Способ определения мембранной активности веществ на живых клетках



Способ определения мембранной активности веществ на живых клетках
Способ определения мембранной активности веществ на живых клетках
Способ определения мембранной активности веществ на живых клетках

 


Владельцы патента RU 2545712:

Федеральное Бюджетное учреждение науки "Московский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Г.Н. Габричевского" Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (RU)

Изобретение относится к биотехнологии, а именно к способам определения активности веществ, обладающих способностью встраиваться в биологические мембраны клеточных стенок с нарушением функционирования клеток. В измерительные ячейки прибора для автоматизированного подсчета числа живых инфузорий вносят суспензию клеток Tetrahymena pyriformis и испытуемое вещество с последующим определением числа живых клеток в каждую минуту, при этом совпадение динамики изменения числа живых клеток во времени для сравниваемых веществ делают заключение о равенстве их активностей. Методы расчета основаны либо на определении времени инкубации инфузорий с испытуемым веществом, необходимого для гибели половины инфузорий, либо на определении константы скорости гибели клеток, которую удобно рассчитывать по тангенсу угла наклона прямой, характеризующей зависимость логарифма числа подвижных клеток от времени в период наблюдаемого падения числа живых клеток. Обе величины, зависящие от мембранной активности, характеризуют мембранную активность изучаемых веществ и пригодны для сравнения активностей. Способ позволяет определять мембранную активность веществ, обеспечивая возможность стандартизации процесса. 3 з.п. ф-лы, 3 ил., 1 табл., 3 пр.

 

Изобретение относится к биотехнологии, а именно к способам определения активности веществ, обладающих способностью встраиваться в биологические мембраны клеточных стенок с нарушением функционирования клеток, что является причиной токсического действия этих веществ [1]. Известны методы исследования способности веществ взаимодействовать с природными биологическими мембранами с использованием эритроцитов [2] или живых клеточных линий [3]. В этих методах проявляется способность тестируемых веществ нарушать целостность или нативность структуры биологических мембран, что приводит к лизису и гибели клеток. В количественном отношении мембранная активность цитотоксинов, определенная двумя методами, может не совпадать, что косвенно свидетельствует о возможных различиях в действии веществ на разные мембраны [4]. В связи с этим недостатком гемолитического метода можно считать то обстоятельство, что он чувствует только такие воздействия, которые грубо нарушают целостность мембраны или приводят к образованию в мембранах пор, ответственных за осмотический лизис. Недостатком метода, фиксирующего гибель клеток, является необходимость получения и ведения клеточных линий, а также проведение дополнительных реакций, обнаруживающих гибель клеток, например, по потере способности восстанавливать тетразолиевый краситель в формазан.

Преодолеть эти недостатки можно, используя другую клеточную мишень. Из литературы известно [5], что комплемент морской свинки способен обездвиживать инфузории Tetrahymena pyriformis в результате действия мембраноатакующего комплекса и при этом лизис наступает значительно позднее и под влиянием больших количеств сыворотки. Следить за числом оставшихся в живых инфузорий удобно с помощью специального прибора для биологических исследований [6]. Таким образом, такая клеточная модель, как живые инфузории, могла бы быть доступной и пригодной мишенью для изучения действия мембраноактивных соединений на стенку живой клетки. Ранее вопрос об использовании инфузорий в качестве мишени для определения мембранной активности веществ не изучался. Не исследовалось также действие мембраноактивных веществ на инфузории.

Инфузории использовались в качестве мишени «биотестирования», то есть живых клеток, гибнущих при воздействии на них токсических веществ [7], при этом полагалось, что изучается общая интегральная токсичность вещества для живой системы, представленной инфузориями, без рассмотрения механизмов токсичности.

Задачей заявленного изобретения является разработка универсального способа и метода расчета для определения мембранной активности веществ с использованием доступной мишени.

Поставленная задача достигается путем разработки способа определения и метода расчета функциональной активности мембраноактивных соединений по их воздействию на инфузории Tetrahymena pyriformis, с использованием прибора для биологических исследований [6]. Было обнаружено, что при действии мембраноактивного соединения на инфузории через определенный промежуток времени, зависящий от количества активного вещества, начинается процесс обездвиживания инфузорий, протекающий со скоростью, также зависящей от количества этого вещества (рис.1). При этом наблюдается изменение количества живых клеток во времени при добавлении разных количеств кардиотоксина кобры Naja sumatrana: 1 - 80 мкг, 2 - 120 мкг, 3 - 160 мкг, 4 - 240 мкг. Обе измеряемые величины: время инкубации, необходимое для достижения обездвиживания половины микроорганизмов, а также скорость перехода подвижных инфузорий в неподвижные могут быть использованы для расчета количества и активности мембраноактивного вещества.

На рис.1 мы видим число движущихся клеток в данную минуту измерения, поскольку клетки, не изменившие свои координаты, программно не учитываются. Время половинной гибели клеток зависит от количества мембраноактивного вещества (рис. 2). На рис. представлена зависимость времени гибели половины клеток от добавления разных количеств кардиотоксина кобры Naja sumatrana). Наблюдаемая на графике рис.1 сигмоида характеризует переход между двумя состояниями: живое - неживое. Очевидно, что крутизна этого перехода (его скорость) может характеризовать активность испытуемого вещества. Мы предположили, что такой переход может характеризоваться уравнением первого порядка: n=n0e-kt , где n0 - число живых клеток в начале процесса, n - число живых клеток во время t. Логарифмируя это уравнение, получаем линейную зависимость логарифма числа живых клеток от времени, характеризующую константу скорости процесса k с размерностью 1/мин: ln n0 - ln n = kt.

Действительно, на рис.3 представлен калибровочный график зависимости константы скорости обездвиживания инфузорий от количества мембраноактивного вещества - кардиотоксина кобры Naja sumatra , который имеет линейный характер.

Методы расчета основаны либо на определении времени инкубации инфузорий с тестируемым веществом, необходимого для гибели половины инфузорий, либо на определении константы скорости гибели клеток, которую удобно рассчитывать по тангенсу угла наклона прямой, характеризующей зависимость логарифма числа подвижных клеток от времени в период наблюдаемого падения числа живых клеток. Обе величины, зависящие от количества мембраноактивного вещества, могут быть использованы для сравнения с величинами, полученными для соединения, заведомо известного своей мембранной активностью и выбранного за стандарт. Тем самым достигается определение мембранной активности изучаемого вещества методом, пригодным для стандартизации.

Техническим результатом заявленного изобретения является разработка способа и метода расчета для определения мембранной активности веществ с использованием доступной и стандартизуемой мишени в виде инфузории Tetrahymena pyriformis, в результате чего не наблюдается грубого воздействия на целостность мембраны, приводящей к осмотическому лизису клеток.

Пример 1. Определение мембранной активности веществ на живых клетках.

В измерительные ячейки прибора вносят 200 мкл суспензии приблизительно 800 клеток инфузории Tetrahymena pyriformis в вероналовом буферном растворе, pH 7,4, содержащем 0,075 М NaCl, 0,075 мМ Ca2+ и 0,25 мМ Mg2+ и 100 мкл того же буфера, содержащего от 2 до 50 мкл раствора испытуемого вещества. Определяют число живых клеток в ячейках каждую минуту (рис.1). Динамика изменения числа живых клеток во времени для измеряемой активности комплемента сравнивается с аналогичной динамикой, полученной для контрольного образца, представляющего собой раствор вещества, заведомо обладающего мембранной активностью и выбранного за стандарт.

Для совпадающих динамик опытного и контрольного образцов полагают равенство активностей.

Пример 2. Аналогично примеру 1 только для расчета мембранной активности вещества измеряют время (T50) наступления обездвижения половины клеток для разных количеств образца и строят график зависимости времени от количества образца (рис.2).

Пример 3. Аналогично примеру 1 только для расчета мембранной активности определяют тангенс угла наклона прямой, характеризующей зависимость логарифма числа подвижных клеток от времени в период наблюдаемого падения числа живых клеток в качестве константы скорости (k) процесса для взятого количества образца (рис.3). На основании константы скорости в опыте по графику определяют, какому количеству стандартного образца соответствует мембранная активность вещества в эксперименте.

В качестве образца сравнения был выбран мелитин яда пчелы, обладающий высокой мембранной активностью [6]. В таблице 1 приведены константы скорости гибели инфузорий и времена гибели половины клеток под действием разных количеств мелитина яда пчелы и кардиотоксина кобры Naja sumatrana. Сравнение полученных данных показывает, что кардиотоксин кобры по сравнению с мелитином обладает примерно в 300 раз меньшей мембранной активностью.

Таблица 1
Константы скорости (k) гибели инфузорий и времена гибели половины клеток под действием разных количеств мелитина яда пчелы и кардиотоксина кобры Naja sumatrana.
Вещество Кол-во, k, мин-1 T50, мин
МКГ
Мелитин 0,51 0,16 11
" 0,85 0,21 5
Кардиотоксин 80 0,01 >60
" 120 0,07 17
" 160 0,13 9
" 240 0,34 4,5

Литература

1. Куценко С.А. Основы токсикологии. Биомедицинский журнал Medline. ru. 2003. Т.4. Март.

(http://www.medline.ru/public/monografy/toxicology/p5-toxfactors/p3.phtml)

2. Zusman N., Miklas T.M., Graves Т., Dambach G.E., Hudson R.A. On the interaction of cobra venom protein cardiotoxins with erythrocytes. Biochem. Biophys. Res. Communs. 1984, V.124, №2, P.629-636.

3. Green L.M., Reade J.L., Ware C.F. Rapid colorimetric assay for cell viability: application to the quantitation of cytotoxic and growth inhibitory lymphokines. J. Immunol. Methods. 1984, V.70, №2, P.257-268.

4. Lin S.-R., Chang L.-S., Kee-Lung Chang K.-L. Separation and structure-function studies of Taiwan cobra cardiotoxins. J. Protein Chem. V.21, №2, P.81-86.

5. Sinclair I.J.B. The role of complement in the immune reactions of Paramecium aurelia and Tetrahymena pyriformis. Immunology. 1958, V.1, P.291-299.

6. Черемных Е.Г., Покатаев А.С., Гридунова В.Н. Прибор для биологических исследований. - Патент РФ 2361913, опубл. 20.07.09. Бюл. №20.

7. Виноходов Д.О. Научные основы биотестирования с использованием инфузорий. Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук. Санкт-Петербург, 2007.

8. Lin S.Y., Huang M.C., Tseng W.C., Lee C.Y. Comparative studies on the biological activities of cardiotoxin, melittin and prymnesin. Naunyn Schmiedebergs Arch Pharmacol. 1975, V.287, P.349-358.

1. Способ определения мембранной активности веществ на живых клетках, отличающийся тем, что в измерительные ячейки прибора для автоматизированного подсчета числа живых инфузорий вносят суспензию клеток Tetrahymena pyriformis и испытуемое вещество с неизвестной мембранной активностью с последующим определением числа живых клеток в каждую минуту, при совпадении динамики изменения числа живых клеток во времени для испытуемого вещества и контрольного образца, представляющего собой мелитин яда пчелы, полагают равенство их активностей.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что для определения динамики изменения числа живых клеток во времени измеряют время инкубации инфузорий с испытуемым веществом, необходимое для гибели половины клеток, которое обратно пропорционально мембранной активности вещества, и сравнивают его со временем половинной гибели клеток для контрольного образца.

3. Способ по п.1, отличающийся тем, что для определения динамики изменения числа живых клеток во времени рассчитывают тангенс угла наклона зависимости логарифма числа живых клеток от времени в период наблюдаемого падения числа живых клеток, который является константой скорости процесса и прямо пропорционален мембранной активности испытуемого вещества, и сравнивают с константой скорости процесса для контрольного образца.

4. Способ по п.1, отличающийся тем, что в качестве испытуемого вещества используют кардиотоксин кобры Naja sumatrana.



 

Похожие патенты:

Группа изобретений относится к биотехнологии и сельскому хозяйству. Предложены соединения A-87774, представленные соединениями A-87774-1, A-87774-2, A-87774-3 или их солью, способ получения соединений A-87774, штамм Streptomyces sp.

Изобретение относится к области сельскохозяйственной микробиологии и может быть использовано для получения биопрепаратов. Штамм Serratia ficaria TP депонирован во Всероссийской Коллекции Промышленных Микроорганизмов (ВКПМ) под регистрационным номером ВКПМ В-11403 и обладает выраженными антагонистическими, фитостимулирующими и фунгицидными свойствами по отношению к фитопатогенным грибам.
Изобретение относится к биотехнологии и медицине, в частности, может быть использовано для сорбции аэробных микроорганизмов при изготовлении стерильных растворов, очистке воды или нефтезагрязненных почв, а также при лечении различных ран.
Изобретение относится к области полезных для здоровья композиций и способу их получения. Способ получения композиции неживой лактобациллы, обладающей способностью специфического связывания со Streptococcus mutans, включает следующие стадии: нагревание суспензии клеток лактобациллы или смеси лактобацилл, обладающих способностью специфического связывания со Streptococcus mutans, с исходной температуры ниже 40°C до температуры пастеризации от 75 до 85°C с изменением температуры от 0,5 до 2°C/мин, удерживание нагретой суспензии при температуре пастеризации в течение от 20 до 40 минут и охлаждение суспензии до конечной температуры ниже 40°C с изменением температуры от 0,5 до 2°C/мин.

Группа изобретений касается способа улучшения показателей роста животного и композиции, используемой в таком способе. Охарактеризованный способ включает введение животному, не являющемуся насекомым или человеком, эффективного количества композиции, включающей Bacillus subtilis QST713, с кормом или питьевой водой.
Изобретение относится к области биотехнологии. Предложен способ очистки сточных вод.

Изобретение относится к биотехнологии и к сельскохозяйственной микробиологии. Способ предусматривает предпосевную обработку семян, пролив почвы и обработку вегетативных частей растений культуральной жидкостью штамма Lactobacillus plantarum 60-ДЕП, депонированного во Всероссийской государственной коллекции штаммов микроорганизмов, используемых в ветеринарии и животноводстве, с титром 106 KOE/мл при расходе 5-30 мл на 100 мл воды.

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано для очистки промышленных сточных вод машиностроительных, приборостроительных, электротехнических предприятий от повышенных концентраций ионов меди и других тяжелых металлов.
Изобретение относится к медицинской микробиологии, а именно к получению плотной питательной среды, с помощью которой возможно определение антибиотикочувствительности культур возбудителя легионелеза - Legionella pneumophila.

Группа изобретений относится к биотехнологии. Предложена бактерия Bacillus subtilis, продуцирующая 5′-аминоимидазол-4-карбоксамидрибозид (АИКАР).
Изобретение относится к медицинской микробиологии, а именно к получению плотной питательной среды, с помощью которой возможно определение антибиотикочувствительности культур возбудителя легионелеза - Legionella pneumophila.

Изобретение относится к области биотехнологии и касается способа получения коклюшного компонента комплексных вакцин. Представленный способ включает выращивание культуры B.
Изобретение относится к области медицины, а именно к медицинской бактериологии и медицинской микологии, и описывает способ количественной оценки адгезивных свойств условно-патогенных микроорганизмов, выделенных от человека и объектов окружающей среды.
Группа изобретений относится к биотехнологии и может быть использована для биотестирования токсичности объектов окружающей среды. Заявлены штамм бактерий Vibrio aquamarinus, способ определения токсичности проб с его помощью и применение штамма в качестве тест- культуры для определения химической токсичности проб.
Изобретение относится к области контроля качества дезинфекции. Способ предусматривает дезинфекцию помещений, отбор тест-объектов, в качестве которых используют суспензию Bacillus subtilis штамма АТСС-РТА 6737 (РВ6), сорбированную на носителе - фильтровальной бумаге с клейким участком поверхности.
Изобретение относится к биотехнологии и микробиологии и представляет собой способ идентификации кластера генов, кодирующих стафилококковые белки, являющиеся экзотоксинами.

Представленные решения касаются способа генерирования заквасочной культуры, заквасочной культуры и способа ферментации с использованием такой заквасочной культуры.
Изобретение относится к области микробиологии. Готовят две взвеси.

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано для дифференцированного определения числа жизнеспособных актинобактерий рода Rhodococcus, иммобилизованных в нерастворимом гелевом носителе.
Изобретение относится к биотехнологии. Способ предусматривает отбор проб почвы, внесение в почву метсульфурон метила (МСМ) в заданном количестве с последующей инкубацией и определением удельной метаболической активности (УМА) сапрофитного комплекса почвы при помощи мультисубстратного тестирования (МСТ) и учета числа КОЕ (колониеобразующих единиц) на разбавленной агаризованной среде.
Настоящее изобретение относится к вакцинной композиции для иммунизации животного против кокцидиоза и способу иммунизации животного. Охарактеризованная вакцина содержит от приблизительно 10 до приблизительно 1000 ооцист из первого штамма Eimeria и от приблизительно 100 до приблизительно 10000 ооцист второго штамма указанного вида, причем первый и второй штаммы имеют асинхронные эндогенные периоды и первый штамм представляет собой неослабленный штамм Eimeria, а второй штамм представляет собой ранний штамм Eimeria.
Наверх