Бионаноконъюгат для обнаружения и выделения нуклеиновых кислот и способ его получения



Бионаноконъюгат для обнаружения и выделения нуклеиновых кислот и способ его получения
Бионаноконъюгат для обнаружения и выделения нуклеиновых кислот и способ его получения
Бионаноконъюгат для обнаружения и выделения нуклеиновых кислот и способ его получения
Бионаноконъюгат для обнаружения и выделения нуклеиновых кислот и способ его получения
Бионаноконъюгат для обнаружения и выделения нуклеиновых кислот и способ его получения
Бионаноконъюгат для обнаружения и выделения нуклеиновых кислот и способ его получения
Бионаноконъюгат для обнаружения и выделения нуклеиновых кислот и способ его получения
Бионаноконъюгат для обнаружения и выделения нуклеиновых кислот и способ его получения
Бионаноконъюгат для обнаружения и выделения нуклеиновых кислот и способ его получения

 

C12N15/00 - Получение мутаций или генная инженерия; ДНК или РНК, связанные с генной инженерией, векторы, например плазмиды или их выделение, получение или очистка; использование их хозяев (мутанты или микроорганизмы, полученные генной инженерией C12N 1/00,C12N 5/00,C12N 7/00; новые виды растений A01H; разведение растений из тканевых культур A01H 4/00; новые виды животных A01K 67/00; использование лекарственных препаратов, содержащих генетический материал, который включен в клетки живого организма, для лечения генетических заболеваний, для генной терапии A61K 48/00 пептиды вообще C07K)

Владельцы патента RU 2542476:

Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Томский научный центр Сибирского отделения Российской академии наук (ТНЦ СО РАН) (RU)
Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Сибирский государственный медицинский университет" Министерства здравоохранения Российской Федерации (ГБОУ ВПО СибГМУ Минздрава России) (RU)

Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к созданию конъюгатов магнитная частица - нуклеиновая кислота, и может быть использовано для молекулярно-генетической диагностики. Бионаноконъюгат включает наноразмерную суперпарамагнитную частицу кобальтовой феррошпинели CoxFe3-xO4, где 0.6≤x≤0.98, полученную механохимическим синтезом. Для выделения нуклеиновой кислоты, содержащей олиго- или поли-A/dA последовательность, используют синтетический одноцепочечный олигонуклеотид 5′-dGndTm, где n=5-30, m=10-35, один участок которого, состоящий из гуаниновых нуклеотидов, в присутствии фосфат-анионов в растворе специфически связан с поверхностью наночастицы, а другой - состоящий из тиминовых нуклеотидов, способен вступать в гибридизацию с олиго- или поли-A/dA нуклеотидными последовательностями. Для выделения из раствора в присутствии фосфат-анионов специфической гетеронуклеотидной последовательности дополнительно используют молекулу олигонуклеотида-адаптера, содержащую последовательность олиго-dAx на 3′-конце, гибридизованную с тиминовыми нуклеотидами комплекса комплекса 5′-dGndTm, где n=5-30, m=10-35, и участок на 5′-конце, комплементарный специфической гетеронуклеотидной последовательности в растворе. Изобретение позволяет эффективно обнаруживать и выделять одноцепочечные нуклеиновые кислоты. 2 н. и 1 з.п. ф-лы, 8 ил., 1 табл., 5 пр.

 

Изобретение относится к биологии и медицине, а именно к созданию конъюгатов магнитная частица - нуклеиновая кислота, необходимых для молекулярно-генетической диагностики.

Создание новых эффективных систем и бионаногибридных конструкций для диагностики различных заболеваний и решения ряда других проблем представляет собой важнейшее направление современной медицины и биологии. Одной из главных задач при этом является создание конъюгатов, в частности, для последующего обнаружения и выделения из различных органов и тканей генетического материала (ДНК, РНК), на основе исследования которого и будет поставлен диагноз. Методы обнаружения и выделения нуклеиновых кислот должны обладать высокой чувствительностью и специфичностью, быть простыми и быстрыми, давать воспроизводимые результаты и обеспечивать высокую чистоту ДНК/РНК.

Наиболее перспективным методом обнаружения и выделения нуклеиновых кислот является метод магнитной сепарации, в котором в качестве сорбентов выступают магнитные наночастицы, смешанные в растворе с биологическими структурами и образующие с последними конъюгаты. В большинстве случаев такие частицы состоят из оксидов железа, поверхность которых покрыта различными веществами и функциональными группами, способствующими образованию конъюгатов. При наложении магнитного поля с достаточно большим градиентом магнитные частицы, создающие конъюгаты с нуклеиновыми кислотами (ДНК/РНК), могут быть отделены из раствора и подвергнуты дальнейшей обработке.

Основные преимущества использования магнитных наночастиц для систем обнаружения и выделения нуклеиновых кислот обусловлены следующим:

- магнитные наночастицы являются однодоменными, обладают суперпарамагнитным поведением и магнитными свойствами, необходимыми для выделения биологических объектов с помощью внешнего магнитного поля.

Задачей настоящего изобретения является создание бионаноконъюгата с высокой степенью селективности для выделения одноцепочечных специфических нуклеиновых кислот из раствора.

Поставленная задача решается тем, что в качестве основы бионаноконъюгата берут наноразмерную суперпарамагнитную частицу кобальтовой феррошпинели CoxFe3-xO4, где 0.6<х≤0.98, полученную методом механохимического синтеза (RU 2471502, 2013), и для выделения нуклеиновой кислоты, содержащей олиго- или поли-A/dA последовательность, используют синтетический одноцепочечный олигонуклеотид 5′-dGndTm, где n=5-30, m=10-35, один участок которого, состоящий из гуаниновых нуклеотидов, в присутствии фосфат-анионов в растворе специфически связан с поверхностью наночастицы, а другой - состоящий из тиминовых нуклеотидов, способен вступать в гибридизацию с олиго- или поли-A/dA нуклеотидными последовательностями, а для выделения из раствора, содержащего фосфат-анионы, специфической гетеронуклеотидной последовательности используют молекулу олигонуклеотида-адаптера, содержащую последовательность олиго-dAx на 3′-конце, гибридизованную с тиминовыми нуклеотидами комплекса 5′-dGndTm, где n=5-30, m=10-35, и участок на 5′-конце, комплементарный специфической нуклеотидной последовательности в растворе.

При n<5 связывание наночастицы с нуклеиновой кислотой является слабым. При n>30 доля выделенного продукта практически не изменяется и, таким образом, дальнейшее увеличение числа гуаниновых нуклеотидов не приводит к существенным преимуществам. Соответственно при m<10 связь между олигоdТ-«хвостом» бионаноконъюгата и комплементарной нуклеиновой кислотой является нестабильной при нормальных условиях (нестабильность формирующегося за счет водородных связей А-Т двухцепочечного гибрида при комнатной температуре), а при m>35 возникают трудности при последующем отделении выделяемой нуклеиновой кислоты от бионаноконъюгата (высокая температура плавления А-Т-связей).

По сравнению с другими техническими решениями предложенный бионаноконъюгат имеет преимущества, которые состоят в следующем:

а) Для создания бионаноконъюгатов используют наночастицы кобальтовой феррошпинели CoxFe3-xO4, где 0.6≤х≤0.98 со средним диаметром в интервале 3-11 нм, полученные методом механохимического синтеза и обладающие суперпарамагнитным поведением.

В отличие от других методов химической конденсации при механохимическом синтезе воздействие интенсивной деформации (удар, трение) приводит к формированию в наночастицах «активных» неравновесных состояний, для которых характерны высокие упругие микронапряжения (Δd/d=(5.4-7.4)·10-3), нарушения степени порядка в расположении разнородных ионов, изменение параметров решетки, аморфизация поверхностного слоя. Кристаллическая решетка таких наночастиц отличается большими смещениями ионов, химический состав в основном соответствует нестехиометрии, поэтому полученные механохимическим синтезом наночастицы обладают большой запасенной энергией и являются метастабильными и «активными». Можно полагать, что наличие «активных» неравновесных состояний облегчает образование конъюгатов между ДНК и катионами металлов на поверхности наночастицы.

Установлено, например, что по эффективности переноса ДНК в клетки in vitro при магнитофекции наночастицы, синтезированные механохимическим методом, заметно превосходят такие же по размеру наночастицы, полученные методом химического осаждения (М.А. Sukoyan, Е.А. Khrapov, E.N. Voronina et.al. Magnitofection of Human Somatic Cells with Magnetite and Cobalt Ferrospinel Nanoparticles/Bulletin in Experimental Biology and Medicine. 2013, v.154, №5, March, pp. 673-676).

б) Магнитная наночастица кобальтовой феррошпинели не требует покрытия, широко используемого в других технических решениях, так как предложенный химически синтезированный олигонуклеотид осуществляет прямое связывание непосредственно с поверхностью наночастицы за счет участка, представленного повтором из гуаниновых нуклеотидов. Применение магнитных наночастиц без покрытия приводит к повышению магнитных свойств, которые обычно снижаются при нанесении покрытий, увеличивает площадь поверхности для связывания с биомолекулами и позволяет более легко создать коллоидную систему. Одновременно в результате данной функционализации достигается блокирование адсорбционно-активных центров в отношении нуклеиновых кислот на поверхности наночастицы.

Установлено, что в случае использования наночастиц без покрытия процедура экстракции является простой, быстрой, дешевой и надежной, не требует применения органических растворов и ее можно легко автоматизировать (Saiyed Z.M., Ramchand. Extraction of Genomic DNA Using Magnetic Nanoparticles (Fe3O4) as a Solid-Phase Support/Americal Journal of Infectious Diseases 3(4): 225-229, 2007; Saiyed Z.M., Ramchand C.N., Telang S.D. Isolation of genomic DNA using magnetic nanoparticles as a solid-phase support/J. Phys.: Condens. Matter, v.20 (2008) 204153).

в) Предлагаемый бионаноконъюгат обеспечивает высокую степень селективности, близкую к 100% при выделении олиго- или поли A/dA нуклеотидных последовательностей из раствора, содержащего фосфат-анионы в концентрации (10±0.5)·10-3 моль/л. После дополнительного присоединения молекулы-«адаптера» биоконъюгат обеспечивает такую же степень селективности при выделении специфических гетеронуклеотидных последовательностей. При этом важную роль играют фосфат-анионы, которые в выбранной концентрации предотвращают неспецифическое связывание.

Способ получения бионаноконъюгата для выделения одноцепочечных нуклеиновых кислот, заключающийся в том, что для выделения нуклеиновой кислоты, содержащей олиго- или поли-A/dA последовательность, берут наночастицы суперпарамагнитной кобальтовой феррошпинели CoxFe3-xO4, где 0.6≤х≤0.98, полученные механохимическим синтезом, наночастицы промывают дистиллированной водой, готовят водную суспензию отмытых наночастиц, суспензию разделяют на фракции в виде осадка и надосадка, отбирают надосадок и смешивают с ним синтетический одноцепочечный олигонуклеотид 5′-dGndTm, где n=5-30, m=10-35, и фосфат натрия в концентрации (10±0.5)·10-3 моль/л, после чего смесь инкубируют до установления полного адсорбционного равновесия и выделяют бионаноконъюгат методом магнитной сепарации с последующим центрифугированием и промыванием, а для выделения гетеронуклеотидной последовательности в раствор, содержащий наночастицы кобальтовой феррошпинели, связанные с синтетическим одноцепочечным олигонуклеотидом 5′-dGndTm, где n=5-30, m=10-35, и фосфат натрия в концентрации (10±0.5)·10-3 моль/л, добавляют молекулы олигонуклеотида-«адаптера», содержащие последовательность олиго-dAx на 3′-конце и участок на 5′-конце, комплементарный специфической гетеронуклеотидной последовательности в растворе, после чего смесь вновь инкубируют до установления полного адсорбционного равновесия и выделяют бионаноконъюгат методом магнитной сепарации с последующим центрифугированием и промыванием. При этом n предпочтительно равно = 20-25, a m предпочтительно равно 15-25.

Концентрационные границы содержания фосфата натрия в буферном растворе определяются следующими соображениями. При содержании фосфата натрия менее (10±0.5)·10-3 моль/л участок олигонуклеотида, представленный тиминовыми нуклеотидами, может вступать в связывание с поверхностью наночастицы. Повышение концентрации фосфата натрия в растворе выше (10±0.5)·10-3 моль/л может приводить к снижению плотности покрытия поверхности наночастицы.

Пример 1. Получение бионаноконъюгата.

Для приготовления суспензии вносят суперпарамагнитные наночастицы кобальтовой феррошпинели Co0.9Fe2.1O4, полученные механохимическим синтезом, в 10 мМ трис (pH 5.0) до конечной концентрации 0.2 мг/мл. Обрабатывают суспензию 20 минут ультразвуком при частоте 22 кГц, мощности 25 Вт (Bandelin Sonopuls HD 2070) и центрифугируют при 13400 об/мин в течение минуты (Eppendorf MiniSpin) для осаждения агрегатов наночастиц. Отбирают надосадочную часть, представляющую собой суспензию наночастиц кобальтовой феррошпинели с концентрацией 0.15 мг/мл (pH 6.5).

Для получения бионаноконъюгата к 8/10 частей полученной суспензии наночастиц добавляют 1/10 объема водного раствора соответствующего олигонуклеотида состава dG18dT25 с концентрацией 50*10-6 моль/л и 1/10 объема 10х фосфатно-солевого буфера (PBS) (10xPBS:1.37 Μ NaCl, 0.027 Μ KCl, 0.1 Μ Na2HPO4, 0.02 Μ ΚΗ2ΡO4, pH 7.4) и перемешивают на вортексе (BioSan FV-2400). Далее инкубируют реакционную смесь при нормальных условиях (температура окружающего воздуха 20±10°C, относительная влажность воздуха от 40 до 60%, атмосферное давление 760±20 мм рт.ст.) в течение 24 часов для установления полного адсорбционного равновесия. Полученный бионаноконьъюгат отделяют из раствора методом магнитной сепарации на магнитном штативе (Promega), центрифугируют в течение 15 минут при 13400 об/мин и дважды промывают бидистиллированной водой и трис-содержащим буфером.

На рисунке 1 представлены ИК-спектры наночастиц феррита кобальта (Co0.9Fe1.1O4) после выдерживания в фосфатсодержащем буфере, олигонуклеотида (dG18T25) и бионаноконъюгата (dG18T25-Co0.9Fe1.1O4), полученного согласно примеру 1.

ИК спектр получали в D2O и Н2O методом НПВО на алмазном кристалле (Nicolet 6700 Thermo). Присутствие в ИК-спектре бионаноконъюгата характеристических полос поглощения: феррита кобальта при 588 см-1, обусловленную колебаниями связи металл-кислород в тетраэдрических кислородных междоузлиях феррита, а также олигонуклеотида при 1083 см-1 и 1210 см-1, обусловленную колебаниями симметричного и ассиметричного фосфата, и в области 1500-1700 см-1, обусловленных колебаниями групп оснований, подтверждает формирование бионаноконъюгата. Наблюдаемые изменения положения полос поглощения на ИК-спектре бионаноконъюгатов по сравнению с несвязанным олигонуклеотидом (таблица 1) является следствием взаимодействия групп сахарофосфатного остова и оснований гуанина с заряженными атомами на поверхности наночастицы.

На рисунке 2 показана эффективность связывания олигонуклеотида dG18T25 с наночастицами различного состава. Видно, что наночастицы с содержанием кобальта в пределах 0.69-0.90 эффективно связывают олигонуклеотид из раствора (Вmax=2.7±0.2, Kd=0.36±0.07·10-6 М) и формируют нанобиоконъюгат.

Удельная намагниченность ансамбля бионаноконъюгатов (МАГНИТОМЕТР Н-04) составляет 20±0.4 Гс·см3/г. Небольшое снижение магнитных свойств по сравнению с исходным ансамблем наночастиц феррита кобальта (22 Гс·см3/г) является следствием снижения межчастичного взаимодействия в ансамбле наночастиц из-за увеличения расстояния между ними.

Пример 2. Получение бионаноконъюгата для выделения нуклеиновой кислоты, содержащей олиго(dA) последовательность на 3′-конце.

Бионаноконъюгат, полученный согласно примеру 1, после отмывок водой промывают буфером 0.5 Μ NaCl, 10 мМ трис (7.5-8.0) и растворяют в этом же буфере до концентрации 5 мг/мл. В пробирке типа эппендорф смешивают 20 мкл суспензии, содержащей бионаноконъюгат, 60 мкл буфера 0.5 Μ NaCl, 10 мМ трис (7.5-8.0), 10 мкл 10х фосфатно-солевого буфера (PBS) (10xPBS: 1.37 Μ NaCl, 0.027 Μ KCl, 0.1 Μ Na2HPO4, 0.02 Μ ΚΗ2ΡΟ4, pH 7.4) и 10 мкл водного раствора олигонуклеотида dΑ25 25 (5′-аааааааааааааааааааааааааа-3′). Перемешивают смесь на вортексе (BioSan FV-2400). Выдерживают 10 минут при нормальных условиях и снова встряхивают на вортексе. Осаждают на магнитном штативе (Promega) в течение 10 минут. Супернатант удаляют. Дважды промывают осадок буфером 0.8 Μ NaCl, 10 мМ трис (7.5-8.0). Добавляют 20 мкл воды.

На рисунке 3 показана эффективность связывания (А, нмоль/мг) синтетического олигонуклеотида, содержащего 25 остатков аденина (dA25) из раствора 537 мМ NaCl, 8 мМ Трис, 2.7 мМ КСl, 10 мМ Na2HPO4, 2 мМ КН2РO4 (pH 7.5), при варьировании концентрации dA25 от 0.25 до 5 мкмоль/л с использованием бионаноконъюгата. Эффективность последующей элюции в воде при прогревании до 70°C составила 96,0±0,8%.

На рисунке 4 показана эффективность связывания (А, нмоль/мг) синтетического олигонуклеотида, содержащего олиго(dA) последовательность на 3′-конце dN23dA25 (5′-tctggtaaagtggatattgttgcaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaa-3′) с использованием бионаноконъюгатов, полученных на основе наночастиц различного состава.

Пример 3. Выделение полиА+ мРНК с использованием нанобиоконъюгата.

После отмывок водой бионаноконъюгат промывают буфером 0,5 Μ NaCl, 10 мМ трис (7.5-8.0) и растворяют в этом же буфере до концентрации 5 мг/мл. В пробирке типа эппендорф смешивают 10 мкл суспензии, содержащей бионаноконъюгат, 70 мкл буфера 0,5 Μ NaCl, 10 мМ трис (7.5-8.0), 10 мкл 10х фосфатно-солевого буфера (PBS) (10xPBS: 1,37 Μ NaCl, 0,027 Μ KCl, 0,1 Μ Na2HPO4, 0,02 Μ ΚΗ2ΡO4, pH 7.4) и 10 мкл исследуемой пробы (тотальной РНК), препарат тотальной РНК предварительно прогревают при 65°C в течение 5 минут). Тщательно перемешивают смесь. Выдерживают 5 минут при нормальных условиях и снова перемешивают. Осаждают на магнитном штативе (Promega) в течение 5 минут. Супернатант удаляют. Дважды промывают осадок буфером 0,5 Μ NaCl, 10 мМ трис (7.5-8.0). Добавляют 20 мкл деионизованной воды (свободной от РНКаз), тщательно перемешивают и инкубируют при 70°C в течение 10 минут в твердотельном термостате (Термит, ДНК-технология). Осаждают бионаноконъюгат на магнитном штативе и отбирают супернатант, содержащий полиА+ мРНК, в чистую пробирку. Препарат мРНК может быть использован для дальнейших молекулярно-генетических манипуляций.

Препарат тотальной РНК из мононуклеаров венозной крови человека получали с использованием TRIzol-реагента (Life technologies) согласно инструкции фирмы производителя. Выделенную с применением бионаноконъюгата мРНК из препарата тотальной РНК использовали для синтеза кДНК с использованием набора для постановки реакции обратной транскрипции Mint-ревертаза (Евроген). Синтезированную кДНК применяли для ПЦР в режиме реального времени с использованием наборов для постановки ПЦР-РВ в присутствии SybrGreen I (Синтол) с использованием праймеров к мРНК/кДНК гена глицерофосфатдегидрогеназы. На рисунке 5 представлены кривые амплификации, полученные в результате постановки ПЦР-РВ (LightCycler 480, Roche). Для постановки реакции брали кДНК, синтезированную на матрице мРНК, выделенной с помощью бионаноконъюгата (кривая а) и тотальной РНК (кривая b). Кривые с, d, е, f - серия последовательных десятикратных разведений контрольной кДНК (1:10, 1:100, 1:1000, 1:10000).

Таким образом, реализуемое техническое решение - бионаноконъюгат - обеспечивает эффективное (>1.2 мкмоль/г) связывание с молекулами специфических нуклеиновых кислот, имеющих определенную последовательность нуклеотидов, в растворе, которые могут быть отделены (элюированы) от бионаноконъюгата с эффективностью не менее 95%. Эффективность элюции значительно превосходит максимальное значение данного показателя для прототипа (58%). Низкая эффективность элюции может служить источником ложноотрицательных результатов (невыявленных) при использовании в молекулярно-генетической диагностике. Способность бионаноконъюгата в отличие от прототипа связываться со специфическими молекулами ДНК/РНК позволяет использовать его для обнаружения диагностически значимых нуклеиновых кислот в образце, например с флуоресцентным или магнитно-резонансным детектированием.

Пример 4. Получение биоконъюгата для выделения специфической нуклеиновой кислоты (заданного состава) из смеси.

Бионаноконъюгат, полученный согласно примеру 1, промывают в буфере (10 мМ трис, 0,137 Μ NaCl, 0,0027 Μ КСl, 0,01 Μ Na2HPO4, 0,002 Μ KH2PO4, pH 7.4) и растворяют в этом же буфере до концентрации 5 мг/мл. В пробирке типа эппендорф смешивают 50 мкл суспензии содержащей бионаноконъюгат, 50 мкл олигонуклеотида-«адаптера» dN23dA25 25·10-6 Μ (5′-gcaacaatatccactttaccagaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaa-3′) и доводят объем буфером (10 мМ трис, 0,137 Μ NaCl, 0,0027 Μ КСl, 0,01 Μ Na2HPO4, 0,002 Μ KH2PO4, pH 7.4) до 500 мкл. Перемешивают смесь на вортексе (BioSan FV-2400). Выдерживают 15 минут при нормальных условиях и снова встряхивают на вортексе. Осаждают биоконъюгат магнитной сепарацией и центрифугированием. Супернатант удаляют. Дважды промывают осадок буфером (10 мМ трис, 0,137 Μ NaCl, 0,0027 Μ КСl, 0,01 Μ Na2HPO4, 0,002 Μ КН2РO4, pH 7.4). Растворяют в этом же буфере в конечном объеме 50 мкл.

10 мкл полученного бионаноконъюгата, гибридизованного с молекулой олигонуклеотида-«адаптера» dN23dA25, смешивают в пробирке типа эппендорф с 90 мкл смеси содержащей два типа олигонуклеотидов в концентрации от 0.5 до 0.7·10-6 М, меченных различными флуоресцентными метками.

Смесь инкубируют при 37°C 20 минут. Осаждают биоконъюгат магнитной сепарацией и центрифугированием. Надосадок отбирают, осадок промывают дважды буфером: 10 мМ трис, 0,137 Μ NaCl, 0.0027 Μ КСl, 0,01 Μ Na2HPO4, 0.002 Μ KH2PO4, pH 7.4. Осадок ресуспендируют в воде и прогревают 15 минут при 70°C для элюции олигонуклеотида от бионаноконъюгата.

На рисунке 6 показана эффективность связывания (гибридизации) синтетических олигонуклеотидов Cy3-dN23 (5′-tctggtaaagtggatattgt-/Cy3/-3′) и Cy5-dN19 (5′-/Сy5/-aatggtgtctgagcgatgtg-3′) из смеси в буфере (10 мМ трис, 0,137 Μ NaCl, 0,0027 Μ КСl, 0,01 Μ Na2HPO4, 0,002 Μ KH2PO4, pH 7.4) с вариабельным участком молекулы-«адаптера» dN23dA25 (5′-gcaacaatatccactttaccagaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaa-3′), входящей в состав бионаноконъюгата.

Можно видеть, что эффективность связывания комплементарного вариабельному участку молекулы-«адаптера» олигонуклеотида Cy3-dN23 достигает 99%, тогда как некомплементарный олигонуклеотид Cy5-dN19 не связывается с биоконъюгатом при данных условиях.

На рисунке 7 приведены результаты электрофоретического анализа в 1,2% агарозном геле водных растворов олигонуклеотидов, выделенных с использованием бионаноконъюгата (элюция) (дорожки 1-3), супернатантов после инкубации смеси олигонуклеотидов с бионаноконюгатом (дорожки 4-6), исходных проб (дорожки 7-9) содержащих смесь комплементарного и некомплементарного олигонуклеотидов (контроль) в концентрации от 0.5 до 0.7·10-6 М. Можно наблюдать, что Сy5-меченый олигонуклеотид, некомплементарный вариабельной части олигонуклеотида-«адаптера», остается в супернатанте, тогда как комплементарный Сy3-меченый олигонуклеотид связывается с биоконъюгатом и может быть в последующем отделен от биоконъюгата (элюирован) водой.

Пример 5. Получение бионаноконъюгата для обнаружения и выделения специфической нуклеиновой кислоты (олигонуклеотида заданного состава).

Бионаноконъюгат, полученный согласно примеру 1, промывают в буфере (10 мМ трис, 0,137 Μ NaCl, 0,0027 Μ КСl, 0,01 Μ Na2HPO4, 0,002 Μ KH2PO4, pH 7.4) и растворяют в этом же буфере до концентрации 5 мг/мл. В пробирке типа эппендорф смешивают 50 мкл суспензии содержащей бионаноконъюгат, 50 мкл олигонуклеотида-«адаптера» dN21dA25 в концентрации 25·10-6 Μ (5′-aagcttatcagactgatgttgaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaa) и доводят объем буфером (10 мМ трис, 0,137 Μ NaCl, 0,0027 Μ КСl, 0,01 Μ Na2HPO4, 0,002 Μ KH2PO4, pH 7.4) до 500 мкл. Перемешивают смесь на вортексе (BioSan FV-2400). Выдерживают 15 минут при нормальных условиях и снова встряхивают на вортексе. Осаждают биоконъюгат магнитной сепарацией и центрифугированием. Супернатант удаляют. Дважды промывают осадок буфером (10 мМ трис, 0,137 Μ NaCl, 0,0027 Μ КCl, 0,01 Μ Na2HPO4, 0,002 Μ KH2PO4, pH 7.4). Растворяют в этом же буфере в конечном объеме 50 мкл.

10 мкл полученного бионаноконъюгата, гибридизованного с молекулой олигонуклеотида «адаптера» dN21dA25 (5′-aagcttatcagactgatgttgaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaa-3′), смешивают в пробирке типа эппендорф с 90 мкл смеси, содержащей выбранный Сy3-dN21 (5′-caacatcagtctgataagct-/Cy3/-3′), Cy3-dN23 (5′-tctggtaaagtggatattgt-/Cy3/-3′) олигонукеотид в концентрации от 0.1 до 0.8·10-6 М, меченный флуоресцеиновой меткой (Сy3). Смесь инкубируют при 37°C 20 минут. Осаждают бионаноконъюгат магнитной сепарацией и центрифугированием. Надосадок отбирают, осадок промывают дважды буфером: 10 мМ трис, 0,137 Μ NaCl, 0,0027 Μ КСl, 0,01 Μ Na2HPO4, 0,002 Μ KH2PO4, pH 7.4. Осадок ресуспендируют в воде и прогревают 15 минут при 70°C для элюции олигонуклеотида от бионаноконъюгата.

На рисунке 8 представлены результаты электрофоретического разделения проб, полученных в результате элюции, и супернатантов, полученных после выдерживания биоконъюгата с некомплементарным (дорожка 1 и 1s) и комплементарным (в концентрации от 0,1 до 0,7·10-6 М) вариабельному участку молекулы-«адаптера» олигонуклеотидами (дорожка 2-8 и 2s-8s). Можно видеть, что при инкубации с некомплементарным олигонуклеотидом он не связывается с биоконъюгатом (дорожка 1) и остается в супернатанте (дорожка 1s), тогда как комплементарный вариабельному участку молекулы-«адаптера» олигонуклеотид эффективно связывается из раствора (дорожки 2s-8s) и может быть элюирован в последующем от биоконъюгата (дорожки 2-8). Эффективность последующей элюции в воде при прогревании до 70°C составила 96.0±0.8%.

1. Бионаноконъюгат для выделения одноцепочечной нуклеиновой кислоты, представляющей собой специфическую гетеронуклеотидную нуклеиновую кислоту или нуклеиновую кислоту, содержащую олиго- или поли-A/dA последовательность, включающий наноразмерную суперпарамагнитную частицу кобальтовой феррошпинели CoxFe3-xO4, где 0.6≤x≤0.98, полученную механохимическим синтезом, при этом для выделения нуклеиновой кислоты, содержащей олиго- или поли-A/dA последовательность, используют синтетический одноцепочечный олигонуклеотид 5′-dGndTm, где n=5-30, m=10-35, один участок которого, состоящий из гуаниновых нуклеотидов, в присутствии фосфат-анионов в растворе специфически связан с поверхностью наночастицы, а другой - состоящий из тиминовых нуклеотидов, способен вступать в гибридизацию с олиго- или поли-A/dA нуклеотидными последовательностями, а для выделения из раствора в присутствии фосфат-анионов специфической гетеронуклеотидной последовательности дополнительно используют молекулу олигонуклеотида-адаптера, содержащую последовательность олиго-dAx на 3′-конце, гибридизованную с тиминовыми нуклеотидами комплекса комплекса 5′-dGndTm, где n=5-30, m=10-35, и участок на 5′-конце, комплементарный специфической гетеронуклеотидной последовательности в растворе.

2. Способ получения бионаноконъюгата для выделения одноцепочечных нуклеиновых кислот по п. 1, заключающийся в том, что для выделения нуклеиновой кислоты, содержащей олиго- или поли-A/dA последовательность, берут наночастицы суперпарамагнитной кобальтовой феррошпинели CoxFe3-xO4, где 0.6≤x≤0.98, полученные механохимическим синтезом, наночастицы промывают дистиллированной водой, готовят водную суспензию отмытых наночастиц, суспензию разделяют на фракции в виде осадка и надосадка, отбирают надосадок и смешивают с ним синтетический одноцепочечный олигонуклеотид 5′-dGndTm, где n=5-30, m=10-35, и фосфат натрия в концентрации (10±0.5)·10-3 моль/л, после чего смесь инкубируют до установления полного адсорбционного равновесия и выделяют бионаноконъюгат методом магнитной сепарации с последующим центрифугированием и промыванием, а для выделения гетеронуклеотидной последовательности в раствор, содержащий наночастицы кобальтовой феррошпинели, связанные с синтетическим одноцепочечным олигонуклеотидом 5′-dGndTm, где n=5-30, m=10-35, и фосфат натрия в концентрации (10±0.5)·10-3 моль/л, добавляют молекулы олигонуклеотида-адаптера, содержащие последовательность олиго-dAx на 3′-конце и участок на 5′-конце, комплементарный специфической гетеронуклеотидной последовательности в растворе, после чего смесь вновь инкубируют до установления полного адсорбционного равновесия и выделяют бионаноконъюгат методом магнитной сепарации с последующим центрифугированием и промыванием.

3. Способ по п. 2, заключающийся в том, что n предпочтительно равно = 10-25, а m предпочтительно равно 15-25.



 

Похожие патенты:

Изобретение относится к области биотехнологии, в частности к способам получения ферментных препаратов. Изобретение касается термостабильной двухдоменной лакказы бактерии Streptomyces griseoflavus Ac-993 со щелочным оптимумом активности, последовательности ДНК, кодирующей данный фермент, и способа получения фермента, включающий клонирование в клетках бактерии Escherichia coli гена фермента, продукцию фермента в клетках Escherichia coli, внесение ионов меди в среду для культивирования рекомбинантного штамма для образования активного фермента, получение ферментного препарата методами металлхелатной хроматографии и гельфильтрации.

Группа изобретений относится к генной инженерии, биохимии, биотехнологии и иммунологии и представляет собой рекомбинантную плазмиду pESAT6-CFP10-DBD, рекомбинантный штамм Escherichia coli M15 [pREP4, pESAT6-CFP10-DBD], способ получения, иммобилизации, концентрирования и очистки рекомбинантного белка ESAT6-CFP10-DBD на декстране, рекомбинантный белок ESAT6-CFP10-DBD с молекулярной массой 26,4 кДа, иммуногенную композицию, содержащую белок ESAT6-CFP10-DBD, иммобилизованный на декстране, специфически активирующую Т-лимфоциты, синтезирующие ИФН-гамма при стимуляции антигенами микобактерий.

Изобретение относится к биохимии, в частности к молекулярной биологии, биотехнологии, генной инженерии. Изобретение представляет собой оптимизированные последовательности ДНК, кодирующие легкую и тяжелую цепь моноклонального антитела, предназначенные для синтеза антитела в рекомбинантных CHO-S клетках, и способ получения данного антитела в указанных клетках.

Настоящее изобретение относится к биотехнологии и представляет собой молекулярные конъюгаты, способные связываться с нуклеиновыми кислотами (ДНК или РНК) для доставки их в клетки млекопитающего, экспрессирующие рецепторы трансферрина.

Изобретение относится к области молекулярной биологии и генной инженерии. Предложена молекула RNAi для супрессии экспрессии тимидилатсинтазы за счет действия RNAi, содержащая домен двухцепочечной РНК, состоящий из смысловой цепи, состоящей из нуклеотидной последовательности, представленной SEQ ID NO: 1, гибридизованной с антисмысловой цепью, гибридизующейся в жестких условиях со смысловой цепью.

Изобретение относится к биотехнологии и генной инженерии и представляет собой рекомбинантный слитый белок формулы S-L-R, в том числе SR10, SR13, SR15, SdR10, SdR13 или SdR15, специфически узнающий меланомные клетки, в котором S - мономер стрептавидина, L - линкер, имеющий аминокислотную последовательность Ser-Arg-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys, содержащую сайт расщепления энтеропептидазой и обозначаемую как «d», или аминокислотную последовательность Ser-Arg-Ala-Gly-Ala,R - меланома-адресующий олигопептид, представляющий собой R10, имеющий аминокислотную последовательность Asp-Gly-Ala-Arg-Tyr-Cys-Arg-Gly-Asp-Cys-Phe-Asp-Gly, или R13, имеющий аминокислотную последовательность Leu-Ser-Gly-Cys-Arg-Gly-Asp-Cys-Phe-Glu-Glu, или R15, имеющий аминокислотную последовательность Asp-Gly-Phe-Pro-Gly-Cys-Arg-Gly-Asp-Cys-Ser-Gln-Glu.

Группа изобретений относится к области биотехнологии и направлена на молекулы нуклеиновых кислот, которые кодируют белок, проявляющий свойства биосенсора для детекции пероксида водорода в живых клетках, обладающий флуоресценцией в красной области спектра.

Изобретение относится к молекулярной биологии, в частности к коротким интерферирующим РНК (siRNA), и может быть использовано в противоопухолевой терапии. На основе геномного анализа сконструированы последовательности siRNA против гена HIF1A человека с SEQ ID NO:1-2, siRNA против гена HSP8A человека с SEQ ID NO:3-4, siRNA против гена APEX1 человека с SEQ ID NO:5-6 и siRNA против гена CCND3 человека с SEQ ID NO:7-8, ассоциированных с пролиферацией клеток аденокарциномы поджелудочной железы человека.
Изобретение относится к биотехнологии и микробиологии и представляет собой способ идентификации кластера генов, кодирующих стафилококковые белки, являющиеся экзотоксинами.

Изобретение относится к биотехнологии и представляет собой рекомбинантную плазмидную ДНК pET3.54, кодирующую полипептид FN3.54, взаимодействующий с фактором некроза опухолей человека.

Способ получения фосфатов кобальта(II)-аммония относится к промышленной экологии и к химической технологии неорганических веществ. Способ может быть использован для переработки жидких отходов получения гальванических и химических покрытий кобальтом.
Изобретение относится к области химии платиновых металлов, в частности синтезу соединений палладия, а именно синтезу гетероядерных ацетатов палладия с цветными металлами.

Изобретение относится к области порошковой металлургии, в частности к способам получения ультрадисперсных порошковых материалов на основе карбидов вольфрама. .

Изобретение относится к новым магнитным сульфидным соединениям кобальта и марганца, обладающих эффектом гигантского магнитосопротивления (т.е. .
Изобретение относится к области металлургии, в частности к способу получения алюмината кобальта, применяемого для поверхностного модифицирования литых деталей из жаропрочных сплавов.

Изобретение относится к способу получения твердых растворов состава CoFe2-xCrx O4 со структурой шпинели и может найти применение в химической промышленности для производства магнитных материалов и катализаторов на основе ферритов-хромитов кобальта (II).

Изобретение относится к технологии неорганических веществ, в частности к способам получения кобальта (II) сульфата из кобальтсодержащего материала. .

Изобретение относится к области получения химических реактивов технологического назначения, а именно солей кобальта, применяемых в промышленности для производства красок и эмалей, катализаторов, аккумуляторов.

Изобретение относится к области химической технологии, в частности к способам получения сульфидов кобальта. .

Изобретение может быть использовано в химической промышленности. Способ получения ультрадисперсных порошков карбонатов включает карбонизацию водной суспензии исходного сырья в условиях повышения давления двуокиси углерода при одновременной гомогенизации суспензии.
Наверх