Штамм вируса гриппа а/17/индиана/11/72 (h3n2v) для производства живой гриппозной интраназальной вакцины для взрослых и для детей


 


Владельцы патента RU 2545706:

Федеральное государственное бюджетное учреждение "Научно-исследовательский институт экспериментальной медицины" Северо-западного отделения РАМН (ФГБУ "НИИЭМ" СЗО РАМН) (RU)

Изобретение относится к медицинской вирусологии и касается штамма вируса гриппа. Вакцинный штамм А/17/Индиана/2011/72 (H3N2v) - реассортант, полученный путем скрещивания «дикого» вируса А/Индиана/10/2011 (H3N2v) с холодоадаптированным температурочувствительным вирусом А/Ленинград/13 4/17/57 (H2N2) - донором аттенуации. Штамм А/17/Индиана/2011/72 (H3N2v) депонирован в Государственную коллекцию вирусов ФГБУ «Научно-исследовательский институт вирусологии им. Д.И. Ивановского» Минздрава России, под №2739, активно размножается в развивающихся куриных эмбрионах при оптимальной температуре 32°C, характеризуется температурочувствительностью и холодоадаптированностью и безвредностью для лабораторных животных. Реассортант унаследовал гены, кодирующие поверхностные антигены вируса гемагглютинин (НА) и нейраминидазу (NA), от эпидемического родительского вируса и остальные шесть генов, кодирующих внутренние негликозилированные белки, от донора аттенуации. Представленное изобретение может быть использовано в практическом здравоохранении для профилактики заболеваемости гриппом среди взрослых и детей. 4 табл.

 

Изобретение относится к медицинской вирусологии и может быть использовано в здравоохранении для профилактики гриппа среди взрослых и детей живой интраназальной гриппозной вакциной из штамма А/17/Индиана/11/72 (H3N2v).

В 2011 году в циркуляции среди людей в США появился новый вирус А/Индиана/10/2011 (H3N2v). Вирус представляет собой реассортант и содержит 7 генов от вируса гриппа свиней Северной Америки A(H3N2), а ген М - от пандемического штамма свиного происхождения A(H1N1)pdm09, который продолжает циркулировать среди людей. Доказаны факты передачи вируса А/Индиана/10/2011 (H3N2v) от человека к человеку, что вызывает обоснованные опасения об эпидемических (пандемических) потенциях реассортантного штамма. Известный вакцинный штамм вируса гриппа - А/17/Калифорния/2009/38 (H1N1), созданный для профилактики заболеваемости гриппом, вызванной пандемическим вирусом А/Калифорния/07/2009 (H1N1)pdm09 - прототип [Патент РФ №2413765 от 16.09.09 - опубл. БИ 2011 - №7. Ларионова Н.В., Киселева И.В., Руденко Л.Г., Александрова Г.И. Вакцинный штамм вируса гриппа А/17/Калифорния/2009/38 (H1N1) для производства живой гриппозной интраназальной вакцины для взрослых и для детей], не может служить средством профилактики заболеваемости, вызванной новым вирусом свиного происхождения антигенной формулы A (H3N2v).

Задачей, на решение которой направлено заявляемое изобретение, является получение вакцинного штамма актуальной антигенной разновидности для взрослых и для детей на основе холодоадаптированного донора аттенуации А/Ленинград/134/17/57 (H2N2) и нового «дикого» вируса А/Индиана/10/2011 (H3N2v). Применяемые в настоящее время штаммы для живых гриппозных вакцин получают методом генетической реассортации эпидемически актуальных вирусов с холодоадаптированными штаммами - донорами аттенуации [Александрова Г.И. Применение метода генетической рекомбинации для получения вакцинных штаммов вируса гриппа // Вопр. Вирусол. - 1977 - №4. - С.387-395].

Донор аттенуации А/Ленинград/134/17/57 (H2N2) - холодоадаптированный (са) температурочувствительный (ts) штамм вируса гриппа, разрешенный для получения безвредных живых интраназальных вакцин для взрослых и детей [Александрова Г.И. Новое в эпидемиологии и профилактике вирусных инфекций. Л., 1968. - С.66-83].

Цель реассортации - получить штамм с вакцинной формулой генома 6:2. Гены, кодирующие поверхностные белки вируса гриппа гемагглютинин (НА) и нейраминидазу (NA), наследуются от антигенно-актуального циркулирующего эпидемического штамма, а шесть генов, кодирующих внутренние и неструктурные белки (РВ2, РВ1, PA, NP, М, NS) - от безвредного донора аттенуации.

Получение вакцинного штамма

Вакцинный штамм А/17/Индиана/2011/72 (H3N2v) получен методом генетической реассортации «дикого» вируса А/Индиана/10/2011 (H3N2v) с донором аттенуирующих свойств А/Ленинград/134/17/57 (H2N2) путем инфицирования развивающихся куриных эмбрионов (РКЭ) смесью родительских вирусов в эквивалентных инфекционных дозах, с последующей селекцией клонов с заданными свойствами при пониженной до 26°C температуре инкубации в присутствии антисыворотки к донору аттенуации. Клоны дополнительно очищены четырьмя последовательными клонированиями методом предельных разведений под прессом антисыворотки к донору при пониженной (26°C - два клонирования) и оптимальной (32°C - два клонирования) температурах инкубации. Чистые клоны проверены по фенотипическим характеристикам (ts-, са-фенотип) и по формуле генома на соответствие вакцинному штамму.

Антигенная характеристика вакцинного штамма

Ответственный за антигенную специфичность поверхностный белок вакцинного штамма - гемагглютинин (НА) - в РТГА идентичен вирусу А/Индиана/10/2011 (H3N2v), антисывороткой к которому полностью нейтрализуется. Второй ответственный за антигенную специфичность поверхностный белок вакцинного штамма - нейраминидаза (NA) - идентичен вирусу А/Индиана/10/2011 (H3N2v) по данным метода микс-ПЦР.

Анализ состава генома

Для анализа состава генома полученных реассортантов на соответствие вакцинной формуле генома использовали Микс-ПЦР анализ ДНК копий генов, основанный на различиях в размерах пар амплифицируемых фрагментов генов донора аттенуации и «дикого» вируса и, соответственно, различий в их электрофоретической подвижности [Киселева И.В. с соавт. Анализ состава генома штаммов сезонной и пандемической живой гриппозной вакцины. Молекулярная генетика, микробиология и вирусология. 2011. №4. С.29-36].

Формула генома 6:2 соответствует требованиям, предъявляемым к штаммам живой гриппозной вакцины: гены, кодирующие поверхностные белки гемагглютинин (НА) и нейраминидазу (NA), принадлежат «дикому» родительскому вирусу А/Индиана/10/2011 (H3N2v), гены, кодирующие внутренние белки (РВ2, РВ1, PA, NP, M, NS), принадлежат донору аттенуации А/Ленинград/134/17/57 (H2N2). Результаты анализа всех генов вакцинного штамма А/17/Индиана/2011/72 (H3N2v) представлены в табл.1.

Таблица 1
Состав генома реассортантного вакцинного штамма А/17/Индиана/2011/72 (H3N2v), полученного на основе «дикого» вируса А/Индиана/10/2011 (H3N2v), и донора аттенуации А/Ленинград/134/17/57 (H2N2)
Ген Принадлежность гена одному из родительских вирусов
Донор аттенуации «Дикий» вирус Вакцинный штамм
РВ2 Лен 171 Wt (H3N2v)2 Лен 17
РВ1 Лен 17 Wt (H3N2v) Лен 17
PA Лен 17 Wt (H3N2v) Лен 17
НА Лен 17 Wt (H3N2v) Wt (H3N2v)
NP Лен 17 Wt (H3N2v) Лен 17
NA Лен 17 Wt (H3N2v) Wt (H3N2v)
M Лен 17 Wt (H3N2v) Лен 17
NS Лен 17 Wt (H3N2v) Лен 17
1 Лен 17 ген принадлежит донору аттенуации А/Ленинград/134/17/57 (H2N2);
2 (H3N2v) ген принадлежит «дикому» вирусу А/Индиана/10/2011 (H3N2v).

Фенотипическая характеристика вакцинного штамма в экспериментах in vitro

Оценку фенотипических свойств вакцинного штамма А/17/Индиана/2011/72 (H3N2v) проводили путем его параллельного титрования в РКЭ при разных температурах. Вакцинный штамм является температурочувствительным (ts-фенотип - его инфекционная активность при повышении температуры инкубации до 40°C - составлял менее 1.7 log10 ЭИД50/мл 40°C) и холодоадаптированным (са фенотип - его инфекционная активность при пониженной до 26°C температуре составляла 8.0 log10 ЭИД50/мл), что свидетельствует о его безвредности для человека, поскольку по этим показателям он идентичен донору аттенуации А/Ленинград/134/17/57 (H2N2) (табл.2). Фенотипические свойства вакцинного штамма не изменились после его пятикратного пассирования в куриных эмбрионах, что свидетельствует о его генетической стабильности (табл.2).

Таблица 2
Фенотипические свойства вакцинного штамма А/17/Индиана/2011/72 (H3N2v) до и после его пассирования в развивающихся куриных эмбрионах
Вирус Пассаж Титр, log10 ЭИД50/мл Фенотип
32°C 26°C 40°C
А/Индиана/10/2011 (H3N2v) («дикий» вирус) 8.2 2.7 5.7 non-ts, non-ca
А/Ленинград/134/17/57 (H2N2) (донор) 9.2 7.2 1.7 ts, са
А/17/Индиана/2011/72 (H3N2v) (вакцинный штамм) до пассирования 9.6 8.0 <1.7 ts, са
5-й пассаж 9.8 8.1 <1.7 ts, са

Генетическая стабильность кодирующих мутаций. Генетическую стабильность вакцинного штамма А/17/Индиана/2011/72 (H3N2v) изучали также сравнением сохранности кодирующих мутаций во внутренних генах до и после его пятикратного пассирования в куриных эмбрионах. Методом рестрикционного анализа ДНК копий генов [Klimov A.I., Сох N.J. PCR restriction analysis of genome composition and stability of cold-adapted reassortant live influenza vaccines // J. Virol. Methods. - 1995. - Vol.52. - №1-2. - P.41-49], основанным на амплификации коротких участков РНК, включающих уникальные нуклеотидные последовательности, характерные только для донора аттенуации А/Ленинград/134/17/57 (H2N2), продемонстрирована идентичность мутаций во всех внутренних генах донора аттенуации А/Ленинград/134/17/57 (H2N2) и вакцинного штамма А/17/Индиана/2011/72 (H3N2v) до и после его пятикратного пассирования, в том числе в генах полимеразного комплекса (РВ2, РВ1, РА), ответственных за аттенуирующий фенотип (табл.3).

Таблица 3
Кодирующие мутации в геноме вакцинного щтамма А/17/Индиана/2011/72 (H3N2v) по сравнению с донором аттенуации А/Ленинград/134/17/57 (H2N2) и его диким предшественником, вирусом А/Ленинград/134/57 (H2N2)
Ген Аминокислота Мутации
Лен/wt1 Лен 17 А/17/Индиана/2011/72 (H3N2v)
до пассирования 5 пассаж
РВ2 478 Val Leu Leu Leu
РВ1 265 Lys Asn Asn Asn
591 Val Ile Ile Ile
РА 28 Leu Pro Pro Pro
341 Val Leu Leu Leu
NP NP ген донора аттенуации не содержит мутаций
M1 15 Ile Val Val Val
144 Phe Leu Leu Leu
NS2 100 Met Ile Ile Ile
1Наличие мутаций в геноме вакцинного штамма А/17/Индиана/2011/72 (H3N2v) определяли путем его сравнения с диким предшественником донора аттенуации А/Ленинград/134/17/57 (H2N2), а именно с вирусом дикого типа А/Ленинград/134/57 (H2N2), с помощью стандартного метода RFLP. Обозначения: Лен - донор аттенуации А/Ленинград/134/17/57 (H2N2); Лен/wt - вирус дикого типа А/Ленинград/134/57 (H2N2), предшественник донора аттенуации.

Безвредность для морских свинок

Доклинические исследования острой и подострой токсичности вакцинного штамма А/17/Индиана/2011/72 (H3N2v) проводили на морских свинках в соответствии с методическими рекомендациями по доклиническим испытаниям новых иммунобиологических препаратов [Методические рекомендации «Доклинические испытания эффективности и безопасности новых иммунобиологических лекарственных препаратов». М.: 2010. 39 с.] и с «Правилами лабораторной практики» [Правила лабораторной практики. Приказ Минздрава РФ №708н от 23.08.20010. http://www.rg.ru/2010/10/22/laboratornaya-praktika-dok.html].

Изучение острой токсичности вакцинного штамма А/17/Индиана/2011/72 (H3N2v) проводили в экспериментах на морских свинках обоего пола. Морским свинкам вводили однократно 5 мл вакцинного вируса подкожно в дозе 7.0 lg ЭИД50/0.2 мл. Животным контрольной группы вводили подкожно физиологический раствор. Ежедневно в течение всего исследования (7 дней) проводился контроль общего состояния каждого животного.

Показана безвредность вакцинного штамма для лабораторных животных при его подкожном введении.

Изучение подострой токсичности изучали на морских свинках обоего пола. Морским свинкам вводили вирус интраназально по 100 мкл вируса в носовой ход, двукратно с 24-часовым интервалом. Животным контрольной группы интраназально вводили физиологический раствор. Ежедневно в течение всего исследования (14 дней) проводился контроль общего состояния каждого животного.

Показана безвредность вакцинного штамма для лабораторных животных при его подкожном введении (табл.4).

Данные физиологического исследования показали, что подкожное или интраназальное введение вакцинного штамма не вызывало гибели экспериментальных животных и не приводило к изменению их внешнего вида, поведения, не отражалось на потреблении ими пищи и воды, что свидетельствует о безвредности вакцинного препарата.

Таблица 4
Результаты изучения безвредности вакцинного штамма в экспериментах на морских свинках
Животные Пол Препарат Путь введения Выжило к последнему дню наблюдения
Морские свинки (острая токсичность) Самцы ВШ п/к 10/10
Самки ВШ п/к 10/10
Самцы Плацебо п/к 10/10
Самки Плацебо п/к 10/10
Морские свинки (подострая токсичность) Самцы ВШ и/н 10/10
Самки ВШ и/н 10/10
Самцы Плацебо и/н 10/10
Самки Плацебо и/н 10/10
Обозначения: ВШ - вакцинный штамм A/17/Texac/2012/30 (H3N2); п/к - подкожное введение; и/н - интраназальное введение.

В результате проведенных доклинических исследований установлено, что заявляемый вакцинный штамм живой гриппозной вакцины А/17/Индиана/2011/72 (H3N2v) характеризуется сочетанием полезных признаков, необходимых вакцинному штамму: антигенной специфичностью «дикого» вируса А/Индиана/10/2011 (H3N2v), структурой генома 6:2, оптимальной для реассортантных вакцинных штаммов, характерной для донора аттенуации температурочувствительностью и холодоадаптированностью и безвредностью для лабораторных животных, что коррелирует с аттенуацией для человека.

Образец паспорта на вакцинный штамм А/17/Индиана/2011/72 (H3N2v) прилагается.

Таким образом, вакцинный штамм А/17/Индиана/2011/72 (H3N2v) по основным биологическим свойствам, изученным в доклинических экспериментах in vitro и in vivo, соответствует требованиям, предъявляемым к вакцинным штаммам Фармакопейной статьей (ФСП: Р №003224/01-270313) на Ультравак®, вакцину гриппозную аллантоисную живую для интраназального применения для взрослых и для детей.

Полученный штамм А/17/Индиана/2011/72 (H3N2v) депонирован 04.07.2013 г. в Государственную коллекцию вирусов ФГБУ «Научно-исследовательского института вирусологии им. Д.И. Ивановского» Минздрава России (ФГБУ НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского Минздрава России, Россия, 123098, город Москва, улица Гамалеи, 16) под №2739 и имеет характеристики, представленные в образце паспорте штамма.

ХАРАКТЕРИСТИКА ШТАММА

Инфекционная активность при репродукции в развивающихся куриных эмбрионах при 32°C в течение 48 часов - 9,6 lg ЭИД50/мл.

Гемагглютинирующая активность - 1:1024.

Штамм проявляет генетическую стабильность биологических признаков после 5 пассажей на куриных эмбрионах (при использовании больших заражающих доз).

Полезным свойством вакцинного штамма вируса гриппа А/17/Индиана/2011/72 (H3N2v) является его пригодность для наработки живой гриппозной вакцины. Предлагаемый по изобретению вакцинный штамм вируса гриппа А/17/Индиана/2011/72 (H3N2v) может быть использован для профилактики гриппа как у взрослых, так и у детей с трехлетнего возраста.

Штамм вируса гриппа А/17/Индиана/2011/72 (H3N2v), депонированный в Государственную коллекцию вирусов ФГБУ «Научно-исследовательский институт вирусологии им. Д.И. Ивановского» Минздрава России под №2739, используемый для получения живой гриппозной интраназальной вакцины для взрослых и детей.



 

Похожие патенты:

Изобретение относится к медицинской вирусологии и касается вакцинного штамма вируса гриппа. Охарактеризованный штамм В/60/Висконсин/2010/125 - реассортант, полученный путем скрещивания эпидемического вируса В/Висконсин/1/2010 с холодоадаптированным температурочувствительным вирусом В/СССР/60/69 - донором аттенуации.
Изобретение относится к вирусологии и касается штамма вируса осповакцины. Предложенный штамм выделен из гомогената тканей легких морских свинок, инфицированных 7-м пассажем вируса осповакцины.

Представлены наборы олигонуклеотидных зондов и праймеров, биологический микрочип и тест-система для идентификации и типирования вируса гриппа А и В. Охарактеризованная тест-система содержит: набор реагентов для выделения РНК вируса гриппа из биологического материала человека; набор реагентов для проведения ПЦР-амплификации, совмещенной с обратной транскрипцией, с образованием флуоресцентно-меченных фрагментов генома вируса гриппа, содержащий описанные олигонуклеотиды-праймеры; набор реагентов для проведения гибридизации фрагментов ДНК, полученных после проведения амплификации на биочипе, содержащем элементы с иммобилизованными описанными олигонуклеотидными зондами; и при необходимости, отрицательный и положительный контрольные образцы.

Изобретение относится к области биотехнологии и вирусологии. Описан реассортантный вирус гриппа.

Изобретение относится к медицинской вирусологии и биотехнологии. Штамм А/17/Виктория/2011/89 (H3N2) активно размножается в развивающихся куриных эмбрионах при оптимальной температуре 32°С.

Изобретение относится к области медицины и касается способа диагностики гриппа С. Представленный способ включает выявление РНК вируса в мазках из носоглотки человека и животных путем проведения этапов обратной транскрипции и амплификации в одной пробирке методом полимеразной цепной реакции в режиме реального времени со специфичными зондом (5'-TGCTCCTGAAACCAGGACAG-3') и праймерами (5'-GAAATATTGATTGCTGAGACAGA-3', 5'-CCCTCCTGTTATTGCTGAAATTA-3').
Представленное изобретение относится к области медицинской микробиологии и касается способа обнаружения микроорганизма вида Vibrio parahaemolyticus. Способ включает посев исследуемого штамма на газон культуры, нанесение капли диагностического препарата фага в центр чашки, выдерживание при температуре 37°С в течение 20-24 часов и подтверждение его принадлежности к микроорганизмам вида V.
Изобретение относится к области биотехнологии и касается олигонуклеотидных праймеров для идентификации вируса блютанга 6, 14 и 21 серотипов. Охарактеризованные праймеры комплементарны участкам вариабельного 2-го сегмента генома вируса блютанга нуклеотипа С (6, 14 и 21 серотипы) используются в ОТ-ПЦР с электрофоретической детекцией продуктов амплификации для идентификации вируса блютанга 6, 14 и 21 серотипов и имеют следующий состав (5'-3'): Прямой: GRAYATGRTGGATATWCCG Обратный: GGCTGCACRTCCAYYGARTC Представленное изобретение позволяет определить генетическую группу нуклеотипа C вируса блютанга в образцах исследуемого биологического материала с помощью ОТ-ПЦР в короткие сроки.
Изобретение относится к медицинской вирусологии и может быть использовано при производстве живой холодоадаптированной аттенуированной вакцины против гриппа. Холодоадаптированный штамм вируса гриппа В/Виктория/2/63/87 обладает уникальными мутациями в генах, кодирующих белки PB2, PB1, PA, NP, M1, NS1, и предназначен для получения холодоадаптированных реассортантных штаммов-кандидатов для получения живой гриппозной сезонной вакцины.

Изобретение относится к медицинской вирусологии и касается вакцинного штамма вируса гриппа. Охарактеризованный штамм В/60/Висконсин/2010/125 - реассортант, полученный путем скрещивания эпидемического вируса В/Висконсин/1/2010 с холодоадаптированным температурочувствительным вирусом В/СССР/60/69 - донором аттенуации.

Изобретение относится к области биотехнологии и вирусологии. Описан реассортантный вирус гриппа.

Изобретение относится к области медицины и может быть использовано для производства различных инактивированных вакцин против гриппа. Для этого проводят заражение куриных эмбрионов, сбор вируссодержащей аллантоисной жидкости (ВАЖ), очистку ВАЖ методом микрофильтрации.

Изобретение относится к медицинской вирусологии и биотехнологии. Штамм А/17/Виктория/2011/89 (H3N2) активно размножается в развивающихся куриных эмбрионах при оптимальной температуре 32°С.

Изобретение относится к области медицины и касается способа диагностики гриппа С. Представленный способ включает выявление РНК вируса в мазках из носоглотки человека и животных путем проведения этапов обратной транскрипции и амплификации в одной пробирке методом полимеразной цепной реакции в режиме реального времени со специфичными зондом (5'-TGCTCCTGAAACCAGGACAG-3') и праймерами (5'-GAAATATTGATTGCTGAGACAGA-3', 5'-CCCTCCTGTTATTGCTGAAATTA-3').

Изобретение относится к области биотехнологии и медицины и касается вакцины против гриппа, вызываемого известными штаммами вирусов гриппа А и В, а также возможными реассортантами.
Изобретение относится к медицинской вирусологии и может быть использовано при производстве живой холодоадаптированной аттенуированной вакцины против гриппа. Холодоадаптированный штамм вируса гриппа В/Виктория/2/63/87 обладает уникальными мутациями в генах, кодирующих белки PB2, PB1, PA, NP, M1, NS1, и предназначен для получения холодоадаптированных реассортантных штаммов-кандидатов для получения живой гриппозной сезонной вакцины.

Изобретение относится к области молекулярной биологии, вирусологии, генной инженерии, биотехнологии и ветеринарии. Предложена рекомбинантная вакцина, содержащая рекомбинантный вирус и фармацевтически приемлемые носитель, адъювант или эксципиент, где рекомбинантный вирус является инактивированным и содержится в вакцине в виде вирусного вектора, имеющего введенную экзогенную нуклеотидную последовательность, которая кодирует антиген заболевания, где инактивацию вируса проводят физическими или химическими методами, и вакцина является эффективной против, по меньшей мере, указанного заболевания, связанного с указанным антигеном.

Изобретение относится к области биотехнологии и касается рекомбинантных векторов, используемых для производства противогриппозных вакцин. Охарактеризованы рекомбинантная псевдоаденовирусная частица на основе генома аденовируса человека 5 серотипа и способ ее использования.

Изобретение относится к области биотехнологии, вирусологии и медицины. Предложен реассортантный вирус гриппа для производства вакцин.

Изобретение относится к медицинской вирусологии и касается штамма вируса гриппа. Вакцинный штамм В/60/Массачусетс/2012/10 - реассортант, полученный путем скрещивания «дикого» вируса В/Массачусетс/2/2012 с холодоадаптированным температурочувствительным вирусом В/СССР/60/69 - донором аттенуации. Штамм В/60/Массачусетс/2012/10 депонирован в Государственную коллекцию вирусов ФГБУ «Научно-исследовательский институт вирусологии им. Д.И. Ивановского» Минздрава России, под №2740, активно размножается в развивающихся куриных эмбрионах при оптимальной температуре 32°C, характеризуется температурочувствительностью и холодоадаптированностью и безвредностью для лабораторных животных. Реассортант унаследовал гены, кодирующие поверхностные антигены вируса гемагглютинин (HA) и нейраминидазу (NA), от эпидемического родительского вируса и остальные шесть генов, кодирующих внутренние негликозилированные белки, от донора аттенуации. Представленное изобретение может быть использовано в практическом здравоохранении для профилактики заболеваемости гриппом среди взрослых и детей. 4 табл.
Наверх