрессируется на ранней стадии развития предшественников В-клеток и сохраняется до дифференцировки плазматических клеток. CD20 присутствует в нормальных В-клетках, а также в злокачественных В-клетках. CD20 прежде всего экспрессируется в более 90% В-клеток лимфомы не-Ходжкина (НХЛ) (Anderson K.C. и др.. Blood, 63(6), 1424-1433 (1984)), но не обнаружен на кроветворных стволовых клетках, про-В-клетках, нормальных плазматических клетках или на других нормальных тканях (Tedder T.F. и др., J, Immunol., 135 (2), 973-979 (1985)).

С-концевой фрагмент (содержащий 85 аминокислотных остатков) белка CD20 локализован в цитоплазме. Длина такого участка существенно отличается от размеров цитоплазматического участка других поверхностных белков В-клеток, таких как тяжелые цепи IgM, IgD и IgG или α- или β-цепи антигенов гистосовметимости класса I1, которые характеризуются относительно короткими цитоплазматическими фрагментами, содержащими 3, 3, 28, 15 и 16 аминокислотных остатков, соответственно (Komaromy M. и др., NAR, 11, 6775-6785 (1983)). В С-концевом фрагменте 21 из 61 аминокислотных остатков являются кислотными и только 2 основными, т.е. указанная область обладает суммарным высоким отрицательным зарядом (The GenBank рег.№NP-690605). Принято считать, что CD20 может принимать участие в регуляции ранней стадии (стадий) процесса активации и дифференцировки В-клеток (Tedder и др., Eur. J. Immunol., 25, 16, 881-887 (1986)) и может функционировать как кальциевый канал (Tedder T.F. и др., J. Cell. Biochem., 14D, 195 (1990)).

Существует два различных типа антител анти-CD20, которые существенно отличаются по способу связывания с CD20 и по биологической активности (Cragg M.S. и др., Blood, 103, 2738-2743 (2004) и Cragg M.S. и др., Blood, 101, 1045-1052 (2003)). Антитела типа I, ритуксимаб, обладают цитотоксичностью, опосредованной комплементом, в то время как антитела типа II, тоситумомаб (B1), 11B8 и АТ80 или гуманизированные антитела В-Lyl эффективно инициируют гибель клеток-мишеней за счет каспаза-независимого апоптоза с одновременным воздействием фосфатидилсерина.

Сводка общих свойств антител анти-CD20 типа I и типа II приводятся в Таблице 1.

Таблица 1
Свойства антител анти-СD20 типа I и типа II
антитела анти-CD20 типа I	антитела анти-CD20 типа II
Эпитоп CD20 типа I	Эпитоп CD20 типа II
CD20 локализованы в липидномслое	CD20 не локализованы в липидномслое
Повышенная КЗЦ (если присутствует изотип IgGI)	Повышенная КЗЦ (если присутствует изотип IgGI)
АЗКОЦ (если присутствует изотип IgGI)	АЗКОЦ (если присутствует изотип IgGI)
Полная емкость связывания	Пониженная емкость связывания
Гомотипическая агрегация	Повышенная гомотипическая агрегация
Индукция апоптоза после связывания	Индукция быстрой гибели клеток при отсутствии связывания

Семейство белков Всl-2 регулирует программируемую гибель клеток, которая запускается стимуляторами эволюции и в ответ на многие стрессовые сигналы (Cory S. и Adams J.M., Nature Reviews Cancer, 2, 647-656 (2002), Adams, Genes und Development, 17, 2481-2495 (2003), Danial N.N. и Korsmeyer S.J., Cell, 116, 205-219 (2004)). В то время как выживание клеток промотируется белком Всl-2 и рядом его близких аналогов (Bcl-xL, Bcl-W, Mcl-1 и А1), которые содержат три или четыре консервативных участка (ВН) белка Всl-2, апоптоз контролируется двумя другими подсемействами белков. Первоначальный сигнал гибели клеток передается большой группой белков ВН3, включающей белки Bad, Bid, Bim, Puma и Noxa, которые содержат одни общий небольшой домен связывания ВНЗ (Huang и Strasser, Cell, 103, 839-842 (2000)). Однако, Вах или Bak, мультидоменные белки, содержащие ВН1-ВН3, необходимы только для коммитирования гибели клетки (Cheng и др. Molecular Cell, 8, 705-711 (2001), Wei M.C. и др., Science, 292, 727-730 (2001), Zong W.X. и др., Genes and Development, 15, 148, 1-1486 (2001)). При активации указанные белки делают внешнюю мембрану проницаемой для митохондрий и высвобождения проапоптогенных факторов (например, цитохрома С), необходимых для активации каспаз, которые разбирают клетку (Wang К., Genes and Development, 15, 2922-2933 (2001), Adams, 2003, см. выше. Green D.R. и Kroemer G., Science, 305, 626-629 (2004)).

Взаимодействие между этими тремя фракциями семейства Всl-2 определяет выживание или гибель клетки. Если, например, в ответ на повреждение ДНК активируются только белки ВН3, то они связываются доменом ВНЗ с бороздкой на белках-аналогах, обеспечивающих выживаемость клетки (Sattler и др., Science, 275, 983-986 (1997). Однако как белки ВН3 и Bcl-2-подобные белки контролируют активацию Вах и Bak, остается неясно (Adams, 2003, см. выше). Основное внимание уделяется белку Вах. Указанный растворимый мономерный белок (Hsu Y.T. и др., Journal of Biological Chemistry, 272, 13289-1 3834 (1997), Wolter K.G. и др., Journal of Cell Biology, 139, 1281-1292 (1997)) обычно содержит погруженный в бороздку мембранотропный домен, по-видимому ответственный за его локализацию в цитозоле (Nechushtan А. и др., ЕМВО Journal, 18, 2330-2341 (1999), Suzukm др., Cell, 103, 645-654 (2000), Schinzel А. и др., J. Cell Biol., 164, 1021-1032 (2004)). Предполагается, что активность ВАХ модулируется рядом других пептидов/белков (Lucken-Ardjomande S. и Martinou J.C., J. Cell Sci., 118, 473-483 (2005)), но их физиологическая функция остается неизвестной. В другом варианте Вах может активироваться за счет прямого стимулирования некоторыми белками ВН3 (Lucken-Ardjomande S. и Martinou J.C, 2005, см. выше), из которых наиболее описанной является укороченная форма белка Bid, tBid (Wei M.C. и др., Genes und Development, 14, 2060-2071 (2000), KuwanaT. и др., Cell, 111,331-342(2002), Roucou X. и др., Biochemical Journal, 368, 915-921 (2002), Cartron P.F. и др., Mol. Cell, 16, 807-818 (2004)). Как указано в литературе (Adams, 2003, см. выше), наиболее распространенная модель, согласно которой Всl-2 непосредственно стимулирует Вах (Oltvai Z.N. и др., Cell, 74, 609-619 (1993)), становится проблематичной, поскольку Всl-2 связан с мембраной, а Вах локализован в цитозоле, и их взаимодействие в существенной степени зависит от детергентов, которые используются для лизиса клеток (Hsu Y.T. и Youle, 1997, см. выше). Тем не менее установлено, что домен ВН3 белка Вах может непосредственно ассоциироваться с белком Всl-2 (Zha H. и Reed J., Journal of Biological Chemistry, 272, 31482-3188 (1997), Wang К. др., Molecular und Cellular Biology, 8, 6083-6089 (1998)) и что Bcl-2 предотвращает олигомеризацию Вах, хотя при этом не удается детектировать присутствие гетеродимеров (Михайлов В. и др. Journal of Biological Chemistry, 276, 18361-18374 (2001)). Таким образом, возможность блокирования белками, обеспечивающими выживание клеток, активации белка Вах непосредственно или опосредовано остается неизвестной.

Хотя Вах и Bak в большинстве случаев являются эквивалентными (Lindsten Т и др., Molecular Cell, 6, 1389-1399 (2000), Wei M.C. и др., 2001, см. выше), благодаря их определенной локализации в здоровых клетках следует ожидать, что они регулируются по совершенно различным механизмам. В отличие от Вах, который в основном локализован в цитозоле, Bak содержится в комплексах на внешней мембране митохондрий и на эндоплазматическом ретикулуме здоровых клеток (Wei M.C. и др., 2000, см. выше, Zong W.X. и др., Journal of Cell Biology, 162, 59-69 (2003)). Тем не менее при получении цитотоксичных сигналов Вах и Bak изменяют конформацию, и Вах переносится в мембраны органелл, где Вах и Bak образуют гомоолигомеры, которые могут ассоциироваться, приводя к нарушению проницаемости мембраны (Hsu Y.T. и др., PNAS, 94, 3668-3672 (1997), Wolter K.G. и др., 1997, см. выше, Antonsson В. и др.. Journal of Biological Chemistry, 276, 11615-11623 (2001), Nechushtan А. и др.. Journal of Cell Biology, 153, 1265-1276 (2001), Wei M.C. и др., 2001, см. выше, Михайлов В. и др.. Journal of Biological Chemistry, 278, 5367-5376 (2003)).

Существует ряд ингибиторов Bcl-2, которые обладают одинаковым свойством ингибировать белки семейства Bcl-2, обеспечивающие выживаемость клеток, благодаря которому они являются перспективными агентами для лечения рака. Такими ингибиторами Bcl-2 являются, например, облимерсен, SPC-2996, RTA-402, госсипол, AT-101, мезилат обатоклакса, А-371191, А-385358, А-438744, АВТ-737, АТ-101, BL-11, BL-193, GX-15-003, 2-метоксиантимицин A3, НА-14-1, KF-67544, пурпурогаллин, TP-TW-37, YC-137 и Z-24, и препараты, описанные, например, в статье Zhai D. и др.. Cell Death and Differentiation, 13, 1419-1421 (2006).

Статьи Smith M. R. и др.. Molecular Cancer Therapeutics, 3(12), 1693-1699 (2004) и Ramanarayanan J. и др., British Journal of Haematology, 127(5), 519-530 (2004) относятся к комбинации антител анти-CD20 типа I (ритуксимаб) с антисмысловыми олигонуклеотидами Всl-2 (облимерсен).

Краткое изложение сущности изобретения

Изобретение включает применение антител анти-CD20 типа II для получения лекарственного средства, предназначенного для лечения рака, экспрессирующего CD20, в комбинации с агентом, активным в отношении Всl-2.

Изобретение также включает применение антител анти-СП20 типа II для получения лекарственного средства, предназначенного для лечения пациента, страдающего от рака, экспрессирующего CD20, в комбинации с агентом, активным в отношении Всl-2.

Предпочтительно указанный активный агент анти-Всl-2 является ингибитором Всl-2, который характеризуется величиной Ic₅₀ 5 мкМ или менее.

Предпочтительно соотношением связывающих активностей указанных антител анти-СD20 типа II и ритуксимаба с CD20 на клетках Raji (ATCC, №CCL-86) составляет от 0,3 до 0,6, более предпочтительно от 0,35 до 0,55 и наиболее предпочтительно от 0,4 до 0,5.

Предпочтительно указанные антитела анти-СD20 типа II являются гуманизированными антителами B-Lyl.

Предпочтительно указанные антитела анти-CD20 типа II обладают повышенной антитело-зависимой клеточно-опосредованной цитотоксичностью (АЗКОЦ).

Предпочтительно указанный агент, активный в отношении Всl-2, выбирают из группы, включающей облимерсен, SPC-2996, RTA-402, госсипол, AT-101, мезилат обатоклакса, А-371191, А-385358, А-438744, АВТ-737, АТ-101, BL-11, BL-193, GX-15-003, 2-метоксиантимицин A3, НА-14-1, KF-67544, пурпурогаллин, TP-TW-37, YC-137 и Z-24, более предпочтительно из группы, включающей АВТ-263 и АВТ-737. Предпочтительно рак, экспрессирующий CD20, обозначает В-клеточную лимфому не-Ходжкина В-клеток (ЛНХ).

Подробное описание изобретения

Термин "антитела" обозначает различные формы антител, включающих, но, не ограничиваясь только ими, полноразмерные антитела, антитела человека, гуманизированные антитела и генно-инженерные антитела, такие как моноклональные антитела, химерные антитела или рекомбинантные антитела, а также фрагменты таких антител при условии сохранения их характерных свойств по изобретению.

Термины "моноклональные антитела" или "композиция моноклональных антител", используемые в описании заявки, относятся к получению молекул антител одного аминокислотного состава. Соответственно, термин "моноклональные антитела человека" относится к моноспецифичным антителам, содержащим вариабельные и константные области иммуноглобулинов линии зародышевых клеток человека. В одном варианте моноклональные антитела человека получают с использованием гибридомы, которая включает В-клетки, полученные от трансгенного животного (исключая человека), например, трансгенной мыши, в геноме которой содержится трансген тяжелой цепи иммуноглобулина человека и трансген легкой цепи иммуноглобулина человека, включенные в иммортализованные клетки.

Предпочтительно указанные антитела анти-CD20 типа II являются моноклональными антителами.

Термин "химерные антитела" обозначает моноклональные антитела, включающие вариабельную область, т.е. связывающий участок, от одного источника или вида и по меньшей мере часть константной области от другого источника или вида, обычно полученные методом рекомбинантных ДНК. Более предпочтительны химерные антитела, включающие вариабельную область антител мыши и константную область антител человека. Такие химерные антитела человека/мыши являются продуктом экспрессированных генов иммуноглобулинов, содержащих сегменты ДНК, кодирующие вариабельные области иммуноглобулина мыши? и сегменты ДНК, кодирующие константные области иммуноглобулина человека. Другими формами " химерных антител" по настоящему изобретению являются такие антитела, класс или подкласс которых модифицирован или изменен по сравнению с исходными антителами. Такие "химерные" антитела обозначаются также как "переключенные по классу антитела". Способы получения химерных антител включают метод рекомбинантных ДНК и методы генной трансфекции, известные в данной области техники. См., например, Morrison S.L. и др., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81, 6851-6855 (1984), US 5202238 и US 5204244.

Термин "гуманизированные антитела" обозначает антитела, в которых каркасный участок или "участки комплементарности" (CDR) модифицированы для включения CDR иммуноглобулина другой специфичности по сравнению с исходным иммуноглобулином. В предпочтительном варианте CDR мыши прививают в каркасный участок антител человека для получения "гуманизированных антител". См., например, Riechmann L. и др., Nature, 332, 323-327 (1988) и Neuberger M.S. и др., Nature, 314, 268-270 (1985)). Более предпочтительные CDR представляют собой аминокислотные последовательности, узнающие антигены, указанные выше для химерных и бифункциональных антител.

Термин "антитела человека", используемый в описании заявки, включает антитела, содержащие вариабельную и константную области иммуноглобулина линии зародышевых клеток человека. Антитела человека известны в данной области техники (van Dijk M.A. и van de Winkel J.G., Curr. Opin. in Chemical Biology, 5, 368-374 (2001)). С использованием такой технологии получают антитела человека, специфичные в отношении множества мишеней. Примеры антител человека, описаны, например, в статье Kellermann S.A., и др., Curr. Opin. BiotechnoL, 13, 593-597 (2002).

Термин "рекомбинантные антитела человека", используемый в описании заявки, обозначает все антитела человека, которые получают, экспрессируют, конструируют или выделяют рекомбинантными методами, такие как антитела, выделенные из клеток хозяина, таких как клетки NSO или СНО, или из животного (например, мыши), которое является трансгенным для генов иммуноглобулина человека, или антитела, экспрессированные с использованием рекомбинантного вектора экспрессии, трансфектированного в клетку хозяина. Такие рекомбинантные антитела человека содержат константные области, полученные из иммуноглобулина линии зародышевых клеток человека в перегруппированной форме. Рекомбинантные антитела человека по изобретению подвергались in vivo соматической гипермутации. Таким образом, аминокислотные последовательности областей VH и VL рекомбинантных антител являются такими последовательностями, которые, хотя они получены из последовательностей VH и VL линии зародышевых клеток человека, не содержатся в нативном мотиве линии зародышевых клеток человека in vivo.

Термин "специфичное связывание" или "специфично связывается", используемый в описании заявки, обозначает специфичное связывание антител с антигеном CD20. Предпочтительно аффинность связывания характеризуется величиной kd 10" мол/л или менее (например, 10' мол/л), предпочтительно величиной kd 10" мол/л или менее (например, 10' мол/л). Аффинность связывания определяют стандартным анализом связывания, таким как анализ графика Скатчарда на клетках, экспрессирующих CD20.

Термин "молекула нуклеиновой кислоты", используемый в описании заявки, обозначает молекулы ДНК и молекулы РНК. Молекула нуклеиновой кислоты является одноцепочечной или двухцепочечной, предпочтительно двухцепочечной ДНК.

Термин "константные домены" не имеет прямого отношения к связыванию антител с антигеном, а относится к эффекторным функциям (АЗКОЦ, связывание комплемента и КЗЦ).

Термин "вариабельная область" (вариабельная область легкой цепи (VL), вариабельная область тяжелой цепи (VH)), используемый в описании заявки, обозначает каждую легкую и тяжелую цепь, которая принимает непосредственное участие в связывании антител с антигеном. Домены вариабельной легкой цепи и тяжелой цепи человека характеризуются одинаковой общей структурой, и каждый домен включает четыре каркасных участка (FR), последовательности которых являются строго консервативными, соединенные тремя "гипервариабельными областями" (или участками комплементарности, CDR). Каркасные участки образуют конформацию β-складчатого листа, а участки CDR образуют петли, связывающие β-складчатую структуру. В каждой цепи CDR сохраняют свою трехмерную структуру благодаря каркасным участкам и вместе с CDR другой цепи образуют антиген-связывающий участок. Участки CDR3 тяжелой и легкой цепи играют главную роль в специфичности связывания антитела по изобретению и, следовательно, представляют собой еще один объект изобретения.

Термины "гипервариабельная область" или "антиген-связывающий участок антитела", используемый в описании заявки, обозначают аминокислотные остатки, которые отвечают за связывание с антигеном. Гипервариабельная область включает аминокислотные остатки из "участков комплементарности" (участков CDR). "Каркасные участки" или "FR" представляют собой такие области вариабельного домена, которые не относятся к указанным гипервариабельным участкам. Следовательно, легкая и тяжелая цепи антител включают (в направлении от N- до С- концевого фрагмента) домены FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 и FR4. Наиболее важным фрагментом тяжелой цепи является CDR3, который вносит основной вклад в связывание с антигеном. Области CDR и FR определяют, как описано в работе Kabat E.A. и др.. Sequences of Proteins oflmmunological Interest, 5 изд.. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991), и/или по их остаткам, включенным в состав "гипервариабельной петли".

Термины "CD20" и "антиген CD20" используются взаимозаменяемым образом и обозначают любые варианты, изоформы и видовые гомологи CD20 человека, который обычно экспрессируется клетками или на клетках, трансфектированных геном CD20. Связывание антител по изобретению с антигеном CD20 опосредует гибель клеток, экспрессирующих CD20 (например, опухолевых клеток), за счет инактивации CD20. Гибель клеток, экспрессирующих CD20, может происходить по одному или более следующих механизмов: индукции апоптоза, АЗКОЦ и/или КЗЦ.

Синонимами CD20, известными в данной области техники, являются антиген CD20 В-лимфоцитов, поверхностный антиген В1 В-лимфоцитов, Leu-16, Вр35, ВМ5 и LF5.

Термин "антитела анти-CD20" по изобретению обозначает антитела, которые специфично связываются с антигеном CD20. В зависимости от связывающих свойств и биологической активности антитела анти-CD20 подразделяются на два типа, тип I и тип II (см. Cragg M.S. и др., Blood, 103, 2738-2743 (2004) и Cragg M.S. и др., Blood, 101, 1045-1052 (2003)), как указано в таблице 2.

Таблица 2
Свойства антител анти-CD20 типа I и типа II
антитела анти-CD20 типа I	антитела анти-CD20 типа II
Эпитоп CD20 типа I	Эпитоп CD20 типа II
CD20 локализованы в липидном слое	CD20 не локализованы в липидном слое
Повышенная КЗЦ (если присутствует изотип IgGI)	Повышенная КЗЦ (если присутствует изотип IgGI)
АЗКОЦ (если присутствует изотип IgGI)	АЗКОЦ (если присутствует изотип IgGI)
Полная емкость связывания	Пониженная емкость связывания
Гомотипическая агрегация	Повышенная гомотпическая агрегация
Индукция апоптоза после связывания	Индукция быстрой гибели клеток при отсутствии связывания

Одним из важнейших свойств антител анти-CD20 типа I и типа II является способ связывания. Таким образом, антитела анти-CD20 типа I и типа II классифицируются по соотношению связывающих активностей указанных антител и ритуксимаба в отношении CD20 на клетках Raji (ATCC, №CCL-86).

Соотношение связывающих активностей антител анти-СВ20 типа II и ритуксимаба в отношении CD20 на клетках Raji (ATCC, №CCL-86) составляет от 0,3 до 0,6, предпочтительно от 0,35 до 0,55, более предпочтительно от 0,4 до 0,5. Примерами таких антител анти-CD20 типа II являются, например, тоситумомаб (B1 IgG2a), гуманизированные антитела В-Lyl IgG1 (химерные гуманизированные антитела IgG1, описанные в WO 2005/044859), 11 В8 IgG1 (описанные в WO 2004/035607) и АТ80 IgG1. Предпочтительно указанные антитела анти-CD20 типа II являются моноклональными антителами, которые связываются с тем же эпитопом, что и гуманизированные антитела В-Lyl (описанные в WO 2005/044859).

В отличие от анти-CD20 типа II соотношение связывающих активностей антител анти-CD20 типа I и ритуксимаба в отношении CD20 на клетках Raji (ATCC, №CCL-86) составляет от 0,8 до 1,2, предпочтительно от 0,9 до 1,1. Примерами таких антител анти-CD20 типа I являются, например, ритуксимаб, 1F5 IgG2a (ЕСАСС, гибридома, Press O.W. и др., Blood, 69/2, 584-591 (1987)), HI47 IgG3 (ЕСАСС, гибридома), 2С6 IgGI (описанные в WO 2005/103081), 2F2 IgG1 (описанные в WO 2004/035607 и WO 2005/103081) и 2Н7 IgG1 (описанные в WO 2004/056312).

«Соотношение связывающих активностей антител анти-CD20 и ритуксимаба в отношении CD20 на клетках Raji (ATCC, №CCL-86)" определяют прямым измерением иммунофлуоресценции (измеряется средняя интенсивность флуоресценции (СИФ)) с использованием указанных антител анти-CD20, конъюгированных с Су5, и ритуксимаба, конъюгированного с Су5, на клеточном сортере FACS (фирма Becton Dickinson) с использованием клеток Raji (ATCC, №CCL-86), как описано в Примере 2, и рассчитывают по следующей формуле:

Соотношение связывающих активностей в отношении CD20 на клетках Raji (ATCC. №CCL-86)=

СИФ обозначает среднюю интенсивность флуоресценции. Термин "доля Су5 в конъюгате" обозначает число молекул метки Су5 - в расчете на молекулу антитела.

Обычно соотношение связывающих емкостей антител анти-CD20 типа II и ритуксимаба в отношении CD20 на клетках Raji (ATCC, №CCL-86) составляет от 0,3 до 0,6, предпочтительно от 0,35 до 0,55, более предпочтительно от 0,4 до 0,5.

В предпочтительном варианте указанные антитела анти-CD20 типа II, предпочтительно гуманизированные антитела В-Lyl, обладают повышенной антитело-зависимой клеточно-опосредованной цитотоксичностью (АЗКОЦ).

Термин "антитела, обладающие повышенной антитело-зависимой клеточно-опосредованной цитотоксичностью (АЗКОЦ)" обозначает антитела, описанные выше, обладающие повышенной АЗКОЦ, которую определяют способом, известным специалисту в данной области. Например, известным способом анализа АЗКОЦ является следующий:

1) анализ проводят с использованием клеток-мишеней, которые, как известно, экспрессируют антиген, узнаваемый антиген-связывающей областью антител,

2) анализ проводят с использованием в качестве эффекторных клеток одноядерных клеток периферической крови человека (ОКПК), выделенных из крови произвольно выбранного здорового донора,

3) анализ проводят в соответствии со следующим протоколом:

3.1) ОКПК выделяют с использованием обычного центрифугирования в градиенте плотности и осадок суспендируют в культуральной среде RPMI с плотностью 5×10 клеток/мл

3.2) клетки-мишени выращивают стандартными методами культуры тканей, собирают на экспоненциальной фазе роста с выживаемостью более 90%, промывают культуральной средой RPMI, вводят метку в виде 100 мкКи ⁵¹Cr^-, дважды промывают культуральной средой и ресуспендируют в культуральной среде с плотностью 10 клеток/мл,

3.3) 100 мкл конечной суспензии клеток-мишеней переносят в лунки 96-луночного планшета для микротитрования,

3.4) раствор антител серийно разбавляют культуральной средой (от 4000 нг/мл до 0,04 нг/мл) и полученные растворы добавляют (по 50 мкл) в лунки 96-луночного планшета, содержащие клетки-мишени, анализ проводят при различных концентрациях антител в указанном выше интервале при тройном повторе,

3.5) для контролей с максимальным высвобождением (МР) в 3 дополнительные лунки в планшете, содержащем меченые клетки-мишени, вместо раствора антител (как указано в п.3.4) добавляют по 50 мкл 2% водного раствора неионного детергента (VN, Nonidet, фирма Sigma, St. Louis),

3.6) для контролей с произвольным высвобождением (ПР) в 3 дополнительные лунки в планшете, содержащем меченые клетки-мишени, вместо раствора антител (как указано в п.3.4) добавляют по 50 мкл культуральной среды RPMI,

3.7) затем 96-луночный планшет центрифугируют при 50 g в течение 1 мин и инкубируют в течение 1 ч при 4°С,

3.8) в каждую лунку добавляют по 50 мкл суспензии ОКПК (см. п.3.1, выше) до соотношения клетки- эффекторы/клетки-мишени 25:1 и планшеты инкубируют в инкубаторе в атмосфере 5% СО₂ при 37°С в течение 4 ч,

3.9) из каждой лунки отбирают супернатант и измеряют экспериментальную радиоактивность (ЭР) с использованием γ-счетчика,

3.10) для каждой концентрации антител рассчитывают процент специфичного лизиса по формуле (ЭР-МР)/(МР-ПР)×100, где ЭР обозначает среднее значение измеренной радиоактивности (см. п.3.9) для данной концентрации антител, МР обозначает среднюю радиоактивность (см. п.3.9) в МР контроле (см. п.3.5), а ПР обозначает среднюю радиоактивность (см. п.3.9) в ПР контроле (см. п.3.6),

4) "повышенный уровень АЗКОЦ" определяют по повышению максимума (%) специфичного лизиса, наблюдаемого в интервале указанных концентраций антител и/или по понижению концентрации антител, необходимой для снижения вдвое максимума (%) специфичного лизиса, наблюдаемого в интервале указанных выше концентраций антител. Превышение АЗКОЦ по сравнению с цитотоксичностью, измеренной в указанном выше анализе, опосредуется указанными антителами, которые продуцируются теми же клетками хозяина (при использовании стандартных методов очистки, получения и хранения антител, известных специалисту в данной области), но которые не продуцируются клетками хозяина, сконструированными для гиперэкспрессии GnTIII.

Указанную "повышенную АЗКОЦ" получают гликоинженерией указанных антител, которая обозначает усиление указанных природных опосредованных клетками эффекторных функций моноклональных антител за счет инженерии их олигосахаридного компонента, описанной в статье Umana P. и др., Nature Biotechnol., 17, 176-180 (1999) и US 6602684.

Термин "комплемент-зависимая цитотоксичность (КЗЦ)" обозначает лизис клеток-мишеней опухоли человека антителами по изобретению в присутствии комплемента. Предпочтительно КЗЦ измеряют при обработке клеток, экспрессирующих CD20, антителами анти-CD20 по изобретению в присутствии комплемента. КЗЦ наблюдается в том случае, если при концентрации 100 нМ антитела индуцируют лизис 20% или более опухолевых клеток через 4 ч. Предпочтительно анализ проводят с использованием опухолевых клеток, меченых ⁵¹Cr или Eu, и измеряют высвобождаемый ⁵¹Cr или Eu. Контроль включает инкубацию опухолевых клеток-мишеней в присутствии комплемента, но в отсутствие антител.

Обычно антитела анти-CD20 типа II изотипа IgG1 обладают характерной КЗЦ. Антитела анти-СD20 типа II (изотипа IgG1) обладают пониженной КЗЦ по сравнению с антителами типа I. Предпочтительно антитела анти-CD20 типа II являются изотипами IgG1.

Антитела "ритуксимаб" (контрольные антитела, например, анти-CD20 типа I) представляют собой генетически модифицированные химерные моноклональные антитела γ1 человека, содержащие константный домен антител мыши, специфичные в отношении антигена CD20 человека. Указанные химерные антитела содержат константные домены γ1 человека и обозначаются "С2 В8" (US 5736137, Andersen, и др., зарегистрированном 17 апреля 1998 г. Фармацевтическая корпорация IDEC). Ритуксимаб предназначен для лечения пациентов с рецидивирующей или повторной вялотекущей или фолликулярной, СD20-позитивной В-клеточной лимфомы не-Ходжкина. При исследовании механизма действия in vitro установлено, что ритуксимаб проявляет комплемент-зависимую цитоксичность (КЗЦ) (ReiffM.E. и др., Blood, 83(2), 435-445 (1994)). Кроме того, препарат проявляет высокую активность в анализах, где измеряется антитело-зависимая клеточно-опосредованная цитотоксичность (АЗКОЦ).

Термин "гуманизированные антитела В-Lyl" обозначает гуманизированные антитела В-Lyl, описанные в WO 2005/044859 и WO 2007/031875, которые получают из мышиных моноклональных антител анти-CD20 В-Lyl (вариабельная область тяжелой цепи (VH): SEQ ID NO: 1, вариабельная область легкой цепи (VL): SEQ ID NO: 2, см. Poppema S. и Visser L., Biotest. Bulletin, 3, 131-139 (1987)) за счет химеризации с константным доменом IgGI человека и последующей гуманизации (см. WO 2005/044859 и WO 2007/031875). Указанные "гуманизированные антитела В-Lyl" подробно описаны в WO 2005/044859 и WO 2007/031875.

Предпочтительно "гуманизированные антитела В-Lyl" содержат вариабельную область тяжелой цепи (VH), выбранную из группы, включающей SEQ ID No.3 - SEQ ID No.20 (от В-НН2 до В-НН9 и от B-HL8 до B-HL17. см. WO 2005/044859 и WO 2007/031875). Более предпочтительны Seq. ID No. 3, 4, 7, 9, 11, 13 и 15 (В-НН2, ВНН-3, В-НН6, В-НН8, B-HL8. B-HL11 и B-HL13, описанные в WO 2005/044859 и WO 2007/031875). Предпочтительно "гуманизированные антитела В-Lyl" содержат вариабельную область легкой цепи (VL) SEQ ID No. 20 (B-KV1, см. WO 2005/044859 и WO 2007/031875). Кроме того, гуманизированные антитела В-Lyl предпочтительно являются антителами IgGl. Предпочтительно такие гуманизированные антитела В-Lyl гликозилируют в Fc области по методикам, описанным в WO 2005/044859, WO 2004/065540, WO 2007/031875, Umana P. и др., Nature Biotechnol., 17, 176-180 (1999) и WO 99/154342. Такие гликозилированные гуманизированные антитела В-Lyl обладают измененным характером гликозилирования в Fc области, предпочтительно они характеризуются пониженным содержанием остатков фукозы. Предпочтительно в этих антителах не фукозилированы по меньшей мере 40% или более (в одном варианте от 40% до 60%, в другом варианте по меньшей мере 50%, и в еще одном варианте по меньшей мере 70% или более) олигосахаридов Fc области. Кроме того, олигосахариды Fc области предпочтительно являются бисекционными.

Олигосахаридный компонент может оказывать существенное влияние на свойства, обеспечивающие эффективность действия терапевтического гликопротеина, такие как стабильность, устойчивость к действию протеазы, взаимодействие с иммунной системой, фармакокинетика и специфичная биологическая активность. Такие свойства могут зависеть не только от присутствия или отсутствия, но также от конкретных структур олигосахаридов. Можно указать на некоторое соответствие между структурой олигосахарида и функцией гликопротеина. Например, некоторые структуры олигосахарида опосредуют быстрый клиренс гликопротеина из кровотока за счет взаимодействия с некоторыми белками, связывающимися с конкретными углеводами, тогда как другие углеводы могут связываться с антителами и запускать нежелательные иммунные реакции (Jenkins N. и др., Nature Biotechnol., 14, 975-981 (1996)).

Предпочтительными клетками для продуцирования терапевтических гликопротеинов являются клетки млекопитающих благодаря их способности гликозилировать белки в форме, наиболее совместимой с организмом человека (Cumming D.A. и др., Glycobiology, 1, 115-130 (1991), Jenkins N. и др., Nature Biotechnol., 14, 975-981 (1996)). Бактерии очень редко гликозилируют белки, а другие подобные типы продуцентов, такие как дрожжи, нитевидные грибы, клетки насекомых и растений, обеспечивают такой профиль гликозилирования, который ассоциируется с быстрым клиренсом из кровотока, нежелательными иммунными взаимодействиями и некоторыми процессами, снижающими биологическую активность. Последние двадцать лет в качестве клеток млекопитающих наиболее часто используются клетки яичника китайского хомячка (СНО). Наряду с приданием пригодного профиля гликозилирования указанные клетки позволяют провести последовательное размножение генетически стабильных, высокопродуктивных линий клональных клеток. Такие клетки можно культивировать до высокой плотности в простых биореакторах с использованием бессывороточной среды, что позволяет разрабатывать безопасные и воспроизводимые биотехнологии. Другие часто используемые клетки животных включают клетки почек детеныша хомячка (ВНК), клетки NSO- и SР2/0-мышиной миеломы. Кроме того, в последнее время исследуется возможность продуцирования антител с использованием трансгенных животных (Jenkins N. и др., Nature Biotechnol., 14, 975-981 (1996)).

Все антитела содержат углеводные структуры в консервативных положениях константных областей тяжелой цепи, причем каждый изотип обладает собственным профилем N-углеводных структур, которые по разному воздействует на сборку, секрецию или функциональную активность белка (Wright А. и Morrison S. L, Trends Biotech., 15, 26-32 (1997)). Структуры N-углеводных цепей существенно варьируют в зависимости от степени процессинга и могут включать олигосахариды с высоким содержанием маннозы, полиразветвленные, а также двухантенные комплексные олигосахариды (Wright А. и Morrison S.L., Trends Biotech. 15, 26-32 (1997)). Обычно имеет место гетерогенный процессинг каркасных олигосахаридных структур, присоединенных к конкретному сайту гликозилирования, и даже моноклональные антитела присутствуют в полигликозилированных формах. Установлено также, что главные различия в гликозилировании антител наблюдаются между клеточными линиями и при выращивании данной клеточной линии в различных условиях культивирования проявляются даже самые незначительные различия (Lifely M.R. и др., Glycobiology, 5(8), 813-822 (1995)).

Одним из способов существенного повышения активности и возможно исключения значительного нежелательного побочного действия антител при сохранении простого способа получения является усиление природных, клеточно-опосредованных эффекторных функций моноклональных антител за счет формирования их олигосахаридного компонента, как описано в статье Umana P. и др., Nature Biotechnol., 17, 176-180 (1999) и US 6602684. Антитела типа IgGI, наиболее часто используемые в иммунотерапии рака, являются гликопротеинами, которые содержат консервативный сайт N-гликозилирования по Asn297 в каждом домене СН2. Два сложных двухантенных олигосахарида, присоединенных к Asn297, располагаются между СН2 доменами, формируя плотные контакты с полипептидной цепью, и их присутствие является существенным для антител при осуществлении эффекторных функций, таких как антитело-зависимая клеточно-опосредованная цитотоксичность (АЗКОЦ) (Lifely M.R. и др., Glycobiology, 5, 813-822 (1995), Jefferis R. и др., Immunol. Rev., 163, 59-76 (1998), Wright А. и Morrison S.L., Trends Biotechnol., 15, 26-32 (1997)).

Ранее установлено, что гиперэкспрессия в клетках яичника китайского хомячка (СНО) β(1,4)-N-ацетилглюкозаминилтрансферазы I11 (GnTII17y), гликозилтрансферазы, катализирующей образование бисекционных олигосахаридов, существенно повышает АЗКОЦ in vitro анти-необластомных химерных моноклональных антител (chCE7), продуцируемых модифицированными клетками СНО (см. публикации Umana Р. и др., Nature Biotechnol., 17, 176-180 (1999) и WO 99/154342, включенные в описание заявки в полном объеме в качестве ссылок). Антитела chCE7 принадлежат к большому классу неконъюгированных моноклональных антител, которые обладают высокой аффинностью и специфичностью в отношении опухоли, но являются практически непригодными для клинического применения при продуцировании в стандартных производственных клеточных линиях, не содержащих фермента GnTIII (Umana P. и др., Nature Biotechnol., 17, 176-180 (1999)). В указанной работе впервые установлено, что АЗКОЦ можно существенно повысить благодаря конструированию клеток, продуцирующих антитела и экспрессирующих GnTIII, что приводит к повышению доли (Fc)-ассоциированных, бисекционных олигосахаридов, включая бисекционные, нефукозилированные олигосахариды, на уровне, превышающем уровень, наблюдаемый в природных антителах.

Термин "Всl-2", используемый в описании заявки, обозначает белок Всl-2 (Swiss Prot ID №Р10415), член семейства белков Всl-2 (Cory S. и Adams J.M., Nature Reviews Cancer, 2, 647-656 (2002), Adams, Genes und Development, 17, 2481-2495 (2003), Danial N.N. и Korsmeyer S.J., Cell, 116, 205-219 (2004), Petros A.M., Biochim. Biophys. Acta, 1644, 83-94 (2004)).

Термин "активный агент анти-Всl-2" включает "антисмысловые нуклеотиды анти-Всl-2" и "ингибиторы Всl-2". "Антисмысловые нуклеотиды анти-Всl-2" регулируют с понижением уровень мРНК Всl-2 и понижают экспрессию белка Всl-2. Примеры таких антисмысловых нуклеотидов анти-Всl-2 включают облимерсен и SPC-2996. Термин "ингибиторы Всl-2", используемый в описании заявки, обозначает агенты, которые ингибируют связывание белка Всl-2 за счет ингибирования фосфорилирования Всl-2 ("ингибиторы фосфорилирования белка Всl-2", такие, например, как RTA-402), или за счет связывания с белком Всl-2, и таким образом разрушают комплекс Bad/Bcl-2 (такие ингибиторы обозначаются как "ингибиторы связывания белка Всl-2"). Предпочтительно указанными ингибиторами Всl-2 являются ингибиторы связывания белка Всl-2. Ингибирующую активность в отношении Всl-2 за счет непосредственного связывания таких ингибиторов с белком Всl-2 измеряют анализом конкурентного связывания. Таким образом, величину Ic₅₀, характеризующую активность ингибирования белка Всl-2, определяют методом гомогенной флуоресценции с временным разрешением (ГФВР), описанным в примере 3. Предпочтительно величина Ic₅₀, характеризующая активность ингибирования белка Всl-2, составляет 5 мкМ или менее, более предпочтительно 1 мкМ или менее. Такими ингибиторами связывания белка Всl-2 являются соединения, такие как госсипол, АТ-101, мезилат обатоклакса, А-371191, А-385358, А-438744, АВТ-737, АВТ-263. АТ-101, BL-11, BL-193, GX-15-003, 2-метоксиантимицин A3, НА-14-1. KF-67544, пурпурогаллин, TP-TW-37, YC-137 и Z-24, предпочтительно АВТ-263 и АВТ-737.

Облимерсен представляет собой антисмысловой олигонуклеотид, который ингибирует экспрессию Всl-2. Антисмысловой олигонуклеотид, его структура и получение описаны, например, в WO 95/08350, WO 1999/051259, WO 2002/017852, WO 2004/056971 и US 5734033. Термин облимерсен (или другие синонимы: генансенс, G-3139, облимерсен натрий), используемый в описании заявки, представляет собой гептадеканатриевую соль 18-членного антисмыслового фосфоротиоата олигодезоксинуклеотида следующей структуры:

5'-TCTCCCAGCGTGCGCCAT-3', гептадеканатриевую соль антисмыслового олигонуклеотида из фрагмента 32-49 (область стартового кодона) кДНК Всl-2 человека, гептадеканатриевую соль д(Р-тио)(Т-С-Т-С-С-С-А-G-С-G-Т-G-С-G-С-С-А-Т) ДНК, гептадеканатриевую соль Р-тиотимидилил-(3'--5')-2'-дезокси-Р-тиоцитидилил-(3'--5')-Р-тиотимидилил-(3'--5')-2'-дезокси-Р-тиоцитидилил-(3'--5')-2'-дезокси-Р-тиоцитидилил-(3'-5')-2'-дезокси-Р-тиоцитидилил-(3'--5')-2'-дезокси-Р-тиоаденилил-(3'--5')-2'-дезокси-Р-тиогуанилил-(3'--5')-2'-дезокси-Р-тиоцитидилил-(3'--5')-2'-дезокси-Р-тиогуанилил-(3'-5')-Р-тиотимидилил-(3'--5')-2'-дезокси-Р-тиогуанилил-(3'--5')-2'-дезокси-Р-тиоцитидилил-(3'--5')-2'-дезокси-Р-тиогуанилил-(3'--5')-2'-дезокси-Р-тиоцитидилил-(3'--5')-2'-дезокси-Р-тиоцитидилил-(3'--5')-2'-дезокси-P-тиоаденилил-(3'--5')-тимидина.

Антисмысловой олигонуклеотид SPC-2996 представляет собой 16-членный антисмысловой фосфоротиоат олигонуклеотида 5'-CTCCCAACGTGCGCCA-3', в котором нуклеотиды 1,2, 14 и 15 являются нуклеотидами «закрытой» нуклеиновой кислоты (ЗНА), которые повышают устойчивость к действию нуклеазы. Указанный антисмысловой олигонуклеотид ЗНА имитируют нукдеотиды 33-48 (кодирующей последовательности) Всl-2 человека.

RTA-402 представляет собой ЦДДО-Ме, метиловый эфир С28-тритерпеноида, олеанантритерпеноида 2-циано-3,12-диоксоолеан-1,9-диен-28-овой кислоты (ЦДДО) (см., например, Honda Т., Rounds B.V., Bore L. и др., J. Med. Chem., 43, 4233-4246 (2000))), который блокирует фосфорилирование белка Всl-2 (Коноплева М. и др., Blood, 99, 326-335 (2002)).

АВТ-737 представляет собой N-[4-[4-(4'-хлорбифенил-2-илметил)пиперазин-1-ил]бензоил]-3-[3-(диметиламино)-1(R)-(фенилсульфанилметил)пропиламино]-4-нитробензолсульфонамид, 4-[4-(4'-хлорбифенил-2-илметил)пиперазин-1-ил]-Н-[3-[3-(диметиламино)-1(R)-(фепилсульфанилметил)пропиламино]-4-нитрофенилсульфонил]бензамид, ингибитор Всl-2 формулы I, описанный в WO 2006/099667 или Corey S. и др., Cancer Cell, 8, 5-6 (2005).

АВТ-263 представляет собой ингибитор Всl-2 формулы II, описанный в US 2007/027135,

формула II. А-371191 представляет собой ингибитор Всl-2 формулы III,

А-385358 представляет собой [(R)-4-(3-диметиламино-1-фенилсульфанилметилпропиламино)-N-[4-(4,4-диметилпиперидин-1-ил)бензоил]-3-нитробензолсульфопамид (описанный, например, в статье ShoemakerA.R. и др., Cancer Research, 66, 8731-8739 (2006)), ингибитор Bcl-2 формулы IV

Госсипол представляет собой рацемическую смесь (+)-госсипола и (-)-госсипола (ингибитора Bcl-2 формулы V), или чистый (+)-госсипол или (-)-госсипол, предпочтительно термин госсипол обозначает чистый (-)-госсипол.

AT-101 представляет собой используемое в клинике соединение AT-101 (фирма Ascenta Therapeutics), ингибитор Bcl-2 и производное R(-)-госсипола.

Мезилат обатоклакса (или другие синонимы GX-015-070 или GX15-070) представляет собой метансульфонат 2-[2-(3,5-диметил-1Н-пиррол-2-илметилен)-3-метокси-2Н-пиррол-5-ил]-1Н-индола, ингибитор Bcl-2, описанный, например, в WO 2004/106328, WO 2006/089397 и Walensky L.D., Cell Death and Differentiation, 13, 1339-1350(2006).

TW-37 представляет собой ингибитор Bcl-2 формулы VI,

BL-193 представляет собой ингибитор Bcl-2 формулы VII,

NSC-719664 представляет собой 2-метоксиантимицин A3, ингибитор Bcl-2, производное антимицина A3.

YC-137 описан, например, в статье Walensky L.D., Cell Death and Differentiation, 13, 1339-1350(2006).

Пурпурогаллин описан, например, в статье Walensky L.D., Cell Death and Differentiation, 13, 1339-1350(2006).

HA-14-1 описан, например, в статье Walensky L.D., Cell Death and Differentiation, 13, 1339-1350(2006).

Z-24 представляет собой 3Z-3-[(1Н-пиррол-2-ил)метилиден]-1-(1-пиперидинилметил)-1,3-2Н-индол-2-он, ингибитор Bcl-2 формулы VIII,

Предпочтительно активный агент анти-Всl-2 выбирают из группы, включающей облимерсен, SPC-2996, RTA-402, госсипол, AT-101, мезилат обатоклакса, А-371191, А-385358, А-438744, АВТ-737, АТ-101, BL-11, BL-193, GX-15-003, 2-метоксиантимицин A3, НА-14-1, KF-67544, пурпурогаллин, ТР-TW-37,YC-137HZ-24.

Предпочтительно активный агент анти-Всl-2 представляет собой ингибитор связывания белка Всl-2, который характеризуется величиной IC50 5 мкМ или менее. Такой ингибитор связывания белка Всl-2 предпочтительно выбирают из госсипола, АТ-101, мезилата обатоклакса, АВТ-263 и АВТ-737, более предпочтительно из АВТ-263 или АВТ-737.

Термин "экспрессия антигена CD20" обозначает высокий уровень экспрессия в клетке антигена CD20, предпочтительно на поверхности Т- или В-клеток, более предпочтительно В-клеток, полученных от опухоли или рака, соответственно, предпочтительно несолидной опухоли. Пациентов, страдающих от "рака, экспрессирующего CD20", определяют стандартными методами, известными в данной области. Например, экспрессию антигена CD20 измеряют иммуногистохимическим детектированием (ИГХ), СКАФ или детектированием соответствующей мРНК методом ПЦР.

Термин "рак, экспрессирующий CD20", используемый в описании заявки, обозначает все виды рака, при которых опухолевые клетки экспрессируют антиген CD20. Такими видами рака, экспрессирующего CD20, являются, например, лимфома, лимфолейкоз, рак легких, немелкоклеточный рак легких, рак бронхоальвеолярных клеток легкого, рак костной ткани, рак поджелудочной железы, рак кожи, рак головы и шеи, кожная или внутриглазная меланома, рак матки, рак яичника, ректальный (прямокишечный) рак, рак анальной области, рак желудка, желудочный рак, рак ободочной кишки, рак молочной железы, рак матки, рак фаллопиевых труб, карцинома эндометрия, карцинома шейки матки, рак влагалища, рак наружных женских половых органов, болезнь Ходжкина, рак пищевода, рак тонкого кишечника, рак эндокринной системы, рак щитовидной железы, рак паращитовидной железы, рак надпочечников, саркома мягких тканей, рак уретры, рак полового члена, рак предстательной железы, рак мочевого пузыря, рак почки или мочеточника, рак почечных клеток, карцинома почечной лоханки, мезотелиома, печеночно-клеточный рак, билиарный рак, опухоли центральной нервной системы (ЦНС), опухоли ствола спинного мозга, глиома ствола головного мозга, полиморфная глиобластома, астроцитома, невринома (шваннома), эпендимома (эпендиальная глиома), медуллобластома, менингиома, плоскоклеточная карцинома, гипофизарная аденома, включая резистентные формы любого из указанных видов рака или комбинацию одного или более вышеуказанных видов рака.

Термин "рак, экспрессирующий CD20", используемый в описании заявки, предпочтительно обозначает лимфомы (предпочтительно В-клеточную лимфому не-Ходжкина (ЛНХ)) и лимфолейкозы. Такие лимфомы и лимфолейкозы включают, например, а) фолликулярные лимфомы, б) мелкоклеточную лимфому с нерасщепленным ядром/лимфому Беркитта (включая эндемическую лимфому Беркитта, спорадическую лимфому Беркитта и лимфому не-Беркитта), в) лимфомы маргинальной зоны (включая В-клеточную лимфому экстранодальной маргинальной зоны (ассоциированная со слизистой и лимфоидной тканью лимфома, MALT), В-клеточную лимфому нодальной маргинальной зоны и лимфому селезеночной маргинальной зоны), г) лимфому клеток коры головного мозга (ЛККГМ), д) крупноклеточную лимфому (включая В-клеточную диффузную крупноклеточную лимфому (ДККЛ), диффузную клеточную лимфому смешанного типа, иммунобластическую лимфому, первичную медиастинальную В-клеточную лимфому, В-клеточную лимфангиому легких), е) лейкоз ворсистых клеток, ж) лимфолейкоз, макроглобулинемию Вальденстрема, з) острый лимфолейкоз (ОЛЛ), хронический лимфолейкоз (ХЛЛ)/слабый лимфолейкоз (СЛЛ), В-клеточный пролимфолейкоз, и) плазмоцитому, миеломную болезнь, множественную миелому, плазмацитому, к) болезнь Ходжкина.

Более предпочтительно рак, экспрессирующий CD20, представляет собой В-клеточные лимфомы не-Ходжкина (НХЛ). Рак, экспрессирующий CD20, прежде всего представляет собой лимфому клеток коры головного мозга (ЛККГМ), острый лимфолейкоз (ОЛЛ), хронический лимфолейкоз (ХЛЛ), В-клеточную диффузную крупноклеточную лимфому (ДККЛ), лимфому Беркитта, лейкоз ворсистых клеток, фолликулярную лимфому, множественную миелому, лимфому маргинальной зоны, посттрансплантационное лимфопролиферативное заболевание (ПТЛЗ), лимфому, ассоциированную с ВИЧ, макроглобулинемию Вальденстрема или первичную лимфому ЦНС.

Термин "лечение", используемый в описании заявки, обозначает, если не указано иное, реверсию, облегчение или подавления развития, или предотвращение, частично или полностью, роста опухолей, опухолевых метастазов, или других опухолевых или неопластических клеток в организме пациента. Термин "лечение", используемый в описании заявки, обозначает действия по реализации лечения.

Термин "способ лечения" или его эквивалент, например, в отношении рака, обозначает способ или курс лечения, который предназначен для снижения числа или ликвидации раковых клеток в организме пациента, или уменьшения интенсивности симптомов рака. "Способ лечения" рака или другого пролиферативного нарушения необязательно обозначает, что раковые клетки или другое нарушение будут ликвидированы фактически или что симптомы рака или другого нарушения будут уменьшены фактически. Часто способ лечения рака проводят даже при слабой надежде на успех, но такой способ при данной истории болезни и предполагаемой продолжительности жизни пациента тем не менее обеспечивает общий благоприятный ход лечения.

Термин "совместное введение" обозначает введение указанных антител анти-СD20 типа II и указанного ингибитора Всl-2 в составе одной композиции или в составе двух отдельных композиций. Совместное введение можно проводить одновременно или последовательно в любом порядке, причем предпочтительно существует период времени, когда оба (или все) активные агенты одновременно проявляют биологическую активность. Указанные антитела анти-CD20 типа II и указанный ингибитор Всl-2 вводят одновременно или последовательно (например, в виде внутривенного непрерывного вливания (одного вливания антител, а затем одного вливания ингибитора Всl-2, или ингибитор Всl-2 можно вводить перорально). Если оба терапевтических агента вводятся последовательно, дозу вводят в один и тот же день двумя отдельными частями, или один из агентов вводят в день 1, а другой агент вводят в день 2-7, предпочтительно в день 2-4. Таким образом, термин "последовательно" обозначает в течение 7 дней после введения дозы антител, предпочтительно в течение 4 дней после введения дозы антител, а термин "одновременно" обозначает в одно время. Термин "совместное введение" в связи с поддержанием уровня антител анти-CD20 типа II и ингибитора Всl-2 обозначает, что поддерживающие дозы можно вводить одновременно, если курс лечения является пригодным для обоих лекарственных средств, например каждую неделю, или ингибитор Всl-2 вводят, например, каждые 1-3 дня, а антител анти-CD20 типа II вводят каждую неделю, или поддерживающие дозы вводят последовательно в течение одного или нескольких дней.

Подразумевается, что антитела вводят пациенту в «терапевтически эффективном количестве» (или просто в «эффективном количестве»), которое обозначает такое количество соответствующего соединения или комбинации, которое вызывает биологическую или лечебную ответную реакцию ткани, системы, животного или человека, на которую рассчитывали исследователь, ветеринар, лечащий врач или другой медицинский персонал.

Количество совместно введенных антител анти-CD20 типа II и указанного ингибитора Всl-2 и время совместного введения зависят от типа субъекта (вида, пола, возраста, массы тела и т.п.), состояния пациента, подлежащего лечению, и тяжести заболевании или состояния, подлежащего лечению. Указанные антитела анти-СП20 типа II и указанный ингибитор Всl-2 являются пригодными для совместного введения пациенту одновременно или для многократного введения. В зависимости от типа и тяжести заболевания первоначальные варианты доз указанных антител анти-CD20 типа II, предназначенные для совместного введения лекарственных средств пациенту, составляют приблизительно от 1 мкг/кг до 50 мг/кг (например, 0,1-20 мг/кг), а варианты доз указанного ингибитора Всl-2 составляют от 1 мкг/кг до 50 мг/кг (например, 0,1-20 мг/кг). Если указанные агенты вводят внутривенно, первоначальное время вливание указанных антител анти-СП20 типа II или указанного ингибитора Всl-2 является более продолжительным, чем последующие циклы введения, например, первоначальное вливание можно проводить в течение приблизительно 90 мин, а последующее вливание можно проводить в течение приблизительно 30 мин (при условии хорошо переносимого первоначального вливания).

Предпочтительная доза указанных антител анти-СВ20 типа II составляет от приблизительно от 0,05 мг/кг до приблизительно 30 мг/кг. Таким образом, пациенту можно совместно вводить одну или более доз, составляющих приблизительно 0,5 мг/кг, 2,0 мг/кг, 4,0 мг/кг, 10 мг/кг или 30 мг/кг (или их любую комбинацию). Предпочтительная доза указанного ингибитора Всl-2 составляет от 20 мг/кг до приблизительно 150 мг/кг. В зависимости от типа субъекта (вида, пола, возраста, массы тела и т.п.), состояния пациента и от типа антитела анти-CD20 и ингибитора Всl-2 доза и схема введения указанных антител анти-CD20 отличается от доз ингибитора Всl-2. Например, указанные антитела анти-CD20 можно вводить каждые 1-3 недели, а указанный ингибитор Всl-2 можно вводить ежедневно или каждые 2-7 дней. Первоначально можно также ввести более высокую дозу, а затем одну или более низких доз.

В предпочтительном варианте лекарственное средство можно использовать для профилактики или снижения метастазирования или дальнейшего распространения патологического состояния в организме пациента, страдающего от рака, экспрессирующего CD20. Лекарственное средство можно использовать для увеличения продолжительности жизни такого пациента, увеличения выживаемости такого пациента без развития заболевания, увеличения продолжительности ответной реакции, приводящей к статистически достоверному и клинически подтвержденному улучшению состояния пациента по данным продолжительности жизни, выживаемости без развития заболевания, скорости или продолжительности ответной реакции. В предпочтительном варианте лекарственное средство можно использовать для увеличения ответной реакции в группе пациентов.

В контексте настоящего изобретения в составе комбинации антител анти-CD20 типа II и ингибитора Всl-2, предназначенной для лечения рака, экспрессирующего анти-CD20, можно использовать другие цитотоксичные, химиотерапевтические или противоопухолевые агенты или соединения, которые усиливают действие таких агентов (цитокины). Такие агенты должны присутствовать в комбинации в количествах, которые являются эффективными для оказания терапевтического действия. Предпочтительно комбинация антител анти-CD20 типа II и ингибитора Всl-2 используется для лечения в отсутствии таких дополнительных цитотоксичных, химиотерапевтических или противоопухолевых агентов или соединений, усиливающих действие таких агентов.Такими агентами являются, например, алкилирующие агенты или агенты с алкилирующим действием, такие как циклофосфамид (СТХ, например, cytoxan®), хлорамбуцил (CHL, например, leukeran®), цисплатин (CisP, например, platinol®), бусулфан (например, myleran®), мелфалан, кармустин (BCNU), стрептозотоцин, триэтиленметамин (ТЭМ), митомицин С и т.п., антиметаболиты, такие как метотрексат (МТХ), этопозид (VP16, например, vepesid®), 6-меркаптопурин (6МП), 6-тиогуанин (6ТГ), цитарабин (Ага-С), 5-фторурацил (5-ФУ), капецитабин (например, Xeloda®), декарбазин (DTIC) и т.п., антибиотики, такие как актиномицин D, доксорубицин (DXR, например, adriamycin®), даунорубицин (дауномицин), блеомицин, митрамицин и т.п., алкалоиды, такие как алкалоиды барвинка розового, такие как винкристин (VCR), винбластин и т.п., и другие противоопухолевые агенты, такие как паклитаксел (например, taxol®) и производные паклитакселя, цитостатические агенты, глюкортикоиды, такие как дексаметазон (DEX, например, decadron®) и кортикостероиды, такие как преднизон, ингибиторы нуклеаз, такие как гидроксимочевина, специфичные протеазы, такие как аспарагиназа, лейковорин и другие производные фолиевой кислоты, и подобные противоопухолевые агенты. Кроме того, можно использовать другие дополнительные агенты, такие как арнифостин (например, ethyol®), дактиномицин, меклоретамин (азотистый иприт), стрептозоцин, циклофосфамид, ломустин (CCNU), доксорубицин липо (например, doxil®), гемцитабин (например, gemzar®), даунорубицин липо (например, daunoxome®), прокарбазин, митомицин, доцетаксел (например, taxotere®), алдеслейкин, карбоплатин, оксалиплатин, кладрибин, камптоцетин, СРТ 11 (иринотекан), 10-гидрокси-7-этилкамфотецин (SN38), флоксуридин, флударабин, ифосфамид, идарубицин, месна, β-интерферон, α-интерферон, митоксантрон, топотекан, лейпролид, мегестрол, мелфалан, меркаптопурин, пликамицин, митотан, пегаспаргаза, пентостатин, пипоброман, пликамицин, тамоксифен, тенипозид, тестолактон, тиогуанин, тиотепа, урацилиприт, винорелбин, хлорамбуцил. Предпочтительно комбинация антител анти-CD20 типа II и ингибитора Всl-2 используется для лечения в отсутствие таких дополнительных агентов.

Применение цитотоксических и противоопухолевых агентов, описанных выше, а также антипролиферативных специфичных противоопухолевых лекарственных средств, таких как ингибиторы протеинкиназы, в курсе химиотерапии обычно известно в терапии рака, и их применение должно соответствовать тем же требованиям переносимости, эффективности и контроля способов введения и дозирования, с некоторыми поправками. Например, фактические дозы цитотоксических агентов могут изменяться в зависимости от ответной реакции культивированных клеток пациента, которую определяют гистохимическими методами на культуре ткани. В общем случае, доза снижается по сравнению с количеством, которое используется в отсутствии других дополнительных агентов.

Типичные дозы эффективного цитотоксического агента могут находиться в интервалах, рекомендованных производителем, а по результатам испытаний на ответные реакции in vitro и на модели животных концентрация или количество агента может снижаться приблизительно на порядок. Таким образом, фактическая доза зависит от мнения врача, состояния пациента и эффективности способа лечения, основанного на чувствительности первичных культивированных злокачественных клеток или культуры ткани, или ответной реакции, наблюдаемой на соответствующей модели животных.

В контексте настоящего изобретения при лечении рака, экспрессирующего CD20, в дополнение к комбинации антител анти-CD20 типа II и ингибитора Всl-2 можно использовать эффективное количество ионизирующего излучения и/или радиотерапевтические методы. Источником излучения являются внешний и внутренний относительно пациента источники. Лечение с использованием внешнего источника называется лучевая терапия (ЛТ), лечение с использованием внутреннего источника носит название брахитерапия (БТ). Радиоактивные элементы для применения по изобретению выбирают из группы, включающей, но, не ограничиваясь только ими, радий, цезий-137, иридий-192, америций-241, золото-198, кобальт-57, медь-67, технеций-99, иод-123, иод-131 и индий-111. Кроме того, такие радиоактивные изотопы можно вводить в антитела. Предпочтительно комбинация антител анти-CD20 типа II и ингибитора Всl-2 используется без применения лучевой терапии.

Лучевая терапия является стандартным способом лечения неоперабельных опухолей и/или опухолевых метастазов. Положительные результаты наблюдаются в том случае, когда лучевую терапию используют в комбинации с химиотерапией. Лучевая терапия основана на том принципе, что интенсивное облучение очага поражения должно привести к гибели репродуктивных клеток в опухолевых и нормальных тканях. Курс лучевой терапии обычно приводится в виде поглощенной дозы (ПД), времени и фракционирования дозы и должен тщательно контролироваться онкологом. Количество излучения, полученное пациентом, зависит от ряда факторов, наиболее важными из которых являются локализация опухоли относительно других важных структур или органов и степени распространения опухоли. Типичный курс лечения пациента с использованием лучевой терапии представляет собой график, рассчитанный на 1-6 недель, с общей дозой от 10 до 80 ПД, введенной пациенту в виде суточной фракции приблизительно от 1,8 до 2,0 ПД в течение 5 дней в неделю. В предпочтительном варианте настоящего изобретения, если опухоли в организме пациентов подвергаются воздействию комбинации по изобретении и облучения, наблюдается синергетическое действие. Иными словами, подавление роста опухоли с использованием агентов, включающих комбинацию по изобретению, усиливается при одновременном облучении, необязательно с использованием дополнительных химиотерапевтических или противоопухолевых агентов. Параметры адъювантной лучевой терапии приводятся, например, в WO 99/60023.

Антитела анти-СВ20 типа II вводят пациенту известными способами, например, внутривенно в виде однократного вливания или непрерывным вливанием в течение определенного времени, внутримышечным, внутрибрюшинным, интрацереброспинальным, подкожным, интраартикулярным, внутрисуставным или интратекальным способами. Предпочтительны внутривенный или подкожный способ введения антител.

Ингибиторы Всl-2 вводят пациенту известными способами, например, внутривенно в виде однократного вливания или непрерывным вливанием в течение определенного времени, внутримышечным, внутрибрюшинным, интрацереброспинальным, подкожным, интраартикулярным, внутрисуставным или интратекальным или пероральным способами. Предпочтительны внутривенный, подкожный или пероральный способ введения ингибиторов Всl-2.

Изобретение также включает набор, содержащий антитела анти-СD20 типа II и активный агент анти-Всl-2 для комбинированного лечения пациента, страдающего от рака, экспрессирующего CD20. В предпочтительном варианте контейнеры набора могут также включать фармацевтически приемлемый носитель. Набор может также включать стерильный разбавитель, который предпочтительно хранится в отдельном дополнительном контейнере. Набор может также включать листовку-вкладыш с инструкциями по применению для комбинированного лечения рака, экспрессирующего CD20, предпочтительно В-клеточной лимфомы не-Ходжкина (ЛНХ).

Термин "листовка-вкладыш" обозначает инструкции, обычно включенные в коммерческие упаковки лекарственных средств, которые содержат информацию относительно показаний, применения, доз, способа введения, противопоказаний и/или предупреждения относительно применения таких лекарственных средств.

В предпочтительном варианте, содержание контейнеров включает также фармацевтически приемлемый носитель, а также стерильный разбавитель, который предпочтительно хранится в отдельном дополнительном контейнере.

Термин "фармацевтически приемлемый носитель", используемый в описании заявки, включает любые материалы, пригодные для введения в составе фармацевтического препарата, включая растворители, диспергирующие среды, материалы покрытия, антибактериальные и противогрибковые агенты, изотонические агенты и агенты, замедляющие абсорбцию, и другие материалы и соединения, пригодные для введения в составе фармацевтического препарата. Изобретение включает применение таких носителей в составе композиций по изобретению, за исключением любых обычных сред или агентов, несовместимых с активным соединением. Композиции могут также включать дополнительные активные соединения.

Фармацевтические композиции

Фармацевтические композиции антител получают переработкой анти-CD20 типа II и/или активного агента анти-Всl-2 по настоящему изобретению в смеси с фармацевтически приемлемыми неорганическими или органическими носителями. Например, в качестве таких носителей при получении таблеток, таблеток с покрытием, драже и твердых желатиновых капсул используют лактозу, кукурузный крахмал или его производные, тальк, стеариновую кислоту или ее соли и т.п. Пригодными носителями для мягких желатиновых капсул являются, например, растительные масла, воски, жиры, полутвердые и жидкие полиолы и т.п. Однако в зависимости от природы активного вещества в случае мягких желатиновых капсул обычно не требуется никаких носителей. Пригодными носителями для получения растворов и сиропов являются, например, вода, полиолы, глицерин, растительные масла и др. Пригодными носителями для суппозиториев являются, например, природные или отвержденные масла, воски, жиры, полужидкие или жидкие полиолы и т.п.

Кроме того, фармацевтические препараты могут содержать консерванты, солюбилизирующие агенты, стабилизирующие агенты, смачивающие агенты, эмульгаторы, подсластители, красители, ароматизаторы, соли для регуляции осмотического давления, буферные вещества, маскирующие агенты или антиоксиданты. Кроме того, они могут содержать другие терапевтически ценные вещества.

Одним вариантом изобретения является фармацевтическая композиция, включающая антитела анти-СВ20 типа II и указанный активный агент анти-Bcl-2, предназначенная прежде всего для лечения рака, экспрессирующего CD20.

Указанная фармацевтическая композиция может также включать один или более фармацевтически приемлемых носителей.

Кроме того, в настоящем изобретении предлагается фармацевтическая композиция, предназначенная прежде всего для применения при лечении рака, включающая (1) эффективное количество антитела анти-СD20 типа II, и (2) эффективное количество активного агента анти-Всl-2. Такая композиция необязательно включает фармацевтически приемлемые носители и/или эксципиенты.

Фармацевтические композиции антител анти-CD20 типа II, используемые отдельно по настоящему изобретению, получают для хранения смешиванием антител (требуемой степени чистоты) с необязательными фармацевтически приемлемыми носителями, эксципиентами или стабилизирующими агентами (Remington's Pharmaceutical Sciences, 16 изд., Osol А., ред. (1980)), в форме лиофилизированных препаратов или водных растворов. Приемлемые носители, эксципиенты или стабилизирующие агенты являются нетоксичными для реципиентов в используемых дозах или концентрациях и включают буферные вещества, такие как фосфат, цитрат и другие органические кислоты, антиоксиданты, включающие аскорбиновую кислоту и метионин, консерванты (такие как хлорид октадецилдиметилбензиламмония, хлорид гексаметония, хлорид бензалкония, хлорид бензетония, фенол, бутиловый или бензиловый спирт, алкилпарабены, такие как метил- или пропилпарабен, катехин, резорцин, циклогексанол, 3-пентанол и мета-крезол), низкомолекулярные полипептиды (содержащие менее приблизительно 10 аминокислот), белки, такие как сывороточный альбумин, желатин или иммуноглобулины, гидрофильные полимеры, такие как поливинилпирролидон, аминокислоты, такие как глицин, глутамин, аспарагин, гистидин, аргинин или лизин, моносахариды, дисахариды и другие углеводы, включающие глюкозу, маннозу или декстрины, комплексоны, такие как ЭДТА, сахара, такие как сахароза, маннит, трегалоза или сорбит, солеобразующие противоионы, такие как натрий, комплексы металлов (например, Zn-содержащие белки), и/или неионные ПАВ, такие как TWEEN, PLURONICS™ или полиэтиленгликоль (ПЭГ).

Фармацевтические композиции активного агента анти-Всl-2, например ингибитора Всl-2, зависят от фармацевтических свойств активного агента, например, композиция, содержащая низкомолекулярные соединения, такие например, как АВТ-737 or ABT-263, имеет следующий состав:

а) Состав таблетки (влажное гранулирование)

№	Ингредиенты	мг/таблетка
1	Соединение формулы (I)	5	25	100	500
2	Лактоза безводная DTG	125	105	30	150
3	Sta-Rx 1500	6	6	6	30
4	Микрокристаллическая целлюлоза	30	30	30	150
5	Стеарат магния	1	1	1	1
	Всего	167	167	167	831

Методика получения:

1. Смешивают ингредиенты 1, 2, 3 и 4 и гранулируют в присутствии очищенной воды.

2. Гранулы высушивают при 50°С.

3. Гранулы размалывают на соответствующей мельнице.

4. Добавляют ингредиент 5, перемешивают в течение 3 мин и прессуют на соответствующем прессе.

б) Состав капсул:

№	Ингредиенты	мг/таблетка
1	Соединение формулы (I)	5	25	100	500
2	Безводная лактоза	159	123	148	-
3	Кукурузный крахмал	25	35	40	70
4	Тальк	10	15	10	25
5	Стеарат магния	1	2	2	5
	Всего	200	200	300	600

1. Смешивают ингредиенты 1, 2 и 3 в соответствующем смесителе в течение 30 мин.

2. Добавляют ингредиенты 4 и 5 и перемешивают в течение 3 мин.

В еще одном варианте изобретения фармацевтические композиции по изобретению предпочтительно представляют собой два отдельных препарата, содержащих указанные антитела анти-CD20 типа II и указанный ингибитор Всl-2.

Активные ингредиенты можно также включать в микрокапсулы, полученные, например, методами коацервации или полимеризации на границе раздела фаз, например, гидроксиметилцеллюлозы или желатиновых капсул и микрокапсул поли(метилметакрилата), соответственно, в коллоидные системы доставки лекарственных средств (например, в липосомы, альбуминовые микросферы, микроэмульсии, наночастицы и нанокапсулы) или в микроэмульсии. Такие методы описаны в Remington's Pharmaceutical Sciences, 16 изд., Osol А.,ред. (1980).

Кроме того, можно получать препараты с замедленным высвобождением. Пригодными примерами таких препаратов являются полупроницаемые матрицы из твердых гидрофобных полимеров, содержащие антитела, причем матрицы могут иметь различные формы, такие как пленки или микрокапсулы. Примерами матриц с замедленным высвобождением являются полиэфиры, гидрогели (например, поли(2-гидроксиэтилметакрилат) или поли(виниловый спирт)), полилактиды (см. US 3773919), сополимеры L-глутаминовой кислоты и γ-этил-L- глутамата, недеградируемый этиленвинилацетат, деградируемые сополимеры молочная кислота/гликолевая кислота, такие как LUPRON DEPOT (инъецируемые микросферы сополимера молочная кислота/гликолевая кислота и лейпролидацетата) и поли-D-(-)-3-гидроксимасляная кислота.

Препараты, предназначенные для введения in vivo, должны быть стерильными. Стерилизацию проводят фильтрованием через стерильные мембраны.

В настоящем изобретении также предлагается способ лечения рака, заключающийся в том, что пациенту, который нуждается в таком лечении, вводят (1) эффективное количество антител анти-CD-20 типа II и (2) эффективное количество активного агента анти-Всl-2.

В настоящем изобретении также предлагается способ лечения рака, заключающийся в том, что пациенту, который нуждается в таком лечении, вводят (1) эффективное количество антител анти-CD20 типа II и (2) эффективное количество активного агента анти-Всl-2.

Термин "пациент", используемый в описании заявки, предпочтительно обозначает человека, который нуждается в лечении антителами анти-CD20 типа II (например, пациента, страдающего от рака, экспрессирующего CD20) любым способом, и более предпочтительно человека, который нуждается в таком лечении рака, или предракового состояния, или патологического изменения. Однако термин "пациент" может также обозначать животных, предпочтительно млекопитающих, таких как собаки, кошки, лошади, рогатый скот, свиньи, овцы, нечеловекообразные приматы и др.

Изобретение также включает антитела анти-СD20 типа II, предназначенные для лечения рака, экспрессирующего CD20, в комбинации с активным агентом анти-Всl-2.

Изобретение также включает антитела анти-CD20 типа II, предназначенные для лечения пациента, страдающего от рака, экспрессирующего CD20, в комбинации с активным агентом анти-Всl-2.

Изобретение также включает антитела анти-CD20 типа II и активный агент анти-Всl-2, предназначенные для лечения рака, экспрессирующего CD20.

Изобретение также включает антитела анти-CD20 типа II и активный агент анти-Всl-2, предназначенные для лечения пациента, страдающего от рака, экспрессирующего CD20.

Предпочтительно указанный активный агент анти-Всl-2 выбирают из группы, включающей облимерсен, SPC-2996, RTA-402, госсипол, АТ-101, мезилат обатоклакса, А-371191, А-385358, А-438744, АВТ-737, АТ-101, BL-11, BL-193, GX-15-003, 2-метоксиантимицин A3, НА-14-1, KF-67544, пурпурогаллин, TP-TW-37, YC-137 и Z-24.

Предпочтительно активный агент анти-Всl-2 представляет собой ингибитор, связывающий белок Всl-2, характеризующийся величиной Ic₅₀ 5 мкМ или менее. Такой ингибитор, связывающий белок Всl-2, предпочтительно выбирают из группы, включающей госсипол, АТ-101, мезилатобат, АВТ-263 и АВТ-737, более предпочтительно АВТ-263 или АВТ-737.

Предпочтительно соотношение связывающих активностей указанных антител анти-CD20 типа II и ритуксимаба в отношении CD20 на клетках Raji (АТСС №CCL-86) составляет от 0,3 до 0,6, более предпочтительно от 0,35 до 0,55 и наиболее предпочтительно от 0,4 до 0,5.

Предпочтительно указанные антитела анти-CD20 типа II являются гуманизированными антителами B-Lyl.

Предпочтительно указанные антитела анти-CD20 типа II характеризуются повышенной антитело-зависимой клеточно-опосредованной цитотоксичностью (АЗКОЦ).

Предпочтительно рак, экспрессирующий CD20, является В-клеточной лимфомой не-Ходжкина (ЛНХ).

Предпочтительно указанные антитела анти-CD20 типа I являются моноклональными антителами.

Настоящее изобретение, объем которого указан в прилагаемых пунктах формулы изобретения, иллюстрируется следующими примерами, перечнем последовательностей и фигурами. Подразумевается, что в пределах сущности изобретения возможны различные модификации указанных методик.

Перечень аминокислотных последовательностей

SEQ ID NO: 1 аминокислотная последовательность вариабельной области тяжелой цепи (VH) мышиных моноклональных антител анти-CD20 B-Lyl.

SEQ ID NO: 2 аминокислотная последовательность вариабельной области легкой цепи (VL) мышиных моноклональных антител анти-CD20 B-Lyl.

SEQ ID NO: 3-19: аминокислотные последовательности вариабельной области тяжелой цепи (VH) гуманизированных антител B-Lyl (B-HH2-В-НН9, B-HL8 и B-HL10 - B-HL17).

SEQ ID NO: 20: аминокислотная последовательность вариабельной области легкой цепи (LH) гуманизированных антител B-Lyl B-KV1.

Описание фигур

Фиг.1. Противоопухолевая активность при комбинированном воздействии на клетки В-клеточной лимфомы не-Ходжкина (ЛИХ) SU-DHL-4 DLBCL антител анти-CD20 типа II (B-HH6-B-KV1 GE), у которых соотношение связывающих активностей в отношении CD20 на клетках (АТСС №CCL-86) по сравнению с ритуксимабом составляет 0,44, и ингибитора белка Bcl-2 (ABT-737, IC₅₀ 0,040 мкМ). На оси у указан средний объем опухоли (мм³), на оси х указаны дни после инъекции опухолевых клеток. Надписи: А) носитель (кружочки). В) гуманизированные антитела B-lyl (B-HH6-B-KV1 GE), 10 мг/кг один раз в неделю (квадратики). С) ингибитор Bcl-2 (ABT-737), 100 мг/кг каждые два дня (треугольники) и D) гуманизированные антитела B-lyl (B-HH6-B-KV1 GE), 10 мг/кг один раз в неделю, в комбинации с ингибитором Bcl-2 (ABT-737), 100 мг/кг каждые два дня (крестики).

Фиг.2. Среднее значение интенсивности флуоресценции (СИФ, левая ось у) антител анти-CD20 типа I (Су5/ритуксимаб=белый столбик) и антител анти-CD20 типа II (Су5/гуманизированные B-Lyl B-HH6-B-KV1 GE=черный столбик) на клетках Raji (ATCC №CCL-86). Соотношение связывающих активностей антител анти-CD20 типа I (ритуксимаб) и антител анти-CD20 типа II (B-HH6-B-KV1 GE) по сравнению с ритуксимабом в отношении CD20 указаны на правой оси у.

Фиг.3. Противоопухолевая активность при комбинированном воздействии на клетки человека Z138 лимфомы не-Ходжкина (ЛНХ) двух антител анти-CD20 типа II. Оба антитела являются гуманизированными антителами анти-CD20 В-Lyi, 1) B-HH6-B-KV1 гликомодифицированные (GE) и 2) B-HH6-B-KV1 дикого типа (негликомодифицированные). На оси у указан средний объем опухоли (мм), на оси х указаны дни после инъекции опухолевых клеток. Надписи: А) носитель (кружочки), Б) гуманизированные антитела B-lyl GE (B-HH6-B-KV1 GE), 30 мг/кг один раз в неделю (треугольнички) и В) гуманизированные B-lyl дикого типа (B-HH6-B-KV1 wt), 30 мг/кг один раз в неделю (крестики).

Примеры

Пример 1

Противоопухолевое действие при комбинированном лечении антителами анти-СD20 типа II (B-HH6-B-KV1 GE) и ингибитором белка Bcl-2 (ABT-737)

Анализируемые агенты

Антитела анти-CD20 типа II B-HH6-B-KV1 GE (гуманизированные В-Lyl, гликомодифицированные B-HH6-B-KV1, см. WO 2005/044859 и WO 2007/031875) получали в виде концентрированного раствора (с 9,4 мг/мл (фирма GlycArt, Шлирен, Швейцария). Буферный раствор включал гистидин, трегалозу и полисорбат 80. Перед инъекцией концентрированный раствор антител разбавляли в ФСБ.

Ингибитор белка Bcl-2 (ABT-737) получали в порошкообразной форме и растворяли (с 10 мг/мл) в 5% растворе глюкозы, содержащем 1,5% ДМСО, 5% твин 80, 30% 1,2-пропандиола.

Клеточные линии и условия культивирования

В эксперименте использовали клетки человека SU-DHL-4 лимфомы не-Ходжкина (Chang H. и др., Leuk. Lymphoma, 8, 129-136 (1992)), предоставленные фирмой DSMZ (Брауншвейг). Линию опухолевых клеток культивировали в стандартных условиях в среде RPMI (фирма РАА Laboratories, Австрия), содержащей 10% ЭТС (фирма РАА Laboratories, Австрия) и 2 мМ L-глутамин, при 37°С в насыщенной влажной атмосфере, содержащей 5% CO₂. Для трансплантации использовали клетки после пятикратного пересева.

Животные

Самок мышей SCID с врожденным отсутствием клеток-киллеров возрастом 4-5 недель (полученных от фирмы Bomholtgard, Ry, Дания) после доставки выдерживали в специальных стерильных условиях в режиме 12 ч свет/12 ч темнота в соответствии с методическими рекомендациями (фирма GV-Solas, Felasa, TierschG). Протокол испытаний рассмотрен и утвержден местными административными органами. После доставки животных выдерживали в карантинном блоке вивария в течение одной недели для привыкания к новым условиям и для обследования. При этом проводили непрерывный контроль состояния здоровья при свободном доступе к корму (Provimi Kliba 3337) и воде (подкисленная до рН 2,5-3).

Обследование

Животных обследовали ежедневно на наличие клинических симптомов и проявление побочного действия. В течение эксперимента у животных дважды в неделю регистрировали массу тела и измеряли размер опухоли штангенциркулем после определения стадии заболевания.

Лечение животных

Лечение начинали в день рандомизации через 22 дня после трансплантации клеток. Исследуемым группам животных вводили гуманизированные антитела анти-CD20 типа II (B-HH6-B-KV1 GE) отдельно или в комбинации, а контрольной группе вводили соответствующий носитель (внутривенно, один раз в неделю) в день 22, 29, 36 и 43, в дозе 10 мг/кг. Ингибитор белка Bcl-2 ABT-737 вводили внутрибрюшинно каждые два дня (дни 23-33, 2 раза в день) в дозе 100 мг/кг и из-за низкой переносимости до дня 41 в уменьшенной дозе 50 мг/кг.

Исследование подавления роста опухоли in vivo

Контрольную группу животных, которым вводили носитель, исключали из эксперимента через 15 дней после начала лечения из-за большой опухолевой массы. Лечение животных, которым один раз в неделю вводили антитела В-НН6-B-K.V1 GE (10 мг/кг) в виде единственного агента, приводило к существенному подавлению роста ксенотрансплантата через 14 дней (ПРО 68%) по сравнению с контролем. Однако, несмотря на еженедельные инъекции антител, позднее наблюдался непрерывный рост ксенотрансплантатов SU-DHL-4. Напротив, монотерапия ингибитором Bcl-2 (100 мг/кг, каждые два дня) была неэффективной, при этом наблюдался прогрессирующий рост опухоли, сравнимый с контролем. Несмотря на умеренную активность обоих агентов при использовании отдельно, комбинированная терапия приводила к ремиссии ксенотрансплантатов лимфомы SU-DHL-4. Еженедельное введение антител В-HH6-B-KV1 GE (10 мг/кг) и инъекция ингибитора белка Bcl-2 ABT-737 (каждый второй день) приводили к регрессии лимфомы в течение первой недели, а при последующей комбинированной терапии наблюдалась полная ремиссия всех 4 опухолей SU-DHL-4 при отсутствии рецидива.

Пример 2

Определение соотношения связывающих активностей антител анти-СР20 типа II и ритуксимаба в отношении CD20 на клетках Raji (ATCC №CCL-86)

Клетки Raji (ATCC №CCL-8б) культивировали в среде RPMI-1640 (фирма PanBiotech GmbH, Cat. №Р04-18500), содержащей 10% ЭТС (фирма Gibco, Cat. №10500-064). В антитела анти-CD20 типа II (B-HH6-B-KV1, гуманизированные антитела В-Lyl) и в ритуксимаб вводили метку с использованием моно-NHS-эфира Су5 (фирма Amersham GE Healthcare, Cat. №РА 15101) по методике фирмы-производителя. Конъюгат ритуксимаб/Су5 содержал 2,0 молекулы Су5 в одной молекуле антитела. Конъюгат B-HH6-B-KV1/Су5 содержал 2,2 молекулы Су5 в одной молекуле антитела. Для определения и сравнения связывающих активностей и способа связывания обоих конъюгатов строили кривые связывания (титрованием Су5-конъюгированного ритуксимаба и Су5-конъюгированных антител B-HH6-B-KV1) методом прямой иммунофлуоресценции с использованием линии клеток Raji лимфомы Беркитта (ATCC №CCL-86). По величине средней интенсивности флуоресценции (СИФ) рассчитывали величину ЕС₅₀ (50% от максимальной интенсивности флуоресценции) Су5-ритуксимаба и Су5-антител B-HH6-B-KV1, соответственно, 5×10 клеток в образце окрашивали в течение 30 мин при 4°С. Затем клетки промывали культуральной средой, для исключения погибших клеток использовали окрашивание пропидийиодидом. Измерения проводили на приборе FACSArray (фирма Becton Dickinson). Пропидийиодид регистрировали в дальней красной области А, а Су5 в красной области А. Средние интенсивности флуоресценции (СИФ) для связывания при ЕС₅₀ (50% от максимума) приводятся на фиг.2 (Су5-антитела B-HH6-B-KV1 - черный столбик, а Су5-ритуксимаб -белый столбик).

Затем рассчитывали соотношение связывающих активностей в отношении CD20 на клетках Raji (ATCC №CCL-8б) по следующей формуле:

соотношение связывающих активностей в отношении CD20 на клетках Raji (ATCC №CCL-86)=

Таким образом, антитела B-HH6-B-KV1, т.е. типичные антитела анти-CD20 типа II, обладают пониженной связывающей активностью по сравнению с ритуксимабом.

Пример 3

Определение величины IC₅₀ ингибирующей активности анти-Всl-2 ингибитора Bcl-2 (ABT-737)

Анализ Bcl-2 и Bcl-xL методом ГФВР:

Пипетирование соединения:

Из 10 мМ раствора соединений в 100% получали серийные разведения (3-кратные, 10 точек), начиная от 1,8 мМ.

Реагенты

Анализ Bcl-2

1) Биотинилированный-BAD пептид (Bio-BAD, BAD=Bcl-2-антагонист гибели клеток, BAD белок является индуктором апоптоза, ассоциированного с BCL2 и ВАХ) для анализа Bcl-2:

Bio-BAD пептид (73,64 нМ) растворяли в буферном растворе для анализа, содержащем 50 мМ трис/HCl, 0,2 мг/мл бычий сывороточный альбумин (БСА), 1 мМ дитиотреит и 9% ДМСО.

2) His6-Bcl-2:

His6-Bcl-2 (180 нМ) растворяли в буферном растворе для анализа, содержащем 50 мМ трис/HCl, 0,2 мг/мл бычий сывороточный альбумин (БСА), 1 мМ дитиотреит.

3) Метка европий/стрептавидин (ЕВ/СА) и анти-6His АРС:

Реагент растворяли в буферном растворе для детектирования, содержащем 50 мМ трис/HCl, 0,2 мг/мл БСА 4,5 нМ ЕВ/СА и 67,5 нМ анти-6His АРС.

Конечные концентрации: Bio-BAD (22,5 нМ), His6-Bcl-2 (80 нМ), ЕВ/СА (1 нМ), АРС (15 нМ).

Анализ Bcl-xL

1) Биотинилированный-BAD пептид (В1о-ВАО) для анализа Bcl-xL:

Bio-BAD пептид (9,82 нМ) растворяли в буферном растворе для анализа, содержащем 50 мМ трис/HCl, 0,2 мг/мл БМА, 1 мМ дитиотреит и 9% ДМСО.

2) His-Bcl-xL:

His6-Bcl-xL (22,5 нМ) растворяли в буферном растворе для анализа, содержащем 50 мМ трис/HCl, 0,2 мг/мл БСА, 1 мМ дитиотреит.

3) Метка европий/стрептавидин (ЕВ/СА) и анти-6His АРС:

Реагент растворял в буферном растворе для детектирования, содержащем 50 мМ трис/HCl, 0,2 мг/мл БСА, 3,4 нМ ЕВ/СА и 45 нМ анти-6His АРС.

Конечные концентрации: Bio-BAD (3 нМ), His6-Bcl-xL (10 нМ), ЕВ/СА (0,75 нМ), анти-6His АРС (10 нМ).

Методика

Промежуточный планшет: в 384-луночный промежуточный планшет переносили 5 мкл раствора соединения из препаративного планшета (или в контрольные лунки помещали 5 мкл 100% ДМСО) и добавляли 55 мкл раствора Bio-BAD. Из промежуточного планшета в планшет для анализа переносили 12 мкл смеси и в лунки для анализа добавляли 16 мкл раствора His6-Bcl-2 или His6-Bcl-xL, в контрольные лунки добавляли буферный раствор для анализа. Смесь инкубировали в течение 1 ч при 37°С. Затем в лунки добавляли по 8 мкл раствора ЕВ-СА/АРС и инкубировали в течение 1 ч при комнатной температуре. Планшеты считывали на планшет-ридере, пригодном для измерения гомогенной флуоресценции с временным разрешением (ГФВР, возбуждение при 340 нм, излучение при 665/615 нм).

Конечные концентрации соединения: 50, 16,7, 5,6, 1,85, 0,62, 0,21, 0,07, 0,03, 0,01, 0,004 мкМ.

Перекрестная поправка: в ряд лунок добавляли 16 мкл буферного раствора для анализа, 12 мкл раствора Bio-BAD, 8 мкл буферного раствора для детектирования в присутствии или в отсутствии ЕВ-СА/АРС.

Результаты: АВТ-737 тестировали на ингибирование Всl-2 и Bcl-xL, величины IС₅₀ рассчитывали с использованием нелинейного графика (программа XLfit, фирма ID Business Solution Ltd., Guilford, Surrey, UK)).

IС₅₀ (Всl-2) для АВТ-737: 0,040 мкМ

IC₅₀ (Bcl-xL) для АВТ-737: 0,019 мкМ

Пример 4

Одинаковая противоопухолевая активность гликомодифицированных (GE) и немодифицированных (дикого типа) антител анти-СР20 (B-HH6-B-KV1 GE и дикого типа) в отношении ксенотрансплантатов клеток Z138 MCL у мышей SCID с врожденным отсутствием клеток-киллеров

Анализируемые агенты

Антитела анти-CD20 типа II, B-HH6-B-KV1 (гликомодифицированные и дикого типа) получали в виде концентрированного раствора (с 9,4 мг/мл и 12,5 мг/мл) в буферном растворе, содержащем гистидин, трегалозу и полисорбат 20 (фирма GlycArt, Шлирен, Швейцария),

Перед инъекцией оба концентрированных раствора разбавляли в ФСБ.

Клеточные линии и условия культивирования

Клетки человека Z138 В-клеточной лимфомы не-Ходжкина (лимфома клеток коры головного мозга) получали от фирмы Glycart. Линию опухолевых клеток культивировали в стандартных условиях в среде DMEM (фирма РАА Laboratories, Австрия), содержащей 10% ЭТС (фирма РАА Laboratories, Австрия) и 2 мМ L-глутамин, при 37°С в насыщенной влажной атмосфере, содержащей 5% СО₂. Для трансплантации использовали клетки после двукратного пересева.

Животные

Самок мышей SCID с врожденным отсутствием клеток-киллеров возрастом 4-5 недель (полученных от фирмы Bomholtgard, Ry, Дания) после доставки выдерживали в специальных стерильных условиях в режиме 12 ч свет/12 ч темнота в соответствии с методическими рекомендациями (фирма GV-Solas, Felasa, TierschG). Протокол испытаний рассмотрен и утвержден местными административными органами. После доставки животных выдерживали в карантинном блоке вивария в течение одной недели для привыкания к новым условиям и для обследования. При этом проводили непрерывный контроль состояния здоровья при свободном доступе к корму (Provimi Kliba 3337) и воде (подкисленная до рН 2,5-3).

Обследование

Животных обследовали ежедневно на наличие клинических симптомов и проявление побочного действия. В течение эксперимента у животных дважды в неделю регистрировали массу тела и измеряли размер опухоли штангенциркулем после определения стадии заболевания.

Лечение животных

Лечение начинали в день рандомизации через 14 дней после трансплантации клеток. Исследуемым группам животных вводили гуманизированные антитела анти-СС20 (B-HH6-B-KV1 GE и дикого типа), а контрольной группе животных вводили соответствующий носитель, внутривенно, один раз в неделю, в день 14, 20, 27 и 34, в дозе 10 мг/кг.

Подавление роста опухоли in vivo

Контрольную группу животных, которым вводили носитель, исключали из эксперимента в день 19 после начала лечения из-за большой опухолевой массы. Лечение животных, которым еженедельно вводили B-HH6-B-KV1 (гликомодифицированные и дикого типа) в дозе 10 мг/кг, приводило к подавлению роста ксенотрансплантата сразу после начала лечения. После завершения контроля наблюдалась регрессия всех опухолей, обработанных антителами, а через некоторое время наблюдалась полная ремиссия ксенотрансплантатов опухоли Z138. При этом на указанной модели ксенотрансплантата не наблюдалось существенной разницы между действием антител дикого типа и гликомодифицированными анти-СВ20 B-HH6-B-KV1. Такое явление вполне возможно, поскольку у таких мышей клетки NK не экспрессируют нативную форму рецептора Fc и кроме того известно, что мыши SCID некомпетентны для NK-опосредованной АЗКОЦ из-за тяжелой формы тройного иммунодефицита. Следовательно модели подкожного ксенотрансплантата у мышей SCID являются непригодными для имитации АЗКОЦ, опосредованной гликомодифицированными антителами, в организме человека.

1. Применение антитела анти-CD20 типа II для получения лекарственного средства, предназначенного для лечения рака, экспрессирующего CD20, в комбинации с активным агентом анти-Bcl-2.
отличающееся тем, что указанное антитело анти-CD20 типа II является гуманизированным антителом B-Lyl, и тем, что указанный активный агент анти-Bcl-2 является ингибитором связывания белка Bcl-2, который действует посредством связывания белка Bcl-2 и таким образом разрушает комплекс Bad/Bcl-2 с IC₅₀ ингибиторной активности анти-Bcl-2 1 мкМ или менее, которую измеряют анализом конкурентного связывания при анализе системы гомогенной флуоресценцией с временным разрешением (ГФВР),
причем гуманизированное антитело B-Lyl отличается включением аминокислотной последовательности вариабельной области тяжелой цепи (VH) SEQ ID NO:7 и
включением аминокислотной последовательности вариабельной области легкой цепи (VL) SEQ ID NO:20.

2. Применение по п.1, отличающееся тем, что по меньшей мере 40% или более олигосахаридов в области Fc указанных антител анти-CD20 типа II являются нефукозилированными.

3. Применение по п.2, отличающееся тем, что указанный ингибитор связывания белка Bcl-2 выбирают из АВТ-263 и АВТ-737, где
АВТ-737 представляет собой ингибитор Bcl-2 формулы I

и АВТ-263 представляет собой ингибитор Bcl-2 формулы II

4. Применение по любому из пп.1-3, отличающееся тем, что вводят один или более других дополнительных цитотоксичных, химиотерапевтических или противоопухолевых агентов, или соединений, которые усиливают действие таких агентов.

5. Применение по любому из пп.1-3, отличающееся тем, что рак, экспрессирующий CD20, является В-клеточной лимфомой не-Ходжкина (ЛИХ).

6. Комбинация антитела анти-CD20 типа II и анти-Bcl-2 активного агента, предназначенная для лечения рака, экспрессирующего CD20,
отличающаяся тем, что указанное антитело анти-CD20 типа II является гуманизированным антителом В-Lyl, и тем, что указанный активный агент анти-Bcl-2 является ингибитором связывания белка Bcl-2, который действует посредством связывания белка Bcl-2 и таким образом разрушает комплекс Bad/Bcl-2 с IC₅₀ ингибиторной активности анти-Bcl-2 5 мкМ или менее, которую измеряют анализом конкурентного связывания при анализе системы гомогенной флуоресценцией с временным разрешением (ГФВР),
причем гуманизированное антитело В-Lyl отличается включением аминокислотной последовательности вариабельной области тяжелой цепи (VH) SEQ ID NO:7 и
включением аминокислотной последовательности вариабельной области легкой цепи (VL) SEQ ID NO:20.

7. Комбинация по п.6, отличающаяся тем, что по меньшей мере 40% или более олигосахаридов в области Fc указанных антител анти-СD20 типа II являются нефукозилированными.

8. Комбинация по п.7, отличающаяся тем, что указанный ингибитор связывания белка Bcl-2 выбирают из АВТ-263 и АВТ-737, где
АВТ-737 представляет собой ингибитор Bcl-2 формулы I

и АВТ-263 представляет собой ингибитор Bcl-2 формулы II

9. Комбинация по любому из пп.6-8, отличающаяся тем, что вводят один или более других дополнительных цитотоксичных, химиотерапевтических или противоопухолевых агентов, или соединений, которые усиливают действие таких агентов.

10. Комбинация по любому из пп.6-9, отличающаяся тем, что рак, экспрессирующий CD20, является В-клеточной лимфомой не-Ходжкина (ЛНХ).