Перевиваемая гибридная сублиния клеток а4с2/9к sus scrofa, используемая для вирусологических исследований вируса африканской чумы свиней

Авторы патента:

C12N7/00 - Вирусы, например бактериофаги; их композиции; приготовление или очистка их (лекарственные препараты, содержащие вирусы A61K 35/76; получение лекарственных составов, содержащих вирусные антигены или антитела, например вакцин из вирусов A61K 39/00)

C12N5/073 - Недифференцированные клетки человека, животных или растений, например клеточные линии; ткани; культивирование или сохранение их; питательные среды для них (размножение растений из тканевых культур A01H 4/00)

Владельцы патента RU 2545720:

Государственное научное учреждение Всероссийский научно-исследовательский институт ветеринарной вирусологии и микробиологии Россельхозакадемии (RU)

Изобретение относится к области ветеринарной вирусологии и касается перевиваемой гибридной сублинии клеток A₄C₂/9к SUS SCROFA. Представленная сублиния клеток A₄C₂/9к обладает высокой чувствительностью к вирусу АЧС. В качестве ростовой среды используется среда Игла - MEM с 10% сыворотки крови свиньи. Посевная концентрация 80-100 тыс. клеток/мл. Митотический индекс к 2-3 суткам культивирования составляет 25-35. Сублиния клеток депонирована в Специализированной коллекции клеточных культур сельскохозяйственных и промысловых животных при Всероссийском научно-исследовательском институте экспериментальной ветеринарии под №87. Охарактеризованное изобретение позволяет выделить вирус африканской чумы свиней без предварительной адаптации в реакции гемадсорбции и обеспечивает его накопление в титре до 6,0-6,5 lg ГАЕ₅₀/см³. 1 табл., 3 пр.

Изобретение относится к области ветеринарной вирусологии, биотехнологии, и представляет собой сублинию внутривидовых гибридных клеток A₄C₂/9к для выделения, определения инфекционной активности и типовой принадлежности вируса африканской чумы свиней (АЧС).

Установлено, что лимфоцитоподобные клетки более чувствительны к вирусу АЧС, чем эпителиоподобные клетки. Кроме того, известны способы повышения титра вируса АЧС путем перевода культивирования клеток и вируса в питательную среду, содержащую сыворотку крови свиней [1].

Известна перевиваемая линия клеток A₄C₂, которая является гибридной линией клеток СПЭВ ТК^- и представлена 2-мя типами клеток: эпителиоподобные, лимфоцитоподобные. Эпителиоподобные клетки обладают высокими адгезивными свойствами. Лимфоцитоподобные - низкоадгезивными свойствами и накапливаются, кроме мультислоя, в культуральной жидкости на 3-6 сутки культивирования в концентрации 50-100 тыс. кл/мл. Основная среда культивирования для постоянного поддержания культуры клеток 199 или Игла - МЕМ с 10-20% сыворотки эмбрионов крупного рогатого скота или телят-доноров. Линия клеток чувствительна к вирусам классической чумы свиней, трансмиссивного гастроэнтерита свиней, энцефаломиокардита свиней и др. [2].

В вирусологии известны перевиваемые линии клеток чувствительные к вирусу африканской чумы свиней, такие как ПСГК-60, ППК-666, CV-1, COS-1 [3]. Однако они имеют ряд недостатков: необходима предварительная адаптация вируса к перевиваемой линии клеток, вирус АЧС размножается в них без проявления гемадсорбции.

Целью нашего изобретения являлось получение высокочувствительной линии клеток к вирусу АЧС методом направленной селекции клеток, по принципу увеличения числа лимфоцитоподобных клеток и с последующей их адаптацией к росту в питательной среде с сывороткой крови свиньи.

Поставленная цель достигается тем, что перевиваемая линия клеток A₄C₂ чувствительна к вирусу АЧС, и вирус накапливается в ней в титре 2,5-3,0 lg ГАЕ₅₀/см³.

Суть изобретения: получена сублиния внутривидовых гибридных клеток СПЭВ ТК^- с лимфоцитоподобными клетками свиньи. Сублиния позволяет выделить вирус африканской чумы свиней без предварительной адаптации в реакции гемадсорбции и обеспечивает его накопление в титре до 6,0-6,5 lg ГАЕ₅₀/см³.

Получение. Перевиваемую линию клеток A₄C₂ выращивали при температуре 37±0,5°C в течение 6-7 суток, поддерживая pH среды в пределах 7,2-7,6, с периодическим добавлением 7,5% NaHCO₃. Учитывая способность клеток переходить в суспензию по мере зарастания монослоя, количество их в популяции увеличивали путем осаждения. Культуральную среду центрифугировали 15 минут при 1000 об/мин, осадок клеток ресуспендировали в 5-6 см³ питательной среды и подсчитывали клетки. Концентрацию клеток доводили до посадочной 80-100 тыс. клеток/мл и культивировали в питательной среде Игла - MEM с 10% фетальной сыворотки крупного рогатого скота. Аналогично проводили 10 пассажей. В результате получена новая сублиния клеток, культуральные свойства которой оставались стабильными в течение следующих 20 пассажей (срок наблюдения).

Учитывая, что, как правило, вирус АЧС культивируют в поддерживающей среде, содержащей свиную сыворотку, осуществляли адаптацию культуры клеток к выращиванию в среде, постепенно увеличивая содержание сыворотки крови свиньи до полной замены фетальной сыворотки крупного рогатого скота на сыворотку крови свиньи с конечной концентрацией 10% в среде Игла - MEM.

В течение 15 последовательных пассажей культура сохранила свои основные цитоморфологические характеристики. Клетки при пересеве с коэффициентами 1:3, 1:5 формировали монослой на 2-3 сутки, который сохранялся без смены среды в течение 14 суток.

Морфологическая характеристика. Сублиния представлена лимфоцитоподобными клетками с плотными ядрами и узким ободком цитоплазмы, обладающие низкоадгезивными свойствами, и накапливаются в культуральной жидкости на 5 сутки культивирования в концентрации 500-550 тыс. кл/см³, а также эпителиоподобными клетками полигональной формой, плотно примыкают друг к другу, обладают высокими адгезивными свойствами. Культура представлена в монослое эпителиоподобными клетками до 30-40% и лимфоцитоподобными клетками 60-70% (таблица 1).

Модальное число хромосом 40 имеют 46% клеток популяции. Разброс числа хромосом составляет 38-45.

Таблица 1
Сравнительная характеристика перевиваемой линий клеток A₄C₂ и сублинии клеток A₄C₂/9к
№ п/п	Характеристика	A₄C₂	Сублиния A₄C₂/9к
1	процент лимфоцитоподобных клеток	30-40%	60-70%
2	посевная концентрация, тыс. клеток/мл	80-100	80-100
3	среда для культивирования	Игла - MEM	Игла - MEM
4	сыворотка крови	фетальная КРС	свиньи
5	накопление вируса АЧС, lg ГАЕ₅₀/см³	3,0±0,12	6,5±0,14

Культуральные свойства. В качестве ростовой среды используется среда Игла - MEM с 10% сыворотки крови свиньи. Посевная концентрация 80-100 тыс. клеток/см³. Для снятия клеток используют 0,25% раствор трипсина и 0,02% раствор версена в соотношении 1:9. Коэффициент пересева (1:3)-(1:5). Сбор клеток в суспензии осуществляют методом осаждения. Митотический индекс к 2-3 суткам культивирования составляет 25-35.

Криоконсервацию культуры осуществляют в криозащитной среде, состоящей из 60% среды Игла, 30% сыворотки свиньи и 10% глицерина. Режим замораживания: эквилибрация при 4°C в течение 1 часа, далее снижение температуры до минус 70°C. Затем помещают в жидкий азот при минус 196°C. Количество жизнеспособных клеток после размораживания составляет 80-95%.

Сведения о контаминантах. Бактерии, грибы, микроплазмы не обнаружены.

Пример 1. Культивирование сублинии клеток A₄C₂/9к

Культуру выращивают на питательной среде Игла - MEM, содержащей 10% сыворотки крови свиньи. Посевная концентрация 80-100 тыс. клеток/см³. Для снятия клеток используют 0,25% раствор трипсина и 0,02% раствор версена в соотношении 1:9. Коэффициент пересева 1:3-1:5. Сбор клеток в суспензии осуществляют методом осаждения. Монослой формируется на 2 сутки культивирования.

Пример 2. Выделение эпизоотического вируса

Культуру клеток выращивают на чашках Карреля, инфицируют вирусом АЧС с адсорбцией вируса в течение 60 минут и заменой ростовой питательной среды на поддерживающую с 2% сыворотки крови свиньи. Через 24 часа вносят по 0,1 см³ 0,5% взвеси эритроцитов свиней. Инфицированные культуры клеток инкубируют при температуре 37±0,5°C в течение 5-7 суток. На поверхности инфицированных клеток отмечают специфическую гемадсорбцию, которая характеризуется многослойным прикреплением к ним эритроцитов свиней.

Сублиния клеток A₄C₂/9к обладает высокой чувствительностью к вирусу АЧС по сравнению с другими перевиваемыми линиями CV-1, Vero, РК-15, кроме того, вирус АЧС размножается в нем с проявлением гемадсорбции.

Пример 3. Определение типовой принадлежности вируса АЧС

Культуру выращивают в 24 - луночных культуральных планшетах, инфицируют вирусом АЧС с множественностью заражения 0,1 ТЦД₅₀/кл с адсорбцией вируса в течение 60 минут, затем вносят поддерживающую среду Игла - MEM с 2% сыворотки крови свиньи и по 0,1 см³ специфической сыворотки и 0,1 см³ 0,5% взвеси эритроцитов свиней. Культуры клеток инкубируют при 37°C в течение 5-7 суток. Учет реакции проводят аналогично реакции задержки гемадсорбции в культуре клеток КМС.

Культура клеток костного мозга свиней является переживающей клеточной системой, и чувствительность клеток зависит от партии клеток. Сублиния клеток A₄C₂/9к является стабильной перевиваемой клеточной линией, которая обладает высокой чувствительностью к вирусу АЧС. Применение A₄C₂/9к для выявления, определения инфекционной активности и типовой принадлежности вируса АЧС позволяет оптимизировать условия и стандартизировать методы исследований.

Список использованных источников

1. Калантаенко Ю.Ф. Выращивание вируса африканской чумы свиней в культуре перевиваемых клеток: дис. … канд. вет. наук. 16.00.03 / Калантаенко Юрий Федорович. - Покров, 1982. - 57 с.

2. Патент РФ 2082758, C12N 5/06. Штамм внутривидовых гибридных клеток Suis Domestica, используемый для выделения и культивирования вируса классической чумы свиней / Дьяконов Л.П., Майджи Е.В., Герасимов В.Н., Гальнбек Т.В.; Дудар Л.Н.; Солдатова Н.В.; Федорова Е.Е.; Егорова А.И.; ГНУ ВИЭВ. - №94026140/13; заявл. 14.07.1994; опубл. 27.06.1997.

3. Apoptosis induced in an early step of African swine virus entry into Vero cell does not require virus replication / A.L. Carrascosa, M.J. Bustos, M.L. Nogal [et al.] // J. Virol. - 2002. - Vol.294. - P.372-382.

Перевиваемая гибридная сублиния клеток A4C2/9к SUS SCROFA, используемая для вирусологических исследований вируса африканской чумы свиней, депонирована в Специализированной коллекции клеточных культур сельскохозяйственных и промысловых животных при Всероссийском научно-исследовательском институте экспериментальной ветеринарии под №87.

Изобретение относится к медицинской вирусологии и касается штамма вируса гриппа. Вакцинный штамм А/17/Индиана/2011/72 (H3N2v) - реассортант, полученный путем скрещивания «дикого» вируса А/Индиана/10/2011 (H3N2v) с холодоадаптированным температурочувствительным вирусом А/Ленинград/13 4/17/57 (H2N2) - донором аттенуации.

Вакцинный штамм вируса гриппа в/60/висконсин/2010/125 // 2545695

Изобретение относится к медицинской вирусологии и касается вакцинного штамма вируса гриппа. Охарактеризованный штамм В/60/Висконсин/2010/125 - реассортант, полученный путем скрещивания эпидемического вируса В/Висконсин/1/2010 с холодоадаптированным температурочувствительным вирусом В/СССР/60/69 - донором аттенуации.

Штамм gpa вируса осповакцины для исследования эффективности противовирусных препаратов in vivo и оценки схем купирования нежелательных поствакцинальных реакций при первичном оспопрививании // 2542400

Изобретение относится к вирусологии и касается штамма вируса осповакцины. Предложенный штамм выделен из гомогената тканей легких морских свинок, инфицированных 7-м пассажем вируса осповакцины.

Способ нейтрализации вируса гепатита с, полностью человеческое моноклональное антитело против вируса гепатита с (варианты), композиция полностью человеческих моноклональных антител против вируса гепатита с и гибридная мышь/человек клеточная линия - продуцент полностью человеческих моноклональных антител против вируса гепатита с (варианты) // 2539770

Изобретение относится к области биотехнологии. Раскрыты способы и технологии нейтрализации вируса гепатита С, а также антитела против вируса гепатита С.

Наборы олигонуклеотидов-праймеров и зондов, биологический микрочип и тест-система для идентификации и типирования вируса гриппа а и в с их использованием // 2538168

Представлены наборы олигонуклеотидных зондов и праймеров, биологический микрочип и тест-система для идентификации и типирования вируса гриппа А и В. Охарактеризованная тест-система содержит: набор реагентов для выделения РНК вируса гриппа из биологического материала человека; набор реагентов для проведения ПЦР-амплификации, совмещенной с обратной транскрипцией, с образованием флуоресцентно-меченных фрагментов генома вируса гриппа, содержащий описанные олигонуклеотиды-праймеры; набор реагентов для проведения гибридизации фрагментов ДНК, полученных после проведения амплификации на биочипе, содержащем элементы с иммобилизованными описанными олигонуклеотидными зондами; и при необходимости, отрицательный и положительный контрольные образцы.

Варианты гемагглютинина и нейраминидазы гриппа // 2535970

Изобретение относится к области биотехнологии и вирусологии. Описан реассортантный вирус гриппа.

Штамм вируса гриппа а/17/виктория/2011/89 (h3n2) для производства живой гриппозной интраназальной вакцины для взрослых и для детей // 2532844

Изобретение относится к медицинской вирусологии и биотехнологии. Штамм А/17/Виктория/2011/89 (H3N2) активно размножается в развивающихся куриных эмбрионах при оптимальной температуре 32°С.

Способ диагностики гриппа с // 2532843

Изобретение относится к области медицины и касается способа диагностики гриппа С. Представленный способ включает выявление РНК вируса в мазках из носоглотки человека и животных путем проведения этапов обратной транскрипции и амплификации в одной пробирке методом полимеразной цепной реакции в режиме реального времени со специфичными зондом (5'-TGCTCCTGAAACCAGGACAG-3') и праймерами (5'-GAAATATTGATTGCTGAGACAGA-3', 5'-CCCTCCTGTTATTGCTGAAATTA-3').

Способ обнаружения микроорганизма вида vibrio parahaemolyticus // 2531236

Представленное изобретение относится к области медицинской микробиологии и касается способа обнаружения микроорганизма вида Vibrio parahaemolyticus. Способ включает посев исследуемого штамма на газон культуры, нанесение капли диагностического препарата фага в центр чашки, выдерживание при температуре 37°С в течение 20-24 часов и подтверждение его принадлежности к микроорганизмам вида V.

Синтетические олигонуклеотидные праймеры для идентификации вируса блютанга нуклеотипа с (6, 14 и 21 серотипы) методом от-пцр // 2529955

Изобретение относится к области биотехнологии и касается олигонуклеотидных праймеров для идентификации вируса блютанга 6, 14 и 21 серотипов. Охарактеризованные праймеры комплементарны участкам вариабельного 2-го сегмента генома вируса блютанга нуклеотипа С (6, 14 и 21 серотипы) используются в ОТ-ПЦР с электрофоретической детекцией продуктов амплификации для идентификации вируса блютанга 6, 14 и 21 серотипов и имеют следующий состав (5'-3'): Прямой: GRAYATGRTGGATATWCCG Обратный: GGCTGCACRTCCAYYGARTC Представленное изобретение позволяет определить генетическую группу нуклеотипа C вируса блютанга в образцах исследуемого биологического материала с помощью ОТ-ПЦР в короткие сроки.

Способ защиты клеток от повреждения при гипоксии путем глутатионилирования каталитической субъединицы na, к-атфазы // 2544958

Изобретение относится к способам защиты клеток и тканей от гипоксического повреждения и может быть использовано для разработки средств защиты от повреждения при гипоксии и ишемии.

Способ создания клеточных моделей болезни альцгеймера. // 2544957

Изобретение относится к способу создания клеточных моделей болезни Альцгеймера, предназначенных для тестирования лекарственной эффективности химических веществ с целью их дальнейшего использования в медицине, более конкретно в сфере лечения нейродегенеративных заболеваний человека, обусловленных нейротоксическими эффектами бета-амилоидных агрегатов.

Способ получения прогениторных клеток миокарда // 2542964

Изобретение относится к области биотехнологии и касается способа получения прогениторных клеток из образцов миокарда млекопитающего. Представленный способ включает измельчение образцов, посадку их на культуральные чашки с покрытием, обеспечивающим их адгезию, культивирование образцов в условиях гипоксии, обеспечивающей адгезию образцов, с образованием клеточной культуры, извлечение клеток из клеточной культуры посредством обработки ее ферментами, культивирование извлеченных клеток до момента образования клеточных агрегатов и обработку клеточных агрегатов раствором ферментов для получения прогениторных клеток миокарда.

Штамм гибридных культивируемых клеток животных mus musculus α-продуцент моноклональных антител, специфичных к гранулоцитарному колониестимулирующему фактору (gcsf) человека // 2542381

Изобретение относится к области биотехнологии и медицины. Предложен штамм гибридных культивируемых клеток животных mus musculus α-продуцент моноклональных антител, специфичных к гранулоцитарному колониестимулирующему фактору (GCSF) человека, депонированный в Специализированной коллекции клеточных культур Института цитологии РАН под номером РККК (П) 662 Д.

Способ лечения цитомегаловирусной инфекции // 2540474

Изобретение относится к медицине, а именно к гастроэнтерологии, и может быть применено в качестве способа лечения гормонозависимой/гормонорезистентной формы язвенного колита, осложненного оппортунистическими инфекциями.

Дифференцировка эмбриональных стволовых клеток человека // 2540021

Изобретение относится к области биотехнологии и медицины. Предложен способ дифференцировки популяции полипотентных стволовых клеток, полученных из установленных линий полипотентных стволовых клеток, в популяцию клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии панкреатической энтодермы, которая ко-экспрессирует PDX1, NKX6.1, но не экспрессирует CDX2 и NGN3.

Дифференцировка эмбриональных стволовых клеток человека // 2540016

Изобретение относится к области генетической инженерии, молекулярной биологии и биотехнологии. Предложен способ дифференцировки популяции полипотентных стволовых клеток в популяцию клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии панкреатической энтодермы, которая ко-экспрессирует PDX1, NKX6.1, но не экспрессирует CDX2 и NGN3В.

Способ подготовки клеточных культур в виде сфероидов для формирования биоинженерной конструкции передних слоев искусственной роговицы // 2539831

Изобретение относится к области медицины, офтальмологии и биотехнологии. Предложен способ подготовки клеточных культур в виде сфероидов для формирования передних слоев искусственной роговицы, включающий использование кусочков лимба.

Выращенные в прикрепленной к субстрату культуре клетки из ткани плаценты и их использование при лечении // 2539786

Изобретение относится к биотехнологии и представляет собой выращенную прикрепленной к субстрату клетку из плаценты. Данная клетка культивирована в трехмерных (3D) условиях культивирования, которые обеспечивают возможность размножения клетки.

Вич вакцина, основанная на направленности максимизированных gag и nef на дендритные клетки // 2539765

Изобретение относится к области биотехнологии. Предложен способ нагрузки антигеном антигенпрезентирующей клетки.

Способ восстановления костных дефектов трубчатых костей критической величины // 2545993

Группа изобретений относится к медицине, а именно к ортопедии, и может быть использована для получения трансплантата для регенерации костной ткани трубчатых костей. Для этого собирают аспират костного мозга в пробирки с литий-гепарином, разбавляют фосфатно-солевым буфером, фильтруют через фильтр с размером пор 70 µм и центрифугируют 10 мин при 400 g. Полученные мезенхимные стволовые клетки (ММСК) высевают во флаконы площадью 150 см2 из расчета 1×106 клеток/см2, культивируют при температуре 37°С и 5% CO2 в воздухе, в среде ДМЕМ с содержанием глюкозы 1 г/л и менее, с 10% эмбриональной сывороткой теленка, с раствором аминокислот и антибиотиками. Среду меняют каждые 3 суток. Перед подготовкой трансплантата клетки снимают с субстрата раствором 0,05% трипсин-ЭДТА, отмывают и ресуспендируют. Суспензию клеток наносят на матрикс, инкубируют 3 часа при температуре 37°С при покачивании на орбитальном шейкере со скоростью 25 оборотов в минуту. Затем матрикс заливают средой ДМЕМ с 10% сывороткой плода коров, дексаметазоном 10-7 М, β-глицерофосфатом 10 мМ, аскорбат-2-фосфатом 0,05 мМ, 1% стрептомицином с концентрацией 100 мкг/мл или пенициллином 100 Ед/мл. Культивируют ММСК в течение 28 дней. Также предложен способ регенерации костной ткани трубчатых костей. Группа изобретений обеспечивает равномерную регенерацию костной ткани при замещении трансплантатом дефектов костной ткани критической величины. 3 н.п. ф-лы, 2 табл.,6 пр.