Способ повышения проницаемости мембраны эритроцитов для депонирования ими лекарственных веществ


 


Владельцы патента RU 2545992:

Федеральное государственное бюджетное учреждение "Нижегородский научно-исследовательский институт травматологии и ортопедии" Министерства здравоохранения Российской Федерации (RU)

Изобретение относится к медицине, в частности к гематологии, и описывает способ повышения проницаемости мембраны клеток крови для депонирования ими лекарственных средств, включающий добавление к клеточной массе, полученной путем центрифугирования крови, лекарственных препаратов и последующее проведение фотогемотерапии, причем в качестве «контейнеров» для лекарственного вещества используют отмытые в физиологическом растворе эритроциты, выделенные из клеточной массы после удаления тромбоцитарно-лейкоцитарной пленки, образовавшейся в процессе центрифугирования, помещают их в среду с лекарственным веществом и воздействуют на эритроциты ультрафиолетовым облучением (УФО) с длиной волны 360 нм и общей дозой облучения 0,72 Дж/см2. Способ повышает точность и информативность исследования. 3 табл., 1 пр.

 

Предлагаемое изобретение относится к медицине, в частности к гематологии.

В качестве прототипа выбран способ повышения проницаемости мембраны клеток крови для депонирования ими лекарственных веществ, заключающийся в центрифугировании крови для выделения клеточной массы, добавлении к ней антибиотика и последующей инкубации клеток крови с антибиотиком при температуре 37°C при одновременном облучением ее гелий-неоновым лазером с длиной волны 633 нм в течение 15-20 минут (см. Абу Идда А.Ш., Горелов С.В., Коган О.Ф. Роль экстракорпоральной антибиотикотерапии в комплексном лечении больных с гнойно-воспалительными заболеваниями почек // Клиническая эфферентология - 2005. - №4. - efferens.dsmu.edu.ua/index.shtml).

Однако известный способ не позволяет определить, какие конкретно клетки (эритроциты, лейкоциты или тромбоциты) «захватывают» лекарственное вещество. Кроме того, в способе оценивается результат «захвата» клеткой лекарственного вещества только по клинической картине.

Задача предлагаемого изобретения - усовершенствование способа.

Технический результат - повышение точности и информативности исследования.

Поставленный технический результат достигается за счет того, что в способе, включающем добавление к клеточной массе, полученной путем центрифугирования крови, лекарственных препаратов и последующее проведение фотогемотерапии, в качестве «контейнеров» для лекарственного вещества используют отмытые в физиологическом растворе эритроциты, выделенные из клеточной массы после удаления тромбоцитарно-лейкоцитарной пленки, помещают в среду с лекарственным веществом, воздействуют на эритроциты ультрафиолетовым облучением (УФО) с длиной волны 360 нм и общей дозой облучения 0,72 Дж/см2.

Способ повышения проницаемости мембраны эритроцитов для депонирования ими лекарственных средств осуществляют следующим образом. Для выделения клеточной массы центрифугируют кровь в течение 20 минут при 3000 об/мин. Удаляют плазму и тромбоцитарно-лейкоцитарную пленку. Отмывают эритроциты в физиологическом растворе, удаляют надосадочную жидкость и используют эритроциты в качестве «контейнеров». Для этого добавляют к суспензии эритроцитов лекарственное вещество. Смесь подвергают воздействию фотогемотерапии, а именно ультрафиолетовому облучению (УФО) с длиной волны 360 нм в течение часа (общая доза облучения 0,72 Дж/см2).

Пример

В качестве лекарственного препарата был использован гепарин.

Для выделения клеточной массы центрифугировали кровь в течение 20 минут при 3000 об/мин. Удаляли плазму, которую затем использовали для определения скорости ее свертывания тромбином (тромбиновое время), затем удаляли тромбоцитарно-лейкоцитарную пленку. Отмывали эритроциты один раз в физиологическом растворе. Удаляли надосадочную жидкость и разливали оставшуюся суспензию эритроцитов по 0,5 мл в три пробирки. Затем в первую пробирку добавляли 1 мл физиологического раствора. Во вторую и третью - 1 мл гепарина, разведенного в физиологическом растворе (4000 ME гепарина и 1,5 мл физиологического раствора). Содержимое третьей пробирки подвергали воздействию фотогемотерапии, а именно ультрафиолетовому облучению (УФО) с длиной волны 360 нм в течение часа. Первую и вторую пробирки в это время инкубировали при комнатной температуре. По истечении часа суспензию эритроцитов во всех пробирках отмывали физиологическим раствором 3 раза для удаления внеклеточного гепарина. Для высвобождения депонированного эритроцитами гепарина путем гемолиза эритроцитов к отмытым эритроцитам добавляли по 1 мл дистиллированной воды. Затем 0,1 мл полученного гемолизата смешивали с 0,1 мл аутоплазмы плазмы, 0,1 мл полученной смеси помещали в кювету гемокоагулографа, инкубировали 1 минуту при 37°C, после чего добавляли 0,1 мл тромбина. По времени свертывания плазмы определяли наличие или отсутствие гепарина в гемолизате и судили о «захвате» эритроцитами лекарственного вещества.

Все исследования проведены на крови 15 здоровых доноров.

Полученные результаты представлены в таблице 1.

Таблица 1
Влияние УФО на депонирование эритроцитами гепарина
1-я пробирка (эритроциты + физиологический раствор) контроль 2-я пробирка (эритроциты + гепарин, разведенный физиологическим раствором) 3-я пробирка (эритроциты + гепарин, разведенный физиологическим раствором + УФО)
8.0±0.16 8.1±0.27* (р<0.05) 11.3±0.43* (р≤0.001)
* - р<0,05, сравнение с контролем, критерий Вилкоксона

Полученные данные свидетельствовали о том, что время свертывания плазмы в первой (отсутствие гепарина в суспензии эритроцитов) и во второй пробирке (наличие гепарина в суспензии эритроцитов) практически одинаковое. Из этого следует, что инкубация суспензии эритроцитов с гепарином при комнатной температуре не сопровождалась увеличением проницаемости мембран эритроцитов, и гепарин не попадал внутрь эритроцитов. В третьей пробирке воздействие ультрафиолетового облучения приводило с высокой достоверностью к увеличению времени свертывания аутоплазмы (р<0,001) и, следовательно, увеличивало проницаемость мембран и способность эритроцитов «захватывать» гепарин. Эритроциты при этом не изменяли ни свои реологические свойства, ни свою морфологию.

Для доказательства этого положения проведены следующие исследования. Деформируемость эритроцитов определяли в ригидометре собственной конструкции. (А.с. №1363065 Россия, МКИ J01N 33/14. Устройство для деформации эритроцитов в сдвиговом потоке / Левин Г.Я., Яхно В.Г., Царевский Н.Н., Котяева Н.П.; опубл. 30.12.1987, бюл. №48 (заявка №3954988/28-14 от 16.09.1085). Оценка деформируемости эритроцитов осуществлялась по соотношению деформируемых (вытянутых) и недеформируемых эритроцитов в микроскопе. Было установлено, что деформируемость эритроцитов в пробах, которые в течение 1 часа обрабатывались УФО, снижалась очень незначительно (табл.2). Морфологию эритроцитов изучали в световом микроскопе Primo Star Carl Zeiss (Германия). Определяли количество дискоцитов, эхиноцитов и стоматоцитов. Было установлено, что морфологические свойства эритроцитов практически не изменялись (табл.2). Наблюдалось небольшое увеличение количества эхиноцитов, которые, как известно, являются обратимой формой и могут при определенных условиях свободно трансформироваться обратно в дискоциты.

Таблица 2
Влияние УФО на деформируемость и морфологию эритроцитов
Деформируемость эритроцитов (%) Морфология эритроцитов (%)
дискоциты эхиноциты стоматоциты
1-я проба (контроль) Эритроциты + физиологический раствор 83,00±4,74 88,15±5,56 11,15±5,09 0,76±0,83
2-я проба Эритроциты + гепарин 81,6±4,89 87,90±4,93 10,36±5,26 0,82±0,87
3-я проба Эритроциты + физиологический раствор + УФО 79,92±4,05* 84,77±5,23* 13,54±5,08* 0,92±0,95
* - р<0,05, сравнение с контролем, критерий Вилкоксона

Агрегацию и дезагрегацию эритроцитов исследовали на приборе собственной конструкции, в котором использован принцип, предложенный Н. Schmid-Schonbain et. al. (Пат. 2278381 РФ, Устройство для исследования агрегации тромбоцитов [Текст] / Левин Г.Я., Модин А.П., Кудрицкий С.Ю., Соснина Л.Н. (РФ). - №2005100408/14; заявл. 11.01.05; опубл. 20.06.06, Бюл. №17). Процесс агрегации и дезагрегации эритроцитов регистрировали на самописце (по изменению оптической плотности) после гидродинамического перемешивания суспензии клеток и остановки вращения. По полученной агрегатограмме рассчитывали максимальную амплитуду МА (показатель степени агрегации), а также степень дезагрегации - при скоростях сдвига 10 с-1 (D10), 15 с-1 (D15), 20 с-1 (D20). Было показано, что после воздействия УФО агрегационная способность эритроцитов и их дезагрегация при различных скоростях сдвига не менялась (табл.3).

Таблица 3
Влияние УФО на агрегацию эритроцитов
Степень агрегации (мм) Дезагрегация эритроцитов
Скорость сдвига D10 (%) Скорость сдвига D15 (%) Скорость сдвига D20 (%)
1-я проба (контроль) Эритроциты + физиологический раствор 103,90±6,82 32,90±14,78 62,10±15,74 75,10±13,22
2-я проба Эритроциты + гепарин 103,80±10,59 35,20±19,42 59,30±14,74 70,20±12,42
3-я проба Эритроциты + физиологический раствор + УФО 104,40±10,89 41,90±18,68 55,70±20,19 69,70±13,89
* - р<0,05, сравнение с контролем, критерий Вилкоксона

Предложенный способ повышения проницаемости мембран эритроцитов для депонирования ими лекарственных веществ является точным и объективным, так как позволяет определить, что именно эритроциты «захватывают» препарат. Важным достоинством способа является его малоинвазивностью для эритроцитов.

Способ повышения проницаемости мембраны клеток крови для депонирования ими лекарственных средств, включающий добавление к клеточной массе, полученной путем центрифугирования крови, лекарственных препаратов и последующее проведение фотогемотерапии, отличающийся тем, что в качестве «контейнеров» для лекарственного вещества используют отмытые в физиологическом растворе эритроциты, выделенные из клеточной массы после удаления тромбоцитарно-лейкоцитарной пленки, образовавшейся в процессе центрифугирования, помещают их в среду с лекарственным веществом и воздействуют на эритроциты ультрафиолетовым облучением (УФО) с длиной волны 360 нм и общей дозой облучения 0,72 Дж/см2.



 

Похожие патенты:
Изобретение относится к области медицины, а именно к исследованиям нейтрофилов крови при действии факторов различной природы, и может быть использовано для оценки влияния света, генерируемого светодиодными источниками освещения, на клеточные факторы врожденного иммунитета.

Изобретение относится к области медицины и может быть использовано в медицинской диагностике и терапии. Способ определения физико-биологических параметров кожи и концентраций производных гемоглобина в крови путем посылки на кожу поляризованного оптического излучения с известным спектром, регистрации сигналов диффузно-отраженного кожей света с поляризацией, ортогональной поляризации посылаемого на кожу излучения.

Изобретение относится к медицине и может быть применено в практическом здравоохранении для повышения точности диагностики и снижения риска тромботических, геморрагических и тромбоэмболических осложнений.
Изобретение относится к медицине, а именно к акушерству и гинекологии, и позволяет осуществить прогнозирование преэклампсии у беременных с плацентарной недостаточностью.

Группа изобретений относится к медицине, а именно к лабораторной диагностике, и может быть использована для тестирования функции тромбоцитов. Для этого предоставляют возможность антикоагулированной крови проходить через капилляр, имеющий склеивающую тромбоциты поверхность, и наблюдают или измеряют поведение крови в капилляре для оценки функции тромбоцитов.

Изобретение относится к области медицины, а именно к клинической лабораторной диагностике, и описывает способ оценки функционального состояния лимфоцита человека.

Изобретение относится к медицине, а именно к лабораторной диагностике, и может быть использовано для in vitro оценки прогнозирования иммунного ответа пациента на действие внешних факторов.

Изобретение относится к области лабораторной диагностики и может быть использовано в клинической практике для оценки эффективности антибактериальной терапии у больных с бактериальной инфекцией, в том числе с бактериальным сепсисом.

Изобретение относится к области медицины, а именно к медицинской диагностике и описывает способ прогнозирования эффективности химиотерапии у больных со злокачественными новообразованиями эпителиальных тканей с помощью исследования свойств биологических жидкостей химическими и физическими методами.

Изобретение относится к области медицины. Изобретение представляет кристалломорфологический способ диагностики опухолевого заболевания почек, включающий отбор у пациента мочи, введение в пробу мочи кристаллообразующего вещества, в качестве которого используют спиртовой раствор нингидрина с добавлением тинктуры спиртовой вытяжки из растения, борщевика Сосновского с примесью трутовика гапалопилуса в соотношении 3:1, с последующим высушиванием смеси методом испарения, получение изображения, визуальное определение морфологии кристаллов, выделение фрактальных объектов и расчет по ним среднего фрактального масштаба F, и при значении фрактального масштаба в интервале F = 4,0 - 5,9 диагностируют доброкачественную опухоль, а в интервале F = более 6,0 диагностируют злокачественную опухоль.
Изобретение относится к медицине, а именно к гепатологии, и может быть использовано для определения прогноза эффективности комбинированной противовирусной терапии (ПВТ) хронического вирусного гепатита С (ХГС). Для этого с использованием регрессионного анализа вычисляли значение коэффициента прогнозирования вида вирусологического ответа (КУВО). КУВО=-3,581+эозиноф. *0,073- моноциты *0,012+лимфоциты *0,0772- билирубин *0,098+АЛТ*0,7357+глюкоза *0,1049, где эозиноф. - относительное (%) количество эозинофилов в периферической крови; моноциты - относительное (%) количество моноцитов в периферической крови; лимфоциты - относительное (%) количество лимфоцитов в периферической крови; билирубин - количество билирубина свободного в венозной крови, мкмоль/л; АЛТ - количество аланинаминотрансферазы в венозной крови, в единицах на литр; глюкоза - количество глюкозы в венозной крови, ммоль/л. При значении КУВО 319 и менее прогнозируют отсутствие устойчивого вирусологического ответа. При значении КУВО более 319 прогнозируют формирование устойчивого вирусологического ответа в результате лечения противовирусными препаратами. Использование данного способа позволяет прогнозировать результат противовирусного лечения путем персонифицированного подхода и проводить индивидуализацию выбора схемы терапии. 2 пр.
Изобретение относится к медицине и представляет собой способ прогнозирования развития полипозного риносинусита у больных бронхиальной астмой, который осуществляется путем определения в крови пациентов показателей эндотоксикоза: лейкоцитов, молекул средней массы, креатинина, мочевины и скорости оседания эритроцитов; прогноз осуществляют с помощью дискриминантного уравнения: D=6,900×лейкоциты(×10^9/л)+2,640×скорость оседания эритроцитов (мм/ч)+17,819×молекулы средней массы (ед. оп. пл.)+1,127×креатинин (мкмоль/л)+24,801×мочевина(ммоль/л), где D - дискриминантная функция с граничным значением, равным - 223,12; при D, равном или большим граничного значения, прогнозируют развитие полипозного риносинусита у больных бронхиальной астмой, а при D меньше граничного значения прогнозируют отсутствие полипозного риносинусита у больных бронхиальной астмой. Техническим результатом заявленного изобретения является обеспечение прогнозирования полипозного риносинусита у больных с бронхиальной астмой с повышенной точностью. 2 пр.
Изобретение относится к медицине, а именно к способу оценки устойчивости мембран эритроцитов к ишемии. Сущность способа состоит в том, что определяют: СОЭ, фибриноген, общий билирубин, простациклин, агрегацию эритроцитов, вязкость крови в сосудах микроциркуляции, мочевину, адгезию тромбоцитов, плазминоген и нитриты. Используя полученные данные, оценку устойчивости мембраны эритроцитов проводят по коэффициенту (Кум). При величине Kум меньше или равной -0,1 мембрану эритроцитов оценивают неустойчивой к ишемии, а при величине Кум больше или равной 0,0 - устойчивой. Использование заявленного способа позволяет быстро, точно и объективно оценить индивидуальную устойчивость эритроцитов к ишемии. 2 пр.
Изобретение относится к клинической иммунологии и может быть использовано для экспресс-определения атерогенности иммунных комплексов (ИК) сыворотки крови человека. Сущность изобретения состоит в том, что в предлагаемом способе преципитат ИК из сыворотки крови человека готовят путем обработки буфером, содержащим 10% раствор полиэтиленгликоля с молекулярной массой 3350 (ПЭГ-3350), в соотношении 1:3,5, инкубируют в течение 10 мин при комнатной температуре. Агрегаты ИК осаждают центрифугированием, растворяют в буфере без ПЭГ-3350, определяют содержание холестерина в иммунных комплексах (ХИК) и степень связывания комплемента (ССК) морской свинки преципитированными иммунными комплексами. Рассчитывают атерогенность ИК как отношение ССК к ХИК и при величине менее 4 ЕД констатируют повышенную атерогенность крови. ! табл.
Изобретение относится к клинической иммунологии и может быть использовано для определения атерогенности иммунных комплексов, содержащих множественно модифицированные липопротеины низкой плотности (ИК-ммЛПНП). Для этого преципитат ИК-ммЛПНП из сыворотки крови человека готовят путем обработки буфером, содержащим 10%-ный раствор полиэтиленгликоля с молекулярной массой 3350 (ПЭГ-3350), в соотношении 1:2,5, инкубируют в течение 10 мин при комнатной температуре. Агрегаты ИК-ммЛПНП осаждают центрифугированием, растворяют в буфере без ПЭГ-3350, определяют содержание холестерина в иммунных комплексах (ХИК) и степень связывания комплемента (ССК) морской свинки преципитированными иммунными комплексами. Рассчитывают атерогенность ИК-ммЛПНП как отношение ССК к ХИК. При величине менее 24 ЕД констатируют повышенную атерогенность крови из-за сниженной комплементактивирующей функции IgG в ИК-ммЛПНП. Использование данного способа позволяет проводить оценку атерогенности ИК-ммЛПНП, диагностировать атеросклероз на доклинической стадии, а также прогнозировать как течение атеросклеротического процесса у индивидуумов, так и эффективность проводимой терапии. 1 табл.

Изобретение относится к медицине и предназначено для прогнозирования умеренного и выраженного гемолиза у больных ишемической болезнью сердца после операции коронарного шунтирования. Проводят оценку состояния здоровья пациента до операции, причем, учитывают наличие/отсутствие заболеваний легких и почек, С-антигена системы Резус на эритроцитах, гиперфибриногенемию величиной более 4 г/л и содержание эритроцитов в крови в количестве 4,81×1012/л и менее, и рассчитывают гемолитический риск перфузии (ГРП) по формуле ГРП=(6,38×Хлег+8,93×ХГФб+3,32×ХЭр)-(4,10×Хпоч+2,95×ХС), где 6,38; 8,93; 3,32; 4,10; 2,95 - числовые значения являются коэффициентами; Хлег - наличие (1)/отсутствие (0) болезней легких; ХГФб - наличие (1)/отсутствие (0) гиперфибриногенемии до операции; ХЭр - наличие (1)/отсутствие (0) концентрации эритроцитов в крови до операции 4,81x1012/л и менее; Хпоч - наличие (1)/отсутствие (0) болезней почек; ХС - наличие (1)/отсутствие (0) на эритроцитах С-антигена системы Резус; и при значении ГРП>6,1 прогнозируется развитие выраженного гемолиза после операции, при ГРП<6,1 - развитие умеренного гемолиза. Способ позволяет повысить точность, информативность и доступность прогнозирования гемолиза. 2 пр., 1ил., 3 табл.

Изобретение относится к области медицины, а именно к неонатологии, реаниматологии и респираторной терапии, и описывает способ прогнозирования эффективности неинвазивной вентиляции легких у недоношенных новорожденных. Способ включает анализ клинико-функциональных показателей здоровья ребенка, а именно параметров вентиляции: фракционной концентрации кислорода во вдыхаемой смеси, среднего давления в дыхательных путях, парциального давления кислорода в артериальной постдуктальной крови, и расчет индекса оксигенации. При значении индекса оксигенации, равного или меньше 3,5, прогнозируют эффективность проводимой неинвазивной вентиляции легких, а при значении индекса оксигенации больше 3,5 - неэффективность. Способ позволяет прогнозировать успешность проведения различных методов неинвазивной вентиляции легких у недоношенных новорожденных с очень низкой и экстремально низкой массой тела при рождении с диагнозом респираторный дистресс-синдром. 2 пр.

Изобретение относится к области медицины, а именно к неонатологии, реаниматологии и респираторной терапии, и описывает способ прогнозирования эффективности неинвазивной вентиляции легких у недоношенных новорожденных. Способ включает анализ клинико-функциональных показателей здоровья ребенка, а именно параметров вентиляции: фракционной концентрации кислорода во вдыхаемой смеси, среднего давления в дыхательных путях, парциального давления кислорода в артериальной постдуктальной крови, и расчет индекса оксигенации. При значении индекса оксигенации, равного или меньше 3,5, прогнозируют эффективность проводимой неинвазивной вентиляции легких, а при значении индекса оксигенации больше 3,5 - неэффективность. Способ позволяет прогнозировать успешность проведения различных методов неинвазивной вентиляции легких у недоношенных новорожденных с очень низкой и экстремально низкой массой тела при рождении с диагнозом респираторный дистресс-синдром. 2 пр.

Изобретение относится к медицине, а именно к кардиологии, гериатрии, и может быть использовано для прогнозирования течения системной воспалительной реакции (СВР) у пациентов с острым инфарктом миокарда (ОИМ). Для этого определяют содержание лейкоцитов в крови, определяют величины индекса сдвига лейкоцитов крови (ИСЛК), индекса соотношения нейтрофилов и лимфоцитов (ИСНЛ), лейкоцитарного индекса интоксикации (ЛИИ). При их значениях: ИСЛК >4, ИСНЛ >5, ЛИИ >4 и выявлении мутации гена TNFα G-308A прогнозируют увеличение интенсивности системной воспалительной реакции у данной категории больных. Использование данного способа позволяет прогнозировать степень выраженности системной воспалительной реакции у гериатрических больных с ОИМ, проводить первичную профилактику у лиц с выявленным полиморфизмом TNFα G-308A и отягощенным семейным анамнезом по ИБС, а также вторичную профилактику осложнений ОИМ. 3 пр.

Изобретение относится к лабораторной диагностике, а именно к способу сохранения белка мочи, взятой для диагностики инфекционной геморрагической лихорадки с почечным синдромом (ГЛПС) методом ПЦР. Cущность способа состоит в том, что осуществляют взятие мочи у пациента в острый период болезни, выделяют белок, который осаждают методом высаливания сернокислым аммонием с последующим его высушиванием и сохранением при температуре 20-24°С. Диагностику с помощью метода ПЦР проводят после удаления соли методом диализа проточной водой в течение 24-48 часов массы, полученной смешиванием 3-5 г сухого белка и 8-12 мл дистиллированной воды. Использование заявленного способа позволяет осуществить диагностику ГЛПС через многие годы с использованием сохраненного в сухом виде белка мочи. 1 ил., 1 пр.
Наверх