Способ криоконсервирования лейкоцитов с ксеноном


 

A01N1/02 - Консервирование тел людей или животных, или растений или их частей; биоциды, например дезинфектанты, пестициды, гербициды (препараты для медицинских,стоматологических или гигиенических целей A61K; способы или устройства для дезинфекции или стерилизации вообще, или для дезодорации воздуха A61L); репелленты или аттрактанты (приманки A01M 31/06; лекарственные препараты A61K); регуляторы роста растений (соединения вообще C01,C07,C08; удобрения C05; вещества, улучшающие или стабилизирующие состояние почвы C09K 17/00)

Владельцы патента RU 2543534:

Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт физиологии Коми научного центра Уральского отделения Российской академии наук (RU)
Федеральное государственное бюджетное учреждение науки "Кировский научно-исследовательский институт гематологии и переливания крови Федерального медико-биологического агентства" (RU)

Изобретение относится к физиологии, криобиологии и медицине, а именно к технологии консервирования ядерных клеток крови человека с применением инертного газа. Способ включает насыщение клеток в пластикатном контейнере «Компопласт 300», помещенном в металлический криобароконтейнер, инертным газом ксеноном под давлением 0,6 атм в течение 20 мин в условиях комнатной температуры 21±2°C с последующим удалением избытка газа и извлечением из металлического контейнера, замораживанием биообъекта до -28°C в этиловом спирте и перемещением в электроморозильник на -80°C. Размораживание биообъекта осуществляется в водяной ванне 39±1,5°C в течение 1,5 мин. Осуществление изобретения обеспечивает надежное криоконсервирование лейкоцитов в среде инертного газа и высокий уровень количественной и морфологической сохранности лейкоцитных концентратов крови человека. 1 табл., 3 пр.

 

Изобретение относится к криобиологии и медицине, а именно к технологии консервирования ядерных клеток крови человека с газовым криопротектором.

Известен способ криоконсервации органов и тканей IN SITU, принятый в качестве прототипа. Способ заключается в том, что биологический объект (сердце, почка и др.) охлаждают в воде до 0°C с одновременным насыщением смесью ксенона, криптона, аргона в соотношении 2,5:47,5:50 об.%, затем вытесняют воду указанной смесью газов и при давлении 1,5 атм понижают температуру до -43°C, далее снижают давление газовой среды до нормального и продолжают охлаждение до -196°C [RU (11) 2268590 C1 (51) МПК A01N 1/02 (2006.01)]. Способ позволил добиться надежной криоконсервации сердца животного в составе всего организма. У пересаженного трансплантата, консервированного шесть часов, восстанавливается адекватная сердечная деятельность.

Недостатком прототипа является громоздкая, дорогостоящая жидкоазотная технология замораживания (-196°C) и высокая трудоемкость с привлечением большого числа квалифицированных исполнителей, что существенно снижает доступность предложенного способа. Кроме того, он предполагает замораживание целого организма животного с последующим извлечением конкретного органа и не предполагает эффективную консервацию ядросодержащих клеток организма человека.

Техническим результатом настоящего изобретения является разработка надежного способа криконсервирования лейкоцитов в среде инертного газа, обеспечивающего высокую сохранность ядросодержащих клеток.

Технический результат достигается путем насыщения клеточных взвесей (лейкоцитных концентратов) в пластикатном контейнере «Компопласт 300», помещенном в металлический криобароконтейнер, инертным газом ксеноном под давлением 0,6 атм в течение 20 мин при комнатной температуре с последующим замораживанием до -28°C в этиловом спирте и хранением в электроморозильнике -80°C, при этом размораживание осуществляют в водяной ванне при температуре 39±1,5°C в течение 1,5 мин. После отогрева в водяной ванне количество морфологически сохранных лейкоцитов в разных сериях экспериментов составляет от 95,3% до 97,6%, устойчивой к витальному красителю мембраной обладает от 43,3% до 64,5% клеток.

Практически способ осуществляют следующим образом.

Экспериментальные исследования выполнены на базе лабораторий криофизиологии крови ФГБУН Институт физиологии Коми НЦ УрО РАН и консервирования крови и тканей ФГБУН Кировский НИИ гематологии и переливания крови ФМБА России.

Пример 1.

Лейкоцитные концентраты крови доноров-добровольцев объемом 17±2 мл в пластикатном контейнере «Компопласт 300», помещенном в криобароконтейнер, насыщали инертным газом ксеноном 20 минут при комнатной температуре 21±2°C под давлением 0,3 атм. Замораживание осуществляли по двухступенчатой программе: на первом этапе 15 мин в охлажденной до -28°C спиртовой (96°) ванне, на втором этапе перекладывали в воздушную среду электроморозильника на -80°C, где хранили в течение суток. Далее «Компопласт 300» с биообъектом извлекали из криобароконтейнера, предварительно снизив давление ксенона до атмосферного. Размораживали биообъект 10 мин в 20-литровой водяной ванне при температуре 19,6±2,1°C.

Определяли общее количество размороженных лейкоцитов, их морфологическую сохранность и жизнеспособность по витальному красителю трипановому синему. Полученные данные выражали в процентах, приняв исходный уровень за 100% (табл.1).

При статистической обработке данных вычисляли среднее арифметическое значение±среднее квадратичное отклонение (М±δ). Для выявления статистической значимости различий между группами применяли непараметрический критерий Уилкоксона с использованием компьютерной программы для медико-биологической статистики «BIOSTAT».

Пример 2.

Лейкоцитные концентраты в пластикатном контейнере «Компопласт 300», помещенном в криобароконтейнер, насыщали инертным газом ксеноном 20 минут при комнатной температуре 21±2°C под давлением 0,3 атм. Замораживание осуществляли по двухступенчатой программе: на первом этапе 15 мин в охлажденной до -40°C спиртовой (96°) ванне, на втором этапе перекладывали в воздушную среду электроморозильника на -80°C, где хранили в течение суток. Далее «Компопласт 300» с биообъектом извлекали из криобароконтейнера, предварительно снизив давление ксенона до атмосферного. Размораживали биообъект 10 мин в 20-литровой водяной ванне при температуре 19,6±2,1°C. Полученные данные представлены в табл.1.

Пример 3.

Лейкоцитные концентраты крови доноров-добровольцев в пластикатном контейнере «Компопласт 300», помещенном в криобароконтейнер, насыщали инертным газом ксеноном 20 минут при комнатной температуре 21±2°C под давлением 0,6 атм, с последующим удалением избытка ксенона. Замораживание осуществляли в пластикатном контейнере «Компопласт 300» по двухступенчатой программе: на первом этапе в охлажденной до -28°C спиртовой (96°) ванне в течение 15 мин, на втором этапе перекладывали в воздушную среду электроморозильника на -80°C, где хранили в течение суток. Размораживали биообъект 1,5 мин в 20-литровой водяной ванне при температуре 39±1,5°C. Полученные данные представлены в табл.1.

Таблица 1
Морфофункциональные показатели лейкоцитов после суточной экспозиции в электроморозильнике -80°C
Вариант использования Жизнеспособность, % Морфологическая сохранность, % Сохранность гранулоцитов, %
Пример 1 43,3±3,1 95,3±5,6 51,0±14,0
Пример 2 48,3±16,6 95,1±7,0 83,6±9,9*
Пример 3 64,5±14,4* 97,6±2,5 86±11*
* - различие с показателем примера 1 статистически значимо (p<0,05)

Применение технологии, указанной в Примере 3, обеспечивает более эффективную сохранность ядросодержащих клеток крови человека. Предложенный метод предельно прост в реализации, дает стабильный положительный результат и найдет широкое применение в медицинской практике.

Способ криоконсервирования лейкоцитов включает насыщение клеток в пластикатном контейнере «Компопласт 300», помещенном в металлический криобароконтейнер, инертным газом ксеноном под давлением 0,6 атм в течение 20 мин в условиях комнатной температуры 21±2°C с последующим удалением избытка газа и извлечением из металлического контейнера, замораживанием биообъекта до -28°C в этиловом спирте и перемещением в электроморозильник на -80°C, при этом размораживание биообъекта осуществляется в водяной ванне 39±1,5°C в течение 1,5 мин.



 

Похожие патенты:

Изобретение относится к области криобиологии. Способ снижения влияния низкотемпературного скачка на раствор криопротектора обеспечивается за счет дистанционной обработки раствора криопротектора с клетками живых организмов ультразвуковым излучением частотой 0,50-10 перед его замораживанием.
Изобретение относится к области медицины, в частности к области нормальной анатомии, трансплантологии, и может быть использовано с целью подготовки трупов для обучения хирургов-трансплантологов приемам забора и пересадки внутренних органов.

Изобретение относится к способу лиофилизации композиции, содержащей очищенный антитромбин III (AT III) и кристаллизующееся вещество, выбранное из аланина, маннита, глицина или NaCl.

Настоящее изобретение относится к новым соединениям общей формулы (I), где Х=S, SO или SO2, и один из радикалов R1 и R2 представляет собой атом водорода, а другой имеет значения, перечисленные в формуле изобретения, которые используют для депигментации кожи, и/или волос на голове, и/или волосяного покрова и для дезинфекции кожи, к косметическому применению предложенных соединений, а также соединений формулы (I), в которой R1 и R2 могут также одновременно представлять собой атом водорода.
Изобретение относится к медицине, а именно к трансплантологии, и может быть использовано для презервирования миокарда при трансплантации. Для этого проводят перфузию и хранение изолированного сердца с использованием раствора Кустодиол при температуре 2-4°C.
Изобретение относится к медицине. Состав содержит рекомбинантный интерферон, выбранный из группы: рекомбинантный интерферон-альфа, рекомбинантный интерферон-бета, рекомбинантный интерферон-гамма, антибиотики, антисептики, гипромеллозу и воду при следующем соотношении компонентов в г на 1 мл состава: рекомбинантный интерферон, ME 100-1000000 антибиотики, г 0,00001-0,5 антисептики, г 0,00001-0,5 гипромеллоза, г 0,00001-0,5 вода остальное до 1 мл Указанный состав может содержать антибиотики широкого спектра действия, выбранные из группы: амоксициллин, ампициллин, оксациллин, метициллин, цефалексин в количестве 0,00001-0,5 г на 1 мл состава.

Изобретение относится к медицине. Анатомический препарат после фиксации тканей и приготовления путем препаровки погружают в промежуточный растворитель - ацетон на 4 недели, охлаждают до -20°C, помещают в герметичную металлическую камеру, заполненную композицией, содержащей силоксановый полимер медицинского назначения, сшивающий агент и катализатор.

Изобретение относится к ветеринарии и анатомии. Способ изготовления рентгеноконтрастной массы для вазорентгенографии при посмертных исследованиях животных включает приготовление массы, состоящей из 45% свинцовых белил, соединенных с 45% живичного скипидара, и 10% порошка медицинского гипса, вводимого тонкой струей в данный состав.
Изобретение относится к медицине и трансфузиологии и касается создания раствора для замораживания ядерных клеток крови. Раствор содержит диметилацетамид - 3,5 мл, гидроксиэтилкрахмал (в составе «Инфукола») - 46,3 мл и фосфатный буфер (NaH2PO4·2Н2О, моль) в количестве, необходимом для обеспечения рН раствора 6,5-7,0.
Предлагаемое изобретение относится к медицине и может быть использовано в работе анатомических музеев, коллекций, кафедр анатомии медицинских вузов. Способ консервации костных анатомических препаратов предусматривает нанесение на предварительно очищенную от мягких тканей, обезжиренную, высушенную кость композиции-консерванта, приготовленной из полимерного клея «Dragon» и ацетона, взятых в соотношении 1:(1-3).
Изобретение относится к области консервации биологических объектов, в частности палеонтологических объектов с мягкими тканями, и может быть использован в палеонтологии и музейном деле. Палеонтологические объекты с мягкими тканями в течение 1-4 месяцев обрабатывают бальзамирующим раствором, включающим формалин 40% - 0,516%, фенол кристаллический - 0,262%, глицерин - 79,077%, спирт 96% - 18,576%, натрий хлорид - 1,569%. Соотношение бальзамирующего раствора к массе палеонтологического объекта должно составлять не менее 3:1. Бальзамирование производят при комнатной температуре. Способ бальзамирования палеонтологических объектов с мягкими тканями обеспечивает долговременную сохранность мягких тканей, минимизацию потерь мягких тканей, имеющих разные стадии гниения, приостановление гнилостных процессов, распрямление кожи, сохранение ее естественного окраса и естественных морфометрических параметров, что позволяет в дальнейшем использовать палеонтологический объект в научных целях, а также для экспонирования в сухом виде. 2 з.п. ф-лы.

Изобретение относится к способу получения 1,6-бис-(1,5,3 -дитиазепан-3-ил)-2,5-дисульфанилгексана формулы (1), обладающего фунгицидной активностью против Botrytis cinerea и Rhizoctonia solani. Сущность способа заключается во взаимодействии смеси 1,2-этандитиола и формальдегида с водным раствором солей аммония NH4X (X=F, Br, OAc, NO3, 1/2SO4) при мольном соотношении HS(CH2)2SH:CH2O:NH4X=3:6:2 при комнатной температуре (~20°C) и атмосферном давлении в течение 5-7 ч. Выход 1,6-бис-(1,5,3-дитиазепан-3-ил)-2,5-дисульфанилгексана общей формулы (1) в зависимости от применяемых солей аммония (NH4X) составляет 31-67%. 2 н.п. ф-лы, 2 табл., 1 пр.

Изобретение относится к медицине - консервированию гемопоэтических стволовых клеток (ГСК) человека. Проводят вскрытие флакона криопротектора в ламинарном боксе, заправку криопротектора в специальный шприц шприцевого насоса, введение ограждающего раствора криопротектора - 55% диметилсульфоксида с 5% декстран 40 при температуре +4°C во взвесь ядросодержащих клеток с гемопоэтическими стволовыми клетками в криопакете с концентратом и одновременное механическое перемешивание в аппарате для перемешивания, перенос системы вместе с флаконом криопротектора в ламинарный бокс, выпуск воздуха из криопакета и части взвеси, запайку и помещение его в термоусадочный пакет и осуществление программного многоэтапного замораживания, на первом этапе которого смесь взвеси со стволовыми клетками и криопротектором - образец замораживания - выдерживают 10 мин при температуре +4°C, на втором этапе охлаждают со скоростью 1°C/мин до температуры -12°C, на третьем этапе охлаждают со скоростью 20°C/мин до температуры -60°C, на четвертом этапе нагревают образец со скоростью 10°C/мин до температуры -18°C, на пятом этапе охлаждают образец со скоростью 1°C/мин до -60°C и в конце программы замораживания образец охлаждают со скоростью 3°C/мин до температуры -100°C, после замораживания образец помещают в карантинный дьюар с жидким азотом, до определения результатов тестов на инфекционные агенты и бактериологическую грибковую контаминацию. По истечении карантинного срока хранения образец с гемопоэтическими стволовыми клетками переносят на длительное хранение при температуре, не превышающей -150°C, в дьюар с жидким азотом при условии отрицательных результатов тестирования. В случае положительных результатов тестов на инфекции и бактериальную и/или грибковую контаминацию образец с гемопоэтическими стволовыми клетками переносят в дьюар с жидким азотом для инфекционного материала длительного хранения. Изобретение позволяет повысить жизнеспособность клеток в образце. 2 з.п. ф-лы, 4 ил.
Рентгеноконтрастная цветная масса для наливки сосудов и способ ее приготовления для анатомических исследований. Цветная рентгеноконтрастная масса состоит из сульфата бария, глицерина, акриловой краски и водного раствора желатина. Относится к способам получения застывающей цветной рентгеноконтрастной массы. Предлагаемая масса может быть применена для макро- и микропрепарирования сосудов и их рентгенографии. Способ приготовления включает тщательное перемешивание сульфата бария, глицерина с акриловой краской и водным раствором желатина. При этом сульфата бария берут 1,5 части, глицерина 1 часть, акриловой краски 0,1 части, водного раствора желатина добавляют 7,5 частей, перемешивают, а перед применением смесь подогревают до температуры 60-80°C. Приготовленная масса обладает высокой проницаемостью в тонкие сосуды, яркостью (наглядностью), быстрой застываемостью и эластичностью. Приготавливается из доступных и дешевых материалов. Неизрасходованная полностью или невостребованная масса может храниться длительное время. Предлагаемая масса может быть неоднократно подогрета и готова к использованию. 2 н.п. ф-лы.

Изобретение относится к раствору для фиксации биологических клеток. Фиксирующий раствор предназначен для сохранения in vitro цитологического образца, содержащего ядерные клетки и эритроциты. Он содержит от 80% до 95% по объему смеси: 590 мл физраствора, 10 мл полиэтилен гликоля (Carbowax®), 203 мл изопропилового спирта, 193 мл чистого этанола, 0,01% по объему азида натрия, и от 20% до 5% по объему забуференного 4% формалина, pH фиксирующего раствора находится в диапазоне от 6,4 до 7,4. Изобретение позволяет обеспечить хорошую сохранность целостности ядерных клеток. 1 з.п. ф-лы, 2 ил., 1 пр.

Изобретение относится к области медицины, в частности гематологии. Криоконсервирование гемопоэтических стволовых клеток пуповинной крови проводят при добавлении ограждающего раствора криопротектора - диметилсульфоксида - во взвесь ядросодержащих клеток с гемопоэтическими стволовыми клетками. Осуществляют подготовку к замораживанию путем охлаждения взвеси со стволовыми клетками в камере охлаждения до температуры +4°C. Многоэтапное замораживание взвеси со стволовыми клетками проводят при использовании криопротектора - раствора 55% диметилсульфоксида с 5% декстран 40, который вносят во взвесь лейкоцитарного концентрата со стволовыми клетками, размещенными в криопакете. Затем механически перемешивают в аппарате для перемешивания и добавляют криоконсервант при температуре +4°C, выпускают воздух из криопакета и часть взвеси, закрывают пакет, запаивают, помещают его в термоусадочный пакет и осуществляют программное многоэтапное замораживание. На первом этапе смесь взвеси со стволовыми клетками и криопротектором (далее образец) выдерживают 10 мин при температуре +4°C, затем охлаждают со скоростью 1°C/мин до температуры -12°C, далее охлаждают со скоростью 15°C/мин до температуры -60°C, после оттаивания образца со скоростью 10°C/мин его охлаждают со скоростью 1°C/мин до -60°C и в конце программы замораживания образец охлаждают со скоростью 3°C до температуры -100°C. После окончания программы замораживания образец, помещенный в криокоробку, размещают в карантинный сосуд Дьюара с жидким азотом до определения результатов тестов на наличие или отсутствие инфекционных агентов и бактериологической и грибковой контаминации, По истечении карантинного срока хранения образец с гемопоэтическими стволовыми клетками, полученными из пуповинной крови, переносят на длительное хранение при температуре не менее -150°C в сосуд Дьюара с жидким азотом при условии отрицательных результатов тестирования. Изобретение позволяет повысить жизнеспособность клеток. 1 табл., 1 ил.

Изобретение относится к области медицины и биологии, а именно к способу дополнительного электронноплотного контрастирования кислых групп биомолекул при гистохимическом выявлении катионов натрия в ультраструктурах клеток и тканей легких и трахеи. Сущность способа состоит в том, что кусочки тканей фиксируют, проводят отмывку поверхности в бидистиллированной воде, далее помещают в раствор реагента, который содержит 1 мл 4% тетраоксида осмия и 8 мл 2% гексагидроксоантимоната калия. В течение 4 часов кусочки тканей окрашивают при энергичном встряхивании, промывают в бидистиллированной воде. Далее кусочки тканей препарируют путем разрезания на более тонкие, обезвоживают, изготовляют полутонкие и ультратонкие срезы, которые исследуют с помощью трансмиссионного электронного микроскопа, с последующей компьютерной обработкой с обнаружением диффузного избирательного окрашивания кислых клеточных ультраструктур и межклеточного вещества. Использование заявленного способа позволяет эффективно проводить дополнительное электронноплотное контрастирование кислых групп биомолекул при гистохимическом выявлении катионов натрия в ультраструктурах клеток и тканей легких и трахеи. 5 ил., 1пр.

Изобретение относится к области сельского хозяйства, в частности к овощеводству, и может найти применение при выращивании капусты. Способ предпосевной обработки семян капусты белокочанной включает использование черемшаного отвара, приготовленного кипячением растений 3-5 мин, растворение в нем при температуре 75-80°C парааминобензойной кислоты в концентрации 0,05%, а при остывании раствора до температуры 30-40°C замачивают в полученном растворе семена капусты на 5-10 мин. После чего их обволакивают в смеси двух видов глин: аланита и голубой, в соотношении 1:1. После прорастания семян до 3-4 листьев рассаду обрабатывают таким же раствором и обволакивают корневую систему теми же глинами. Способ позволяет снизить заболеваемость растений, повысить их продуктивность и эффективность способа.

Группа изобретений относится к медицине и касается способа криоконсервации стволовых клеток, включающего получение взвеси стволовых клеток и добавление к ней раствора криопротектора при постоянном перемешивании, с последующей криоконсервацией, где в качестве криопротектора во взвесь добавляют 50%-ный раствор ДМСО в реополиглюкине до конечной концентрации ДМСО 10% в получившейся суспензии. Группа изобретений также касается комбинированного криопротектора для криоконсервации стволовых клеток, содержащего 50%-ный раствор ДМСО в реополиглюкине. Группа изобретений обеспечивает создание криопротектора с более низкой молекулярной массой и более низкой концентрацией ДМСО для улучшения сохранности клеток после размораживания. 2 н.п. ф-лы, 1 пр., 5 табл.

Изобретение относится к области биотехнологии и может быть использовано для получения композиций, содержащих стволовые плацентарные клетки. Способ включает: (a) получение адгезивных плацентарных клеток в растворе, включающем от 2% до 10% декстрана, от 2,5% до 10% ДМСО и от 4% до 10% HSA, (b) фильтрацию полученного раствора через 70 мкм - 100 мкм фильтр; (c) разбавление указанных клеток до содержания не более 10±3·106 клеток на миллилитр раствором, включающим от 2% до 5% декстрана, от 2,5% до 10% ДМСО и от 4% до 10% HSA, и (d) криоконсервацию раствора, содержащего клетки. После оттаивания раствор с клетками может быть разбавлен в соотношении от 1:1 до 1:11 вторым раствором, содержащим от 2% до 10% декстрана 40 и от 4% до 10% HSA. Изобретение позволяет повысить жизнеспособность адгезивных плацентарных клеток при криоконсервации. 3 н. и 17 з.п. ф-лы, 29 ил., 11 табл., 3 пр.
Наверх