Способ определения интегральной функциональной активности компонента с1 комплемента человека


 


Владельцы патента RU 2542399:

Федеральное Бюджетное учреждение науки "Московский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Г.Н. Габричевского" Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (RU)

Изобретение относится к области медицинской иммунологии и предназначено для определения интегральной функциональной активности компонента С1 комплемента человека по его действию на инфузории. В измерительные ячейки прибора для автоматизированного подсчета числа живых инфузорий вносят суспензию клеток Tetrahymena pyriformis, реагент R1 и испытуемый образец, содержащий компонент С1 комплемента с последующим определением числа живых клеток в каждую минуту. Совпадение динамики изменения числа живых клеток во времени для испытуемого образца и контрольного, представляющего пул 10 сывороток здоровых доноров, предполагает равенство активностей компонента С1 комплемента в этих образцах. Изобретение обеспечивает эффективный способ расчета активности комплемента, пригодный при диагностике ряда заболеваний. 1 з.п. ф-лы, 1 ил., 1 пр.

 

Изобретение относится к медицинской иммунологии, а именно к способам определения функциональной активности комплемента в сыворотке крови организма при диагностике ряда заболеваний.

Традиционный способ определения функциональной активности комплемента человека в сыворотке крови основан на его способности лизировать клетки-мишени, каковыми являются эритроциты барана, сенсибилизированные кроличьими антителами к поверхностным антигенам. Для определения функциональной активности отдельных компонентов такой гемолиз проводят с образцами сыворотки в количествах, недостаточных для осуществления самостоятельного лизиса, но в присутствии реагента RX (где X - тестируемый компонент), характеризующийся отсутствием тестируемого компонента, но избыточным содержанием остальных компонентов, необходимых для осуществления лизиса. Размер фиксируемого гемолиза в этом случае определяется количеством функционально активного тестируемого компонента, находящегося в образце сыворотки, взятой в количествах, недостаточных для осуществления самостоятельного лизиса [1, 2]. Первый компонент комплемента представляет собой комплекс, состоящий из трех белков: C1q, C1r и C1s, в стехиометрическом соотношении 1:2:2. Для определения интегральной функциональной активности компонента C1, отражающей активность наименее активного субкомпонента: C1q, C1r или C1s в комплексе C1, в качестве реагента R1 используется псевдоглобулиновая фракция, полученная путем диализа против дистиллированной воды при pH 5,5 пула не менее 10 сывороток здоровых людей и не содержащая комплекса С1, содержащая все остальные компоненты комплемента и пониженное, но достаточное содержание компонента C3 [2, 3].

Недостатком гемолитического метода является необходимость наличия сенсибилизированных эритроцитов барана, что сопряжено с необходимостью содержания животного или приобретения свежей бараньей крови. Другим недостатком гемолитического метода определения активности C1 является то, что комплемент в крови больных в фазе острого воспаления способен приводить к реактивному гемолизу [4], что завышает результаты определения активности компонента С1 комплемента.

Преодолеть эти недостатки можно, используя другую мишень для тестирования активности комплемента. Из литературы известно [5], что комплемент морской свинки способен обездвиживать инфузории Tetrahymena pyriformis и при этом не требуется дополнительной сенсибилизации микроорганизма антителами. В работе, однако, не было изучено, какой из наблюдаемых эффектов: набухание микроорганизма, обездвиживание или дальнейший лизис мог бы послужить в дальнейшем критерием для определения активности комплемента. Кроме того, не было известно, можно ли такой подход использовать для определения активности отдельных компонентов комплемента. Получение необходимых для осуществления способа клеток Tetrahymena pyriformis существенно удобнее и дешевле, чем получение или приобретение сенсибилизированных эритроцитов барана.

Задачей заявленного изобретения является разработка способа определения интегральной функциональной активности компонента С1 комплемента человека с использованием доступной мишени для действия активного комплемента, не требующей дополнительной сенсибилизации антителами и не подверженной реактивному лизису.

Поставленная задача достигается путем разработки способа определения функциональной активности компонента С1 комплемента человека по измерению его воздействия в присутствии реагента R1 на инфузории Tetrahymena pyriformis, с использованием прибора для биологических исследований Био-ЛаТ-3 [6]. Было обнаружено, что при действии комплемента на инфузории через определенный промежуток времени, зависящий от количества активного комплемента, начинается процесс обездвиживания инфузорий, протекающий со скоростью, также зависящей от количества активного комплемента. Скорость перехода подвижных инфузорий в неподвижные может быть использована для расчета количества функционально активного комплемента.

Способ определения предусматривает внесение в измерительные ячейки прибора суспензии инфузорий в буферном растворе, добавление в ячейки сыворотки крови в необходимом количестве как источника С1 и реагента R1 как источника остальных, кроме С1, компонентов комплемента и автоматический циклический подсчет оставшихся подвижными клеток во времени.

Метод расчета основан на определении константы скорости гибели клеток, которую удобно рассчитывать по тангенсу угла наклона зависимости логарифма числа подвижных клеток от времени в период наблюдаемого падения числа живых клеток. Величина константы скорости падения числа живых клеток, зависящая от количества активного компонента С1 комплемента, сравнивается с активностью компонента С1 комплемента в пуле не менее 10 сывороток здоровых людей, что выбирается в качестве стандарта. Тем самым достигается определение функциональной активности компонента С1 комплемента методом, пригодным для стандартизации.

Техническим результатом заявленного изобретения является разработка способа определения функциональной активности компонента С1 комплемента человека с использованием доступной мишени для действия комплемента, каковой являются инфузории Tetrahymena pyriformis.

Пример 1. Определение интегральной функциональной активности компонента С1 комплемента человека. В измерительные ячейки прибора БиоЛаТ-3 вносят 200 мкл суспензии приблизительно 800 клеток инфузории Tetrahymena pyriformis в вероналовом буферном растворе, pH 7,4, содержащем 0,075 М NaCl, 0,075 мМ Са2+ и 0,25 мМ Mg2+, и 100 мкл того же буфера, содержащего от 5 до 20 мкл испытуемой пробы и от 10 до 40 мкл реагента R1, представляющего псевдоглобулиновую фракцию, полученную путем диализа против дистиллированной воды при pH 5,5 пула не менее 10 сывороток здоровых людей. С помощью прибора БиоЛаТ-3 и совмещенного с ним компьютера определяют число живых клеток в ячейках каждую минуту. На основании динамики падения числа живых клеток во времени рассчитывают константу скорости реакции первого порядка, определяя тангенс угла наклона зависимости логарифма числа подвижных клеток от времени в период наблюдаемого падения числа живых клеток. Калибровочную кривую получают, измеряя падение числа живых клеток во времени для пула сывороток, выбранного в качестве стандарта (рис.1). На рис.1 представлен калибровочный график зависимости константы скорости обездвиживания инфузорий от количества активного компонента C1 (R2=0.997). Содержание активного С1 в стандартной сыворотке принято за 160 мкг/мл в соответствии с литературными данными [6].

Литература

1. Козлов Л.В., Крылова Ю.И., Чих В.П., Молчанова Н.Н. Модифицированные методы определения функциональной активности факторов комплемента С2, С3, С4 и С5. Биоорган. химия. 1982. Т.8. С.652-659.

2. Козлов Л.В., Вавилова Л.М., Голосова Т.В. Микрометод определения факторов комплемента. Иммунология. 1985. №3. С.66-68.

3. Козлов Л.В., Шибанова Е.Д., Зинченко А.А. Образование классической С3-конвертазы в ходе активации альтернативного пути комплемента человека. Биохимия. 1987. Т.52. №4. С.660-666.

4. Thompson R.A., Rowe D.S. Reactive haemolysis - a distinctive form of red cell lysis. Immunology. 1968. V.14. №5. P.745-762.

5. Sinclair I.J.B. The role of complement in the immune reactions of Paramecium aurelia and Tetrahymena pyriformis. Immunology. 1958. V.1. P.291-299.

6. Черемных Е.Г., Покатаев A.C., Гридунова B.H. Прибор для биологических исследований. Патент РФ 2361913, опубл. 20.07.09, бюл. №20.

7. Antes U., Heinz Н.Р., Loos М. Enzyme-linked immunosorbent assay for Clq in human serum by use of monoclonal antibodies. J. Immunol. Methods. 1984. V.74. №2. P.299-306.

1. Способ определения интегральной функциональной активности компонента С1 комплемента человека по его действию на клетки-мишени в присутствии реагента R1, являющегося сывороткой крови человека, избирательно лишенной активности компонента С1, отличающийся тем, что в качестве клеток-мишеней выбраны инфузории Tetrahymena pyriformis, суспензию которых вместе с испытуемым образцом, содержащим компонент С1 комплемента, и реагентом R1 вносят в измерительные ячейки прибора для автоматизированного подсчета числа живых инфузорий с последующим определением числа живых клеток в каждую минуту, при этом совпадение динамики изменения числа живых клеток во времени для испытуемого образца и контрольного, представляющего пул 10 сывороток здоровых доноров, предполагает равенство активностей компонента С1 комплемента в этих образцах.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что рассчитывают константу скорости процесса, определяя ее как тангенс угла наклона зависимости логарифма числа живых клеток от времени в период наблюдаемого падения числа живых клеток, и сравнивают с константой скорости процесса для стандартного образца, представляющего собой пул сывороток от 10 доноров крови.



 

Похожие патенты:

Изобретение относится к области медицинской иммунологии и предназначено для определения интегральной функциональной активности компонентов мембраноатакующего комплекса комплемента человека по его действию на инфузории.
Изобретение относится к медицине, а именно к иммунологии и неврологии, и может быть использовано для выявления степени выраженности интоксикации парами металлической ртути.
Изобретение относится к медицине, а именно к трансплантации органов и клинической лабораторной диагностике, и может быть использовано для дооперационного прогноза осложненного течения раннего посттрансплантационного периода.
Изобретение относится к области медицины, а именно к проблеме создания новых способов диагностики угрозы гибели эмбриона при цитомегаловирусной инфекции. Выполняют измерение у беременной в момент обострения заболевания в периферической крови титра антител IgG к цитомегаловирусу и уровня кортизола.
Изобретение относится к медицине, а именно к гематологии, к лабораторной диагностике, и может быть использовано для диагностики анемического синдрома в детском возрасте.

Изобретение относится к способу получения антигенного эритроцитарного диагностикума для обнаружения антител к антигенам возбудителей сапа и мелиоидоза. Указанный способ включает стерилизацию культуры авирулентного штамма Burkholderia pseudomallei 107, суспендирование высушенной бактериальной массы в 0,15 М растворе NaCl, обработку полученной суспензии ультразвуком, центрифугирование взвеси разрушенных клеток с последующим отделением супернатанта и высаливание из него гликопротеиновой фракции, на основе которой получают диагностикум.
Изобретение относится к области медицины, педиатрии, детской неврологии и может быть использовано для прогнозирования детского церебрального паралича у детей 1-го года жизни.

Изобретение относится к офтальмологии и предназначено для прогнозирования развития поздней отслойки сетчатки у детей с рубцовой ретинопатией недоношенных. В сыворотке крови больного определяют одновременно содержание трансформирующего фактора роста β1 (TGF β1) и фактор роста эндотелия сосудов (VEGF).
Изобретение относится к области медицины, а именно кардиологии, и может быть использовано для раннего иммунологического прогнозирования возникновения нарушений ритма в остром периоде Q-инфаркта миокарда.

Группа изобретений относится к области лабораторной диагностики. Устройство для автоматического обнаружения аналита в пробе телесной жидкости содержит матрицу адресуемых блоков анализа для проведения химической реакции, которая дает различимый сигнал, несущий информацию о наличии или отсутствии аналита; матрицу адресуемых блоков реагентов, в которой обращаются к индивидуальному адресуемому блоку реагента, соответствующему индивидуальному адресуемому блоку анализа, и в которой индивидуальный блок реагента выполнен с возможностью калибровки по опорному сигналу соответствующего индивидуального блока анализа до сборки матриц на устройстве, причем индивидуальный блок анализа содержит наконечник для количественного анализа, имеющий внутреннюю поверхность, содержащую реагенты, фиксированные на поверхности, для обнаружения аналита.

Изобретение относится к области медицинской иммунологии и предназначено для определения интегральной функциональной активности компонентов мембраноатакующего комплекса комплемента человека по его действию на инфузории.
Изобретение относится к медицине и ветеринарии, а именно к средствам для определения чувствительности различных микроорганизмов, в том числе бактерий и грибов, к антимикробным веществам.

Изобретение относится к области биотехнологии и представляет собой новое применение индол-3-ил глиоксиламидов в качестве специфических ингибиторов протеазы CPAF для подавления хламидийной инфекции.

Изобретение относится к области биомедицинских измерительных технологий. .

Изобретение относится к технической микробиологии и биокоррозионным испытаниям, а именно к способам определения подверженности алюминиево-магниевых сплавов, применяемых в авиа-космической технике, к воздействиям технофильных штаммов микроорганизмов, выделенных в реальных эксплуатационных условиях с элементов конструкций Российского сегмента (PC) Международной космической станции (МКС) и депонированных во Всероссийскую коллекцию микроорганизмов (ВКМ).
Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано в клинической микробиологии. .

Изобретение относится к медицине, микробиологии, а именно к бактериологии и относится к способам определения действия антибиотика на микроорганизмы. .
Изобретение относится к медицине, экологии и фармакологии и может быть использовано для выявления влияния внутренней среды организма или факторов внешней среды на микробиоценоз биотопов организма млекопитающего.
Изобретение относится к области медицинской микробиологии и иммунологии и касается отбора высокоактивных моноклональных антител (МКА), взаимодействующих с эпитопами, экспонированными на поверхности микробных клеток возбудителя мелиоидоза.

Изобретение относится к области медицинской иммунологии и предназначено для определения функциональной активности фактора D комплемента человека по его действию на инфузории в бескальциевой среде, содержащей ионы магния. В измерительные ячейки прибора для автоматизированного подсчета числа живых инфузорий вносят суспензию клеток Tetrahymena pyriformis, реагент RD, представляющий собой пул не менее 10 сывороток здоровых доноров, лишенный фактора D с сохранением активностей остальных компонентов и факторов комплемента в результате хроматографической сорбции фактора D на колонке с CM-сефадексом C-50, и испытуемый образец, содержащий определяемый фактор D, с последующим определением числа живых клеток в каждую минуту. Совпадение динамики изменения числа живых клеток во времени для испытуемого образца и контрольного, представляющего пул 10 сывороток здоровых доноров, предполагает равенство активностей фактора D комплемента в этих образцах. Изобретение обеспечивает эффективный способ расчета функциональной активности комплемента, пригодный при диагностике ряда заболеваний. 1 з.п. ф-лы, 1 ил., 1 пр.
Наверх