Способ получения диагностикума для обнаружения антигена гепатита с в реакции агломерации объемной (рао)


 


Владельцы патента RU 2542475:

Федеральное казенное учреждение здравоохранения "Ростовский-на-Дону ордена Трудового Красного знамени научно-исследовательский противочумный институт" Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (RU)

Изобретение относится к медицинской вирусологии. Предложен способ получения диагностикума для обнаружения антигена гепатита С в реакции агломерации объемной (РАО). Благодаря повышению специфичности реакции и уменьшению сроков исследования крови изобретение может быть успешно использовано в лабораторной диагностике для прямого обнаружения в крови людей вируса гепатита С. 3 табл., 3 пр.

 

Способ получения диагностикума для обнаружения антигена гепатита С в реакции агломерации объемной (РАО).

Предлагаемое изобретение относится к медицинской вирусологии и может быть использовано в лабораторной диагностике для прямого обнаружения в крови людей вируса гепатита С.

В настоящее время существует проблема обнаружения вируса гепатита С (ВГС) на ранних стадиях инфицирования человека. Основным широко используемым методом диагностики обнаружения ВГС в сыворотке крови инфицированных больных является полимеразная цепная реакция (ПЦР).

Однако метод ПЦР, как правило, дает отрицательные результаты первые 6 месяцев после инфицирования ВГС. Кроме того, ПЦР - дорогостоящий метод, требующий зысокой квалификации специалистов, дорогостоящего оборудования, праймеров, реактивов и поэтому он имеет существенные ограничения в использовании для массового скрининга образцов крови.

Известна тест-система в виде набора антигенов для обнаружения антител к вирусу гепатита С человека (см. пат. RU №2262704, МПК G01N 33/576, 20.10.2005 г.), заключающаяся в том, что предлагаемый комплект включает в себя ряд рекомбинантных антигенов, полученных на основе аминокислотных последовательностей наиболее иммунореактивных эпитопов белков вирусов гепатита С разных генотипов, иммобилизованных на поверхности твердофазного носителя.

Недостатком известной тест-системы является сложность ее воспроизведения и длительность исследования, что не дает возможности использовать ее при скрининговых исследованиях.

За прототип выбран способ ускоренной диагностики гепатита С, основанный на обнаружении гемагглютининов вируса гепатита С и антител к ним в РГА и РТГА в крови (см. пат. RU №2194993, МПК G01N 33/569, G01N 33/576, 20.12.2000 г.), предусматривающий обнаружение антигенов ВГС на способности последних агглютинировать эритроциты гусей или голубей в реакции гемагглютинации (РГА), при этом результаты считают положительными, если титры антигенов ВГС в РГА превышают 1:20-1:40.

Недостатки этого способа:

во-первых РГА представляет собой неспецифическую реакцию агглютинации эритроцитов, которая не позволяет утверждать о наличии в крови людей антигенов ВГС, а не других антигенов, обладающих способностью агглютинировать эритроциты гуся (антигены арбовирусов, вируса краснухи и др);

во-вторых для идентификации антигенов ВГС, обнаруженных в РГА, требуется постановка более сложного теста - реакции торможения гемагглютинации (РТГА) с помощью антител к антигенам ВГС;

в-третьих постановка РТГА может быть затруднена из-за наличия ВГС-специфических комплексов антиген-антитело в сыворотках крови ВГС инфицированных людей.

Таким образом РГА и РТГА для обнаружения антигенов ВГС требует обязательного наличия формалинизированных эритроцитов гуся, способ получения которых из 6-месячного гуся-самца не приводил бы к их способности агглютинировать в присутствии антигена; кроме того, способ не отличается стандартностью и наглядностью результатов в виду того, что рецепторы для гемагглютининов вируса на эритроцитах варьируют от группы крови птицы. Следовательно, этот метод не может получить широкого внедрения в практическое здравоохранение.

Цель предлагаемого изобретения состояла в разработке нового диагностикума, позволяющего осуществлять в короткие сроки скрининговые исследования образцов крови для обнаружения антигена гепатита С в стандартном режиме и отличающегося хорошей наглядностью.

Поставленная цель достигается тем, что в известном способе получения диагностикума для обнаружения антигена гепатита С в реакции агломерации объемной (РАО), включающем иммунизацию кроликов для получения сыворотки крови с выделением антител к антигенам ВГС и иммобилизацию последних на полимерный носитель с последующим проведением РАО, отличающемся тем, что сыворстку крови получают путем поэтапной иммунизации кроликов штаммом Virus hepatitis С, ГКВ-963 в дозе 5·106 ЛД50, МИЦ (100) в объеме 0,5 мл и выделяют методом Duberta из полученной иммунной сыворотки анти-ВГС, последние ковалентно связывают с полимерными микросферами, для этого 100 мг полимерного носителя дважды отмывают в 0,1 М фосфатно-буферного раствора рН 7,0 и разливают в емкости по 10 мл и центрифугируют при 3000 об/мин в течение 10 мин, после деконтируют надосадочную жидкость, а осадок суспендируют в 1,5 мл 0,1 М фосфатного буферного раствора с добавлением 200 мкг/мл анти-ВГС из кроличьей сыворотки, перемешивают, оставляют для контакта в течение 2 ч при температуре 20°C и на 16-18 часов при 7°C, после этого к полученной суспензии добавляют 2 мл 1,0% раствора желатозы на 0,9% растворе хлорида натрия и оставляют при постоянном перемешивании в течение 2 ч при температуре 20°C, затем полученную суспензию диагностикума центрифугируют и трижды отмывают 0,9% раствором хлорида натрия при 3000 об/мин по 5 мин, полученный осадок повторно суспендируют в 8 мл 0,1% раствора желатозы на 0,9% растворе хлорида натрия, после определяют специфическую активность полученного препарата, который затем разливают в ампулы и лиофилизируют.

При этом поэтапную иммунизацию кроликов проводят в четыре этапа, на первом в течение 3-х дней внутривенно в количестве 0,5 мл вводят штамм Д-1, ГКВ-963, на 8, 9 и 10 в полном адьюванте Фрейда в отношении 1:1 и в объеме 0,5 мл вводят подкожно в холку животного, а на 15, 16 и 17 дни повторно вводят тот же препарат в 0,5 мл и на 22 день также в полном адьюванте Фрейда в отношении 1:1 и в количестве 1,0 мл вводят в холку животного и только на 30 день проводят обескровливание животного с последующим выделением из сыворотки анти-ВГС антител.

Кроме того, носитель получают путем растворения в 250 мл дистиллированной воды 1,5 г поливинил пирролидона и 75 мл акролеина, затем к охлажденному до 12°C раствору при перемешивании добавляют раствор 0,3 сафронина в 20 мл 0,1 М натрий хлор, после прекращения подъема температуры охлаждение убирают, реакционную смесь перемешивают 1 час, затем добавляют 2 г персульфата калия и раствор продувают азотом и полимеризацию проводят еще 2 часа при температуре 70°C, после этого полученные микросферы диаметром 1,1 мкм отмывают водой осаждением в центрифуге.

При этом для проведения РАО проводят подготовку исследуемой сыворотки, для этого 0,1 мл последней разводят в 0,9 мл 0,9% раствора хлорида натрия, после этого ее прогревают в течение 30 мин в водяной бане при температуре 56°C и оставляют при 20°C на 10 мин, после этого проводят исследования в РАО.

Способ осуществляется следующим образом.

Для проведения способа необходим исходный материал:

- штамм Virus hepatitis С, Д-1, ГКВ-963, который депонирован и хранится в Государственной коллекции вирусов НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского РАМН;

Первоначально получают антитела из гепатитной сыворотки. Для

этого проводят иммунизацию кроликов в четыре этапа:

I этап - кроликам в течение 3-х дней внутривенно в объеме 0,5 мл вводят штамм Virus hepatitis С, Д-1, ГКВ-963, в дозе 5·106 ЛД50, МИЦ (100);

II этап - на 8, 9 и 10 дни после первой иммунизации препарат (штамм Д-1, ГВК-963) суспендируют в полном адьюванте Фрейда в отношении 1:1 и в объеме 0,5 мл вводят подкожно в холку животного;

III этап - на 14, 15 и 16 сутки повторяют внутривенное введение препарата в количестве 0,5 мл;

IV этап - на 20 день штамм Д-1 (ГКВ-963) суспендируют в полном адьюванте Фрейда в отношении 1:1 и в 1,0 мл вводят подкожно в холку животного.

Обескровливание животных проводили на 30 день от начала иммунизации.

Антитела вируса гепатита С (ВГС) выделяют из полученной иммунной сыворотки методом Duberta.

Следующий этап в получении диагностикума заключается в иммобилизации анти-ВГС на полимерные носители. В качестве носителя используют сферические полимерные частицы диаметром 1,0 мм, содержащие 1,3 мМ/г альдегидных групп.

Носитель был получен путем полимеризации акролеина в водно-щелочной среде в присутствии радикального инициатора - персульфата калия. Для этого в 250 мл дистиллированной воды растворяют 1,5 г поливинил пирролидона и 75 мл акролеина. К охлажденному до 12°C раствору при перемешивании добавляют раствор 0,3 сафранина в 20 мл 0,1 М NaOH. После прекращения подъема температуры охлаждение убирают, реакционную смесь перемешивают 1 час, затем добавляют к ней 2 г персульфата калия. Раствор продувают азотом и полимеризацию проводят еще 2 часа при температуре 70°C. Микросферы отмывают водой осаждением в центрифуге.

Анти-ВГС ковалентно связывают с полимерными микросферами. Для этого в центрифужный стакан помещают 100 мг носителя (1 мл суспензии микросфер) и дважды отмывают его 0,1 М фосфатным буферным раствором, рН 7,0 разливают в емкости по 10 мл и центрифугируют при 3000 об/мин в течение 10 мин. После деконтирования надосадочной жидкости осадок носителя суспендируют в 1,5 мл 0,1 М фосфатного буферного раствора, содержащего 200 мкг/мл анти-ВГС иммуноглобулинов и, перемешивая, оставляют для контакта в течение 2 ч при температуре 20°C. Далее оставляют для контакта при температуре 7°C на 16-18 ч.

После этого к полученной суспензии добавляют 2 мл 1,0% раствора желатозы на 0,9% растворе хлорида натрия и оставляют при постоянном перемешивании в течение 2 ч при температуре (20±2)°C. Полученную таким образом суспензию диагностикума центрифугируют и трижды отмывают 0,9%-ном раствором хлорида натрия при 3000 об/мин по 5 мин. Осадок диагностикума повторно суспендируют в 8 мл 0,1%-го раствора желатозы на 0,9%-ном растворе хлорида натрия.

После этого определяют специфическую активность и специфичность суспензии полученного диагностикума, который затем разливают в ампулы и лиофилизируют.

Применение полученного диагностикума подтверждено примерами 1,2,3 (см. таблицы).

Проведен ряд исследований сывороток крови людей, подозрительных на заболевание гепатитом С в реакции агломерации объемной (РАО) с применением предложенного диагностикума.

Диагностический титр препарата 1:20-1:40.

Для постановки РАО вначале проводят подготовку исследуемых сывороток следующим образом: берут 0,1 мл исследуемой сыворотки и 0,9 мл 0,9%-ного раствора хлорида натрия. Разведенные сыворотки прогревают в течение (30±1)мин в водяной бане или инактиваторе при температуре (56=1)°C. После этого сыворотки оставляют при (20±2)°C на 10 мин и затем исследуют в РАО.

Затем в U-лунки планшета для иммунологических реакций разливают по 50 мкл 1% раствора нормальной кроличьей сыворотки (НКС). В первую лунку ряда вносят по 50 мкл исследуемой сыворотки и титруют до 12 лунки. В каждую лунку добавляют по 25 мкл суспензии иммобилизированных на микросферах анти-ВГС антител диагностикума, после добавления которого содержимое лунок помешивают покачиванием в течение 1 минуты и оставляют при температуре 20°C на 2,5 часа.

Для контроля диагностикума на спонтанную агломерацию в 2 лунки вносят только НКС и диагностикум. Через 2,5 часа проводят учет реакции.

За положительный результат (+) принимают ярко-розовый агломерат, равномерно выстилающий все дно лунки («зонд»). Положительный результат указывает на наличие в исследуемой сыворотке ВГС. Учет результатов основан на подсчете титров антигена ВГС. Результаты считаются положительными, если титр антигена ВГС в РАО превышает 1:20-1:40. В случае отрицательного результата (-) частицы скатываются на дно в виде плотного осадка «пуговицы» или в виде маленького колечка. При получении отрицательного результата можно предположить, что в исследуемой сыворотке вирус гепатита С не обнаружен.

Пример 1.

Были исследованы 18 сывороток крови людей, подозрительных на заболевание гепатитом С, двумя методами: полимеразной цепной реакцией (ОТ ПЦР) и в серологической реакции РАО с иммуноглобулиновым гепатита С полимерным диагностикумом (см. табл. 1).

Таблица 1
№ п/п РАО ПЦР
1 1:160 +
2 1:80 +
3 1:160 +
4 1:40 +
5 1:640 +
6 1:640 +
7 1:40 +
8 1:640 +
9 1:1280 +
10 1:320 +
11 1:320 +
12 1:40 +
13 1:160 +
14 1:1280 +
15 1:640 +
16 1:1280 +
17 1:160 +
18 1:20 +

Из таблицы 1 видно, что все сыворотки по данным ПЦР содержали РНК ВГС и также были положительны в РАО, причем титры антигена ВГС значительно различались, что указывает на возможность дифференциации стадий заболевания гепатитом С.

Пример 2.

Отличается от примера 1 тем, что в качестве исследуемых сывороток взяты сыворотки доноров (см. табл. 2).

Таблица 2
№ п/п РАО ПЦР
1 0 0
2 0 0
3 0 0
4 0 0
5 0 0
6 0 0
7 0 0
8 0 0
9 0 0
10 0 0

Данные таблицы 2 свидетельствуют о том, что в сыворотках крови исследуемой группы доноров антигены вируса гепатита С не были обнаружены ни методом ОТ ПЦР ни РАО. Это указывает на отсутствие ложноположительных результатов при применении диагностикума иммуноглобулинового полимерного гепатата С.

Пример 3.

Отличается от примера 1 и 2 тем, что в качестве исследуемых сывороток взяты сыворотки больных вирусными инфекциями и контрольные сыворотки больных гепатитом В (из набора для постановки ИФА).

Таблица 3
№ п/п сыворотки больных (диагноз) РАО ПЦР
1 грипп 1:80 0
2 грипп 0 0
3 грипп 0 0
4 орви 0 0
5 цмви 0 0
6 герпес 0 0
7 цмви 0 0
8 контрольная вируса гепатита В 0 0
9 контрольная вируса гепатита В 0 0
10 контрольная вируса гепатита В 0 0

Из таблицы З видно, что в одной из сывороток больных гриппозной инфекцией зарегистрированы титры к ВГС и не выявлена РНК ВГС. В данном случае возможны два объяснения наблюдаемого феномена. Во первых: полученный результат ложноположительный и в крови больного присутствуют не анти-ВГС антитела, а имеется повышенный уровень С-реактивного белка, что вызывает спонтанную агглютинацию микросфер диагностикума. Либо обнаруженная концентрация ВГС в крови больного гриппозной инфекцией свидетельствует о ранних сроках заболевания гепатитом С, что дает возможность устанавливать диагноз инфекции в тех случаях, когда методом ПЦР еще не удается обнаружить РНК ВГС.

Использование предлагаемого изобретения позволяет за счет полученного диагностикума проводить в короткие сроки скрининговые исследования большого количества людей, подозрительных на заболевание гепатитом С в стандартном режиме и хорошей наглядностью без дорогостоящего оборудования, праймеров и реактивов, что значительно сократит себестоимость проведения как единичных, так и массовых исследований.

Способ получения диагностикума для обнаружения антигена гепатита С в реакции агломерации объемной (РАО), включающий следующие стадии:
а) получают сыворотку крови путем иммунизации кроликов вирусным препаратом штамма Virus hepatitis С, Д1, ГКВ-963 в дозе 5·106 ЛД50, МИЦ (100) в четыре этапа:
I - в течение 3-х дней упомянутый препарат вводят внутривенно в объеме 0,5 мл;
II - на 8, 9 и 10 дни после первой иммунизации препарат штамма Virus hepatitis С, Д1 суспендируют в полном адьюванте Фрейда в отношении 1:1 и в объеме 0,5 мл и вводят подкожно в холку животного;
III - на 14, 15 и 16 сутки повторяют внутривенное введение препарата штамма Virus hepatitis С, Д1 в количестве 0,5 мл;
IV этап - на 20 день вирусный препарат штамма Virus hepatitis С, Д1 суспендируют в полном адьюванте Фрейда в отношении 1:1 и в количестве 1,0 мл вводят подкожно в холку животного, затем на 30 день от начала иммунизации проводят обескровливание животных;
б) выделяют из полученной иммунной сыворотки методом Duberta антитела вируса гепатита С (ВГС);
в) готовят предварительно полимерный носитель, который получают путем растворения в 250 мл дистиллированной воды 1,5 г поливинил пирролидона и 75 мл акролеина, затем к охлажденному до 12°С раствору при перемешивании добавляют раствор 0,3 сафронина в 20 мл 0,1 М натрий хлор, после прекращения подъема температуры охлаждение убирают, реакционную смесь перемешивают 1 час, затем добавляют 2 г персульфата калия и раствор продувают азотом и полимеризацию проводят еще 2 часа при температуре 70°С, после этого полученные микросферы диаметром 1,1 мкм отмывают водой осаждением в центрифуге;
г) проводят иммобилизацию на полимерный носитель анти-ВГС гепатита С, которые ковалентно связывают с полимерными микросферами носителя, для этого 100 мг последнего дважды отмывают в 0,1 М фосфатно-буферного раствора рН 7,0 и разливают в емкости по 10 мл и центрифугируют при 3000 об/мин в течение 10 мин, после деконтируют надосадочную жидкость, а осадок суспендируют в 1,5 мл 0,1 М фосфатного буферного раствора, с добавлением 200 мкг/мл анти-ВГС из кроличьей сыворотки, перемешивают, оставляют для контакта в течение 2 ч при температуре 20°С;
д) получают суспензию диагностикума, которую центрифугируют и трижды отмывают 0,9% раствором хлорида натрия при 3000 об/мин по 5 мин, полученный осадок повторно суспендируют в 8 мл 0,1% раствора желатозы на 0,9% растворе хлорида натрия, определяют специфическую активность полученного препарата, который затем разливают в ампулы и лиофилизируют;
е) проводят предварительную подготовку исследуемой сыворотки для РАО, для этого берут сыворотку в количестве 0,1 мл, разводят в 0,9 мл 0,9% раствора хлорида натрия, после этого ее прогревают в течение 30 мин в водяной бане при температуре 56°С и оставляют при 20°С на 10 мин, после этого проводят исследования в РАО;
ж) осуществляют реакцию агломерации объемную в планшетах путем внесения в лунки 50 мкл 1% нормальной кроличьей сыворотки, 50 мкл взвеси исследуемой культуры и 25 мкл диагностикума с последующим перемешиванием в течение 1 минуты и контактированием при температуре 20°С в течение 2,5 часов.



 

Похожие патенты:
Изобретение относится к области биотехнологии и иммунологии и представляет собой способ получения слабоположительной контрольной сыворотки, содержащей AD и AY субтипы HBsAg, включающий отбор донорских сывороток с помощью ИФА, титрование положительной сыворотки, содержащей AD & AY субтипы HBsAg в разводящем стабилизированном растворе, генотипирование, проведение теста термодеградации для установления сроков годности панели, отличающийся тем, что положительные контрольные сыворотки, содержащие AY и AD субтипы HBsAg, разводят до диапазона концентраций от 0,05 до 0,025 МЕ/мл и вязкости, равной вязкости нормальной сыворотки человека, а в качестве разводящего стабилизированного раствора используют отрицательную дефибринизированную и безлипидную сыворотку, не содержащую маркеры HBV инфекции, для выявления которой предназначена искомая тест-система.

Изобретение относится к технологии изготовления референс-панелей сывороток, содержащих антигены вирусных инфекций. .
Изобретение относится к медицине, а именно к педиатрии, и может быть применено для определения обострения течения хронического гепатита С у детей подростков. .
Изобретение относится к медицине и может быть использовано в педиатрии, инфектологии и гепатологии. .
Изобретение относится к медицине, а именно к гастроэнтерологии, и касается способа определения степени активности хронического гепатита. .
Изобретение относится к медицине, а именно к лабораторной диагностике внутренних болезней. .
Изобретение относится к способу изготовления рабочего стандарта (PC) сывороток, содержащих антитела к вирусу гепатита С. .

Изобретение относится к диагностическим средствам медицинского назначения, и касается набора для раздельного выявления антител к структурным и неструктурным белкам вируса гепатита С.
Изобретение относится к медицине, а именно к гинекологии, и может быть использовано при проведении диагностики нарушения транспортной функции маточных труб. Для этого проводят гистероскопию, во время которой в полость матки в зоне внутренних отверстий маточных труб устанавливают катетеры, которые выводят через влагалище и фиксируют к внутренней поверхности бедра.
Изобретение относится к медицине, в частности к диагностике вкусовой чувствительности к поваренной соли, и может быть использовано в кардиологии, терапии и диетологии для профилактики и немедикаментозного лечения артериальной гипертонии.
Группа изобретений относится к биохимии, в частности к получению аллергена туберкулопротеина - полуфабриката аллергена туберкулезного очищенного в стандартном разведении.
Изобретение относится к области судебной медицины. В долевой бронх предполагаемой поврежденной доли легкого вводят шланг от аппарата искусственной подачи воздуха.
Изобретение относится к области медицины, а именно к стоматологии, и может быть использовано для прогнозирования развития у детей кариеса временных зубов с незаконченной минерализацией.

Изобретение относится к хирургии детского возраста и может быть использовано для обоснованного выбора методики оперативного лечения пороков развития органов брюшной полости у новорожденных.
Изобретение относится к медицине, а именно к неврологии, может быть использовано для уточнения стадии обострения или ремиссии для пациентов с рассеянным склерозом (РС).
Способ относится к области медицины, а именно к клинической диагностике, и предназначен для выявления здоровых лиц с неинфекционными хроническими заболеваниями или предрасположенностью к ним с помощью интегральной оценки факторов риска, субоптимального статуса здоровья и эндотелиальной дисфункции.

Группа изобретений относится к медицине, а именно к стоматологии, и может быть использована для диагностирования наличия заболевания ротовой полости у субъекта. Для этого предложены устройство и способ.

Изобретение относится к медицине и может быть использовано при определении чувствительности химиопрепарата к злокачественной опухоли. В качестве препарата используют материал, взятый из опухоли.

Изобретение относится к медицине, а именно к кардиологии и профилактической медицине, и может быть использовано для дифференциации пациентов с наследственными нарушениями соединительной ткани в группу риска развития нежелательных сердечно-сосудистых событий с целью индивидуализации планирования и осуществления профилактических мероприятий. Определяют возраст пациента и выявляют наличие диспластических изменений в органах, присваивают выявленным изменениям прогностические коэффициенты, причем при наличии: кожных проявлений присваивают коэффициент «+6», флебопатии - «+6», патологии позвоночных артерий - «+2», наследственных нарушений соединительной ткани со стороны 3 и более органов - «+2», а менее 3 - «-4», полностью разомкнутого Виллизиева круга - «+7», двустворчатого аортального клапана - «+16», если возраст пациента составляет до 30 лет включительно присваивают прогностический коэффициент «+6», а более 30 лет - «-3». Полученные коэффициенты суммируют и при достижении значения «+13» определяют принадлежность пациента к группе риска. Способ позволяет с высокой точностью у пациентов с недифференцированными формами наследственных нарушений соединительной ткани определить индивидуальный суммарный риск развития нежелательных сердечно-сосудистых событий. 4 табл.
Наверх