Способ иммунохроматографического определения специфических антител

Изобретение относится к иммунологии и медицинской диагностике и представляет собой способ иммунохроматографического определения специфических антител. В основе способа лежит контакт мембранной тест-полоски с анализируемой жидкой пробой и инициируемое этим контактом движение по мембранам тест-полоски реагентов, которые содержатся в пробе или нанесены на мембрану и в ходе взаимодействий в порах мембраны или на ее поверхности формируют иммунные комплексы. Интенсивность окраски метки, связавшейся в аналитической зоне, детектируется визуально. Отличительной особенностью предлагаемого способа определения антител является то, что в тесте используется конъюгат коллоидного золота с антигеном, а в аналитической зоне тест-полоски иммобилизуется реагент для связывания общих антител, в то время как в стандартной схеме иммунохроматографии для определения специфических антител с коллоидным золотом конъюгируется реагент для связывания антител, а в аналитической зоне тест-полоски иммобилизуется антиген. Использование предложенного способа анализа позволяет повысить чувствительность анализа и/или уменьшить расход антигена. 2 ил., 1 пр.

 

Изобретение относится к иммунологии и медицинской диагностике и представляет собой метод иммунохроматографического определения специфических антител. Наличие в сыворотке крови антител, специфичных к возбудителю определенного заболевания, является эффективным критерием, позволяющим с высокой достоверностью диагностировать соответствующее инфекционное заболевание (Rose N.R. (ed.). Manual of Clinical Laboratory Immunology (4th ed.). Washington, D.C.: American Society for Microbiology, 1992.). В случае диагностики инфекционных заболеваний преимуществами данного подхода по сравнению с непосредственным выявлением и идентификацией возбудителя является определенность при выборе тестируемой пробы (сыворотка крови, тогда как возбудитель может на данной стадии инфекции преимущественно локализоваться в самых разных органах и тканях), а также возможность быстрой детекции достаточно высокого уровня антител, индуцированного контактом с антигеном, в то время как для выявления антигена могут потребоваться довольно продолжительные стадии доращивания до достижения им регистрируемой концентрации. Хотя в настоящее время активно используются как микробиологические, так и иммунологические способы диагностики инфекционных заболеваний, для проведения массового первичного скрининга оптимально иммунологическое определение наличия в сыворотке крови специфических антител (серодиагностика), которое может быть реализовано с высокой экспрессностью и производительностью. Особенный интерес вызывают серодиагностические подходы в тех случаях, когда в силу особенностей роста микроорганизмов получение результатов микробиологического тестирования может потребовать значительного времени.

Благодаря высокой чувствительности и специфичности серологические тесты незаменимы при массовых обследованиях. Кроме того, гуморальный иммунный ответ отражает активный инфекционный процесс, и поэтому результаты иммунохимического тестирования достоверно отражают именно случаи заболевания, дискриминируя их от бактерионосительства.

Иммунохимический анализ может быть реализован в различных форматах. Однако, поскольку для массовых обследований первоочередное значение имеют скорость и производительность тестирования, в данной ситуации несомненными преимуществами обладает иммунохроматографический анализ, для которого все необходимые реагенты предварительно нанесены на мембранные компоненты тест-полоски, и ее контакт с тестируемой пробой непосредственно инициирует движение фронта жидкости по мембранам, протекание специфических реакций и формирование иммунных комплексов, которые благодаря включению в их состав окрашенного маркера могут детектироваться визуально или с помощью оптического детектора (Рис.1).

Применительно к серодиагностике (определению антител, специфичных к определенному антигену или группе антигенов) общая схема иммунохроматографии заключается в следующем.

Проба, потенциально содержащая специфические антитела, под действием капиллярных сил перемещается вдоль тест-полоски. При этом она вначале взаимодействует с окрашенными частицами (коллоидное золото или иной маркер), на поверхности которых адсорбирован компонент, предназначенный для связывания с антителами. Обычно в качестве такового компонента выбирают антивидовые антитела (иммуноглобулины, выделенные из сыворотки животного, иммунизированного препаратом иммуноглобулинов человека или другого организма, для которого проводится серодиагностика), белок А из Staphylococcus aureus или белок G из Streptococcus spp. Затем фронт жидкости преодолевает аналитическую (тестовую) зону, которая представляет собой участок мембраны с иммобилизованным антигеном (нативным или специально модифицированным для эффективной сорбции). Степень связывания маркера с иммобилизованным антигеном и, соответственно, интенсивность окрашивания мембраны определяются концентрацией специфических антител в пробе. Для проверки качества реагентов и сохранения функциональности тест-системы используется расположенная далее контрольная зона, в которой компонент, сорбированный на окрашенной частице, связывается с соответствующим иммобилизованным на мембране реагентом.

Ниже представлена информация о методике, реализуемой в тест-системе «TB-Check-I» фирмы «Vedalab» (Франция) - см. http://www.sanitamedikal.com/Assets/MD_220002_m3_TB_1408_c.pdf. Данная методика определения антител к возбудителю туберкулеза рассматривается в настоящей заявке в качестве прототипной.

Метод основан на комбинации антител к иммуноглобулинам человека, конъюгированных с хромогеном, и высокоочищенного БЦЖ-белка… При прохождении исследуемого образца через адсорбционную зону тестового устройства конъюгат, содержащий меченые антитела, связывается с IgG, образуя комплекс «антиген-антитело». Этот комплекс взаимодействует с высокоочищенным БЦЖ-белком в тестовой зоне устройства, и если концентрация специфического IgG к возбудителю туберкулеза превышает 350 Е/мл, образует окрашенную полосу. При низкой концентрации антител окрашенная полоса в тестовой зоне не образуется. Несвязавшийся конъюгат взаимодействует с реагентом в контрольной зоне тестового устройства, образуя окрашенную полосу, что указывает на правильное проведение теста… Процедура исследования: …заполнить одноразовую пипетку сывороткой или плазмой и внести 1 каплю в окно для пробы тестового устройства. Добавить в окно для пробы 5-6 полных капель разбавляющего раствора (дилюента). Через 10-15 мин произвести учет результатов.

Одной из наиболее важных задач в иммунохроматографии является повышение чувствительности анализа. Для увеличения чувствительности анализа следует использовать как можно более высокие концентрации конъюгата и рецептора в аналитической зоне. Однако увеличение концентрации коллоидного конъюгата лимитировано тем фактом, что конъюгат должен полностью продиффундировать через иммунохроматографические мембраны за время проведения анализа (~10 мин), поэтому использование конъюгатов с оптической плотностью выше 10 проблематично. Увеличение концентрации центров связывания на поверхности коллоида лимитировано низкой сорбционной емкостью наночастиц золота - обычно концентрация белка около 10 мкг/мл является насыщающей (GHITESCU, L. and M. BENDAYAN. Immunolabeling efficiency of protein A-gold complexes. J. Histochem. Cytochem., 38, 1523-1530, 1990). Сорбционная емкость рабочей мембраны иммунохроматографического теста на несколько порядков выше, чем коллоидного золота - до 15 мг/мл (http://www.millipore.com/publications.nsf/a73664f9i981af8c852569b9005b4eee/348ee7096d9 3729b85256bf40066a40d/$FILE/tb500en00.pdf), но повышение концентрации рецептора в аналитической зоне в стандартном методе иммунохроматографического анализа для серодиагностики нецелесообразно по экономическим причинам, так как рецептором обычно являются самые дорогие компоненты тест-системы: рекомбинантные белки бактерий или вирусов. Поэтому нами был предложен способ иммунохроматографического анализа, в котором молекулы антигена или антигенов сорбируются на поверхности коллоидного золота (при этом расход антигена значительно снижается: с 300-600 нг до 100 нг на тест), а в аналитической зоне тест-полоски иммобилизуется компонент для связывания антител: антивидовые антитела, белок А из Staphylococcus uureus или белок G из Streptococcus spp. Перечисленные реагенты для связывания антител широко используются в иммунохимии (в иммуноанализе, для выделения очистки антител и т.д.), поэтому существует налаженное массовое производство данных реагентов и их стоимость более чем на порядок ниже стоимости рекомбинантных антигенов, поэтому 10-кратное повышение концентрации данных реагентов не приводит к существенному повышению стоимости теста и при этом позволяет значительно повысить чувствительность анализа.

Предложенный подход был реализован заявителями для серодиагностики туберкулеза с использованием антигена 38 кДа (Ag78, antigen 5, PhoS, Rv0934) M. tuberculosis. Ниже представлено описание способа получения тест-полосок и проведения иммунохроматографического анализа, а также полученные результаты.

Пример

Для формирования тест-системы использовали набор мембран «mdi Easypack» фирмы «Advanced Microdevices» (Индия), включающий рабочую мембрану CNPC-SN12 L2-P25 (размер пор 15 мкм), мембрану под конъюгат PT-R5, мембрану для нанесения образца GFB-R4, адсорбирующую мембрану АР 045, для нанесения БСА использовалась мембрана PT-R5.

На мембраны были нанесены следующие реагенты:

1. Белок А из Staphylococcus aureus, производства ООО «Имтек» (Россия).

2. Конъюгат коллоидного золота со средним диаметром частиц 30 нм и рекомбинантного антигена 38 кДа М. tuberculosis (Rv0934), фирмы «Arista Biologicals Inc.» (США), кат. № AGMTB-0220.

3. Моноклональные антитела НТМ81 против рекомбинантного антигена 38 кДа M. tuberculosis. Центр молекулярной диагностики и терапии, Москва (Россия).

Для формирования аналитической зоны использовали белок А, контрольной зоны - моноклональные антитела НТМ81 против рекомбинантного антигена 38 кДа M. tuberculosis. На 1 см полосы наносили 2 мкл раствора белка А (10,0 мг/мл в 50 мМ фосфатном буфере, pН 7,4) и 2 мкл раствора антител (0,5 мг/мл в том же буфере). Конъюгат коллоидного золота с антигеном наносили в разведении, соответствующем D520=6,5, в объеме 10 мкл на 1 см полосы. Для нанесения реагентов использовали диспенсер «IsoFlow» фирмы «Imagene Technology» (США). После нанесения реагентов мембраны высушивали не менее 24 ч в помещении с контролируемыми температурой и влажностью. Листы мембран с нанесенными иммунореагентами нарезали на индивидуальные тест-полоски шириной 3,5 мм.

Для сравнения изготавливали тест-полоски по стандартной схеме с использованием тех же реагентов и мембран, но с коллоидным золотом. Конъюгировали белок А (10 мкг/мл, конъюгат наносили на мембрану из оптической плотности 7), а в аналитической зоне иммобилизовали рекомбинантный белок 38 кДа М. tuberculosis.

Иммунохроматографический анализ проводили при комнатной температуре. Тест-полоску погружали в пробу на 1 мин в вертикальном положении, а затем извлекали и помещали на горизонтальную поверхность. Детекцию связывания коллоидного золота осуществляли через 10 мин визуально (Рис.2).

Достигнутая при использовании предложенного способа анализа чувствительность на порядок превышает чувствительность, достигнутую при использовании стандартного способа анализа.

Рис.1. Принцип иммунохроматографического анализа для серодиагностики. 1 - мембрана, адсорбирующая образец; 2 - частицы коллоидного золота; 3 - реагент для связывания антител: антивидовые антитела, белок А, белок G или др.; 4 - пластиковая основа; 5 - рабочая мембрана; 6 - конечная адсорбирующая мембрана; 7 - антиген, иммобилизованный в аналитической зоне; 8 - антивидовые антитела, иммобилизованные в контрольной зоне.

Рис.2. Тестирование сывороток крови больных туберкулезом (3 пробы): А - стандартным методом и Б - альтернативным методом, предложенным заявителями (стрелкой указано положение аналитической зоны).

Способ иммунохроматографического определения специфических антител, отличающийся тем, что для анализа используется конъюгат коллоидного золота с антигеном, а в аналитической зоне тест-полоски иммобилизуется реагент для связывания общих антител, в качестве которого могут использоваться антивидовые антитела, белок А из Staphylococcus aureus или белок G из Streptococcus spp.



 

Похожие патенты:
Изобретение относится к области медицины и предназначено для лечения заболеваний и биологических состояний, опосредованных, по меньшей мере частично, активным галектином-3.
Изобретение относится к области медицины, в частности к офтальмологии. Изобретение представляет способ дифференциальной диагностики типов хориоидальной неоваскуляризации (ХНВ) при влажной форме возрастной макулярной дистрофии, отличающийся тем, что производят забор влаги передней камеры глаза, определяют концентрацию фактора роста эндотелия сосудов, после чего оценивают результат по уровню данных показателей.

Изобретение относится к иммунологическим методам анализа и может быть использовано для массового скрининга инфекций TORCH-группы у новорожденных, беременных женщин и женщин, планирующих беременность.
Группа изобретений относится к медицине, в частности к клинической лабораторной диагностике, иммунохимии, и касается диагностики цитомегаловирусной инфекции методом иммунного блоттинга, который является референтным, наиболее высокочувствительным, высокоспецифичным, подтверждающим (или исключающим) диагноз при подозрении на инфицирование в случае получения положительных или сомнительных (неопределенных) результатов.

Изобретение относится к области медицинской иммунологии и предназначено для определения функциональной активности компонента С3 комплемента человека по его действию на инфузории.

Изобретение относится к медицине, а именно к травматологии, и может быть использовано для прогнозирования замедленной консолидации переломов. Описано прогнозирование замедленной консолидации переломов, которое осуществляют на основании определения относительного содержания ростового фактора (TGFβ1), лимфоцитарно-тромбоцитарной адгезии (ЛТА), дезоксипиридинолина (ДПИД), регистрации показателя микроциркуляции (ПМ) конечностей пациента на 10-е сутки посттравматического периода и расчета коэффициента по предлагаемой формуле, на основании значения которого прогнозируют замедленную консолидацию переломов.

Группа изобретений относится к медицине и касается способа идентификации пациентов с инфарктом миокарда, имеющих повышенный риск развития патологического состояния сердца, включающего исследование, после инфаркта, образца биологической жидкости пациента на предмет уровней сосудистого эндотелиального фактора роста В (VEGFB), тромбоспондина-1 (THBS1) и плацентарного фактора роста (PGF).

Изобретение относится к медицине, а именно к диагностике в стоматологии, и может быть использовано для дифференциальной диагностики процессов повышенного ороговения эпителия у лиц в возрасте от 15 до 45 лет, проживающих в регионе с неблагоприятными факторами окружающей среды.
Изобретение относится к персонализированной (персонифицированной) профилактической медицине и к адаптационной физиологии и может быть использовано для прогностической диагностики дезадаптационных расстройств.

Изобретение относится к медицине, а именно к акушерству, и может быть использовано для выявления нарушений свертывающей системы крови у беременных во 2-3 триместре.

Группа изобретений относится к медицине и касается способа диагностики нарушения почек у собак, включающего стадию измерения уровня экспрессии группы биомаркеров в биологическом образце от собаки, где биомаркеры представляют собой кластерин (CLU), секретируемый связанный с frizzle белок-2 (SFRP2); матрилин-2 (Matn2); лумикан (LUM); декорин (DCN); альфа 1 (III) цепи коллаген, вариант 12 (COL3A1); ретинол-связывающий белок 4 (rbp4); ММР-9; трансферрин (TF); Аро-С-1 (АроС1); и ингибин-бета A (INHBA). Кроме того, группа изобретений относится к способу лечения, ослабления или замедления прогрессирования нарушения почек; зонду нуклеиновой кислоты, являющемуся фрагментированной кРНК и способному гибридизоваться с геном собаки; применению зонда для получения набора для применения в указанном выше способе. Группа изобретений обеспечивает диагностику нарушения почек у собак. 4 н. и 14 з.п. ф-лы, 6 пр., 5 табл.

Изобретение относится к медицине, а именно, к психиатрии, и может быть использовано для прогноза эффективности лечения больных шизофренией. Для этого у больных шизофренией перед назначением лечения проводится иммунологическое обследовании и определение биохимических показателей сыворотки крови. При одновременном содержании натуральных киллеров (CD16+) 0,22·109/Л и более, лимфоцитов с маркерами поздней активации (HLADR+) 0,56·109/Л и более и концентрации аспартатной аминотрансферазы (ACT) в сыворотке 20,76 Е/Л и менее прогнозируют высокую эффективность нейролептической терапии. Использование данного способа позволяет прогнозировать эффективность терапии до назначения активного психофармакологического лечения классическими нейролептиками и целенаправленно проводить реабилитационные психофармакологические мероприятия. 2 пр., 1 табл.

Изобретения относятся к химерным белкам, нуклеиновой кислоте, кодирующей такой белок, экспрессирующей кассете, обеспечивающей экспрессию нуклеиновой кислоты, вектора, включающего экспрессирующую кассету, способу диагностики и набора для диагностики. Охарактеризованный химерный белок боррелии включает по меньшей мере одну последовательность внеклеточного домена белка VlsE боррелии первого вида, соответствующего определенному штамму, и по меньшей мере одну последовательность области IR6 белка VlsE боррелии второго вида или боррелии первого вида, но соответствующего штамму, отличающемуся от штамма первого вида, причем боррелии выбраны из Borrelia stricto-sensu, Borrelia afzelii и Borrelia garinii. Представленные изобретения позволяют производить диагностику Лайм-боррелиоза с повышенной специфичностью и чувствительностью. 6 н. и 8 з.п. ф-лы, 8 табл., 7 пр.
Раскрыты раствор для предварительной обработки для иммуногистохимического окрашивания, который элюирует содержащую парафин заливочную среду с предметного стекла с образцом ткани, залитым в среду, и извлекает антигенность образца ткани, и который можно использовать три или более раз, и концентрат раствора для предварительной обработки для иммуногистохимического окрашивания, который обеспечивает возможность легкого получения раствора для предварительной обработки. Раствор для предварительной обработки для иммуногистохимического окрашивания содержит извлекающий антигены агент, определенные неионные поверхностно-активные вещества в заданном диапазоне и циклодекстрин или его производное в определенном количестве, причем остальную часть составляет не менее чем 80% воды. Содержание извлекающего антигены агента таково, что pH раствора для предварительной обработки находится в заданном диапазоне, и содержание циклодекстрина или его производного представляет собой заданное количество. 3 н. и 18 з.п. ф-лы, 5 табл., 11 пр.

Изобретение относится к медицине, а именно к определению воздействия метанола, поступающего из производственной среды, на иммунный статус работников, занятых в химическом производстве. Для этого производят отбор пробы венозной крови у работников, установление в ней фактического содержания метанола и лабораторных иммунологических показателей, внутриклеточных маркеров апоптоза: белка bax и белка bcl2. Причем после установления в пробе крови фактического содержания метанола производят его сравнение с величиной фоновой концентрации путем определения коэффициента, равного их соотношению: С1/С2, где С1 - фактическое содержание метанола в крови; С2 - фоновая концентрация метанола, затем рассчитывают критериальный коэффициент, равный соотношению указанных bax/bcl2, далее рассчитывают информационный индекс клеточной гибели по формуле: E ⌢ = b a x b c l 2 × C 1 C 2 . При значении указанного индекса клеточной гибели более 6, при одновременном содержании метанола в крови выше его фоновой концентрации, оценивают состояние иммунного статуса работника химического производства от воздействия метанола как иммунодефицитное. Использование данного индекса клеточной гибели позволяет определить величину эффекта неблагоприятного воздействия метанола на апоптоз как на индивидуальном, так и на популяционном уровнях, а также позволяет на ранних этапах процесса принимать решения о иммунокоррекции. 2 табл., 2 пр.
Изобретение относится к области кардиологии, в частности к прогнозированию течения хронической сердечной недостаточности. Сущность способа: у больных с хронической сердечной недостаточностью определяют в периферической крови полиморфизмы генов AGTR2: 1675 и GNB3: 825. Если выявляется сочетание полиморфизмов генов AGTR2: 1675 и GNB3: 825 в виде гетерозигот, то прогнозируется неблагоприятное течение заболевания. Изобретение направлено на повышение точности и объективности прогнозирования течения хронической сердечной недостаточности. Использование способа позволяет определить течение хронической сердечной недостаточности на ранних этапах заболевания как на госпитальном этапе, так и в амбулаторной практике. 2 табл., 2 пр.
Изобретение относится к медицине и может быть использовано для прогнозирования часто рецидивирующего течения хронического панкреатита. Определяют концентрацию цитокинов МСР-1 и G-CSF в сыворотке крови. При выявлении концентрации МСР-1 более 218 пг/мл и G-CSF более 24 пг/мл прогнозируют развитие часто рецидивирующего течения хронического панкреатита. Способ позволяет осуществить ранний точный прогноз часто рецидивирующего течения заболевания. 1 табл., 4 пр.

Группа изобретений относится к медицине, а именно диагностике глютен-чувствительной энтеропатии у генетически предрасположенных пациентов, и может быть использована для уточнения диагноза аутоиммунного заболевания. Для этого измеряют уровень связывания аутоантител в образцах сыворотки крови пациента с неизменным целиакальным эпитопом белков семейства трансглутаминаз по сравнению с уровнем связывания тестового соединения (ТС). ТС представляет собой тестовое антитело либо его фрагмент, вариант или аналог. ТС способно связываться с основным целиакальным эпитопом белков семейства трансглутаминаз. Превышение уровня связывания аутоантител в отсутствие ТС или снижение уровня связывания аутоантител на 50% в присутствие ТС указывают на индуцируемое глютеном аутоиммунное заболевание у указанного индивидуума. Группа изобретений обеспечивает корректировку диагностики индуцируемых глютеном аутоиммунных заболеваний и назначение сопутствующей диеты с устранением источников глютена. 4 н. и 4 з.п. ф-лы, 15 ил., 2 табл. 10 пр.
Изобретение относится к области медицины, а именно к фтизиатрии и гинекологии, и может быть использовано для диагностики скрытой активной формы туберкулеза женских гениталий у пациенток с трубно-перитонеальным бесплодием. Для этого у пациенток без предварительной стимуляции туберкулином проводят лапароскопию для предварительной оценки макроскопических признаков специфического поражения органов малого таза. Проводят забор перитонеальной жидкости и определяют уровень иммуноглобулина (Ig) M к микобактериям туберкулеза. При показателе оптической плотности Ig M к микобактериям туберкулеза более ≥2,7 диагностируют активную туберкулезную инфекцию, при показателе менее 2,7, но более 2,5 - туберкулезную инфекцию сомнительной активности, а ≤2,5 - отсутствие активной туберкулезной инфекции. Использование данного способа позволяет проводить раннюю постановку диагноза, своевременное назначение специфического лечения, что способствует восстановлению репродуктивной функции женщин. 2 табл., 2 пр.

Изобретение относится к медицине, а именно к онкогематологии, и может быть использовано для мониторинга эффективности противоопухолевого лечения больных В-клеточным хроническим лимфолейкозом. Для этого в периферической крови определяют содержания B-клеток, позитивных по антигену CD20 после курса лечения. При этом дополнительно определяют среднюю интенсивность флюоресценции антигена CD20 на B-лимфоцитах, а также содержание B-клеток, позитивных по антигену CD25. При выявлении значений CD20-позитивных B-клеток от 0 до 20%, CD25-позитивных B-клеток от 0 до 20%, средней интенсивности флюоресценции антигена CD20 от 150 у.е. и более определяют лечение как эффективное. При значениях CD20 позитивных B-клеток более 20%, CD25-позитивных B-клеток более 20%, средней интенсивности флюоресценции антигена CD20 менее 150 у.е. лечение считают неэффективным. Использование данного способа позволяет сделать заключение об эффективности проводимых режимов терапии заболевания на более ранних сроках, еще до клинических проявлений, что дает возможность клиницисту своевременно скорректировать тактику лечебных мероприятий, сократит частоту возможных осложнений терапии (миелотоксичности и иммуносупрессии) при применении новых препаратов. 3 пр., 6 ил.

Изобретение относится к иммунологии и медицинской диагностике и представляет собой способ иммунохроматографического определения специфических антител. В основе способа лежит контакт мембранной тест-полоски с анализируемой жидкой пробой и инициируемое этим контактом движение по мембранам тест-полоски реагентов, которые содержатся в пробе или нанесены на мембрану и в ходе взаимодействий в порах мембраны или на ее поверхности формируют иммунные комплексы. Интенсивность окраски метки, связавшейся в аналитической зоне, детектируется визуально. Отличительной особенностью предлагаемого способа определения антител является то, что в тесте используется конъюгат коллоидного золота с антигеном, а в аналитической зоне тест-полоски иммобилизуется реагент для связывания общих антител, в то время как в стандартной схеме иммунохроматографии для определения специфических антител с коллоидным золотом конъюгируется реагент для связывания антител, а в аналитической зоне тест-полоски иммобилизуется антиген. Использование предложенного способа анализа позволяет повысить чувствительность анализа иили уменьшить расход антигена. 2 ил., 1 пр.

Наверх