Способ восстановления костных дефектов трубчатых костей критической величины

Группа изобретений относится к медицине, а именно к ортопедии, и может быть использована для получения трансплантата для регенерации костной ткани трубчатых костей. Для этого собирают аспират костного мозга в пробирки с литий-гепарином, разбавляют фосфатно-солевым буфером, фильтруют через фильтр с размером пор 70 µм и центрифугируют 10 мин при 400 g. Полученные мезенхимные стволовые клетки (ММСК) высевают во флаконы площадью 150 см² из расчета 1×10⁶ клеток/см², культивируют при температуре 37°С и 5% CO₂ в воздухе, в среде ДМЕМ с содержанием глюкозы 1 г/л и менее, с 10% эмбриональной сывороткой теленка, с раствором аминокислот и антибиотиками. Среду меняют каждые 3 суток. Перед подготовкой трансплантата клетки снимают с субстрата раствором 0,05% трипсин-ЭДТА, отмывают и ресуспендируют. Суспензию клеток наносят на матрикс, инкубируют 3 часа при температуре 37°С при покачивании на орбитальном шейкере со скоростью 25 оборотов в минуту. Затем матрикс заливают средой ДМЕМ с 10% сывороткой плода коров, дексаметазоном 10^-7 М, β-глицерофосфатом 10 мМ, аскорбат-2-фосфатом 0,05 мМ, 1% стрептомицином с концентрацией 100 мкг/мл или пенициллином 100 Ед/мл. Культивируют ММСК в течение 28 дней. Также предложен способ регенерации костной ткани трубчатых костей. Группа изобретений обеспечивает равномерную регенерацию костной ткани при замещении трансплантатом дефектов костной ткани критической величины. 3 н.п. ф-лы, 2 табл.,6 пр.

 

Область техники, к которой относится изобретение

Изобретение относится к области биомедицины, в частности к созданию in vitro специального биологического эквивалента костной ткани, на основе стволовых клеток взрослого организма, и способа восстановления дефектов длинных трубчатых костей при его имплантации, и может найти применение в ортопедии для восстановления целостности трубчатой кости при критически обширном дефекте костной ткани.

Уровень техники.

Одними из наиболее перспективных развивающихся направлений современной биомедицины является использование клеточных технологий и тканевой инженерии для разработки методов регенерации различных тканей. Основой такого успешного развития данных направлений стали успехи клеточной биологии, а именно выделение и характеристика стволовых клеток, которые обладают большим потенциалом к репарации различных органов и тканей.

Стволовые клетки во взрослом организме обычно находятся в состоянии покоя, активизируясь в случае необходимости восстановления клеточного состава ткани и органа, например, при повреждении или физиологической регенерации. Считается, что для выполнения своей биологической роли стволовые клетки обладают уникальной способностью к самообновлению и дифференцировке в различные клеточные типы. На сегодняшний день выделены и охарактеризованы практически все виды стволовых клеток из различных тканей организма человека: мезенхимные, эпидермальные, нейральные, мышечные стволовые клетки и другие. Благодаря своей способности к дифференцировке в различные клеточные линии и репарации тканевых дефектов использование стволовых клеток в методах клеточной терапии и тканевой инженерии стало наиболее развивающимся и перспективным направлением регенеративной медицины.

Среди многочисленных случаев восстановления целостности костной ткани существуют значительные трудности в восстановлении обширных дефектов критической величины таких, где самостоятельное (спонтанное) восстановление костной ткани невозможно. Такие дефекты могут появиться в результате обширных травм, переломов, оперативных вмешательств при реконструкции костной ткани после удаления имплантов или крупных опухолей, кроме того, восстановление больших участков костной ткани необходимо для удлинения ног в эстетической хирургии.

Первым подходом к восстановлению таких дефектов было использование аутологичной (собственной) костной ткани. На сегодняшний день данный метод является одним из самых распространенных способов. Аутологичный материал содержит белки и остеогенные клетки, способные стимулировать рост новообразованной костной ткани. Использование аутотрансплантатов ограничено небольшим количеством забираемого материала, невозможностью проводить лечение обширных дефектов у детей, пожилых людей, а также у людей с врожденными заболеваниями и имеющих метастазирующие опухоли. Помимо перечисленных недостатков, существенным ограничением данного метода является сам процесс получения материала. Забор ткани представляет собой отдельную операцию, после которой пациенты могут испытывать болезненные ощущения в донорской области и другие послеоперационные осложнения.

В качестве альтернативы аутологичному материалу для замещения костных дефектов стали использовать аллогенные (взятые у донора) трансплантаты. В настоящее время аллогенная костная ткань хранится в различных банках мира, что делает ее доступной в необходимом для каждого случая количестве. Кроме того, такой трансплантат может иметь различную форму и отличаться по минеральной плотности, поэтому можно подобрать материал для каждого конкретного клинического случая. Недостатками аллогенной костной ткани является хрупкость заготавливаемого материала и его чувствительность к инфекциям (Pelker R.R., Friedlaender G.E., Markham Т.С. Biomechanical properties of bone allografts // Clin Orthop Relat Res. 1983. №(174). P.54-57).

В настоящее время наиболее широкое распространение получили пористые матриксы, натуральной (коралл, деминерализованный костный матрикс (ДКМ)) или синтетической природы (биокерамика, стеклокерамика и другие).

Эти материалы обладают такими важными свойствами для матрикса, как остеокондуктивность (способность обеспечивать структурную поддержку костной ткани) и остеоинуктивность (способность активировать рост костной ткани), но у них отсутствует ключевая характеристика - остеогенность (способность трансплантата вызывать рост костной ткани за счет собственных остеогенных клеток). Для обеспечения трансплантатов остеогенными свойствами, исследователи обратили свое внимание на стволовые клетки, в частности мультипотентые мезенхимные стволовые клетки (ММСК), выделенные из костного мозга и других тканей (подкожно-жировая клетчатка, плацента). Отрабатываются подходы использования как цельного костного мозга, так и ММСК различных тканей.

Мультипотентные мезенхимные стволовые клетки характеризуются относительной простотой выделения, высокой способностью к пролиферации in vitro в течение достаточно длительного времени, с сохранением способности к дифференцировке в различные клеточные типы. Впервые ММСК были выделены из костного мозга отечественным ученым. А.Я. Фриденштейн и сотрудники его лаборатории показали, что костный мозг содержит особую популяцию клеток, не являющихся стволовыми клетками крови (Fridenshtein A.J., Deriglazova U.F., Kulagina N.N. et al. Precursors for fibroblasts in different populations of hematopoietic cells as detected by the in vitro colony assay method. // Exp. Hematol. 1974. Vol.2. P.83-92). Они не только выделили эти клетки, но и охарактеризовали их. В дальнейшем, ММСК были выделены из различных тканей - подкожно-жировой клетчатки, тимуса, плаценты, мышечной ткани и др., и охарактеризованы.

Помимо широких потенций к дифференцировке, ММСК обладают особыми иммунологическими свойствами, поэтому данный клеточный материал активно используется учеными для разработки способов восстановления целостности и функциональной активности различных тканей. Способность ММСК к направленной эффективной дифференцировке в клетки остеогенного ряда определили этот материал как наиболее перспективный и эффективный для использования с целью восстановления костной ткани.

Для заполнения дефектов критической величины используются матриксы достаточного большого размера и объема, поэтому важным этапом создания эффективного костного трансплантата in vitro, является получение равномерно заселенной стволовыми клетками конструкции. Существующие методы создания биологических эквивалентов костной ткани позволяют получить матриксы с неравномерным заполнением клеточным материалом, для изготовления которого используется большое число клеток, что значительно повышает себестоимость технологии и препятствует ее широкому внедрению в клиническую практику. Кроме того, при таких способах восстановления ткани наблюдается длительное (неэффективное) заживление костных дефектов, с образованием соединительной ткани (рубца) или незрелой грубоволокнистой костной ткани. Поэтому создание современного эквивалента костной ткани для максимально быстрого и эффективного заживления костных дефектов критической величины подразумевает разработку метода, который позволит использовать минимальное число клеток, равномерно заселенных в объемный пористый матрикс, с их последующей обработкой средой для дифференцировки.

Известен способ восстановления костных дефектов с помощью аутологичного костного мозга или рекомбинантного остеогенного белка человека, загруженных в гидроксиапатиный носитель (den Boer FC, Wippermann BW, Blokhuis TJ et al. Healing of segmental bone defects with granular porous hydroxyapatite augmented with recombinant human osteogenic protein-1 or autologous bone marrow // J Orthop Res. 2003. Vol.21(3) P:521-8).

Такие конструкции помещали в 3-см дефект левой большеберцовой кости овец и фиксировали с помощью интрамедуллярного гвоздя. Через 12 недель после имплантации было показано, что в области дефекта формировалась соединительная ткань и грубоволокнистая костная ткань.

Недостатком этого способа является то, что для создания костных трансплантатов необходимо большое количество рекомбинантного белка, что значительно повышает себестоимость метода. Кроме того, ограничения в использовании данного подхода связаны с трудностями манипуляции данным веществом.

Кроме того, в результате, формируется не пластинчатая кость характерная для трубчатых костей, а грубоволокнистая, незрелая костная ткань наравне с соединительной тканью, которые не обеспечивают достаточной механической прочности.

Известен способ применения мезенхимных стволовых клеток пуповинной крови собак для восстановления 1,5 см дефекта лучевой кости собак (порода - бигль) (Jang BJ, Byeon YE, Lim JH et al. Implantation of canine umbilical cord blood-derived mesenchymal stem cells mixed with beta-tricalcium phosphate enhances osteogenesis in bone defect model dogs // J Vet Sci. 2008.Vol.9(4). P:387-93). Через 12 недель после имплантации было показано, что в группе, где для создания импланта использовали мезенхимные стволовые клетки пуповинной крови, восстановление костной ткани происходило интенсивнее, по сравнению с контролем, где стволовые клетки не использовались. Костные импланты изготавливались путем смешивания мезенхимных стволовых клеток (число которых составило 1×10⁶) с бета-трикальцийфосафтными гранулами, после чего происходила имплантация материала в 1,5 см дефект костной ткани. Для фиксации импланта, его окружали композитной мембраной и фиксировали пластиной с винтами.

Минусом данного подхода являются ограничения, связанные с использованием аутологичного материала для восстановления костной ткани. То есть при клиническом использовании данного подхода, костные импланты будут иметь в основном аллогенную природу. Кроме того, анализ радиографии (рентген) показал, что полное соединение кости с имплантом обнаруживалось только у 3-х из 6-ти собак к 12-ти неделям наблюдения. Гистоморфометрический анализ выявил, что формирование новой кости составило 4.08±2.08% в контрольной группе и 10.92±2.74% в группе, где дефект заполнялся костными имплантами на основе мезенхимных стволовых клеток пуповинной крови. Таким образом, данный метод характеризуется низкой эффективностью и длительным периодом образования костной ткани.

Известен способ восстановления костных дефектов у мышей с помощью применения стволовых клеток из стромы жировой ткани человека (Choi HJ, Kirn JM, Kwon E et.al. Establishment of efficacy and safety assessment of human adipose tissue-derived mesenchymal stem cells (hATMSCs) in a nude rat femoral segmental defect model // J Korean Med Sci. 2011. Vol.26(4). P:482-91). В сформированный дефект, размером 5 мм, помещали матрикс, заполненный мезенхимными стволовыми клетками жировой ткани человека в разной концентрации (7.5×10⁵, 7.5×10⁶, 7.5×10⁷ клеток). Матриксы насыщали клетками с помощью вакуума, помещали их в инкубатор на 3 часа, для того, чтобы клетки прикрепились к поверхности матрикса, и на следующий день проводили операции. В качестве контроля в область дефекта помещали пустой матрикс или оставляли дефект пустым. Результаты данного исследования показали, что через 16 недель после имплантации, в опытных группах наблюдалось значительно формирование новообразованной костной ткани, по сравнению с контрольной группой животных. Кроме того, степень образования костной ткани была прямо пропорциональна числу клеток, заселенных в пористый матрикс.

Недостатком данного метода является длительное время заживления дефекта, а также его высокая себестоимость.

Известен способ применения мезенхимных стволовых клеток костного мозга, заселенных в пористый матрикс (коралл) без последующей дифференцировки клеток, для восстановления 2,5 см дефекта плюсневой кости овец (Petite H, Viateau V, Bensaïd W et al. Tissue-engineered bone regeneration // Nat Biotechnol. 2000. Vol.18(9). P:959-63). В данном случае пористый имплант помещали в клеточную суспензию (32,5×10⁶ клеток) на два часа, затем добавляли культуральную среду и оставляли в инкубаторе на ночь. При применении данного метода получения костного импланта наблюдалось неравномерное заселение матрикса клетками, с большей концентрацией их по периферии. Заживление дефекта наблюдалось через 16 недель.

Недостатком данного метода является применение большого числа клеток, и неравномерное распределение внутри матрикса и достаточно долгое время заживление дефекта.

Известен способ восстановления 2,1 см дефекта бедренной кости собак, с помощью полого пористого матрикса, заселенного аллогенными мезенхимными стволовыми клетками костного мозга (Arinzeh TL, Peter SJ, Archambault MP et al. Allogeneic mesenchymal stem cells regenerate bone in a critical-sized canine segmental defect // J Bone Joint Surg Am. 2003. Vol.85-A(10). P:1927-35). В качестве контроля использовались матриксы, не заселенные клеточным материалом, и пустые дефекты. Для заселения матриксов клетками использовали метод вакуумной загрузки клеточного материала. С этой целью пустой матрикс помещали в шприц, с помощью которого набирали культуральную среду с клеточным материалом. На один матрикс наслаивали 37,5 млн клеток. Через 16 недель на месте дефекта наблюдалось формирование костной ткани. Процент образования костной ткани был выше в имплантах, содержащих клеточный материал, по сравнению с имплантированными пустыми матриксами. Тем не менее, содержание небиодеградировавшей керамики было сравнительно одинаковым в трех группах и составляло около 35%.

Недостатком данного метода является то, что для формирования костной ткани требуется большое число клеточного материала, кроме того, не весь матрикс замещается костной тканью, и через 16 недель он детектируется в достаточно большом количестве.

Известен способ использования мезенхимных стволовых клеток костного мозга, заселенных на коралловые матриксы для восстановления 2,5 см дефектов плюсневой кости овец. Клетки после культивирования в остеогенной среде (18×10⁶) наносили за день до имплантации непосредственно на матрикс, обернутый с трех сторон фольгой. Кроме того, в эксперименте использовали костные трансплантаты, которые были подготовлены таким же образом, но после нанесения клеток, импланты снова выдерживали в культуральной среде с индукторами остеогенной дифференцировки в течение двух недель. Через 16 недель после операции было показано, что при имплантации костных имплантов, созданных с применением первой методики, на месте дефекта формировалась соединительная ткань, которая характерна для образующегося рубца на месте повреждения. Образование костной ткани на месте таких дефектов было минимальным. При использовании имплантов с двухнедельным этапом культивирования, на месте дефекта наблюдалось формирование грубоволокнистой, то есть незрелой, костной ткани. Этими же авторами было показано, что при нанесении клеток на коралловый матрикс, обработанный гидроксиапатитом, сформированный дефект через 4 месяца заполнялся костной тканью, но только у пяти овец из семи (BensaTd W, Oudina К, Viateau V et al. De novo reconstruction of functional bone by tissue engineering in the metatarsal sheep model // Tissue Eng. 2005. Vol.11(5-6). P:814-24).

Недостатком этого метода является большое число клеток, необходимое для создания костного импланта, его высокая себестоимость, а также низкая эффективность созданных имплантов для восстановления дефекта костной ткани.

Из патента RU 2386453 известен биотрансплантат на основе пенокерамических носителей системы оксид циркония - оксид алюминия и мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток костного мозга человека для восстановления дефектов костной ткани. Для изготовления этого биотрансплантата используют в качестве носителя образцы из биокерамики в виде трехмерных блоков размером 0,5×0,5×0,2 см с диаметром пор от 50 до 100 нм. При изготовлении биотрансплантата проводят термообработку порошков системы оксид алюминия - оксид циркония в температурном интервале (100-1000)°С.

При получении биотрансплантата на основе пенокерамических носителей полученный аспират костного мозга наслаивают на разделяющий градиент раствора фикола и центрифугируют при 1300 об/мин в течение 20 мин при +4°С, полученное таким образом интерфазное кольцо с ядросодержащими клетками отбирают и центрифугируют при 1100 об/мин в течение 10 мин при +4°С, при этом супернатант удаляют, а клеточный осадок суспендируют в культуральной среде (DMEM/F12 1:1, с добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки или аутологичной сыворотки, 2 mM L-глутамина и 0,5 мг/мл амикацина, суспензию клеток рассевают на пластиковые чашки Петри в концентрации 10⁴ клеток на 1 мл и инкубируют при стандартных условиях, затем неприкрепленные клетки удаляют, а прикрепившиеся клетки промывают культуральной средой и инкубируют до достижения 75-85% конфлюентности, в дальнейшем смену среды проводят каждые 2-3 суток в зависимости от ростовых характеристик культуры, при этом культивирование проводят до 3-4 пассажа до получения необходимого количества клеточной массы, при этом пенокерамические носители подвергают стерилизации методом облучения в дозе 2,5 Мрад, затем носители промывают физиологическим раствором и высушивают в потоке воздуха, подготовленные образцы носителя вместе с полученной клеточной суспензией с концентрацией клеток от 1 до 2 млн в 1 мл среды наносят на образцы из расчета 100 мкл суспензии на 100 мг образца.

Недостатком этого трансплантата является неравномерность распределения клеток по его поверхности и в глубине, недостаточная прикрепленность клеток к субстрату. Вследствие этого регенерация костной ткани может происходить неравномерно, сроки замещения костных дефектов могут быть слишком длительными, кроме того, возможен риск вторичных переломов, в том числе и в отдаленном периоде. Кроме того, биотрансплантат, полученный этим способом, может быть неэффективен при замещении дефектов кости значительной протяженности.

Автором разработаны способы получения трансплантатов для замещения костных дефектов критической величины, позволяющие устранить недостатки, присущие трансплантатам, полученным с помощью ранее известных способов.

Соблюдение всей последовательности действий по способам получения трансплантатов, предложенных автором, соблюдение всех разработанных условий при получении трансплантатов позволяет обеспечить равномерность распределения клеток в трансплантате, их хорошую прикрепленность к субстрату, позволяет обеспечить равномерность регенерации костной ткани, сокращение сроков замещения костных дефектов, в том числе костных дефектов, имеющих значительный объем, значительную протяженность. Способ замещения костных дефектов критической величины с помощью трансплантатов, полученных предлагаемыми способами, позволит свести к минимуму риск вторичных переломов в отдаленном периоде.

Раскрытие изобретения

Задача, на решение которой направлено заявленное изобретение, заключается в создании специального биологического эквивалента костной ткани на основе стволовых клеток взрослого организма, и способа восстановлении дефектов длинных трубчатых костей при его имплантации.

Техническим результатом изобретения является эффективное и быстрое восстановление костной ткани трубчатых костей, которое достигается благодаря оптимальному подбору способа загрузки клеточного материала внутрь носителя и последующей обработке данной конструкции, что приводит к уменьшению количества используемой популяции соматических клеток, высокой скорости репарации дефекта, низкой себестоимости метода и простоте его воспроизведения. В результате дефектная область заполняется вновь образованной зрелой пластинчатой костной тканью, что подтверждается данными морфологического и гистологического анализа.

Согласно данному изобретению, было обнаружено, что мультипотентные мезенхимные стволовые клетки (ММСК) обладают выраженными потенциями к репарации костной ткани. При имплантации в область дефекта импланта, созданного специальным образом с применением ММСК, происходит зарастание дефекта кости новообразованной пластинчатой костной тканью, при этом эффективность восстановления зависит от происхождения клеточного материала (ауто- или аллогенные ММСК). Следовательно, целью данного изобретения, являлась разработка способа восстановления костной ткани трубчатых костей для его дальнейшего применения в ортопедии при лечении дефектов костной ткани критической величины, отличающегося тем, что в качестве клеточного материала использовались аутологичные мультипотентные мезенхимные стволовые клетки костного мозга, заселенные на носитель методом наслоения с последующим вращением при скорости 25 об./мин и дальнейшей обработкой средой с индукторами остеогенной дифференцировки, для достижения максимально эффективной репарации костной ткани.

Теоретический результат изобретения достигается за счет того, что используемые мультипотентные мезенхимные стволовые клетки (ММСК) выделяются из костного мозга. Известно, что для восстановления костной ткани ММСК, выделенные из костного мозга, являются наиболее перспективным материалом по сравнению с ММСК, выделенными из других источников, например жировой ткани (Savchenkova I.P., Rostovskaya M.S., Chupikova N.I. et al. Osteogenic Differentiation of Multipotent Mesenchymal Stromal Cells Isolated from Human Bone Marrow and Subcutaneous Adipose Tissue // Cell and Tissue Biology. 2008. Vol.2(6). P:566-571.) Данные клетки имеют в культуре уникальные характеристики: способны к пролиферации в течение длительного времени и, при индукции к дифференцировке, формируют клетки тканей мезенхимного происхождения.

Выделенные и культивированные ММСК вводят в носитель и подвергают обработке средой с индукторами остеогенной дифференцировки.

Теоретическим основанием для использования нового метода нанесения клеток и их последующей обработки является то, что с помощью существующих методов нанесения клеток на матрикс (вакуум, наслоение) клетки распределяются не равномерно внутри матрикса, а по градиенту нанесения раствора с клетками. Последующая дифференцировка клеток в остеогенном направлении способствует формированию биологического эквивалента костной ткани, тем самым активизируя процессы остеогенеза как внутри импланта, так и способствует активации роста новообразованной костной ткани из опилов кости.

Носитель с загруженными в него клетками трансплантируется непосредственно в область дефекта кости.

Осуществление изобретения

Оценка эффективности способа регенерации костной ткани критической величины была проведена в рамках предклинического испытания. Исследование проводилось поэтапно и включало стадии выделения мультипотентных мезенхимных стволовых клеток (ММСК) из костного мозга овец и человека и культивирования их in vitro до наращивания необходимой клеточной массы; подготовку различных комбинаций трансплантата; дифференцировку клеток в остеогенном направлении; моделирования дефекта костной ткани критической величины у мелких сельскохозяйственных животных (овцы); введения в область дефекта подготовленных трансплантатов; морфологического и гистологического анализа костных композитов исследуемых трубчатых костей.

Данное изобретение иллюстрируется следующими примерами, которые не должны рассматриваться как ограничение объема данного изобретения.

Пример 1. Выделение и культивирование мультипотентных мезенхимных стволовых клеток (ММСК) из костного мозга овцы.

Аспират костного мозга получали от половозрелых баранов романовской породы методом пунктирования гребня подвздошной кости. Полученные пробы костного мозга собирали в пробирки с литий-гепарином, затем разбавляли ФСБ. После фильтрования через 70 µм фильтр клетки центрифугировали при 400 g в течение 10 мин для получения осадка. Основной средой для культивирования была среда ДМЕМ, дополненная 10% СПК, однократным раствором заменимых аминокислот и антибиотиками пенициллин и стрептомицин, в конечной концентрации 100 Ед/мл и 100 мкг/мл соответственно.

Полученную клеточную суспензию высевали во флаконы площадью 150 см² из расчета 1×10⁶ клеток/см². Доля прикрепившихся клеток составляла приблизительно 1-1,5%. Культивировали мезенхимные стволовые клетки в среде ДМЕМ с низким содержанием глюкозы, дополненной 10% эмбриональной сыворотки теленка, однократным раствором заменимых аминокислот и антибиотиками (100 ед/мл пеницилина, 100 мкг/мл стрептомицина) при 37°С и 5% CO₂ в воздухе. Среду меняли каждые 3 суток и по достижении конфлуэнтного монослоя осуществляли субкультивирование: клетки снимали с субстрата раствором 0,05% трипсин-ЭДТА и высевали на культуральные флаконы из расчета 1×10 клеток/см² в ростовой среде. Непосредственно перед процедурой подготовки трансплантата клетки снимали с субстрата, отмывали средой ДМЕМ, ресуспендировали в небольшом количестве физиологического раствора и подсчитывали в камере Горяева. Результаты иммунофенотипирования показали, что популяция полученных клеток соответствует по экспрессии поверхностных антигенов мезенхимным стволовым клеткам. Митотический индекс и время цитогенерации составили 60‰ и 38-42 час соответственно.

Пример 2. Выделение и культивирование мультипотентных мезенхимных стволовых клеток (ММСК) из костного мозга человека

ММСК выделяли из костного мозга человека, полученного во время проведения плановой операции с информированного согласия пациента. Аспират помещали в одноразовые стерильные пробирки с напылением LiHe и разбавляли физиологическим раствором, забуференным фосфатами (ФСБ), без ионов Са2+ и Mg2+, содержащим антибиотик/антимикотик (100 ед./мл пенициллина, 100 мкг/мл стрептомицина, 0.25 мкг/мл амфотерицина В). Полученную из аспирата суспензию клеток центрифугировали в градиенте плотности фиколла в течение 30 мин, затем полученную фракцию клеток последовательно промывали ФБС с антибиотиком/антимикотиком и проводили лизирование в специальном буфере. Выделенную популяцию клеток переносили в культуральный матрас из расчета 1 млн клеток на 1 см². Основной средой для культивирования клеток была среда ДМЕМ с низким (1 г/л и менее) содержанием глюкозы, дополненная СПК (10%), стократным раствором заменимых аминокислот, и антибиотиками пенициллин и стрептомицин. Конечная концентрация стрептомицина составляла 100 мкг/мл, а пенициллина - 100 Ед/мл. Периодическое культивирование осуществляли по мере формирования полного монослоя, снятие клеток с субстрата проводили, используя 0,05%-ный раствор трипсина-ЭДТА в течение 5-6 мин.

Количество полученных клеток оценивали подсчетом в камере Горяева, после чего клетки сеяли во флаконы площадью 150 см² из расчета 1×10⁶ клеток/см².

Непосредственно перед процедурой подготовки трансплантата клетки снимали с субстрата, отмывали средой ДМЕМ, ресуспендировали в небольшом количестве физиологического раствора и подсчитывали в камере Горяева. Результаты иммунофенотипирования показали, что популяция полученных клеток соответствует по экспрессии поверхностных антигенов мезенхимным стволовым клеткам. Митотический индекс и время цитогенерации составили 31‰ и 56-60 час соответственно.

Пример 3. Получение трансплантатов

Суспензию клеток медленно наносили на матрикс, инкубировали 3 часа при температуре 37°С при покачивании на орбитальном шейкере со скоростью 25 об/мин После этого матрикс заливали рабочей средой, а через сутки меняли среду на остеогенную. Средой для дифференцировки в клетки остеогенного ряда была ДМЕМ, дополненная СПК (10%), дексаметазоном (10^-7 М), β-глицерофосфатом (10 мМ), аскорбат-2-фосфатом (0,05 мМ) и 1% антибиотиком (конечная концентрация стрептомицина - 100 мкг/мл, а пенициллина - 100 Ед/мл). Каждые 3-й сутки среду меняли на свежую, культивирование проводили в течение 28 дней.

В эксперименте использовали различные варианты трансплантатов с целью изучения влияния различных факторов на процессы регенерации костной ткани.

1. Пустой матрикс без клеточного материала.

2. ММСК костного мозга человека, заселенные в пористый матрикс.

3. ММСК костного мозга овцы, заселенные в пористый матрикс.

Пример 4. Моделирование дефекта костной ткани трубчатой кости критической величины у овец

Хирургическое вмешательство проводилось под общей анестезией с применением правил асептики и антисептики в стерильной операционной. Перед проведением операций животных выдерживали 12 часов на голодной диете. В качестве наркотического вещества применялся 5%-ный раствор тиопентал (пентотал) - натрия из расчета 15 мг/кг массы животного. Животное фиксировалось на специальном столике. Место оперативного вмешательства - правая большеберцовая кость.

Доступ. Выбривали участок большеберцовой кости. Операционное поле обрабатывали спиртовым раствором йода 3%. Проводили рассечение кожи с медиальной стороны средней трети большеберцовой кости. Также рассекали подкожную фасцию и межфасциальную жировую ткань. Рассекали надкостницу, обнажая участок кости.

Моделирование дефекта. На поверхности кости отмерялся участок размером в 2,5 см, по краям выпиливался пилой с возвратно-поступательным движением полотна, с помощью физиологического раствора происходило охлаждение костной ткани.

Пример 5. Введение трансплантатов в сформированный дефект

Из прооперированных животных было сформировано 3 опытные группы по 7 животных в каждой (таблица 1).

Группа №1 являлась контрольной, заживление дефекта проводилось без применения ММСК, в область дефекта имплантировался пустой матрикс. Группы №2 и 3 являлись опытными, в область дефекта помещали трансплантаты, созданные на основе синтетического матрикса и ММСК, выделенных из костного мозга овцы (Группа №2) или человека (Группа №3).

Техника введения трансплантатов. После помещения трансплантатов в сформированные дефекты, на кость накладывали металлическую пластину, которую фиксировали 8-ю винтами.

Таблица 1
Способы восстановления дефекта костной ткани большеберцовой кости у овец
№ группы	Количество животных(овцы, половозрелые самцы)	Состав трансплантата
1	7	Пористый матрикс
2	7	Пористый матрикс+ММСК овцы
3	7	Пористый матрикс+ММСК человека

Затем рана закрывалась в обратном порядке. Накладывали кожные швы шелком №4. Швы обрабатывали Террамицином-спреем. Швы снимали на 10-е сутки после проведения операции. Все операции (21 шт) были проведены успешно, без осложнений.

Пример 6. Морфологический и гистологический анализ костных композитов исследуемых костей.

Для изучения в динамике процесса регенерации костной ткани в зависимости от состава трансплантата забой животных (по одному животному из каждой группы) производили через 3 и 6 месяцев после операции. Изолировали костный композит большеберцовой кости и проводили визуальный и гистологический анализ (Таблица 2).

Таблица 2
Влияние состава трансплантата на регенерацию костной ткани
№ группы	Состав трансплантата	Степень регенерации (костная ткань/матрикс)
3 месяца после операции	6 месяцев после операции
1	Пустой матрикс	+/+++	++/++
2	Матрикс +ММСК овцы	+++/-	++++/-
3	Матрикс +ММСК человека	++/-	+++/-

Наиболее эффективным оказался трансплантат, состоящий из матрикса, заселенного ММСК овцы. Введение в костный дефект мультипотентных мезенхимных стромальных клеток костного мозга способствовало ускорению резорбции синтетического гидроксиапатита, активизировало процессы остеогенеза, ремоделирования и созревания новообразованной кости. Наиболее активно эти процессы происходили при использовании ММСК костного мозга овцы, то есть аутологичного материала. Через 6 месяцев дефект полностью восстанавливался.

Таким образом, использование заявленного изобретения позволяет улучшить восстановление функций костей при обширных повреждениях костной ткани за счет увеличения скорости регенерации костной ткани, малоинвазивным, легко воспроизводимым и недорогим способом.

1. Способ получения трансплантата для регенерации костной ткани трубчатых костей, заключающийся в том, что берут аспират костного мозга, полученные пробы костного мозга собирают в пробирки с литий-гепарином, затем разбавляют фосфатно-солевым буфером, фильтруют через фильтр с размером пор 70 µм, центрифугируют клетки при 400 g в течение 10 мин для получения осадка, полученную клеточную суспензию высевают во флаконы площадью 150 см² из расчета 1×10⁶ клеток/см², культивируют мезенхимные стволовые клетки в среде ДМЕМ с низким содержанием глюкозы, дополненной 10% эмбриональной сыворотки теленка, раствором заменимых аминокислот и антибиотиками, культивирование проводят при температуре 37°С и 5% CO₂ в воздухе, меняют среду каждые 3 суток, по достижении конфлуэнтного монослоя клетки снимают с субстрата раствором 0,05% трипсин-ЭДТА и высевают на культуральные флаконы из расчета 1×10⁶ клеток/см² в ростовой среде, непосредственно перед процедурой подготовки трансплантата клетки снимают с субстрата, отмывают средой ДМЕМ, ресуспендируют в физиологическом растворе, далее суспензию клеток медленно наносят на матрикс, инкубируют 3 часа при температуре 37°С при покачивании на орбитальном шейкере со скоростью 25 оборотов в минуту, после этого матрикс заливают средой ДМЕМ, дополненной СПК (сывороткой плода коров) 10%, дексаметазоном 10^-7 М, β-глицерофосфатом 10 мМ, аскорбат -2-фосфатом 0,05 мМ, 1% антибиотика - стрептомицина с концентрацией 100 мкг/мл или пенициллина 100 Ед/мл, каждые третьи сутки среду меняют на свежую, культивирование проводят в течение 28 дней.

2. Способ получения трансплантата для регенерации костной ткани трубчатых костей, заключающийся в том, что берут аспират костного мозга, помещают в стерильные пробирки, разбавляют физиологическим раствором с фосфатно-солевым буфером, содержащим антибиотик и/или антимикотик, полученную из аспирата суспензию клеток центрифугируют в градиенте плотности фиколла в течение 30 мин, затем полученную фракцию клеток промывают фосфатно-солевым буфером с антибиотиком и/или антимикотиком, выделенную популяцию клеток переносят в среду для культивирования из расчета 1 млн клеток на 1 см², при этом средой для культивирования является ДМЕМ с содержанием глюкозы 1 г/л и менее, дополненная 10% СПК (сывороткой плода коров), раствором заменимых аминокислот, антибиотиками - стрептомицином 100 мкг/мл, пенициллином 100 Ед/мл, культивирование осуществляют до формирования полного монослоя, снимают клетки с субстрата, используя 0,05% раствор трипсина - ЭДТА в течение 5-6 мин, непосредственно перед процедурой подготовки трансплантата клетки снимают с субстрата, отмывают средой ДМЕМ, ресуспендируют в физиологическом растворе, далее суспензию клеток медленно наносят на матрикс, инкубируют 3 часа при температуре 37°С при покачивании на орбитальном шейкере со скоростью 25 оборотов в минуту, после этого матрикс заливают средой ДМЕМ, дополненной СПК (сывороткой плода коров) 10%, дексаметазоном 10^-7 М, β-глицерофосфатом 10 мМ, аскорбат-2-фосфатом 0,05 мМ, 1% антибиотика - стрептомицина с концентрацией 100 мкг/мл или пенициллина 100 Ед/мл, каждые третьи сутки среду меняют на свежую, культивирование проводят в течение 28 дней.

3. Способ регенерации костной ткани трубчатых костей, включающий помещение в дефект трубчатой кости трансплантата, отличающийся тем, что помещают в дефект трансплантат, полученный способом по п.1 или способом по п.2.