Способ определения функциональной активности компонента с2 комплемента человека

Изобретение относится к медицинской иммунологии, а именно к способу определения функциональной активности комплемента в сыворотке крови организма при диагностике ряда заболеваний. Изобретение заключается в следующем: в измерительные ячейки прибора для автоматизированного подсчета числа живых инфузорий вносят суспензию клеток Tetrahymena pyriformis, испытуемую пробу и реагент R2, представляющий собой сыворотку крови человека, избирательно лишенную активности компонента С2 путем прогрева, с последующим определением числа живых клеток в каждую минуту. На основании динамики падения числа живых клеток во времени рассчитывают константу скорости реакции первого порядка, определяя тангенс угла наклона зависимости логарифма числа подвижных клеток от времени в период наблюдаемого падения числа живых клеток. Рассчитанная константа скорости падения числа живых клеток во времени линейно зависит от активности компонента С2. Изобретение эффективно в диагностике ряда заболеваний, связанных с активностью компонента С2. 1 з.п. ф-лы, 2 ил., 1 пр.

 

Изобретение относится к медицинской иммунологии, а именно к способам определения функциональной активности комплемента в сыворотке крови организма при диагностике ряда заболеваний.

Традиционный способ определения функциональной активности комплемента человека в сыворотке крови основан на его способности лизировать клетки-мишени, каковыми являются эритроциты барана, сенсибилизированные кроличьими антителами к поверхностным антигенам. Для определения функциональной активности отдельных компонентов такой гемолиз проводят с образцами сыворотки в количествах, недостаточных для осуществления самостоятельного лизиса, но в присутствии реагента RX (где Х - тестируемый компонент), характеризующийся отсутствием тестируемого компонента, но избыточным содержанием остальных компонентов, необходимых для осуществления лизиса. Размер фиксируемого гемолиза в этом случае определяется количеством функционально активного тестируемого компонента, находящегося в образце сыворотки, взятой в количествах, недостаточных для осуществления самостоятельного лизиса [1]. Для определения функциональной активности компонента С2 в качестве реагента R2 используется пул не менее 10 сывороток здоровых доноров, прогретый при 50°С в течение 35 мин [1].

Недостатком гемолитического метода является необходимость наличия сенсибилизированных эритроцитов барана, что сопряжено с необходимостью содержания животного или приобретения свежей бараньей крови.

Преодолеть эти недостатки можно, используя другую мишень для тестирования активности комплемента. Из литературы известно [2], что комплемент морской свинки способен обездвиживать инфузории Tetrahymena pyriformis и при этом не требуется дополнительной сенсибилизации микроорганизма антителами. В работе, однако, не было изучено, какой из наблюдаемых эффектов: набухание микроорганизма, обездвиживание или дальнейший лизис мог бы послужить в дальнейшем критерием для определения активности комплемента. Кроме того, не было известно, можно ли такой подход использовать для определения активности отдельных компонентов комплемента. Получение необходимых для осуществления способа клеток Tetrahymena pyriformis существенно удобнее и дешевле, чем получение или приобретение сенсибилизированных эритроцитов барана.

Задачей заявленного изобретения является разработка способа определения функциональной активности компонента С2 комплемента человека с использованием доступной мишени для действия активного комплемента, не требующей дополнительной сенсибилизации антителами.

Поставленная задача достигается путем разработки способа определения функциональной активности компонента С2 комплемента человека по измерению его воздействия в присутствии реагента R2 на инфузории Tetrahymena pyriformis, с использованием прибора для биологических исследований БиоЛаТ-3 [3]. Было обнаружено, что при действии комплемента на инфузории через определенный промежуток времени, зависящий от количества активного комплемента, начинается процесс обездвиживания инфузорий, протекающий со скоростью, также зависящей от количества активного комплемента. Скорость перехода подвижных инфузорий в неподвижные может быть использована для расчета количества функционально активного комплемента.

Способ определения предусматривает внесение в измерительные ячейки прибора суспензии инфузорий в буферном растворе, добавление в ячейки сыворотки крови в необходимом количестве как источника С2 и реагента R2 как источника остальных, кроме С2, компонентов комплемента, и автоматический циклический подсчет оставшихся подвижными клеток во времени.

Метод расчета основан на определении константы скорости гибели клеток, которую удобно рассчитывать по тангенсу угла наклона зависимости логарифма числа подвижных клеток от времени в период наблюдаемого падения числа живых клеток. Величина константы скорости падения числа живых клеток, зависящая от количества активного компонента С2 комплемента, сравнивается с активностью компонента С2 комплемента в пуле не менее 10 сывороток здоровых людей, что выбирается в качестве стандарта. Тем самым достигается определение функциональной активности компонента С2 комплемента методом, пригодным для стандартизации.

Техническим результатом заявленного изобретения является разработка способа определения функциональной активности компонента С2 комплемента человека с использованием доступной мишени для действия комплемента, каковой являются инфузории Tetrahymena pyriformis.

Пример 1. Определение функциональной активности компонента С2 комплемента человека. В измерительные ячейки прибора БиоЛаТ-3 вносят 200 мкл суспензии приблизительно 800 клеток инфузории Tetrahymena pyriformis в вероналовом буферном растворе, рН 7,4, содержащим 0,075 М NaCl, 0,075 мМ Са2+ и 0,25 мМ Mg2+, и 100 мкл того же буфера, содержащего от 2 до 50 мкл испытуемой пробы и от 5 до 15 мкл реагента R2, представляющего собой пул не менее 10 сывороток здоровых людей, прогретый при 50°С в течение 35 мин. С помощью прибора БиоЛаТ-3 и совмещенного с ним компьютера определяют число живых клеток в ячейках каждую минуту. На основании динамики падения числа живых клеток во времени рассчитывают константу скорости реакции первого порядка, определяя тангенс угла наклона зависимости логарифма числа подвижных клеток от времени в период наблюдаемого падения числа живых клеток. Калибровочную кривую получают, измеряя падение числа живых клеток во времени для пула сывороток, выбранного в качестве стандарта (фиг.1). Фиг.1 демонстрирует калибровочный график зависимости константы скорости обездвиживания инфузорий от количества активного компонента С2 (R2=0.98).

Содержание активного С2 в стандартной сыворотке принято за 2 мкг/мл в соответствии с литературными данными [4].

На фиг.2 приведено сравнение определений активности компонента С2, проведенное для нескольких сывороток гемолитическим методом и методом определения по падению числа живых инфузорий. Наблюдается хорошее соответствие обоих методов (R2=0.98).

Литература

1. Козлов Л.В., Крылова Ю.И., Чих В.П., Молчанова Н.Н. Модифицированные методы определения функциональной активности факторов комплемента С2, С3, С4 и С5. Биоорган, химия. 1982. Т.8. С.652-659.

2. Sinclair I.J.B. The role of complement in the immune reactions of Paramecium aurelia and Tetrahymena pyriformis. Immunology. 1958. V.1. P.291-299.

3. Черемных Е.Г., Покатаев А.С., Гридунова В.Н. Прибор для биологических исследований. Патент РФ 2361913, опубл. 20.07.09. Бюл. №20.

4. Kerr M.A., Porter R.R. The purification and properties of the second component of human complement. Biochem. J. 1978. V.171. P.99-107.

1. Способ определения функциональной активности компонента С2 комплемента человека по его действию на клетки-мишени в присутствии реагента R2, являющегося сывороткой крови человека, избирательно лишенной активности компонента С2, отличающийся тем, что в качестве клеток-мишеней выбраны инфузории Tetrahymena pyriformis, суспензию которых вместе с испытуемым образцом, содержащим определяемый компонент С2, и реагентом R2 вносят в измерительные ячейки прибора для автоматизированного подсчета числа живых инфузорий с последующим определением числа живых клеток в каждую минуту; при этом совпадение динамики изменения числа живых клеток во времени для испытуемого образца и контрольного, представляющего пул 10 сывороток здоровых доноров, предполагает равенство активностей компонента С2 комплемента в этих образцах.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что рассчитывают тангенс угла наклона зависимости логарифма числа живых клеток от времени в период наблюдаемого падения числа живых клеток, который равен константе скорости процесса и прямо пропорционален активности компонента С2 комплемента, и сравнивают с константой скорости процесса для стандартного образца, представляющего собой пул сывороток от 10 доноров крови, и активность компонента С2 комплемента в котором принимают за 100%.



 

Похожие патенты:

Изобретение относится к области медицинской иммунологии и предназначено для определения интегральной функциональной активности компонента С1 комплемента человека по его действию на инфузории.

Изобретение относится к области медицинской иммунологии и предназначено для определения интегральной функциональной активности компонентов мембраноатакующего комплекса комплемента человека по его действию на инфузории.
Изобретение относится к медицине, а именно к иммунологии и неврологии, и может быть использовано для выявления степени выраженности интоксикации парами металлической ртути.
Изобретение относится к медицине, а именно к трансплантации органов и клинической лабораторной диагностике, и может быть использовано для дооперационного прогноза осложненного течения раннего посттрансплантационного периода.
Изобретение относится к области медицины, а именно к проблеме создания новых способов диагностики угрозы гибели эмбриона при цитомегаловирусной инфекции. Выполняют измерение у беременной в момент обострения заболевания в периферической крови титра антител IgG к цитомегаловирусу и уровня кортизола.
Изобретение относится к медицине, а именно к гематологии, к лабораторной диагностике, и может быть использовано для диагностики анемического синдрома в детском возрасте.

Изобретение относится к способу получения антигенного эритроцитарного диагностикума для обнаружения антител к антигенам возбудителей сапа и мелиоидоза. Указанный способ включает стерилизацию культуры авирулентного штамма Burkholderia pseudomallei 107, суспендирование высушенной бактериальной массы в 0,15 М растворе NaCl, обработку полученной суспензии ультразвуком, центрифугирование взвеси разрушенных клеток с последующим отделением супернатанта и высаливание из него гликопротеиновой фракции, на основе которой получают диагностикум.
Изобретение относится к области медицины, педиатрии, детской неврологии и может быть использовано для прогнозирования детского церебрального паралича у детей 1-го года жизни.

Изобретение относится к офтальмологии и предназначено для прогнозирования развития поздней отслойки сетчатки у детей с рубцовой ретинопатией недоношенных. В сыворотке крови больного определяют одновременно содержание трансформирующего фактора роста β1 (TGF β1) и фактор роста эндотелия сосудов (VEGF).
Изобретение относится к области медицины, а именно кардиологии, и может быть использовано для раннего иммунологического прогнозирования возникновения нарушений ритма в остром периоде Q-инфаркта миокарда.

Изобретение относится к медицинской иммунологии, а именно к способам определения функциональной активности комплемента в сыворотке крови организма при диагностике ряда заболеваний. Изобретение заключается в следующем: в измерительные ячейки прибора для автоматизированного подсчета числа живых инфузорий вносят суспензию клеток Tetrahymena pyriformis, испытуемую пробу и реагент R4, представляющий собой сыворотку крови человека, избирательно лишенную активности компонента С4 путем обработки гидразингидратом, с последующим определением числа живых клеток в каждую минуту. На основании динамики падения числа живых клеток во времени рассчитывают константу скорости реакции первого порядка, опре-деляя тангенс угла наклона зависимости логарифма числа подвижных клеток от времени в период наблюдаемого падения числа живых клеток. Рассчитанная константа скорости падения числа живых клеток во времени линейно за-висит от активности компонента С4. Изобретение эффективно в диагностике ряда заболеваний, связанных с активностью компонента С4. 1 з.п. ф-лы, 1 ил., 1 пр.

Изобретение относится к области медицинской иммунологии и предназначено для определения функциональной активности фактора D комплемента человека по его действию на инфузории в бескальциевой среде, содержащей ионы магния. В измерительные ячейки прибора для автоматизированного подсчета числа живых инфузорий вносят суспензию клеток Tetrahymena pyriformis, реагент RD, представляющий собой пул не менее 10 сывороток здоровых доноров, лишенный фактора D с сохранением активностей остальных компонентов и факторов комплемента в результате хроматографической сорбции фактора D на колонке с CM-сефадексом C-50, и испытуемый образец, содержащий определяемый фактор D, с последующим определением числа живых клеток в каждую минуту. Совпадение динамики изменения числа живых клеток во времени для испытуемого образца и контрольного, представляющего пул 10 сывороток здоровых доноров, предполагает равенство активностей фактора D комплемента в этих образцах. Изобретение обеспечивает эффективный способ расчета функциональной активности комплемента, пригодный при диагностике ряда заболеваний. 1 з.п. ф-лы, 1 ил., 1 пр.
Изобретение относится к медицине, а именно к лабораторной диагностике разных патологических состояний человека. Для этого проводится измерение характеристик клеток крови пациента по определению их адгезивности к стеклу. При этом исследуют их агрегабильность и ведут учет по месторасположению и составу взаимодействующих клеток. Далее клетки разделяют на мононуклеарные и полинуклеарные, количественно стандартизируют и проводят их совместное инкубирование при оптимальных условиях. Способ может быть использован для цитологической характеристики клеток при онкологических и аутоиммунных заболеваниях. Изобретение повышает достоверность и эффективность известного метода подсчета агломеризированных лейкоцитов. 3 пр.
Изобретение относится к области медицины, а именно к иммунологии и гастроэнтерологии, и может быть использовано для прогнозирования развития язвенной болезни двенадцатиперстной кишки у европеоидов Республики Хакасия. Сущность способа: устанавливают факторы риска - определяют полиморфизмы генов цитокинов и генотип Н. pylory. Факторам риска присваивают градации (A1-A2) и числовые значения. Затем определяют прогностические коэффициенты P1, P2 по формулам: P1=-1,54+0,57*A1+0,53*A2 и P2=0,21+1,77*A1+1,70*A2, где A1 - генотип полиморфизма C+3953Т IL-1β: TT=0,44, TC=0,51, СС=2,63; A2 - генотип полиморфизма IL-1Ra VNTR: R2R2=1,74, R2R3=8,08, R2R4=1,33, R3R3=1,59, R3R4=0,30, R4R4=0,51. При P1>P2 прогнозируют низкий риск, а при P1<P2 прогнозируют высокий риск развития ЯБ. Способ обладает достаточно высокой чувствительностью (100%), специфичностью (50%) и точностью (75%) в оценке риска развития язвенной болезни двенадцатиперстной кишки. Применение предлагаемого способа позволит повысить точность и эффективность прогнозирования язвенной болезни двенадцатиперстной кишки на ранних стадиях заболевания, что позволит проводить целенаправленные и ранние профилактические мероприятия распространенного заболевания. 2 пр.
Изобретение относится к области медицины, а именно к акушерству и неонатологии, и может быть использовано для прогнозирования перинатальных гипоксических поражений центральной нервной системы у новорожденных. Сущность способа: проводят определение содержания sRAGE в периферической венозной крови беременной с угрожающими преждевременными родами в сроки гестации 22-27 недель. При его значении, равном 659,5 пг/л или менее, прогнозируют перинатальные гипоксические поражения центральной нервной системы у новорожденных. Заявленный способ прост в исполнении и позволяет с высокой точностью прогнозировать перинатальные гипоксические поражения ЦНС в сроки 22-27 недель гестации, наиболее уязвимые для состояния плода и новорожденного, что способствует выбору правильной тактики лечения беременных, метода их родоразрешения и снижению частоты данной патологии. 1 табл., 4 пр.
Изобретение относится к медицине, а именно к неонатологии, и может быть использовано для ранней диагностики тяжелой формы инфекции, вызванной вирусом простого герпеса 1 и 2 типа у новорожденных детей. Поставленная задача решается тем, что в крови новорожденных от матерей с персистирующей герпесвирусной инфекцией на 7-10 сутки определяют уровень CD16+CD25+ и IL-6. При значениях CD16+CD25+ 3,5% и ниже, а IL-6 32,6 пг/мл и выше диагностируют развитие тяжелой формы инфекции, вызванной вирусом простого герпеса 1 и 2 типа у новорожденных детей. Способ позволяет сократить время исследования и повысить точность индивидуального прогноза. Применение способа дает возможность ранней диагностики тяжелой формы внутриутробной инфекции, вызванной вирусом простого герпеса 1 и 2 типа у новорожденных детей для своевременного назначения патогенетической терапии. 3 пр.

Изобретение относится к электрохимическим методам анализа, а именно к иммуноанализу, в частности к определению содержания патогенных микроорганизмов в различных объектах и средах. Изобретение может быть использовано в микробиологии, медицине, экологии для мониторинга содержания микроорганизмов в природных объектах и дифференциальной диагностики инфекционных заболеваний. Электрохимический способ определения содержания грамотрицательных патогенных бактерий предполагает использование в качестве сигналообразующей метки электроактивных магнитных нанокомпозитных частиц, которые перед стадией конъюгирования получают путем создания на поверхности магнитных наночастиц переходных металлов или их соединений электроактивного полимерного покрытия. Концентрацию патогенных микроорганизмов определяют путем получения электрохимического отклика, регистрируемого напрямую в результате электропревращения электроактивного полимерного покрытия. Изобретение направлено на упрощение анализа, увеличение чувствительности, экспрессности, воспроизводимости, а также на расширение круга электрохимически активных меток. Использование полимерного покрытия позволяет добиться высокой чувствительности и воспроизводимости анализа. 7 ил. 6 пр.

Изобретение относится к биотехнологии. Предложен способ печати биологических лигандов, представляющих собой олигосахариды, и/или полисахариды, и/или пептиды, и/или гликопептиды, и/или биотин. Предварительно на подложку наносят слой гидрофобной нелетучей жидкости, не смешивающейся с растворителем биологических лигандов и имеющей удельную массу меньше, чем удельная масса раствора биологических лигандов. Затем бесконтактным методом осуществляют печать биологических лигандов. В качестве гидрофобной нелетучей жидкости используют вазелин, минеральное масло или высшие предельные углеводороды или их смесь. Толщина слоя гидрофобной нелетучей жидкости предпочтительно составляет 50-200 мкм. Техническим результатом изобретения является повышение равномерности высыхания капель раствора биологических лигандов на подложке при одновременном обеспечении защиты биологических лигандов от преждевременного гидролиза и улучшении морфологии спотов. 2 з.п. ф-лы, 2 ил., 3 пр.
Изобретение относится к области биотехнологии и экологии, в частности к тест-системам для определения содержания микополисахаридов и их производных, имеющих в своем составе участки, аналогичные синтетическому линейному нона-β-(1→3)-D-глюкозиду в окружающей среде, в том числе в пыли помещений, и может быть использовано для оценки пирогенности объектов окружающей среды при проведении экологического мониторинга жилых и производственных помещений с целью количественного определения пирогенной нагрузки пыли окружающей среды при помощи ингибиторного иммуноферментного анализа на твердой фазе. Тест-система включает в себя планшет с иммобилизованным на внутренней поверхности лунок конъюгатом синтетического линейного нона-β-(1→3)-D-глюкозида с бычьим сывороточным альбумином, калибраторы, содержащие растворы синтетического линейного нона-β-(1→3)-D-глюкозида; лиофилизованную специфическую поликлональную кроличью антисыворотку; конъюгат антивидовых антител против IgG(H+L) кролика с пероксидазой из хрена; 25-кратный концентрат 0,1М фосфатно-солевого буферного раствора с 0,05% Tween-20 (ФСБ-Т) рН 7,2-7,4; раствор для разведения поликлональной антисыворотки; раствор для разведения конъюгата антивидовых антител против IgG(H+L) кролика с пероксидазой из хрена; хромоген; стоп-реагент. Изобретение является удобным и эффективным для исследований в области экологии. 2 табл., 6 пр.

Изобретение относится к медицине, а именно к акушерству, и может быть использовано для выявления нарушений свертывающей системы крови у беременных во 2-3 триместре. Для этого предварительно методом двумерного ультразвукового исследования устанавливают пол плода. Затем в венозной крови беременной методом иммунотурбидиметрии определяют уровень D-димера. Если его уровень у беременных с плодами мужского пола 350 и выше нг/мл, а у беременных с плодами женского пола 520 нг/мл и выше, диагностируют нарушение свертывающей системе крови. Использование данного способа позволяет проводить диагностику скрыто протекающего внутрисосудистого фибринообразования, что дает возможность определить высокий риск развития тромбозов и дифференцировать подходы к назначению терапии у таких беременных. 6 пр.

Изобретение относится к медицинской иммунологии, а именно к способу определения функциональной активности комплемента в сыворотке крови организма при диагностике ряда заболеваний. Изобретение заключается в следующем: в измерительные ячейки прибора для автоматизированного подсчета числа живых инфузорий вносят суспензию клеток Tetrahymena pyriformis, испытуемую пробу и реагент R2, представляющий собой сыворотку крови человека, избирательно лишенную активности компонента С2 путем прогрева, с последующим определением числа живых клеток в каждую минуту. На основании динамики падения числа живых клеток во времени рассчитывают константу скорости реакции первого порядка, определяя тангенс угла наклона зависимости логарифма числа подвижных клеток от времени в период наблюдаемого падения числа живых клеток. Рассчитанная константа скорости падения числа живых клеток во времени линейно зависит от активности компонента С2. Изобретение эффективно в диагностике ряда заболеваний, связанных с активностью компонента С2. 1 з.п. ф-лы, 2 ил., 1 пр.

Наверх