Способ получения фармацевтической композиции для индукции развития кровеносных сосудов в тканях, фармацевтическая композиция, полученная этим способом, и способ лечения ишемии тканей и/или органов человека

Изобретение относится к биотехнологии, конкретно к композициям для индукции развития кровеносных сосудов в тканях, и может быть использовано в медицине. Способ предусматривает трансформацию штамма E. coli TOP10 плазмидой pCMV-VEGF165, культивирование штамма в подходящих для накопления биомассы условиях с последующим выделением плазмиды pCMV-VEGF165 в сверхскрученной форме и последующую лиофилизацию плазмиды pCMV-VEGF165, которую проводят при обязательном присутствии в лиофилизируемом растворе криопротектанта, стабилизатора рН, антиоксиданта и иных веществ, позволяющих получить изотонический раствор для инъекций с концентрацией очищенной плазмиды от 0,1 до 10 мг/мл и рН от 7,0 до 9,0 и обеспечивающих сохранение сверхскрученной формы плазмиды pCMV-VEGF165 при последующем хранении. Способ лечения ишемии тканей и/или органов человека заключается во введении внутримышечно человеку эффективного количества полученной фармацевтической композиции. Изобретение позволяет получить пригодную для терапии фармацевтическую композицию плазмидной ДНК pCMV-VEGF165 с сохранением свойств основного вещества при продолжительном хранении при температуре +2-+8°С. 3 н.п. ф-лы, 2 ил., 4 табл., 5 пр.

 

Область техники

Изобретение относится к биотехнологии, а именно к штамму-продуценту плазмидной ДНК и фармацевтической композиции на ее основе, обладающей способностью вызывать рост кровеносных сосудов (васкуляризации) в области введения и ее применению в комплексной терапии для реваскуляризации при ишемии нижних конечностей атеросклеротического генеза, а также в лечении ран и язв различного генеза.

Предшествующий уровень техники

Генотерапия с использованием свободной плазмидной ДНК (naked DNA) для целей терапии заболеваний или вакцинации против патогенов либо антигенов раковых клеток предполагает создание готовых лекарственных форм терапевтической ДНК, которые могут храниться, перевозиться и использоваться специалистами в неблагоприятных условиях, в частности при положительной или повышенной температуре. Физическая и химическая стабильность плазмидной ДНК при хранении в значительной степени определяется составом вспомогательных веществ, ее концентрацией или содержанием в готовой лекарственной форме и условиями хранения (Schleef M, Schmidt Т. Animal-free production of ccc-supercoiled plasmids for research and clinical applications. J Gene Med. 2004; 6 Suppl 1:845-53). Основным процессом, изменяющим фармацевтически активную форму плазмидной ДНК при хранении, является распад цепи ДНК, в ходе которого образуется кольцевая релаксированная форма плазмиды и, в дальнейшем, линейная двухцепочечная форма. Известно, что при хранении замороженного раствора плазмидной ДНК при температуре ниже минус 80°С распад сверхскрученной формы практически не наблюдается (Walther W, Stein U, Voss С, Schmidt Т, Schleef M, Schlag PM. Stability analysis for long-term storage of naked DNA: impact on nonviral in vivo gene transfer. Anal Biochem. 2003; 318(2):230-5). Такой способ хранения плазмидной ДНК не может быть широко использован в клинической практике, поскольку учреждения здравоохранения и аптеки в большинстве случаев не обладают необходимым холодильным оборудованием. Перевозка готовых лекарственных форм с сохранением столь низкой температуры продукта также крайне затруднительна. При подборе надлежащего состава и концентраций вспомогательных веществ могут быть получены растворы плазмидных ДНК, стабильных в течение 12 месяцев при хранении при температуре 4°С или более трех лет при хранении при температуре минус 20°С (Przybylowski M, Bartido S, Borquez-Ojeda О, Sadelain M, Riviere I. Production of clinical-grade plasmid DNA for human Phase I clinical trials and large animal clinical studies. Vaccine. 2007; 25(27):5013-24).

Наиболее распространенным способом создания более стабильных готовых лекарственных форм макромолекул является лиофилизация. Как правило, лиофилизованные лекарственные формы стабильны при хранении при температуре 4°С в течение нескольких лет, в ряде случаев возможно хранение продукта при комнатной температуре в течение нескольких месяцев или даже двух лет. Лиофилизация также позволяет изменять концентрацию действующего вещества - флаконы могут быть заполнены концентрированным раствором небольшого объема, а при растворении продукта перед использованием объем может быть увеличен до необходимого. Также возможна лиофилизация гипотонических растворов и последующее растворение лиофилизата солевым раствором или раствором нормальной осмоляльности (Anchordoquy TJ, Armstrong TK, Molina MC. Low molecular weight dextrans stabilize nonviral vectors during lyophilization at low osmolalities: concentrating suspensions by rehydration to reduced volumes. J Pharm Sci. 2005; 94(6):1226-36).

При лиофилизации растворов плазмидной ДНК обычно ожидается увеличение стабильности продукта при последующем хранении, однако сама процедура замораживания и сублимации в вакууме может существенно повреждать сверхскрученные плазмидные ДНК (Anchordoquy TJ, Armstrong TK, Molina MC, Allison SD, Zhang Y, Patel MM, et al. Physical stabilization of plasmid DNA-based therapeutics during freezing and drying. In: Costantino HR, Pikal MJ, editors. Lyophilization of biopharmaceuticals. AAPS press; 2004. pp.605-41). В частности, лиофилизация ДНК из замороженного водного раствора, не содержащего вспомогательных веществ, вызывает удаление координированных молекул воды, то есть гидратной оболочки молекулы ДНК, что приводит к потере структурной целостности молекулы ДНК (Poxon SW, Hughes JA. The effect of lyophilization on plasmid DNA activity. Pharm Dev Technol. 2000; 5(1):115-22). Такие нарушения конформации молекулы ДНК, распад комплементарных связей между азотистыми основаниями и частичное нарушение стэкинга приводят к практическим нежелательным последствиям - падению биологической активности плазмидной ДНК до 25% от исходной (Anchordoquy TJ, Armstrong ТК, Molina MC. Low molecular weight dextrans stabilize nonviral vectors during lyophilization at low osmolalities: concentrating suspensions by rehydration to reduced volumes. J Pharm Sci. 2005; 94(6): 1226-36).

Известно, что потеря координированных молекул воды, удаляемых при сублимации, может быть скомпенсирована при введении в лиофилизуемый раствор нелетучих гидрофильных веществ, в качестве которых обычно используют сахара и полиолы (Maitani Y, Aso Y, Yamada A, Yoshioka S. Effect of sugars on storage stability of lyophilized liposome/DNA complexes with high transfection efficiency. Int J Pharm. 2008; 356(1-2):69-75). Большая часть известных технических решений по стабилизации ДНК при лиофилизации относится к области получения лиофильно высушенных липосом, содержащих ДНК (Патент США 7,323,297), таким образом применимость этих решений для раствора "голой" плазмидной ДНК представляется неочевидной. В работе (Quaak S, Haanen J, Beijnen J, Nuijen B. Naked Plasmid DNA Formulation: Effect of Different Disaccharides on Stability after Lyophilisation. AAPS PharmSciTech, Vol.11, No.1, March 2010) было исследовано влияние нескольких дисахаридов на процесс лиофилизации плазмидной ДНК и было установлено, что сахароза, используемая в массовом отношении 20:1 с ДНК дает наиболее стабильную при хранении готовую лекарственную форму. Вместе с тем, в данной работе не были рассмотрены вопросы влияния рН и солевого состава раствора на стабильность плазмидной ДНК, не исследованы композиции, дающие изотонический раствор ДНК при концентрации менее 5 мг/мл и не были исследованы моносахариды, потенциально пригодные для получения стабильных лиофилизованных препаратов макромолекул.

Описание Фигур:

1. На Фигуре 1 показана карта экспрессионной плазмиды pCMV-VEGF165 (длина 4859 пар оснований). Используются следующие обозначения: «CMV early promoter/enhancer region» - область промотора/энхансера ранних генов цитомегаловируса; enhancer region - область энхансера; «CMV promoter» - область промотора цитомегаловируса; «ТАТА box» - ТАТА-элемент; «transcription start» - точка начала транскрипции; «Kozak» - последовательность Козак; «start codon» - старт-кодон, первый кодон открытой рамки считывания VEGF165; «VEGF165» - открытая рамка считывания (ОРС) полипептида васкулярно-эндотелиального фактора роста человека 165; «stop codon» - стоп-кодон; «SV40 рА term» - сигнал полиаденилирования и терминатор вируса SV40; «CMV forward primer» - область отжига стандартного праймера CMV forward; «M13 forward20 primer» - область отжига стандартного праймера М13 fbrward20; «M13 pUC fwd primer» - область отжига стандартного праймера M13 pUC fwd; «pBR322ori» - область начала репликации плазмиды pBR322; «f1 origin» - участок инициации репликации бактериофага f1; «AmpR promoter» - прокариотический промотер гена bla; «NTPII (neomycin phosphotransferase; KanR» - последовательность, кодирующая аминогликозид-3'-фосфотрансферазу, обеспечивающую устойчивость бактерий к канамицину. Стрелками указаны направления транскрипции генов, в скобках указаны номера первого и последнего нуклеотидов фрагментов. Курсивом выделены сайты узнавания эндонуклеаз рестрикции, в скобках указаны номера нуклеотидов в точках разрезания.

2. Фигура 2. Ангиограммы пациента 74 лет с хронической ишемией нижних конечностей. Диагноз: атеросклероз, бедренно-подколенная окклюзия с обеих сторон IIб-III ст. (боли в покое). Показатели при поступлении: лодыжечно-плечевой индекс - 0,48 (справа), 0,32 (слева); чрескожное напряжение кислорода - 61 мм рт.ст. Пациент получал ФК в составе стандартной комплексной терапии (декстраны, дезагреганты). Показатели через 90 сут: дистанция безболевой ходьбы 130 м; лодыжечно-плечевой индекс 0,5 (справа), 0,57 (слева); чрескожное напряжение кислорода - 78 мм рт.ст. А, Б - ангиограммы до лечения: на уровне верхней и средней третей бедер (А); на уровне голеней (Б); В, Г - ангиограммы через 90 сут после использование препарата «Неоваскулген» в составе комплексной терапии: на уровне верхней и средней третей бедер (В); на уровне голеней (Г). Стрелками указаны удовлетворительно наполненные кровеносные сосуды, в т.ч. и развитые коллатерали.

Краткое описание настоящего изобретения

Технической задачей, решаемой авторами, являлось создание штамма-продуцента плазмидной ДНК и физиологически приемлемой фармацевтической композиции, обеспечивающей стабильность готовой лекарственной формы плазмидной ДНК в течение длительного времени и пригодной для генотерапии.

Фармацевтическая композиция содержит очищенную плазмидную ДНК, кодирующую васкулярно-эндотелиальный фактор роста человека (VEGF) под контролем функциональных генетических элементов, обеспечивающих экспрессию гена в клетках человека, и фармацевтически допустимые вспомогательные вещества в виде, по меньшей мере, одного криопротектанта, обладающего свойствами наполнителя, и стабилизатора рН, в эффективных количествах, обеспечивающих получение изотонического раствора для инъекций с концентрацией очищенной плазмидной ДНК от 0,1 до 10 мг/мл и рН от 7,0 до 9,0.

Фармацевтическая композиция может быть использована для получения раствора для инъекций для внутримышечного, внутривенного или внутриартериального, подкожного и внутрикожного введения. Также может быть применена для накожного введения в гелевой основе; для имплантации на резорбируемом или нерезорбируемом носителе.

Фармкомпозиция предназначена для приготовления ex tempore или иным путем раствора для внутримышечного или иных путей внутреннего введения пациенту (больному, пострадавшему человеку, животному) с целью индукции развития в тканях кровеносных сосудов.

Одним из показаний к применению фармкомпозиции могут служить хронические ишемические состояния различной этиологии, включая ишемическую болезнь сердца, хронические облитеризующие заболевания сосудов нижних конечностей; ситуации, нуждающиеся для исправления в индукции репаративных процессов в тканях, например обширные, длительно не заживающие раны (язвы), в том числе ожоговые, местные повреждения, включая переломы и дефекты костей.

Способ применения фармацевтической композиции заключается во введении ее человеку (или животным) таким способом и в таком количестве, которые обеспечат лечебный эффект в зависимости от нозологической формы и медицинских показаний.

Подробное описание настоящего изобретения

Плазмидная ДНК, кодирующая васкулярно-эндотелиальный фактор роста человека может быть получена путем лигирования области открытой рамки считывания (ОРС) кДНК ВЭФР человека с плазмидным вектором, обеспечивающим экспрессию кодируемых генов в клетках человека, а также репликацию плазмиды в клетках Esherichia coli. Примерами таких векторов являются плазмиды семейства pcDNA, pCMV- Script и pBK-CMV (источник - электронная база данных http://addgene.org/vector-database/). Необходимым компонентом такого вектора является эукариотический промотор, предпочтительно выбранный из группы немедленного раннего промотора цитомегаловируса (CMV), фактора элонгации трансляции 1 альфа человека (EFIa), убиквитина С человека (Ubc), вакуолизирующего вируса обезьяны (SV40), фосфоглицераткиназы 1 мыши (PGK), бета-актина человека, но не ограниченный данной группой. Более предпочтительная группа векторов для экспрессии гена ВЭФР в клетках человека содержит немедленный ранний промотор цитомегаловируса (далее - промотор CMV), ген устойчивости к действию антибиотика и участок начала репликации (ориджин репликации) средней или высокой копийности, выбранный из группы ориджинов репликации ColE1, pUC, pBR322, p15A. Более предпочтительная группа векторов включает ген устойчивости к антибиотику канамицин, кодирующий неомицин-фофсфотрансферазу (NPT II), что позволяет исключить использование антибиотиков ампициллиновой группы в процессе производства плазмиды. В качестве векторов для получения целевой плазмидной ДНК могут быть также использованы плазмиды, кодирующие ОРС других генов. Целевая плазмидная ДНК может быть получена из таких плазмидных ДНК путем удаления области ОРС постороннего гена рестрикцией, выделения "акцепторного" фрагмента ДНК и последующего лигирования с ним "донорного" фрагмента ДНК, кодирующего ОРС кДНК ВЭФР человека. Примером такой "акцепторной" плазмиды является плазмида pEGFP-N2.

Область открытой рамки считывания кДНК ВЭФР человека может быть выбрана из четырех известных сплайс-вариантов, кодирующих изоформы ВЭФР с длиной аминокислотной цепи 121, 145, 165, 189. Предпочтительной изоформой ВЭФР для получения плазмидной ДНК является сплайс-вариант 165 аминокислот. Область ОРС кДНК ВЭФР человека может быть получена из суммарной кДНК тканей человека или синтезирована из перекрывающихся олигонуклеотидов. В синтетической области ОРС кДНК ВЭФР человека часть или все кодоны могут быть заменены на синонимичные, такой синтетический фрагмент кДНК может заменять природный, если он обеспечивает сравнимое с природным время жизни кДНК и сравнимую с природной эффективность трансляции целевого гена. Используемая для получения целевой плазмиды кДНК ВЭФР может содержать известные полиморфизмы (замены единичных нуклеотидов), не изменяющие аминокислотный состав кодируемого полипептида. Использование кДНК ВЭФР, содержащих такие полиморфизмы, не изменяет свойств получаемой целевой плазмиды.

Наиболее предпочтительным вариантом плазмиды, кодирующей ВЭФР и предназначенной для медицинского использования, является продукт лигирования области ОРС ВЭФР изоформы 165 аминокислот и акцепторного фрагмента плазмиды pBK-CMV.

Данная плазмидная ДНК, согласно настоящему изобретению обозначаемая как pCMV-VEGF165, длиной 4859 пар оснований, представленна в Перечне последовательностей под номером SEQ ID NO: 1. Структура плазмиды pCMV-VEGF165 приведена на Фиг.1.

Указанная плазмида размером 4859 п.о. состоит из:

1. Участка 1-361; 968-4859 вектора pBK-CMV, включающего

1.1. элементы обеспечивающие экспрессию целевого гена в клетках млекопитающих: промотора/энхансера ранних генов цитомегаловируса (4626-355), включающую область энхансера (4684-231) и область промотора цитомегаловируса (274-355); ТАТА-элемент (320-326); точку начала транскрипции (349); сигнал полиаденилирования и терминатор вируса SV40 (1306-1531);

1.2. элементы, обеспечивающие поддержание плазмиды в бактериальной клетке, участок инициации репликации бактериофага f1 (1583-1995); прокариотический промотер гена bla (2058-2086); последовательность, кодирующая аминогликозид-3'-фосфотрансферазу, обеспечивающую устойчивость бактерий к канамицину (2519-3313); область начала репликации плазмиды pBR322 (3907-4526);

2. Участка 362-967, включающего последовательность Козак (380-391), которая располагается вокруг старт-кодона целевого гена и способствует инициации трансляции мРНК целевого гена, открытую рамку считывания гена VEGF165 (392-964), стоп-кодон (965-967).

Указанная плазмида содержит уникальные сайты узнавания эндонуклеазами рестрикции: NdeI (1); BamHI (364); EcoRI (373); BsrGI (854); XmaI (969); Acc651 (978); Bell (1307); NarI (2650); ApaLI (4254); PciI (4568). Структура плазмиды приведена на Фиг.1.

Плазмида была получена с использованием стандартных методов генной инженерии, коммерчески доступных плазмид и клонированных участков кДНК человека (Sambrook J, Fritsch EF, Maniatis T. Molecular Cloning. 2nd ed. New York, NY: Cold Spring Harbor Laboratory Press; 1989).

Элементы плазмиды перечислены в порядке их расположения. Взаимный порядок расположения функциональных элементов является существенным для эффективной работы плазмиды.

В качестве рекомбинантной плазмиды согласно настоящему изобретению могут использоваться различные плазмиды, содержащие ген VEGF165 под контролем эукариотического промотора.

Фрагменты ДНК, которые кодируют по существу те же регуляторные элементы могут быть получены, например, путем модификации нуклеотидной последовательности фрагмента ДНК (SEQ ID NO:1), например, посредством метода сайт-направленного мутагенеза, так что один или несколько нуклеотидов в определенном сайте будут делегированы, заменены, вставлены или добавлены. Фрагменты ДНК, модифицированные, как описано выше, могут быть получены с помощью традиционных методов обработки с целью получения мутации.

Для получения штамма-продуцента плазмидная ДНК pCMV-VEGF165 может быть введена (трансформирована) в бактериальную клетку, предпочтительно бактерию, принадлежащую к роду Escherichia, восприимчивую к подобной трансформации указанной плазмидой. Выбор конкретной клетки не является критическим, поскольку методология и приемы трансформации хорошо известны специалисту в данной области техники. И хотя в зависимости от вида клетки и условий культивирования полученного трансформанта копийность и общее содержание плазмиды pCMV-VEGF165 в бактериальной суспензии может варьироваться, факт присутствия целевой плазмиды будет иметь место при условии успешной трансформации клетки - реципиента.

«Трансформация клетки плазмидой» означает введение плазмиды в клетку с помощью методов, хорошо известных специалисту в данной области техники. Методы трансформации включают любые стандартные методы, известные специалисту в данной области техники, например метод, описанный в Jac A. Nickoloff, Electroporation Protocols for Microorganisms (Methods in Molecular Biology) // Humana Press; 1st edition (August 15, 1995).

Согласно настоящему изобретению «бактериальная клетка-продуцент плазмиды pCMV-VEGF165» означает бактериальную клетку, обладающую способностью к поддержанию, репликации и накоплению плазмиды pCMV-VEGF165 согласно настоящему изобретению, когда бактериальная клетка согласно настоящему изобретению выращивается в указанной питательной среде. Используемый здесь термин «бактериальная клетка-продуцент плазмиды pCMV-VEGF165» также означает клетку, которая способна накапливать плазмиду pCMV-VEGF165 в количестве не менее чем 1 мг/л (или 1 мкг/109 клеток), более предпочтительно не менее чем 10 мг/л. Указанная плазмида pCMV-VEGF165 накапливается в указанной клетке предпочтительно в кольцевой сверхскрученной форме.

Предпочтительно использование бактерии, принадлежащей к роду Escherichia, для трансформации плазмидой pCMV-VEGF165, кодирующей ВЭФР под контролем промотора CMV.

Термин «бактерия, принадлежащая к роду Escherichia» может означать, что бактерия относится к роду Escherichia в соответствии с классификацией, известной специалисту в области микробиологии. В качестве примера микроорганизма, принадлежащего к роду Escherichia, может быть упомянута бактерия Escherichia coli (E.coli).

Круг бактерий, принадлежащих к роду Escherichia, не ограничен каким-либо образом, однако, например, бактерии, описанные в книге Neidhardt, F.C. et al. (Escherichia coli and Salmonella typhimurium, American Society for Microbiology, Washington D.C., 1208, Таблица 1), могут быть приведены в качестве примеров.

Предпочтительными вариантами штамма-реципиента для получения продуцента плазмиды pCMV-VEGF165 являются штаммы Е. coli, производные от непатогенного штамма K12 и содержащие инактивированный ген системы репарации ДНК recAl, a также инактивированный ген эндонуклеазы end A1. Примерами таких штаммов являются DH5alpha, DH10B, XL-lBlue, ТОРЮ.

Конкретным примером штамма-реципиента для получения продуцента плазмиды pCMV-VEGF165 согласно настоящему изобретению является, но не ограничивается им, штамм Escherichia coli ТОРЮ. Штамм Escherichia coli ТОРЮ характеризуется следующими культурально-морфологическими, физиолого-биохимическими признаками и генетическими признаками.

Культурально-морфологические особенности штамма: грамотрицательные палочки образуют нити; на агаризованной среде - блестящие полупрозрачные выпуклые средние колонии с ровным краем. Штамм хранится в следующих условиях: среда Лурье-Бертрана, 1% глюкозы, 10% глицерина. Штамм размножается в следующих условиях - среда Лурье-Бертрана.

Генетические особенности штамма. Генотип штамма - Δ(агаА-leu)7697, [araD139]B/r, Δ(codB-lacI)3, φp80dlacZ58(M15), galK0, mcrA0, galU-, recA1, endA1, nupG-, rpsL-(strR), Δ(mcrC-mrr)715.

Трансформация штамма Escherichia coli TOP 10 плазмидой pCMV-VEGF165 приводит к получению штамма-продуцента TOP10/pCMV-VEGF165, который обеспечивает биосинтез плазмиды pCMV-VEGF165 в количестве 5-20 мг/л культуры при культивировании в перемешиваемых колбах в течение 12-20 ч в среде Лурье-Бертрана с добавлением канамицина до 30 мкг/мл, при этом не менее 70% плазмиды pCMV-VEGF165 находится в сверхскрученной форме.

Способ получения высокоочищенной плазмиды pCMV-VEGF165 согласно настоящему изобретению включает культивирование описанной выше бактерии в питательной среде, подходящей для выращивания указанных прокариотических клеток, сбор биомассы клеток, ресуспендирование клеток, их щелочной лизис, селективную ренатурацию плазмидной ДНК кислым раствором, отделение осадка, концентрирование ультрафильтрацией, отделение посторонних примесей и РНК гель-фильтрацией в высокосолевом растворе, отделение остаточной геномной ДНК, эндотоксина и родственных примесей аффинной (тиофильной) хроматографией, окончательную очистку анионообменной хроматографией и последующее концентрирование и обессоливание раствора очищенной плазмиды pCMV-VEGF165 при помощи ультрафильтрации/диафильтрации. Получаемый препарат плазмиды pCMV-VEGF165, пригодной для последующего получения фармацевтической композиции и готовой лекарственной формы, характеризуется следующими основными признаками.

1) Доля родственных примесей (релаксированной кольцевой и линейной форм плазмиды) - не более 5% (здесь и далее - доля от концентрации основного вещества).

2) Доля геномной ДНК E. coli - не более 1%.

3) Доля РНК - не более 1%.

4) Доля общего белка - не более 0,1%.

5) Содержание эндотоксина - не более 50 ЕЭ на 1 мг основного вещества.

Раствор плазмидной ДНК pCMV-VEGF165, пригодный для последующего получения фармацевтической композиции и готовой лекарственной формы, может быть получен при помощи других стандартных методов выделения и очистки ДНК, известных специалисту в данной области техники, например метода термического лизиса бактерий в присутствии детергента, метода избирательного осаждения РНК при помощи хлорида кальция, метода разделения сверхскрученной и релаксированной форм плазмиды при помощи градиентной элюции и ряда других методов, описанных в (D.M.F. Prazeres, "Plasmid Biopharmaceuticals: Basics, Applications and Manufacturing", John Wiley & Sons, Inc. (2011) ISBN: 978-0-470-23292-7).

Готовая лекарственная форма плазмидной ДНК pCMV-VEGF165 должна быть пригодна для проведения внутримышечных инъекций и не должна приводить к существенному изменению свойств основного вещества при продолжительном хранении. Возможная готовая лекарственная форма плазмиды pCMV-VEGF165 может быть выбрана из группы замороженного раствора, жидкого раствора, лиофилизата, т.е. лиофильно высушенного раствора, аморфной пленки, но не ограничивается ими.

Предпочтительными вариантами готовой лекарственной формы являются жидкий раствор или лиофилизат, поскольку они могут храниться при положительной температуре, т.е. в стандартных фармацевтических холодильниках, и не требуют значительного времени для подготовки к инъекции.

Наиболее предпочтительным вариантом готовой лекарственной формы является лиофилизат, поскольку отсутствие воды потенциально замедляет химические реакции распада цепей ДНК, приводящие к превращению сверхскрученной плазмидной ДНК в релаксированную кольцевую форму. Кроме того, при хранении жидкой лекарственной формы плазмидной ДНК возможен продолжительный контакт раствора с материалом резиновой пробки, потенциально содержащим экстрагируемые ионы переходных металлов, ускоряющих распад цепей ДНК путем катализа образования гидроксил радикалов.

Получение лиофилизата, то есть аморфной или микрокристаллической пористой массы, требует присутствия в лиофилизуемом растворе вспомогательных веществ, выполняющих функции криопротектанта, стабилизатора рН, хелатирующего агента, антиоксиданта, наполнителя и т.д. Минимально возможный набор вспомогательных веществ может включать в себя, по меньшей мере один, криопротектант, обладающий свойствами наполнителя и стабилизатор рН. Вспомогательное вещество, являющееся криопротектантом и наполнителем, может быть выбрано из группы, включающей моно- и дисахариды, полиолы и полимеры, такие как: сахароза, лактоза, трегалоза, маннитол, сорбитол, глюкоза, раффиноза, поливинилпирролидон или их сочетания. Стабилизатор рН может быть выбран из группы, включающей цитрат натрия, фосфат натрия, Трис-HCl, Трис-ацетат, глицин и другие аминокислоты.

При исследовании различных фармацевтических композиций плазмидной ДНК pCMV-VEGF165 нами было неожиданно обнаружено, что наилучшую стабильность при хранении при температуре +2-+8°С обеспечивает сочетание вспомогательных веществ глюкозы и фосфата натрия рН=7,8.

При сохранении неизменного объема раствора до и после лиофилизации, наилучший состав раствора, обеспечивающий сохранение свойств плазмидной ДНК pCMV-VEGF165 в процессе лиофилизации и при последующем хранении представляет собой:

1. Плазмидная ДНК от 0,1 до 10 мг/мл, предпочтительно от 0,5 до 4 мг/мл, более предпочтительно от 0,8 до 1,2 мг/мл.

2. Глюкоза (декстроза) от 200 до 400 мМ, предпочтительно от 250 до 350 мМ, более предпочтительно от 280 мМ до 320 мМ.

3. Фосфат натрия (смесь тризамещенного, двузамещенного и однозамещенного фосфатов натрия) в концентрации от 3 до 30 мМ, предпочтительно от 5 до 20 мМ, более предпочтительно от 8 до 12 мМ.

4. рН раствора от 7,0 до 9,0, предпочтительно от 7,2 до 8,5, более предпочтительно от 7,4 до 8,2.

Особенности плазмиды, использованной для создания штамма-продуцента и фармацевтической композиции приведены на Фигуре 1.

Настоящее изобретение будет более подробно описано ниже со ссылкой на следующие не ограничивающие настоящее изобретение Примеры.

Пример 1.

Получение раствора очищенной плазмидной ДНК pCMV-VEGF165

Подготовка посевного материала

Проводят оживление емкости консервированного штамма-продуцента ТОР10/pCMV-VEGF165 из рабочего банка, выращивают инокулят в жидкой среде в объеме 50 мл.

Биосинтез пДНК

Готовят к работе ферментер с колбой 10 л, стерилизуют колбу со средой, асептически монтируют линии подачи и отвода, калибруют КиПП, инокулируют ферментер и ведут культивирование 8 часов до достижения постоянной концентрации растворенного кислорода (стационарная фаза роста культуры) при фиксированной скорости мешалки 1000 об/мин, после чего прекращают аэрацию и охлаждают колбу. Пробу культуральной суспензии передают на анализ плотности культуры.

Получение биомассы

Биомассу, то есть осадок клеток, отделяют от культуральной жидкости в напольной высокоскоростной центрифуге периодического действия с бакетным ротором. Супернатант культуральной жидкости передают на обеззараживание автоклавированием. Полученную биомассу хранят в центрифужных стаканах в низкотемпературном холодильнике. Пробу полученной биомассы передают на анализ содержания и подлинности целевого вещества.

Суспендирование биомассы, лизис и нейтрализация

Размороженную биомассу переносят в бак для лизиса и суспендируют верхнеприводной мешалкой в растворе для суспендирования. Проводят лизис клеток раствором гидроксида натрия и додецилсульфата натрия при перемешивании верхнеприводной мешалкой в течение 5 минут. При перемешивании добавляют раствор ацетата калия для нейтрализации и одновременного получения осадка клеточного дебриса, геномной ДНК, связанной с гистонами, и белков. Образование осадка происходит за счет перехода додецилсульфата натрия в нерастворимую калиевую соль и коагуляции мицелл. Одновременно с этим при нейтрализации раствора происходит ренатурация плазмидной ДНК.

Получение осветленного лизата

Полученную суспензию переносят в центрифужные стаканы и отделяют осадок в напольной высокоскоростной центрифуге периодического действия с бакетным ротором. Осадок в стаканах передают на обеззараживание автоклавированием. Осветленный раствор плазмидной ДНК, дополнительно содержащий родственные соединения - релаксированную и линейную форму плазмидной ДНК, а также посторонние примеси - остаточную геномную ДНК, РНК, белки и LAL-эндотоксин собирают в питающий бак ультрафильтрационной установки.

Ультрафильтрация

Проводят концентрирование раствора плазмидной ДНК методом ультрафильтрации в тангенциальном потоке при помощи половолоконных картриджей с порогом отсечения 500 кДа. В процессе ультрафильтрации дополнительно происходит 9-кратное удаление всех молекул размером меньше 300 кДа, то есть белков, транспортной РНК, LAL-эндотоксина, коротких фрагментов геномной ДНК. Предписанная степень концентрирования - 9 раз. Концентрированный раствор плазмиды собирают в стеклянную емкость, промывают ультрафильтрационную установку раствором для гель-фильтрации и объединяют с концентрированным раствором плазмидной ДНК.

Гель-фильтрация

Первый процесс глубокой хроматографической очистки проводят методом гель-фильтрации на крупнопористом декстрановом сорбенте Sepharose 6 Fast Flow "GE Lifesciences». Используют высокосолевой раствор, содержащий 2.1 М сульфата аммония и 10 мМ ЭДТА-Na, что позволяет одновременно с разделением молекул по размеру проводить удерживание примесей РНК и LAL-эндотоксина сорбентом за счет неспецифического гидрофобного взаимодействия. Раствор примесей и промывочные растворы собирают в тару и утилизируют в установленном порядке. Раствор полуочищенной плазмидной ДНК, содержащий 2.1 М сульфата аммония, собирают в стеклянную бутыль.

Аффинная хроматография

Второй процесс глубокой хроматографической очистки ведут методом тиофильной (псевдоаффинной) хроматографии на сорбенте PlasmidSelect Xtra «GE Lifesciences". Для промывки колонны используют раствор, содержащий 2.0 М сульфата аммония, полуочищенный раствор наносят на колонну при концентрации сульфата аммония 2,1 М. При нанесении раствора все формы ДНК и часть остаточной РНК адсорбируются на сорбенте, остаточные белки и эндотоксин не адсорбируются. После нанесения колонну промывают раствором с концентрацией сульфата аммония 2,0 М, при этом происходит элюция остаточных РНК, геномной ДНК и родственных соединений плазмидной ДНК. Основное вещество HSCI-01 элюируют раствором с концентрацией сульфата аммония 1,7 М. Колонну регенерируют и очищают раствором гидроксида натрия 0,1 М. Раствор примесей и промывочные растворы собирают в тару и утилизируют в установленном порядке. Раствор полуочищенной плазмидной ДНК, содержащий 1.7 М сульфата аммония, собирают в стеклянную бутыль, разбавляют водой для инъекций в соотношении 1:2.

Аниоонообменная хроматография

Третий процесс глубокой хроматографической очистки ведут методом аниоонообменной хроматографии на сорбенте SOURCE 30Q «GE Lifesciences". Основное вещество адсорбируют на колонне и проводят промывку раствором, содержащим 0,4 М хлорида натрия. При промывке колонны происходит замена катиона основного вещества с иона аммония на ион натрия и элюция остаточного эндотоксина. Основное вещество элюируют раствором 1 М хлорида натрия. Раствор примесей и промывочные растворы собирают в тару и утилизируют в установленном порядке. Раствор очищенной плазмидной ДНК собирают в стеклянную бутыль.

Ультрафильтрация и диафильтрация

Раствор очищенной плазмидной ДНК концентрируют ультрафильтрацией на установке с половолоконным модулем с порогом отсечения мембраны 300 кДа. По достижении концентрации 0,25% установку переводят в режим диафильтрации и проводят исчерпывающую замену буфера на воду для инъекций. Фильтрат собирают в тару и утилизируют в установленном порядке. Сконцентрированный раствор сливают в стеклянную бутыль, определяют концентрацию сверхскрученной плазмидной ДНК и хранят при температуре ниже минус 70°С.

Пример 2. Получение вариантов лиофилизата для исследования стабильности

Для получения вариантов фармацевтической композиции использовали обессоленный раствор плазмидной ДНК pCMV-VEGF 165 с концентрацией около 2,5 мг/мл и остаточным содержанием Трис-HCl рН=7,5 и NaCl не более 1 мМ. В качестве криопротектантов исследовали глюкозу, сахарозу и лактозу качества не ниже требований Европейской Фармакопеи. В качестве стабилизатора рН использовали раствор фосфата натрия с рН в диапазоне от 7,2 до 9,0. Сахариды использовали в конечной концентрации 300 мМ, фосфат натрия в конечной концентрации 10 мМ. Такие концентрации вспомогательных веществ обеспечивают изотоничность раствора при внутреннем введении. Конечная концентрация ДНК в получаемых фармацевтических композициях составляла 1 мг/мл. Лиофилизацию проводили в стеклянных флаконах вместимостью 5 мл, снабженных полуоткрытыми лиофилизационными резиновыми пробками и заполненных порциями по 1,2 мл исследуемых растворов. Режим лиофильной сушки для всех исследуемых образцов приведен в таблице 1.

Таблица 1
Режим лиофильной сушки
Название стадии Продолжительность, мин Температура, °С
1) Замораживание раствора:
а) 30 -50
б) 300 -50
2) Лиофилизация:
а) 60 -30
б) 930 -30
в) 60 -10
г) 480 -10
д) 60 20
е) 360 20
3) Досушивание:
а) 60 40
б) 600 40

Давление в рабочей камере во время сушки 60 мкбар, температура продукта по окончании этапа замораживания должна быть не выше минус 45°С, то есть на два градуса ниже температуры фазового перехода (glass transition temperature) для глюкозы и более чем на 10 градусов ниже для остальных сахаров. Температура продукта по окончании лиофилизации должна быть не ниже минус 15°С. Измерение температуры продуктов проводили при помощи термопар, вмороженных во флаконы с имитаторами продукта, содержащими все вспомогательные вещества, но не содержащих ДНК. По окончании досушивания проводили герметизацию флаконов в атмосфере стерильного осушенного воздуха сжатием полок. Выгруженные флаконы укупоривали алюминиевыми колпачками. Для сравнения стабильности при хранении при повышенной температуре использовали раствор фосфата натрия рН=7,8, полученный смешиванием растворов двузамещенного фосфата натрия и однозамещенного фосфата натрия в молярном соотношении 91,5:8,5. Лиофилизованные укупоренные флаконы хранили при температуре +37°С в суховоздушном термостате, 1 раз в месяц извлекали очередные флаконы, растворяли лиофилизат и определяли долю релаксированной плазмидной ДНК при помощи аналитической ионообменной хроматографии. Результаты измерений представлены в таблице 2.

Таблица 2
Доля релаксированной плазмидной ДНК при хранении при повышенной температуре
Время хранения, месяцев
Криопротектант 0 1 2 3
Глюкоза 2,2% 2,8% 5,3% 10,0%
Сахароза 2,1% 6,2% 8,4% 10,4%
Мальтоза 2,3% 7,0% 8,8% 14,6%
Лактоза 2,2% 9,0% 9,6% 18,5%

Было установлено, что использование глюкозы в качестве криопротектанта дает наименьшую скорость распада сверхскрученной плазмидной ДНК при массовом соотношении сахарид:ДНК 1:50 и рН=7,8.

Для фармацевтической композиции, основанной на глюкозе, исследовали зависимость стабильности сверхскрученной плазмидной ДНК от рН раствора и концентрации фосфата натрия (при рН 7,8). Было установлено, что стабильность сверхскрученной плазмидной ДНК не изменяется существенным образом при варьировании концентрации фосфата натрия от 5 до 20 мМ (данные не приводятся). При варьировании рН раствора было установлено (таблица 3), что в диапазоне рН от 7,8 до 9,0 существенных изменений стабильности при хранении не наблюдается, но при рН 7,2 стабильность сверхскрученной плазмиды снижается.

Таблица 3
Доля релаксированной плазмидной ДНК при хранении при повышенной температуре, варьирование рН
pH 0 мес 1 мес 2 мес 3 мес
7,2 2,2% 4,09% 7,63% 15,17%
7,8 2,2% 2,80% 5,30% 10,00%
8,4 2,3% 2,76% 3,34% 10,69%
9 2,1% 2,51% 2,97% 8,39%

Таким образом, по данным ускоренного хранения оптимальная фармацевтическая композиция может быть выбрана для диапазона рН от 7,8 до 9,0 и концентрации фосфата натрия от 5 до 20 мМ. Поскольку концентрация ионизуемых фосфатных групп в составе ДНК при концентрации ДНК 1 мг/мл составляет около 3 мМ, и концентрация буферных солей должна существенно превышать суммарную концентрацию ионизуемых групп в составе основного вещества, оптимальная концентрация фосфата натрия была выбрана как 10 мМ. Оптимальный рН раствора был выбран как 7,8, поскольку эта величина наиболее близка к физиологическому рН (7,2-7,4). Однако следует учитывать, что рН, с одной стороны, должен быть как можно ближе к 7,2, а с другой стороны, чем он выше, тем выше стабильность плазмиды (до 9,0). Вероятно, что при температуре хранения +2-+8°С при рН 7,0-9,0 плазмидная ДНК сохранит стабильность, достаточную для геннотерапии.

Пример 3.

Формулирование раствора очищенной плазмидной ДНК и получение готовой лекарственной формы

Ведут процесс получения плазмидной ДНК, как указано в Примере 1, до завершения стадии анионообменной хроматографии. Последующие стадии проводят, как указано ниже.

Ультрафильтрация и диафильтрация

Раствор очищенной плазмидной ДНК концентрируют ультрафильтрацией на установке с половолоконным модулем с порогом отсечения мембраны 300 кДа. По достижении концентрации 0,15% установку переводят в режим диафильтрации и проводят исчерпывающую замену буфера на раствор 10 мМ фосфата натрия, рН 7,8 и 4,4% (300 мМ) глюкозы в воде для инъекций. Фильтрат собирают в тару и утилизируют в установленном порядке. Сконцентрированный формулированный раствор сливают в стеклянную бутыль, определяют концентрацию сверхскрученной плазмидной ДНК и доводят раствор до конечной концентрации 0,1%.

Стерильная фильтрация

Готовый раствор субстанции передают в чистую зону класса А и проводят стерильное фильтрование при помощи дисковых мембранных фильтров в депирогенизированные стерильные бутылки для инфузионных растворов 250 мл по ГОСТ 19808-86. Проводят отбор проб для передачи в ОКК, закрывают бутылки пробками резиновыми, укупоривают колпачками алюминиевыми и замораживают в карантинной зоне склада.

Размораживают формулированный раствор субстанции пДНК и передают в чистую зону класса А. Вскрывают бутылки и проводят стерильное фильтрование при помощи дисковых мембранных фильтров в депирогенизированные стерильные бутылки для инфузионных растворов 250 мл по ГОСТ 19808-86. Проводят стерильный розлив в стерильные "инсулиновые" флаконы 5 мл по ГОСТ 19808-86. Закрывают флаконы пробками резиновыми по ТУ38.006.269-90 и передают на стадию лиофильной сушки.

Флаконы помещают на полки лиофильной сушки, замораживают при -45°С и ведут трехэтапную вакуумную сушку. Закрывают пробки, извлекают флаконы и укупоривают колпачками алюминиевыми по ГОСТ Р 51314-99.

Пример 4.

Проверка стабильности готовой лекарственной формы pCMV-VEGF165

Флаконы со стерильным лиофилизатом плазмидной ДНК pCMV-VEGF165 хранили в фармацевтическом холодильнике при температуре +4°С в течение 2,5 лет и проводили анализ доли родственных примесей при помощи ионообменной хроматографии один раз в 6 месяцев. Результаты анализа представлены в таблице 4.

Таблица 4
Стабильность готовой лекарственной формы при хранении при температуре +4°С
Норма На момент выпуска 6 мес хранения 12 мес хранения 18 мес хранения 24 мес хранения 30 мес хранения
Релаксированная и линейная плазмидная ДНК менее 5% по ионообменной ВЭЖХ 3,0% 3,0% 3,3% 3,7% 4,1% 4,0%

Таким образом, лекарственная форма плазмидной ДНК pCMV-VEGF165 стабильна при хранении в течение двух лет.

Пример 5.

Проверка эффективности использования фармацевтической композиции

При применении фармкомпозиции, включающей помимо плазмидной конструкции вспомогательные вещества, у пациентов с хронической ишемией нижних конечностей были получены результаты подтверждения ее эффективности, демонстрирующие преимущества перед введением только лишь плазмиды. Данный факт установлен при исследовании, проведенным с вовлечением 75 пациентов с 2а-3 ст. хронической ишемии (по А.В.Покровскому-Фонтейну). В качестве критериев проанализированы: длина безболевой ходьбы, чрезкожно определяемое напряжение кислорода, лодыжечно-плечевой индекс и линейная скорость кровотока в задней большеберцовой артерии.

- Длина безболевой ходьбы. На фоне лечения у пациентов клинической группы ДБХ через 3 мес наблюдения составила 236,49±193,49 м (от 50 до 1200 м), а через 6 мес - 284,73±242,02 м (от 20 до 1500 м). Прирост среднего значения пути, который пациент мог пройти без боли, в исследуемой группе составил 149,47 м, значение медианы увеличилось на 127,5 м, различия были статистически достоверны (Р=0,006).

В контрольной группе среднее расстояние, проходимое пациентом, уменьшилось на 1,42 м, значение медианы увеличилось на 35,00 м, различие между показателями оказалось статистически недостоверным. Различия в динамике показателя между группами (+150,89 по среднему значению и +92,5 по значению медианы) были статистически достоверны (Р=0,001).

- Чрезкожно определяемое напряжение кислорода. В клинической группе отмечалась непрерывная тенденция к увеличению среднего значения признака ТКНК с 76,69±9,96 мм рт.ст. при первом визите до 85,42±10,87 мм рт.ст. при четвертом. В контрольной группе отмечалась противоположная динамика: снижение среднего значения показателя с 76,89±55,76 мм рт.ст. до 75,37±61,57 мм рт.ст. за аналогичный период наблюдения. Отмеченные различия между значениями признаков в клинической группе были достоверны, а в контрольной группе статистически недостоверны (Р=0,096), т.е. показатель у данных больных практически не претерпел изменений в ходе стандартного лечения. Зафиксированные различия в приросте среднего значения показателя ТКНК между группами (+10,25) и медианы (+8,00) были значимы (0,0001). Относительный прирост показателя в группах составил: в клинической группе +12,40±17,69% и в контрольной -2,12±4,38% (Р=0,001).

- Лодыжечно-плечевой индекс ЛПИ, измеренный на целевой конечности, у пациентов клинической группы имел тенденцию к росту, а среди пациентов из группы контроля - к снижению. Так, в клинической группе с исходной величины 0,513±0,182 показатель вырос на фоне применения препарата на 0,057 и составил через полгода 0,57. Отмеченные различия в значениях признака между четвертым и первым визитами в клинической группе были статистически достоверны (Р=0,001). В контроле индекс за полгода уменьшился на 0,02 единицы - с 0,458±0,182 до 0,438±0,187. Однако эти изменения не явились статистически значимыми.

Разница между приростом среднего значения ЛПИ между группами составила +0,077 (медиана +0,065), отмеченные различия были статистически достоверны.

- Линейная скорость кровотока (по данным ультразвуковой допплерографии задней болыиеберцовой артерии), У пациентов клинической группы данный показатель имел тенденцию к росту в течение всего периода исследования: значение среднего возросло на 8,24 см/с, медианы - на 5,0 см/с - с уровня 14,95±10,19 см/с до 23,19±12,71 см/с через полгода.

У пациентов контрольной группы значения показателя увеличилось на 1,30 см/с (от 17,60±6,60 см/с. В начале исследования, до 18,90±6,77 см/с - через полгода), значение медианы осталось без изменения, на уровне 20,0 см/с. В ходе всего исследования различия в значениях показателя между группами были статистически достоверны (Р=0,005).

Прирост показателя в клинической группе был больше, чем в контрольной по значению среднего (+6,94 см/с) и медианы (+5,00 см/с), эти различия были статистически достоверны (Р=0,005).

Таким образом, по критерию эффективности «дистанция безболевой ходьбы» у пациентов клинической группы обнаружен статистически значимый рост показателя от 135,3 м на момент первого визита до 248,7 м через полгода (прирост 110,5%), который статистически значимо отличался от выявленной тенденции у пациентов контрольной группы (Р=0,001).

По другим критериям эффективности:

- ЛПИ - прирост составляет 11,11% (Р=0,001);

- ТКНК - прирост составляет 11,38% (Р=0,001);

- ЛСК - прирост составляет 55,12% (Р=0,001).

Хотя указанное изобретение описано в деталях со ссылкой на Примеры, для специалиста в указанной области техники очевидно, что могут быть совершены различные изменения и произведены эквивалентные замены, и такие изменения и замены не выходят за рамки настоящего изобретения.

1. Способ получения фармацевтической композиции для индукции развития кровеносных сосудов в тканях, предусматривающий трансформацию штамма Escherichia coli TOP10 плазмидой pCMV-VEGF165, характеризующейся SEQ ID NO:1, культивирование штамма в подходящих для накопления биомассы условиях с последующим выделением плазмиды pCMV-VEGF165 в сверхскрученной форме и последующую лиофилизацию плазмиды pCMV-VEGF165, которую проводят при обязательном присутствии в лиофилизируемом растворе вспомогательных веществ, а именно криопротектанта, стабилизатора рН, антиоксиданта и иных веществ, позволяющих получить изотонический раствор для инъекций с концентрацией очищенной плазмиды от 0,1 до 10 мг/мл и рН от 7,0 до 9,0 и обеспечивающих сохранение сверхскрученной формы плазмиды pCMV-VEGF165 при последующем хранении.

2. Фармацевтическая композиция для индукции развития кровеносных сосудов в тканях, полученная способом по п.1 и содержащая очищенную плазмиду pCMV-VEGF165, характеризующуюся последовательностью SEQ ID NO:1, обеспечивающую экспрессию гена VEGF165 в клетках человека, и фармацевтически допустимые вспомогательные вещества в виде, по меньшей мере, одного криопротектанта, обладающего свойствами наполнителя, и стабилизатора рН, в эффективных количествах, обеспечивающих получение изотонического раствора для инъекций с концентрацией очищенной плазмиды от 0,1 до 10 мг/мл и рН от 7,0 до 9,0.

3. Способ лечения ишемии тканей и/или органов человека, заключающийся во введении внутримышечно человеку фармацевтической композиции, охарактеризованной в п.2, в эффективном количестве, обеспечивающем лечебный эффект.



 

Похожие патенты:

Изобретение относится к области биотехнологии и иммунологии. Описаны биспецифические антитела против фактора роста сосудистого эндотелия человека VEGF и ангиопоэтина-2 человека ANG-2, способы их получения, фармацевтические композиции, содержащие указанные антитела, и их применения.

Изобретение относится к мостиковым производным спиро[2.4]гептана формулы (I), в которой W обозначает -CH2CH2- или -СН=СН-; Z обозначает -C(O)NR3-* или -CH2NR4C(O)-*, Y обозначает связь или (C1-C4)алкандиильную группу , R1-R4 являются такими, как определено в описании, их получению и применению в качестве агонистов рецептора ALX и/или FPRL2 для лечения воспалительных и обструктивных заболеваний дыхательных путей.

Изобретение относится к области органической химии, а именно к гетероциклическим соединениям формулы I и к их фармацевтически приемлемым солям, где А выбран из СН или N; R1 выбран из группы, состоящей из, С3-6-циклоалкила, С3-6-циклоалкил-С1-7-алкила, С1-7-алкокси-С1-7-алкила, галоген-С1-7-алкила; R2 и R6 независимо друг от друга представляют собой водород или галоген; R3 и R5 независимо друг от друга выбраны из группы, состоящей из водорода, C1-7-алкила и галогена; R4 выбран из группы, состоящей из водорода, C1-7-алкила, галогена и амино; R7 выбран из группы, состоящей из C1-7-алкила, С1-7-алкокси-С1-7-алкила, С1-7-алкоксиимино-С1-7-алкила, 4-6-членного гетероциклила, содержащего один гетероатом О, фенила, указанный фенил не замещен или замещен одной группой гидрокси, и 5-10-членного гетероарила, содержащего 1-3 гетероатома, выбранных из N, S и О, указанный гетероарил не замещен или замещен одной или двумя группами, выбранными из группы, состоящей из C1-7-алкила, гидрокси, С1-7-алкокси, циано, C1-7-алкиламинокарбонила и галогена.
Изобретение относится к медицине, а именно к детской кардиологии и детским инфекционным болезням, и может быть использовано для оценки показаний к кардиометаболической терапии при инфекционных поражениях миокарда у детей.

Изобретение относится к химико-фармацевтической промышленности и представляет собой фармацевтическую композицию для лечения или предупреждения заболевания, связанного с сердечно-сосудистой системой, у субъекта, нуждающегося в этом, включающую, по меньшей мере, 95% этилэйкозапентаеноата (этил-ЕРА), заключенного в оболочку капсулы, включающую желатин, глицерин, сорбит, мальтит и очищенную воду, где композиция имеет исходное пероксидное число не более 5 мэкв/кг и при хранении композиции при 25°C и относительной влажности (ОВ) 60% в течение 6 месяцев композиция имеет второе пероксидное число не более 8 мэкв/кг.
Изобретение относится к медицине, более точно к эндокринологии, и может быть использовано для лечения неалкогольного жирового гепатоза при сахарном диабете 2 типа.

Изобретение относится к области иммунологии и биотехнологии. Представлен иммуноген для индуцирования иммунного ответа против белка PCSK9, содержащий антигенный пептид PCSK9, выбранный из группы, состоящей из раскрытых в описании SEQ ID NO: 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 314, 318 и 319, содержащих аминокислотную последовательность TRFHRQ, и SEQ ID NO: 182, 183, 184, 185, 186, 187, 188, 317, 401, 402 и 403, содержащих аминокислотную последовательность SIPWNLE, где указанный антигенный пептид PCSK9 конъюгирован с иммуногенным носителем, выбранным из CRM197 или Qbeta вирусоподобной частицы (VLP).

Изобретение относится к пиразолопиридиновым производным формулы (I), фармацевтической композиции на их основе, и их применению для лечения и/или профилактики нарушений или состояний, связанных с никотинамидадениндинуклеотидфосфатоксидазой (НАДФН-оксидазой), а также к способу их получения и интермедиату формулы (VIII).
Изобретение относится к медицине, а именно к эндокринологии, и может быть использовано для лечения неалкогольного жирового гепатоза при сахарном диабете 2 типа. Заявляемый препарат мексикор обеспечивает снижение проявлений цитолиза и холестаза, уменьшение индекса стеатоза, позволяет улучшить метаболические липидные и гликемические показатели и снизить инсулинорезистентность.
Фармацевтическая композиция содержит алеглитазар или его натриевую соль в дозе от 0,01 до 0,9 мг. Фармацевтическая композиция алеглитазара применяется для лечения или профилактики диабета типа II или сердечно-сосудистых заболеваний.

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к опухолеспецифичным промоторам, и может быть использовано в противоопухолевой терапии. Сконструированы опухолеспецифичные промоторы широкого спектра действия, обеспечивающие экспрессию терапевтического гена внутри раковой клетки.

Настоящее изобретение относится к биотехнологии и представляет собой молекулярные конъюгаты, способные связываться с нуклеиновыми кислотами (ДНК или РНК) для доставки их в клетки млекопитающего, экспрессирующие рецепторы трансферрина.

Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к клеточным технологиям, и может быть использовано в медицине. Способ включает масштабирование диплоидных клеток линии М-20 из криобанка ИПВЭ им.

Изобретение относится к области молекулярной биологии и генной инженерии. Предложена молекула RNAi для супрессии экспрессии тимидилатсинтазы за счет действия RNAi, содержащая домен двухцепочечной РНК, состоящий из смысловой цепи, состоящей из нуклеотидной последовательности, представленной SEQ ID NO: 1, гибридизованной с антисмысловой цепью, гибридизующейся в жестких условиях со смысловой цепью.

Группа изобретений относится к области биотехнологии и онкологии. Способ предусматривает: а) выделение постнатальных тканеспецифичных мультипотентных аутологичных стволовых клеток (АСК) и/или аутологичных прогениторных клеток (АПК) для их последующего протеомного и полнотранскриптомного анализов; б) выделение АСК и/или АПК и/или мультипотентных аллогенных HLA-гаплоидентичных стволовых клеток (HLA-CK) для последующего ремоделирования их протеомного профиля; в) выделение РСК из опухоли пациента; г) протеомный анализ АСК и/или АПК и РСК; д) полнотранскриптомный анализ АСК и/или АПК и РСК; е) определение набора белков, каждый из которых содержится в протеомных профилях как АСК и/или АПК, так и РСК; ж) анализ ранее определенного набора белков для идентификации в РСК внутриклеточных сигнальных путей, не подвергшихся неопластической трансформации в результате канцерогенеза, и определения белков-мишеней, являющихся мембранными акцепторами идентифицированных сигнальных путей; з) анализ полнотранскриптомного профиля экспрессии генов РСК и подтверждение сохранности и функциональной значимости структурных компонентов идентифицированных сигнальных путей в РСК; и) определение белков-лигандов, способных активировать белки-мишени; к) сравнительный анализ полнотранскриптомных профилей АСК и/или АПК с транскриптомными профилями, содержащимися в известных базах данных транскриптомов, для определения пертурбогенов, способных модифицировать профиль экспрессии генов АСК и/или АПК и/или HLA-CK, выделенных для ремоделирования их протеомного профиля, в направлении секреции ранее определенных белков-лигандов; л) ремоделирование протеомного профиля АСК и/или АПК и/или HLA-CK пертурбогенами с получением модифицированного транскриптомного профиля различных клеточных систем, способных оказывать регуляторное воздействие на РСК пациента.

Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к клеточным технологиям, и может быть использовано в медицине. Популяцию мононуклеарных клеток или неэмбриональных стволовых клеток, обогащенную клетками моноцитарной линии дифференцировки, содержащей промоноциты, применяют для лечения ишемии у субъекта.

Изобретение относится к области биотехнологии и медицины. Описана активная иммуностимулирующая вакцина, содержащая по меньшей мере одну РНК, предпочтительно мРНК, кодирующую по меньшей мере два антигена, которые инициируют иммунный ответ у млекопитающего, предназначенная для лечения рака легких, прежде всего немелкоклеточного рака легких (НМРЛ), предпочтительно выбранного из основных трех его подтипов, плоскоклеточной карциномы легких, аденокарциномы и крупноклеточной карциномы легких, или нарушений, связанных с НМРЛ.

Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к средству для лечения ишемических поражений тканей, представляющему собой смесь с соотношением 1÷0,5-3 из двух культур мезенхимальных стволовых клеток, одна из которых модифицирована генетической конструкцией на основе вирусного вектора, обеспечивающего гиперпродукцию фактора роста эндотелия сосудов, а другая модифицирована генетической конструкцией на основе вирусного вектора, обеспечивающего гиперпродукцию ангиопоэтина, а также способу лечения ишемических поражений тканей посредством обкалывания ишемезированной ткани, и может быть использовано в медицине.
Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к способам генерации антиген-специфических клеток с цитотоксической активностью против клеток рака молочной железы, и может быть использовано в медицине.
Изобретение относится к области медицины. Предложен способ стимулирования посттравматической регенерации спинного мозга, заключающийся в однократной трансплантации в область повреждения мононуклеарных клеток крови пуповины человека, предварительно трансдуцированных рекомбинантным аденовирусом с клонированным геном глиального нейротрофического фактора (gdnf).
Изобретение относится к медицине, в частности к способам лечения циститов различной этиологии. Для повышения эффективности лечения и снижения вероятности возникновения рецидивов предлагается введение терапевтически активных и гелевого препаратов, обладающих повышенной адгезией к стенкам уротелия.
Наверх