Композиции и способы воздействия на насыщение, липидный метаболизм и потребление жира

Группа изобретений основана на применении в составе композиций, комбинаций и устройств для диагностики состояний, связанных с фенотипом, включающим уменьшение жира в организме и триглицеридов в плазме и увеличение насыщения двух или более химически синтезированных или химически модифицированных полинуклеотидов, которые специфически гибридизуются с двумя или более полинуклеотидными мишенями, которые дифференцированно экспрессируются у животных, проявляющих фенотип, включающий уменьшение жира в организме и триглицеридов в плазме и увеличение насыщения, в результате продолжительного регулярного приема вещества, которое воздействует на один или более параметр из поглощения пищи, насыщения, липидного метаболизма и утилизации жира, где полинуклеотидные мишени содержат ген, выбранный из генов, кодирующих белки FAS, вистафин и GPR119. Группа изобретений позволяет идентифицировать новые соединения, воздействующие на один или более из этих параметров и для модуляции связанного с ними фенотипа животного. 3 н. и 14 з.п. ф-лы, 2 табл., 2 пр.

 

Область техники, к которой относится изобретение

Изобретение относится, в основном, к генам, которые дифференцированно экспрессируются у животных, и особенно к генам, которые дифференцированно экспрессируются у животных, получающих на регулярной долговременной основе амиды жирных кислот, которые воздействуют на один или более параметр из поглощения пищи, насыщения, липидного метаболизма и потребления жира, и к применению дифференцированно экспрессируемых генов для идентификации новых соединений, которые воздействуют на один или более из этих параметров и для модуляции связанного с ними фенотипа животного.

Уровень техники

Избыток жира и ожирение признаны мировой проблемой здоровья среди людей. По оценке Всемирной организации здравоохранения имеется более одного миллиарда взрослых с избыточным весом, причем до одной трети из них классифицируются как страдающие ожирением. Дополнительно, ожирение также признано возрастающей проблемой среди животных, особенно среди домашних животных, таких как собаки и кошки. Согласно данным Центра по контролю за болезнями (CDC), ожирение тесно связано по меньшей мере с риском других проблем здоровья, включая гипертензию, дислипидемию, диабет типа II, заболевания сердца, инсульт, синдром апноэ и некоторые вида рака, например, рак груди, эндометрия и рак ободочной кишки. Индивидуальные факторы риска возникновения ожирения включают генетические, эмоциональные/стрессовые факторы, переедание и сидячий образ жизни.

Борьба с ожирением началась по меньшей мере два десятилетия назад вместе с увеличением публичного распространения информации относительно риска, связанного с избыточным весом. Были введены и заново введены рекомендации относительно питания, которые широко распространялись и даже включались в школьную программу. Тем не менее, количество тучных и людей с избыточным весом по-прежнему возрастает. В дополнение к здоровой диете и более частым физическим упражнениям теперь часто прописывают лекарства для потери веса. Эти лекарства действуют на разных уровнях, включая имитацию заполнения желудка, снижение аппетита или ограничение поглощения жиров. Однако такие лекарства оказываются неудовлетворительными при долговременном употреблении частично из-за снижающейся со временем эффективности, а также из-за нежелательных побочных эффектов. По меньшей мере по этим причинам одобрение пациентом лекарств против ожирения может быть менее чем удовлетворительным. Ясно, что в данной области техники имеется потребность в обнаружении и создании новых лекарственных средств или пищевых добавок для борьбы с ожирением.

Амиды жирных кислот (РАЕ) или N-ацилэтаноламиды структурно родственны липидам, содержащим звено жирной кислоты, связанное с этаноламином. РАЕ представляют собой семейство природных липидов, которые обнаруживаются в тканях растений и животных, и оказывают действие на здоровье, например, при регуляции энергетического баланса, в контроле поглощения пищи и также обладают противовоспалительными свойствами. РАЕ также часто образуются in vivo из N-ацетилированных производных фосфатидилэтаноламина. Наиболее распространенными РАЕ, обнаруженными в биологических тканях, таких как мозг и нейроны, являются анандамин (N-арахидоноилэтаноламин) и N-олеоилэтаноламид (ОЕА). ОЕА также обнаруживается в небольших количествах в пище и, в основном, получается в результате эндогенного синтеза (Di Marzo V, 1999, Life Sci. 65:645-55).

Описано, что у грызунов внутрибрюшинное введение ОЕА индуцирует чувство насыщения и периферическую утилизацию липидного субстрата, приводя таким образом к уменьшению накопления жира в организме (Thabuis С, et al, 2007, Lipid Technology 19:225-7). Исследования in vitro и в модели на животных с нокаутом выявили некоторые механизмы действия, такие как передача сигнала PPAR-α (Fu J, et al, 2003, Nature 425:90-3), РАТ/СD36-зависимое поглощение липидов в проксимальном отделе кишечника (Yang Y, et al, 2007, Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. 292:R235-41), избирательная активация нейронов (Ahem GP, 2003, J Biol Chem. 278:30429-34) и передача сигнала грелина (Cani PD, et al, 2004, Br J Nutr. 92:757-61). Проксимальный отдел кишечника представляется органом-мишенью для контроля насыщения (Thabuis С, et al, supra). Показано, что ОЕА регулирует поглощение пищи у мышей дикого типа, но не у мышей PPAR α (-/-). Недавно показано, что ОЕА может также связываться с каннабиноидным рецептором GPR119, сопряженным с G-белком (Overtoil НА, et al, 2006, Cell Metab. 3:167-75). При внутрибрюшном введении ОЕА уменьшает поглощение пищи путем воздействия на несколько параметров: уменьшение объема принимаемой пищи, задержку первого приема пищи и увеличение интервалов между приемами пищи (Oveisi F, et al, 2004, Pharmacol Res. 49:461-6). Воздействия орального введения ОЕА также исследовались через 24 часа после введения путем принудительного кормления и показано, что оно значительно снижает поглощение пищи в течение первых 12 часов (Id.), Однако вышеописанные исследования проводились только в течение коротких периодов времени (от 6 часов до 11 дней в случае внутрибрюшного введения, в течение 24 часов в случае орального введения) и продолжительные воздействия на насыщение или другие параметры, относящиеся к накоплению жира в организме, таким образом не были показаны.

В связи с данными задачами имеющихся на настоящий момент способов борьбы с ожирением, есть постоянная потребность в новых способах и композициях, полезных для скрининга веществ с целью определения возможности их применения для развития фенотипа без признаков ожирения у животного, и применения таких веществ для модуляции количества жировой ткани у животного.

Раскрытие изобретения

Таким образом, объектом настоящего изобретения является предоставление одного или более гена или сегмента генов, которые дифференцированно экспрессируются у животных, проявляющих фенотип, включающий уменьшение жира в организме и триглицеридов в плазме и увеличение насыщения, измеряемое по уменьшению поглощения пищи (фенотип RBF/IS), в результате продолжительного регулярного приема вещества, которое воздействует на один или более параметр из поглощения пищи, насыщения, липидного метаболизма и утилизации жира.

Другим объектом изобретения является предоставление комбинации, включающей множество полинуклеотидов, которые дифференцирование экспрессируются у животных с фенотипом, включающим фенотип RBF/IS, возникшим в результате продолжительного регулярного приема вещества, которое воздействует на один или более параметр из поглощения пищи, насыщения, липидного метаболизма и утилизации жира.

Дополнительным объектом изобретения является предоставление композиций из одной или более полинуклеотидной или полипептидной пробы, подходящих для детектирования экспрессии генов, которые дифференцированно экспрессируются у животных с фенотипом RBF/IS, возникшим в результате продолжительного регулярного приема вещества, которое воздействует на один или более параметр из поглощения пищи, насыщения, липидного метаболизма и утилизации жира, и приспособления, например, матрицы на подложке, содержащей пробы.

Дополнительным объектом изобретения является предоставление способов детектирования дифференцированной экспрессии одного или более гена, который дифференцирование экспрессируется у животных с фенотипом RBF/IS, возникшим в результате продолжительного регулярного приема вещества, которое воздействует на один или более параметр из поглощения пищи, насыщения, липидного метаболизма и утилизации жира, по сравнению с нормальными животными или животными, не подвергавшимися вмешательству.

Другим объектом изобретения является предоставление способа измерения эффекта тестируемого вещества на профиль экспрессии одного или более гена, дифференцированно экспрессируемого у животных с фенотипом RBF/IS, возникшим в результате продолжительного регулярного приема вещества, которое воздействует на один или более параметр из поглощения пищи, насыщения, липидного метаболизма и утилизации жира, по сравнению с нормальными животными или животными, не подвергавшимися вмешательству.

Дополнительным объектом изобретения является предоставление способа, способствующего развитию фенотипа RBF/IS у животных.

Один или более из этих объектов осуществляется с применением новой комбинации полинуклеотидов или полипептидов, представляющих гены и сегменты генов, которые дифференцированно экспрессируются у животных с фенотипов RBF/IS, возникшим в результате регулярного приема вещества, которое воздействует на один или более параметр из поглощения пищи, насыщения, липидного метаболизма и утилизации жира. Полинуклеотиды применяются для получения композиций, проб, приспособлений, основанных на пробах, и способов определения статуса полинуклеотидов, дифференцированно экспрессируемых у животных с фенотипом RBF/IS, по сравнению с нормальными животными или животными, не подвергавшимися вмешательству, которые применимы для выполнения вышеуказанных задач, например, прогнозирования и диагностики состояний, связанных с этим фенотипом, и для скрининга веществ с целью определения, пригодны ли они для развития этого фенотипа. Такие вещества после их идентификации могут применяться для развития этого фенотипа. Различные наборы, включающие комбинации проб, приспособлений, применяющих пробы, и веществ, также предоставлены, как и различные компьютерные программы для обработки информации и средства распространения информации относительно дифференцированно экспрессируемых генов и способов их применения.

Другие и дополнительные объекты, свойства и преимущества изобретения будут легко понятны специалисту в данной области техники.

Осуществление изобретения

Определения

Все процентные величины, приведенные здесь, представляют собой весовые проценты на основе сухого веса композиции, если не указано другое. Специалист в данной области техники поймет, что термин «на базе сухого веса» означает, что концентрации ингредиентов в композиции измеряются после удаления всякой свободной влаги из композиции.

Интервалы величин применяются здесь для краткости во избежание перечисления и описания всех и каждого значения внутри интервала. Каждое соответствующее значение внутри интервала может быть выбрано при необходимости, такое как высшее значение, низшее значение или конец интервала.

Дозы, представленные здесь, выражены в миллиграммах или граммах на килограмм веса тела (мг/кг или г/кг), если не указано другое.

Как применяется здесь, форма единственного числа слов включает множественное число и наоборот, если из контекста с очевидностью не проистекает обратное. Например, ссылки на «животное», «способ» или «вещество» включают формы множественного числа, такие как «животные», «способы» и «вещества». Сходным образом, слова «включают», «включает» и «включающий» следует понимать включительно, а не исключительно.

Термин «животное» означает человека или других животных, включая птиц, коров, собак, лошадей, кошек, hircine, мышей и крыс, овец и свиней, у которых есть жировая ткань. Когда термин применяют в контексте сравнения тестируемых субъектов, животные, которых сравнивают, являются животными одного вида и возможно, одной и той же расы или породы. «Домашнее животное» представляет собой любое одомашненное животное и включает, не ограничиваясь этим, кошек, собак, кроликов, морских свинок, хорьков, хомяков, мышей, песчанок, лошадей, коров, коз, овец, ослов, свиней и т.п. Предпочтительно, животное представляет собой человека или домашнее животное-компаньона, такого как собака или кошка.

Термин «антитело» означает любой иммуноглобулин, который связывается со специфическим антигеном, включая антитела IgG, IgM, IgA, IgD и IgE. Термин включает поликлональные, моноклональные, моновалентные, гуманизированные антитела, гетероконъюгаты, композиции антител с полиэпитопной специфичностью, химерные, биспецифичные антитела, диатела, одноцепочечные антитела и фрагменты антител, например, Fab, Fab', F(ab')2 и Fv или другие антиген-связывающие фрагменты.

Термин «матрица» означает упорядоченное расположение по меньшей мере двух проб на подложке. По меньшей мере одна из проб представляет собой контроль или стандарт и по меньшей мере одна из проб представляет собой диагностическую пробу. Расположение от примерно двух до примерно 40000 проб на подложке обеспечивает индивидуальное распознавание размера и интенсивности сигнала каждого меченого комплекса, образованного между пробой и полинуклеотидом или полипептидом образца.

Термин «связанный комплекс» относится к комплексу, образованному в результате специфичного связывания полипептида образца (как определено здесь) с партнером по связыванию, таким как антитело или его функциональный фрагмент.

Как применяется здесь, «пищевая добавка» представляет собой продукт, предназначенный для приема в дополнение к нормальной диете животного. Пищевые добавки могут быть в любой форме, например в твердой, в пакетике, в виде геля, таблеток, капсул, порошков и т.п. Предпочтительно, их предоставляют в соответствующих лекарственных формах. В отдельных осуществлениях их предоставляют в больших потребительских упаковках, таких как упаковки порошка или жидкости. В других осуществлениях добавки предоставлены в больших (неупакованных) количествах для включения в другие пищевые продукты, такие как закуски, угощения, палочки, напитки и т.п.

Термин «дифференцированная экспрессия» или «дифференцированно экспрессируемый» означает повышенную или нерегулируемую экспрессию генов или означает пониженную или регулируемую на понижение экспрессию генов, что детектируется по отсутствию, присутствию или по меньшей мере двухкратному изменению количества полученной при транскрипции мРНК или полученного при трансляции белка в образце.

Термин «эффективное количество» означает количество соединения, материала, композиции, лекарства или другого материала, которое является эффективным для достижения конкретного биологического результата, такого как способствование развитию фенотипа RBF/IS, описанного здесь.

Термин «пища» или «пищевая композиция» означает композицию, предназначенную для приема животным, включая человека, и предоставляющую питание. Как применяется здесь, «пищевой продукт, составленный для потребления человеком» представляет собой любую композицию, конкретно предназначенную для приема человеческим существом. «Пища для домашних животных» представляет собой композиции для поедания домашними животными, предпочтительно, домашними животными, компаньонами человека. «Полная и сбалансированная по питательным веществам пища для домашних животных» представляет собой такую пищу, которая содержит все известные необходимые питательные вещества для соответствующего реципиента или потребителя пищи в соответствующих количествах и пропорциях, на основе, например, рекомендаций признанных авторитетов в области питания домашних животных. Поэтому такая пища способна служить единственным источником питания для поддержания жизни или способствования производительности без дополнительных питательных ресурсов. Сбалансированные по питательным веществам пищевые композиции для домашних животных широко известны и широко применяются в данной области техники.

Термин «фрагмент» означает (1) олигонуклеотидную или полинуклеотидную последовательность, которая представляет собой часть полной последовательности и которая обладает такой же или сходной активностью для конкретного применения, как и полная полинуклеотидная последовательность, или (2) пептидную или полипептидная последовательность, которая представляет собой часть полной последовательности и которая обладает такой же или сходной активностью для конкретного применения, как и полная полипептидная последовательность. Такие фрагменты могут включать любое число нуклеотидов или аминокислот, соответствующее конкретному применению. В основном, олигонуклеотидный или полинуклеотидный фрагменты содержат по меньшей мере примерно 10, 50, 100 или 1000 нуклеотидов и полипептидные фрагменты содержат по меньшей мере примерно 4, 10, 20 или 50 последовательных аминокислотных остатков из полной последовательности. Термин охватывает варианты полинуклеотидных и полипептидных фрагментов.

Термин «ген» или «гены» означает полный или частичный сегмент ДНК, участвующий в продукции полипептида, включая районы, предшествующие кодирующему району и следующие за ним (лидерная и трейлерная последовательности), и прерывающие последовательности (интроны) между отдельными кодирующими сегментами (экзонами). Термин охватывает любую последовательность ДНК, которая гибридизуется с последовательностями, комплементарными кодирующей последовательности гена.

Термин «продукт гена» означает продукт транскрипции гена, такой как мРНК ли его производные (например, кДНК), или продукт трансляции транскрипта гена. Термин «продукт гена» обычно относится к продукту трансляции, такому как белок. Термин «продукт гена» может здесь применяться взаимозаменяемо с термином «белок».

Термин «гомолог» означает (1) полинуклеотид, включающий полинуклеотиды из того же или другого вида животного, имеющие более 30%, 50%, 70% или 90% сходства последовательности с полинуклеотидом сравнения и обладающие такими же или по существу такими же свойствами и выполняющие такие же или по существу такие же функции, как и полинуклеотид сравнения, или обладающие способностью к специфичной гибридизации с полинуклеотидом сравнения в жестких условиях, или (2) полипептид, включающий полипептиды из того же или другого вида животного, проявляющие более 30%, 50%, 70% или 90% сходства последовательности с полипептидом сравнения и обладающие такими же или по существу такими же свойствами и выполняющие такие же или по существу такие же функции, как и полипептид сравнения, или обладающие способностью к специфичному связыванию с полипептидом сравнения. В случае фрагментов полноцепочечных кодирующих последовательностей, функцией этих фрагментов просто может кодирование избранных частей полипептида определенной последовательности, или представление соответствующей сходной последовательности для гибридизации с другим полинуклеотидным фрагментом, кодирующим полипептид. В случае фрагментов полипептидов, функцией этих фрагментов просто может быть формирование эпитопа, подходящего для генерации антител. Сходство последовательностей двух полипептидов или двух полинуклеотидов определяется с помощью подходов, известных специалисту в данной области техники, например алгоритма Карлина и Алтшуля (Karlin and Altschul, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2264-2268 (1990)). Этот алгоритм включен в программы NBLAST и XBLAST (Altschul et al., J. Mol. Biol. 215:403-410 (1990)). Для сравнения последовательностей с пропусками можно применять Gapped Blast, как описано в (Altschul et al. Nucl. Acids Res. 25:3389-3402 (1997)). При применении программ BLAST и Gapped BLAST можно применять заданные по умолчанию параметры соответствующих программ (e.g., XBLAST и NBLAST). См. http://ww.ncbi.nlm.nih.gov.

Термин «гибридизованный комплекс» означает комплекс, образованный между полинуклеотидами образца, когда пурины одного полинуклеотида образуют водородные связи с пиримидинами комплементарного полинуклеотида, например, 5'-A-G-T-C-3' образует пары оснований с 3'-T-C-A-G-5'. Степень комплементарности и применение аналогов нуклеотида влияет на эффективность и жесткость реакции гибридизации.

Термин «совместно» означает, что лекарство, пища или другое вещество вводят животному (1) вместе в составе композиции, конкретно, пищевой композиции или (2) отдельно с той же или с другой частотой с применением того же или другого пути введения примерно в то же самое время или так же периодически. «Периодически» означает, что вещество вводят по схеме дозировок, соответствующей конкретному веществу. «Примерно в то же время» обычно означает, что вещество (пищу или лекарство) вводят в одно и то же время или в пределах интервала примерно 72 часов между введениями. «Совместно» конкретно включает схемы введения, при которых вещества, такие как лекарства, вводят в течение предписанного периода и композиции согласно изобретению вводят неопределенно (долго).

Термин «индивидуальный» в отношении животного означает индивидуальное животное любого вида или сорта.

«Продолжительное» введение, как применяется здесь, обычно означает периоды больше одного месяца. Периоды продолжительнее двух, трех или четырех месяцев также охвачены. Термин также включает более продолжительные периоды, включающие, например, более 5, 6, 7, 8, 9 или 10 месяцев. Периоды, превосходящие 11 месяцев или 1 год, также включены. Более длительные периоды, превышающие 1, 2, 3 года или более, также включены. В случае отдельных животных можно предвидеть, что животному будут регулярно вводить вещество, идентифицированные с помощью настоящих способов. «Регулярно», как применяется здесь, означает по меньшей мере еженедельное введение. Более частое введение, например, дважды или трижды в неделю, также охвачено. Включены также схемы введения, включающие по меньшей мере однократное, двукратное, трехкратное или более ежедневное введение. Любая частота дозировки независимо от того, указана ли она здесь, считается применимой. Специалист в данной области техники поймет, что частота дозировки является функцией вещества, предназначенного для введения и отдельные композиции могут нуждаться в более или менее частом введении для поддержания желательного биохимического, физиологического действия или действия на экспрессию генов, а именно эффектов, включающих один или более параметр из поглощения пищи, насыщения, липидного метаболизма и утилизации жира и профиля экспрессии генов, связанный с ними. Термин «на продолжительной регулярной основе» относится к продолжительному введению вещества регулярным образом.

«Нормальный» или «нормальные субъекты», или «нормальные животные», как применяется в связи с субъектами, проявляющими фенотип RBF/IS, означает отсутствие молекулярных, биохимических, физиологических, клеточных, системных и физических эффектов, происходящих в результате дифференцированной экспрессии генов, связанных с фенотипом RBF/IS.

Термин «оральное (пероральное) введение» означает, что животное заглатывает или человеку предписано кормить или он кормит животное одним или более веществом, описанным здесь. Термин «прием» применяется здесь взаимозаменяемо с термином «оральное введение». Когда человеку предписано вводить орально или скармливать вещество, такое предписание может инструктировать и/или информировать человека о том, что применение вещества может предоставить и/или предоставит соответствующие преимущества. Такая инструкция может быть устной инструкцией (например, устной инструкцией, например, лечащего врача/терапевта, ветеринара или другого специалиста в области здравоохранения, или полученной по радио или телевизору (например, реклама), или письменной инструкцией (например, написанной терапевтом, ветеринаром или другим специалистом в области здравоохранения (например, рецепт), специалистом по продаже или организацией (например, в торговых брошюрах, листках или других инструктивных печатных материалах), представленной письменно в средствах массовой информации (например, в Интернете, электронной почте и других связанные с компьютерами средствах) и/или на упаковке, связанной с веществом.

Термин «полинуклеотид» или «олигонуклеотид» означает полимер, состоящий из нуклеотидов. Термин включает молекулы ДНК и РНК (включая кДНК и мРНК), как одно-так и двухцепочечные, и в случае одноцепочечных их комплементарные последовательности в линейной или кольцевой форме. Термин также включает фрагменты, варианты, гомологи и аллели с соответствующими последовательностями, обладающие такими же или по существу такими же свойствами и выполняющие такую же или по существу такую же функцию, как оригинальные последовательности. Конкретно, термин охватывает гомологи из различных видов, например, мыши и собаки или кошки. Последовательности могут быть целиком комплементарными (никаких несоответствий) при сравнении или могут включать примерно до 30% несоответствий последовательности. Предпочтительно, для полинуклеотидов цепочка содержит примерно от 50 до 10000 нуклеотидов, более предпочтительно, примерно от 150 до 3500 нуклеотидов. Предпочтительно, в случае олигонуклеотидов цепочка содержит примерно от 2 до 100 нуклеотидов, более предпочтительно, примерно от 6 до 30 нуклеотидов. Точный размер полинуклеотида или олигонуклеотида зависит от различных факторов и от конкретного приложения и применения полинуклеотида или олигонуклеотида. Термин включает нуклеотидные полимеры, которые синтезированы и те, которые выделены и очищены из природных источников. Термин «полинуклеотид» включает «олигонуклеотид».

Термин «полипептид», «пептид» или «белок» означает полимер, состоящий из аминокислот. Термин включает встречающиеся в природе и неприродные (синтетические) полимеры и полимеры, в которых искусственные химические миметики замещают одну или более аминокислоту. Термин также включает фрагменты, варианты и гомологи, обладающие такими же или по существу такими же свойствами и выполняющие такую же или по существу такую же функцию, как оригинальные последовательности. Термин включает полимеры любой длины, содержащие примерно от 2 до 1000 аминокислот, более предпочтительно, примерно от 5 до 500 аминокислотных остатков. Термин включает полимеры из аминокислотных остатков, которые синтезированы и те, которые выделены и очищены из природных источников.

Термин «проба» (зонд) означает (1) олигонуклеотид или полинуклеотид, ДНК или РНК, как природные в очищенном продукте переваривания ферментами рестрикции, так и полученные синтетическим путем, способные к аннилингу (прилеганию) или к специфичной гибридизации с полинуклеотидом, последовательность которого комплементарна последовательности пробы, или (2) соединение или вещество, включая пептид или полипептид, способное специфично связываться с конкретным белком или белковым фрагментом по существу за исключением других белков или белковых фрагментов. Олигонуклеотидная или полинуклеотидная проба может быть одноцепочечной или двухцепочечной. Точная длина пробы зависит от многих фактов, включая температуру, источник и применение. Например, для диагностического применения в зависимости от сложности последовательности мишени олигонуклеотидная проба обычно содержит примерно от 10 до 100, от 15 до 50 или от 15 до 25 нуклеотидов. Для определенных диагностических применений полинуклеотидная проба содержит примерно 100-1000, 300-600 нуклеотидов, предпочтительно примерно 300 нуклеотидов. Пробы здесь отобраны, так чтобы быть по существу комплементарными различным цепочкам конкретной последовательности мишени. Это означает, что пробы должны быть достаточно комплементарными, чтобы специфично гибридизоваться (или прилегать) с соответствующими последовательностями-мишенями в заданных условиях. Поэтому не требуется, чтобы последовательность пробы отражала точную комплементарную последовательность последовательности мишени. Например, некомплементарный нуклеотидный фрагмент может быть присоединен к 5' или 3'-концу пробы, тогда как остаток последовательности пробы комплементарен последовательности мишени. Альтернативно, некомплементарные основания или более длинные последовательности могут быть включены в пробу, так чтобы последовательность пробы оставалась достаточно комплементарной последовательности полинуклеотида мишени для осуществления специфичной гибридизации с полинуклеотидом мишени. Пептидная или полипептидная проба может быть любой молекулой, с которой специфично связывается белок или пептид, включая ДНК (для белков, связывающих ДНК), антитела, клеточные мембранные рецепторы, пептиды, кофакторы, лектины, сахара, полисахариды, клетки, клеточные мембраны и мембраны органелл.

Термин «образец» означает любую животную ткань или жидкость, содержащую, например, полинуклеотиды, полипептиды, антитела, метаболиты и т.п., включая клетки и другие ткани, содержащие ДНК и РНК. Примеры включают жировую ткань, кровь, хрящ, соединительную ткань, эпителий, лимфу, мышцы, нервы, слюну/мокроту и т.п. Образец может быть твердым или жидким и может представлять собой ДНК, РНК, кДНК, жидкости организма, например, кровь или мочу, клетки, клеточные препараты или растворимые фракции, или аликвоты среды, хромосомы, органеллы и т.п.

Термин «единая упаковка» означает, что компоненты набора физически собраны в один или более одного контейнер и считаются одной единицей при изготовлении, распределении, продаже или применении. Контейнеры включают, не ограничиваясь этим, мешки, коробки, бутыли, пленочные упаковки, скрепленные или по-другому связанные компоненты или их комбинации. Единая упаковка может представлять собой контейнеры с индивидуальными пищевыми композициями, физически соединенные так, что они считаются одной единицей для производства, распределения, продажи или применения.

Термин «специфичное связывание» означает специфичное и точное взаимодействие между двумя молекулами, которое зависит от их структуры, конкретно от их молекулярных боковых групп. Например, интеркаляция регуляторного белка в большую бороздку молекулы ДНК, образование водородных связей вдоль скелета между двумя одноцепочечными нуклеиновыми кислотами или связывание эпитопа на белке с агонистом, антагонистом или антителом.

Термин «специфичная гибридизация» означает ассоциацию двух одноцепочечных полинуклеотидов с достаточно комплементарными последовательностями, позволяющими такую гибридизацию при заданных условиях, обычно применяемых в данной области техники (иногда называемыми «практически/по существу комплементарными»). Например, термин может относиться к гибридизации полинуклеотидной пробы с по существу комплементарной последовательностью, содержащейся в одноцепочечной молекуле ДНК или РНК, согласно аспекту изобретения, практически при исключении гибридизации полинуклеотидной пробы с одноцепочечным полинуклеотидом с некомплементарной последовательностью.

Термин «стандарт» означает (1) контрольный образец, содержащий ткань субъекта, которому введено контрольное или стандартное вещество, или никакого вещества, по сравнению с образцом, содержащим ткань субъекта, которому введено тестируемое вещество, например, для определения того, вызывает ли тестируемое вещество дифференцированную экспрессию генов, в соответствии с контекстом его применения.

Термин «жесткие условия» означает (1) гибридизацию в среде, содержащей 50% (объем/объем) формамид, 0,1% бычий сывороточный альбумин, 0,1% фикол, 0,1% поливинилпирролидон, 50 мМ фосфат натрия с рН 6,5, 750 мМ NaCl, 75 мМ цитрат натрия при 42°С, (2) гибридизацию в среде, содержащей 50% формамид, 5х SSC (0,75 М NaCl, 0,075 М цитрат натрия), 50 мМ фосфат натрия (рН 6,8), 0,1% пирофосфат натрия, 5х раствор Денхарда (Denhardt's solution), обработанную ультразвуком ДНК спермы лосося (50 мкг/мл), 0,1% ДСН и 10% декстрансульфат при 42°С; с промывкой при 42°С в 0,2х SSC и 0,1% ДСН или с промывкой раствором 0,015 М NaCl, 0,0015 М цитрата натрия, 0,1% Na₂SO₄ при 50°С, или сходные процедуры, включающие сходные агенты для промывки с низкой ионной силой и при высокой температуре и сходные денатурирующие агенты.

Термин «вариант» означает (1) полинуклеотидную последовательность, содержащую любую замену, вариацию, модификацию, замещение, делецию или вставку одного или более нуклеотида полинуклеотидной последовательности таким образом, чтобы она имела такие же или по существу такие же свойства и выполняла такую же или по существу такую же функцию, как оригинальная последовательность, и (2) полипептидную последовательность, содержащую любое замещение, вариацию, модификацию, замену, делецию или вставку одного или более аминокислотного остатка полипептидной последовательности таким образом, чтобы она имела такие же или по существу такие же свойства и выполняла такую же или по существу такую же функцию, как оригинальная последовательность. Поэтому термин включает полиморфизм одного нуклеотида (SNPs) и варианты аллелей, и включает консервативные и неконсервативные аминокислотные замены в полипептидах. Термин также включает химические производные полинуклеотидов или полипептидов и замену нуклеотидов или аминокислотных остатков нуклеотидами или аминокислотными остатками, не встречающимися в природе, при необходимости.

Термин «виртуальная упаковка» означает, что компоненты набора связаны с помощью инструкций на одном или более физическом или виртуальном компоненте набора, инструктирующими пользователя, как получить другие компоненты, например, в мешке, содержащем один компонент и инструкции, инструктирующие пользователя зайти на веб-участок, найти записанное там послание, посмотреть визуальное послание или связаться с консультантом или инструктором для получения инструкций по применению набора.

Способы и композиции и другие преимущества, раскрытые здесь, не ограничены конкретной методологией, протоколами и реагентами, описанными здесь, поскольку, как понятно специалисту в данной области техники, они могут варьировать. Дополнительно, терминология, применяется здесь только с целью описания конкретных осуществлений, а не для ограничения области притязаний, раскрытой здесь или приведенной в формуле изобретения.

Если не указано другое, все технические и научные термины, термины данной области техники и акронимы, применяемые здесь, имеют общепринятое значение, понятное ординарному специалисту в данной области техники в области (областях), к которой относится изобретение, или в области (областях), где этот термин применяется. Хотя любые композиции, способы, предметы производства или другие подходы или материалы, сходные или эквиваленты описанным здесь, можно применять на практике изобретения, предпочтительные композиции, способы, предметы производства или другие подходы или материалы описаны здесь.

Все патенты, патентные заявки, публикации и другие ссылки, цитированные или на которые ссылаются здесь, включены сюда путем ссылки в той степени, которая соответствует установленному законодательству. Обсуждение таковых ссылок предназначено для суммирования сделанных в них утверждений. Не делается допущений, что какой-либо из таких патентов, патентных заявок, публикаций или ссылок, или любая их часть является релевантной, материалом или прототипом. Право испытывать точность и уместность любых утверждений таких патентов, патентных заявок, публикаций или ссылок в качестве релевантных, материалов или прототипов конкретно сохраняется.

Изобретение

Изобретение частично основано на ясной демонстрации того, что амиды жирных кислот, которые, как известно, при внутрибрюшинном введении влияют на поглощение пищи, насыщение, липидный метаболизм и/или утилизацию жира, вызывают уменьшение жира в организме и уровня триглицеридов в плазме, увеличение насыщения, измеряемое по уменьшению поглощения пищи, и одновременное изменение экспрессии ряда генов, связанных с массой жира в организме и поглощением пищи, при оральном введении на регулярной продолжительной основе. Конкретно, как проиллюстрировано здесь, добавка ОЕА в двух разных концентрациях значительно понижает поглощение пищи, уменьшает массу жировой ткани и снижает уровень триглицеридов в плазме за период четырехнедельного теста на животной модели. Экспрессию 44 генов, связанных с массой жира в организме и поглощением пищи, измеряют с помощью ПЦР в реальном времени в периферических тканях субъектов, получавших ОЕА или его устойчивые к гидролизу производные, за период многонедельного теста. Продукты дифференцирование экспрессируемых генов приведены в таблице 1 и таблице 2. Многовариантный статистический анализ показывает значительный сдвиг в общем характере экспрессии генов в результате таких воздействий. Конкретно, гены жирового лептина и FAAH (гидролазы амидов жирных кислот), кишечного FAT/CD36 и ОЕА-рецептора GPR119 находятся среди генов, ответственных за этот сдвиг. Статистический корреляционный анализ показывает, что эти гены ассоциированы с уменьшением жировых прослоек, тогда как показано, что FAAH жировой ткани, в основном, связан с уменьшением поглощения пищи.

Белки, приведенные в таблице 1 и таблице 2, разделены на группы на основе различных критериев. Во-первых, белки разделены на четыре группы на основе статистического анализа дифференцированной экспрессии каждого гена у животных, получавших добавку, по сравнению с животными, не получавшими ее. Первая «группа» охватывает все белки, перечисленные в таблице 1 и 2. Вторая группа, группа А, представляет белки, для которых разница в экспрессии генов между животными, получавшими добавку и не получавшими ее, статистически значима при уровне р<0,05. Третья группа, группа В, представляет белки, у которых разница в экспрессии генов между животными, получавшими добавку и не получавшими ее, статистически значима при уровне р<0,01. Четвертая группа, группа С, представляет белки, у которых разница в экспрессии генов между животными, получавшими добавку и не получавшими ее, статистически значима при уровне р<0,001.

Во-вторых, белки поделены на группы на основе функции или физиологической роли белка. Эти функции включают: β-окисление липидов, липогенез, транспорт липидов, передачу сигнала инсулина, контроль поглощения пищи, метаболизм или передачу сигнала этаноламида жирных кислот и метаболизм глюкозы.

Так, идентифицировано определенное число генов, которые дифференцированно экспрессируются у субъектов, проявляющих уменьшение жира в организме и триглицеридов в плазме и повышение насыщения, измеряемого по уменьшению поглощения пищи (что называется здесь фенотипом с уменьшенной массой жира/увеличенным насыщением (RBF/IS)), где все эти изменения возникают в результате долговременного регулярного приема веществ, конкретно ОЕА и его производных, которые воздействуют на поглощение пищи, насыщение, липидный метаболизм и/или утилизацию жира. Полинуклеотиды и их фрагменты, образующие эти гены, а также кодируемые ими белки и фрагменты можно применять, например, в диагностических или прогностических анализах для измерения сдвига в сторону фенотипа RBF/IS, или в анализах, применимых для скрининга тестируемых соединений на их эффективность в плане способствования развитию или поддержания фенотипа RBF/IS.

В отдельных осуществлениях изобретения можно измерять экспрессию по меньшей мере одного дифференцированно экспрессируемого гена. В предпочтительных осуществлениях можно замерить экспрессию двух или более дифференцированно экспрессируемых генов, что предоставляет образец экспрессии генов или профиль экспрессии генов. Более предпочтительно, можно проводить измерение множества дифференцированно экспрессируемых генов, предоставляя дополнительную информацию относительно образца или профиля экспрессии генов.

В различных осуществлениях изобретения изменения экспрессии генов можно измерять одним или двумя способами: (1) измеряя транскрипцию путем детектирования мРНК, продуцируемой на основе конкретного гена, и (2) измеряя трансляцию путем детектирования белка, производимого на основе конкретного продукту транскрипции.

Повышенную или пониженную экспрессию можно определять на уровне РНК с применением любого подхода, известного в данной области техники для количественного определения полинуклеотидов, например, ПЦР (включая, но, не ограничиваясь этим, ПЦР в реальном времени и количественный ПЦР), анализ с помощью защиты от РНКазы, нозерн-блоттинг, микроматрицу, макроматрицу и другие гибридизационные подходы. Гены, которые анализируют или исследуют согласно изобретению, обычно присутствуют в форме мРНК или мРНК для обратной транскрипции. Эти гены можно клонировать и/или амплифицировать. Клонирование само по себе не представляется оказывающим негативное влияние на презентацию генов в популяции. Однако, может быть предпочтительным применять полиА+РНК в качестве источника, поскольку это может применяться с меньшим числом стадий обработки.

Так, один аспект изобретения предоставляет комбинацию, включающую множество полинуклеотидов или белков, которые на них экспрессируются, которые дифференцированно экспрессируются у животных, проявляющих фенотип RBF/IS в результате продолжительного регулярного приема вещества, которое воздействует на один или более параметр из поглощения пищи, насыщения, липидного метаболизма и утилизации жира, где полинуклеотиды выбирают из генов, кодирующих белки, перечисленные в таблице 1 или 2, или их фрагментов. В одном осуществлении полинуклеотиды или экспрессируемые белки выбирают из числа генов, кодирующих белки, перечисленные в группе А таблиц 1 или 2, или их фрагментов. В другом осуществлении полинуклеотиды или экспрессируемые белки выбирают из числа генов, кодирующих белки, перечисленные в группе В таблиц 1 или 2, или их фрагментов. В другом осуществлении полинуклеотиды или экспрессируемые белки выбирают из числа генов, кодирующих белки, перечисленные в группе С таблиц 1 или 2 или их фрагментов. В другом осуществлении полинуклеотиды или экспрессируемые белки выбирают из числа генов, кодирующих белки, вовлеченные в одну или более из следующих функций: β-окисление липидов, липогенез, транспорт липидов, передача сигнала инсулина, контроль поглощения пищи, метаболизм или передача сигнала этаноламида жирных кислот и метаболизм глюкозы.

В одном осуществлении комбинации включают два или более полинуклеотида или белка, экспрессируемых на основе этих полинуклеотидов. Предпочтительно, комбинации включают множество полинуклеотидов или белков, экспрессируемых на основе этих полинуклеотидов, обычно примерно 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100 или более полинуклеотидов или белков, или их фрагментов, по необходимости для конкретной группы или применения. Когда комбинации включают один или более фрагмент, фрагменты могут быть любого размера, который сохраняет свойства и функцию оригинального полинуклеотида или белка, предпочтительно, примерно от 30%, 60% или 90% оригинала.

Полинуклеотиды и белки могут происходить из любого животного, предпочтительно собак и кошек, наиболее предпочтительно собак. Гомологи полинуклеотидов и белков из разных видов животных получают путем стандартного поиска информации и с помощью молекулярных подходов, хорошо известных специалисту в данной области техники. Например, название или описание функции гена или белка можно вводить в одну из многих общедоступных баз данных, что приведет к получению списка источников, предоставляющих информацию об этом гене из разных видов, включая информацию о последовательности. Одной такой базой данных является "Information Hyperlinked over Proteins (iHOP), которая доступна в Интернете через адрес ihop-net.org. Альтернативно, инвентарный номер (код доступа) известного гена или белка в открытой базе данных можно применять для получения информации о последовательности этого гена или белка и для поиска гомологов или ортологов у других видов с применением поиска со сравнением последовательностей. Например, инвентарный номер гена или белка мыши по GenBank можно ввести в базу данных NCBl (National Institutes of Health's National Center for Biotechnology Information), получая таким образом доступ к последовательностям ДНК или полипептидов для этого мышиного гена. С применением той же базы данных можно провести поиск с помощью BLAST среди последовательностей мышиной ДНК или белка, или фрагментов достаточной длины для определения гена или белка с целью идентификации последовательностей достаточной гомологии из других видов, например, собак. Инвентарные номера последовательностей из других интересующих видов можно затем вводить в базу данных для получения информации относительно их полной нуклеотидной или белковой последовательности, а также другой описательной информации.

Другой аспект изобретения предоставляет композицию, включающую две или более пробы для детектирования дифференцированной экспрессии генов у животных, проявляющих фенотип RBF/IS в результате продолжительного и регулярного приема вещества, воздействующего на один или более параметр из поглощения пищи, насыщения, липидного метаболизма и/или утилизации жира. Пробы могут включать полинуклеотиды ли олигонуклеотиды, которые специфично гибридизуются с генами, кодирующими белки, перечисленные в таблицах 1 или 2, или их фрагментами. Альтернативно, они могут включать агенты, связывающие полипептиды, которые специфично связываются с полипептидами, включающими белки, перечисленные в таблицах 1 или 2, или их фрагментами. В отдельных осуществлениях агенты, связывающие полипептиды, представляют собой антитела и в конкретном осуществлении они представляют собой моноклональные антитела. В одном осуществлении пробы специфично гибридизуются с генами, кодирующими белки, перечисленные в группе А в таблицах 1 или 2, или их фрагментами, или они специфично связываются с полипептидами, включающими белки, перечисленные в группе А в таблицах 1 или 2, или их фрагментами. В другом осуществлении пробы специфично гибридизуются с генами, кодирующими белки, перечисленные в группе B в таблицах 1 или 2, или их фрагментами, или они специфично связываются с полипептидами, включающими белки, перечисленные в группе B в таблицах 1 или 2, или их фрагментами. В еще одном осуществлении пробы специфично гибридизуются с генами, кодирующими белки, перечисленные в группе С в таблицах 1 или 2, или их фрагменты, или они специфично связываются с полипептидами, включающими белки, перечисленные в группе С на таблицах 1 или 2, или их фрагментами. В другом осуществлении пробы специфично гибридизуются или они специфично связываются с полинуклеотидами, кодирующими белки, или с полипептидами, включающими белки, характеризующиеся функцией, выбранной из β-окисления липидов, липогенеза, транспорта липидов, передачи сигнала инсулина, контроля поглощения пищи, метаболизма или передачи сигнала этаноламида жирных кислот и метаболизма глюкозы. В предпочтительном осуществлении пробы специфично гибридизуются или связываются с полинуклеотидами или полипептидами кошек или собак.

Предпочтительно, композиция включает множество проб, обычно примерно 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 500 или более проб для детектирования полинуклеотидов или белков, или их фрагментов по необходимости для конкретной группы и применения. Специалист в данной области поймет, что можно применять множественные различные пробы для одного гена или белка мишени, чтобы повысить чувствительность и точность анализа с применением проб. Например, можно применять несколько олигинуклеотидных проб, специфично гибридизующихся с различными последовательностями полинуклеотида мишени. Подобным образом, можно применять несколько антител, иммунологически специфичных к различным эпитопам белка мишени.

Одну или более олигонуклеотидную или полинуклеотидную пробу для исследования образца можно получать с применением информации о последовательности любого гена, перечисленного здесь, из любого вида, предпочтительно, собак или кошек. Пробы должны обладать достаточной длиной для специфичной гибридизации достаточно избирательной с соответствующими комплементарными генами или продуктами транскрипции. В отдельных осуществлениях олигонуклеотидные пробы включают по меньшей мере примерно 10, 12, 14, 16, 18, 20 или 25 нуклеотидов в длину. В отдельных осуществлениях предпочтительны более длинные пробы, состоящие по меньшей мере примерно из 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 или 100 нуклеотидов, и пробы длиннее примерно 100 нуклеотидов могут быть предпочтительными в отдельных осуществлениях. Пробы могут включать полноцепочечные последовательности, кодирующие функциональные белки. Пробы, состоящие из нуклеиновых кислот, получают с помощью способов, известных опытному специалисту в данной области техники, например, путем синтеза из нуклеотидов in vitro, путем выделения и очистки из природных источников или ферментативного расщепления полинуклеотидов согласно изобретению.

Гибридизованные комплексы, включающие нуклеиновую кислоту пробы, гибридизованную с полинуклеотидом согласно изобретению, можно детектировать с помощью разнообразных подходов, известных в данной области техники. В отдельных осуществлениях изобретения можно применять иммобилизованные пробы из нуклеиновых кислот для быстрого и специфичного определения полинуклеотидов и образцов их экспрессии. Обычно, пробу из нуклеиновой кислоты присоединяют к твердой подложке и полинуклеотид мишень (например, ген, продукт транскрипции, продукт амплификации или, наиболее обычно, амплификационную смесь) гибридизуют с пробой. Проба или мишень, или обе могут нести метку, обычно, флуорофор или другой таг, например стрептавидин. Когда метка связана с мишенью, гибридизацию можно детектировать путем определения связанной флуоресценции. Когда помечена проба, то гибридизацию обычно детектируют путем гашения метки. Если и проба и мишень несут метки, детектирование гибридизации обычно проводят путем мониторинга цветового сдвига, получающегося из-за сближения двух связанных меток. В данной области техники известны различные стратегии внесения меток, сами метки и т.п., конкретно, для флуоресцентных подходов.

В другом осуществлении пробы включают агенты, связывающие полипептиды, которые специфично связываются с полипептидом, полученным путем экспрессии одного или более генов, перечисленных здесь, или их фрагментов. Такие связывающие белки пробы можно получать с применением информации о последовательности, доступной для любого белка, перечисленного в таблицах 1 и 2, или их фрагментов.

Аналитические техники, которые можно применять для определения уровней белка в образце, также хорошо известны специалисту в данной области техники. Такие аналитические подходы включают радиоиммунологический анализ, анализ с применением конкурентного связывания, вестерн-блоттинг и ELISA. В аналитических подходах с применением антител как поликлональные, так и моноклональные антитела применимы для целей данного изобретения. Такие антитела могут обладать иммунологической специфичностью к конкретному белку или эпитопу белка, или белковому фрагменту, что понятно специалисту в данной области техники. Способы получения поликлональных и моноклональных антител, иммунологически специфичных к конкретному белку или пептиду, также хорошо известны в данной области техники.

В предпочтительных осуществлениях изобретения антитела могут применяться для детектирования и количественной оценки белков, полученных путем экспрессии генов, описанных здесь. Хотя белки можно детектировать с помощью иммунопреципитации, аффинного разделения, вестерн-блоттинга и т.п., предпочтительный способ включает методологию типа ELISA, где антитело иммобилизовано на твердой подложке и белок или пептид мишени приводят в контакт с иммобилизованным антителом. Проба или мишень, или обе они могут нести метку. В данной области техники известно много различных стратегий внесения метки, самих меток и т.п.

Другой аспект изобретения предоставляет приспособление, включающее твердую подложку, к которой прикреплена матрица с набором проб для детектирования дифференцированной экспрессии генов у животных, проявляющих фенотип RBF/IS в результате продолжительного регулярного приема вещества, которое воздействует на один или более параметр из поглощения пищи, насыщения, липидного метаболизма и утилизации жира. В конкретных предпочтительных осуществлениях изобретения образцы или профили экспрессии большого числа генов, дифференцированно экспрессируемых при фенотипе RBF/IS по сравнению с нормальным фенотипом, как определено здесь, наблюдаются с применением матриц с пробами для детектирования полинуклеотидов или белков мишени. Приспособление можно применять для детектирования дифференцированной экспрессии генов, кодирующих продукты, перечисленные в таблицах 1 или 2, или в их подразделах, например, группе А, группе В, группе С, или в функциональных подразделах, включающих функции, выбранные из β-окисления липидов, липогенеза, транспорта липидов, передачи сигнала инсулина, контроля поглощения пищи, метаболизма или передачи сигнала этаноламида жирных кислот и метаболизма глюкозы. В предпочтительном осуществлении приспособление применяется для детектирования дифференцированной экспрессии генов из собак или кошек.

В одном осуществлении можно применять матрицу с олигонуклеотидными или полинуклеотидными пробами, тогда как в другом осуществлении можно применять матрицу с антителами или другими белками, которые специфично связываются с продуктами дифференцированной экспрессии генов. Такие матрицы можно получать на заказ (для конкретной цели) согласно известным способам, например, путем синтеза in situ на твердой подложке или присоединения заранее синтезированных проб к твердой подложке с помощью техники микропечати. В предпочтительных осуществлениях матрицы с нуклеиновыми кислотами или пробами, связывающими белки, можно получать на заказ, чтобы специфично детектировать продукты транскрипции или белки, полученные с помощью двух или более дифференцированно экспрессированных генов или фрагментов генов, описанных здесь.

Другой аспект изобретения предоставляет способ детектирования дифференцированно экспрессированных одного или более генов, которые дифференцированно экспрессируются у животных, проявляющих фенотип, включающий уменьшение жира в организме и триглицеридов в плазме и увеличение насыщения, измеряемого по снижению поглощенной пищи, (фенотип RBF/IS) в результате продолжительного регулярного приема вещества, которое воздействует на один или более параметр из поглощения пищи, насыщения, липидного метаболизма и утилизации жира, по сравнению с нормальными или животными, не подвергавшимися вмешательству. Способ, в основном, включает: (а) предоставление проб, включающих (1) полинуклеотиды, которые специфично гибридизуются с двумя или более генами, кодирующими белки, перечисленные в таблицах 1 или 2, или их фрагменты или (2) агенты, связывающиеся с полипептидами, которые специфично связываются с двумя или более полипептидами, выбранными из белков, перечисленных в таблицах 1 или 2 или их фрагментами; (б) добавление проб к образцу, включающему мРНК или белки животных с фенотипом RBF/IS по способу, позволяющему гибридизацию или связывание проб с мРНК или белками в образце, что приводит к образованию гибридизованных или связанных комплексов в образце, (в) при необходимости, добавление пробы к другому образцу, включающему мРНК или белок нормального животного, по способу, позволяющему гибридизацию или связывание проб с мРНК или белком во втором образце, что приводит к образованию гибридизованных или связанных комплексов в другом образце; г) детектирование гибридизованных комплексов в образце или образцах и д) сравнение гибридизованных или связанных комплексов из первого образца с гибридизованными или связанными комплексами стандарта или, при необходимости, другого образца, где по меньшей мере одно различие в количестве гибридизации или связывания в образце по сравнению со стандартом или при необходимости другим образцом указывает на дифференцированную экспрессию одного или более гена, который дифференцированно экспрессируется у животных с фенотипом RBF/IS по сравнению с животными, не проявляющими этого фенотипа.

Способ можно применять для детектирования дифференцированной экспрессии генов, кодирующих продукты генов, приведенные в таблицах 1 или 2, или в их подразделах, а именно, группе А, группе В, группе С или в функциональных подразделах, включающих функции, выбранные из β-окисления липидов, липогенеза, транспорта липидов, передачи сигнала инсулина, контроля поглощения пищи, метаболизма или передачи сигнала этаноламида жирных кислот и метаболизма глюкозы. В предпочтительном осуществлении способ применяют для детектирования дифференцированной экспрессии генов у собак или кошек. В конкретных осуществлениях пробы связаны с подложкой, предпочтительно, в составе матрицы.

Стадии (в) и часть стадий (г) и (д) являются необязательными и применяются, если необходимо провести относительное одновременное сравнение двух или более тестовых систем. Однако, в предпочтительном осуществлении стандарт, применяемый для сравнения, основан на данных, полученных ранее с применением способа.

Эти пробы приводят в контакт с образцом для образования гибридизованных или связанных комплексов, которые детектируют и сравнивают с таковыми стандарта. Разница между гибридизованными или связанными комплексами образца и стандарта указывает на дифференцированную экспрессию в образце полинуклеотидов и, следовательно, генов, которые дифференцированно экспрессируются у фенотипа RBF/IS по сравнению с нормальным фенотипом. В предпочтительном осуществлении пробы получают с целью специфичного детектирования полинуклеотидов или их фрагментов, продуцируемых одним или более геном или фрагментами генов, идентифицированными по изобретению. Способы детектирования гибридизованных или связанных комплексов известны специалисту в данной области техники.

В одном осуществлении способ дополнительно включает подвергание животного или образца действию тестируемого вещества до проведения анализа. Затем, сравнение указывает на то, изменяет ли тестируемое вещество экспрессию генов, которые дифференцированно экспрессируются у подвергнутых воздействию животных по сравнению с животными, не подвергавшимися воздействию.

В другом осуществлении детектирование, применимое для диагностического или прогностического определения фенотипа RBF/IS, проводят с интервалами, например, с целью мониторинга прогресса при попытке индукции у животного фенотипа RBF/IS.

Другой аспект изобретения предоставляет способ определения возможности того, что тестируемое соединение окажется полезным для воздействия на один или более параметр из поглощения пищи, насыщения, липидного метаболизма и утилизации жира, индуцируя таким образом фенотип RBF/IS при введении животному на регулярной продолжительной основе. Способ обычно включает (а) определение первого профиля экспрессии гена путем измерения продуктов транскрипции или трансляции двух или более полинуклеотидов, выбранных из генов, кодирующих белки, перечисленные в таблицах 1 или 2, или их фрагментов, в тестовой системе в отсутствие тестируемого вещества, (б) определение второго профиля экспрессии гена путем измерения продуктов транскрипции или трансляции двух или более полинуклеотидов, выбранных из генов, кодирующих белки, перечисленные в таблицах 1 или 2, или их фрагментов, в тестовой системе в присутствии тестируемого вещества, и (в) сравнение первого профиля экспрессии гена со вторым профилем экспрессии гена, где изменение второго профиля экспрессии гена указывает на то, что тестируемое вещество вероятно применимо для воздействия на один или более параметр из поглощения пищи, насыщения, липидного метаболизма и утилизации жира у животного.

В отдельных осуществлениях способ может дополнительно включать стадию сравнения по меньшей мере второго профиля экспрессии гена со сравнительным или стандартным профилем экспрессии гена, полученным путем измерения продуктов транскрипции или трансляции двух или более полинуклеотидов, выбранных из генов, кодирующих белки, перечисленные в таблицах 1 или 2, или их фрагментов в тестовой системе в присутствии стандартного вещества, которое, как известно, воздействует на один или более параметр из поглощения пищи, насыщения, липидного метаболизма и утилизации жира, при введении животному. Такое вещество может представлять собой, например, ОЕА или его устойчивые к гидролизу производные.

В одном осуществлении тестовая система представляет собой популяцию культивируемых клеток. Конструкцию нуклеиновой кислоты, включающую связанные с RBF/IS гены согласно изобретению, вводят в культивируемые клетки хозяина. Клетки хозяина могут быть клеточными линиями млекопитающих, такими как, но, не ограничиваясь этим, NIH3T3, СНО, HELA и COS, хотя также можно применять клетки других организмов, например, дрожжей, бактерий и насекомых. Кодирующие последовательности генов функционально связаны с соответствующими регуляторными элементами экспрессии, подходящими для конкретного хозяина, которого собираются применить. Конструкции нуклеиновых кислот можно вводить в клетки хозяина согласно любому приемлемого способу в данной области техники, включая, но, не ограничиваясь этим, трансфекцию, трансформацию, осаждение с фосфатом кальция, электропорацию и липофекцию. Такие подходы хорошо известны и приняты в данной области техники. Трансформированные клетки можно также применять для идентификации соединений, модулирующих экспрессию связанных с RBF/IS генов.

Анализ экспрессии генов можно проводить с применением конструкции гена, включающей промотор выбранного связанного с RBF/IS гена, функциональным образом связанный с репортерным геном. Репортерную конструкцию можно вводить в соответствующие культивируемые клетки, включая, но, не ограничиваясь этим, стандартные линии клеток хозяина, описанные выше, или клетки, свежеизолированные у субъекта, например, клетки жировой ткани, мышцы или печени. Анализ проводят путем мониторинга экспрессии репортерного гена в присутствии или в отсутствие тестируемого соединения.

В предпочтительном осуществлении тестовая система включат животных. Обычно, тестируемое соединение вводят субъекту и анализируют профиль экспрессии гена у субъекта для определения действия тестируемого соединения на транскрипцию или трансляцию генов или продуктов генов согласно изобретению. Экспрессию генов можно анализировать in situ или ex vivo для определения действия тестируемого соединения. В другом осуществлении тестируемое соединение вводят субъекту и анализируют активность белка, эспрессируемого на основе гена, in situ или ex vivo любым подходящим способом, известным в данной области техники для определения действия тестируемого соединения на активность рассматриваемого белка. Дополнительно, когда тестируемое соединение вводят субъекту, можно также оценивать физиологическое, системное и физическое воздействия соединения, а также потенциальную токсичность соединения.

Тестируемые вещества могут быть любым веществом, которое может оказывать действие на полипептиды или гены, которые дифференцированно экспрессируются у животных с фенотипом RBF/IS. Предпочтительными тестируемыми соединениями являются амиды жирных кислот, такие как производные ОБА. Другие тестируемые соединения включают, не ограничиваясь этим, аминокислоты, белки, пептиды, полипептиды, нуклеиновые кислоты, олигонуклеотиды, полинуклеотиды, небольшие молекулы, макромолекулы, витамины, минералы, простые сахара, сложные сахара, полисахариды, углеводы, триглицериды со средним размером цепочки (МСТ), триацилглицериды (TAG), n-3-(омега-3)-жирные кислоты, включая DHA, ЕРА, ALA; n-6 (омега-6) жирные кислоты, включая LA, γ-линоленовую кислоту (GLA) и ARA; SA, конъюгированную линоленовую кислоту (CLA), источники холина, например, лецитин, жирорастворимые витамины, включая витамин А и его предшественники, например, каротиноиды (например, β-каротин), источники витамина D, такие как витамин D2 (эргокальциферол) и витамин D3 (холекальциферол), источники витамина Е, например, токофеоролы (e.g., α-токоферол) и токотриенолы и источники витамина К, такие как витамин К1 (филохинон) и витамин К2 (менадион); водорастворимые витамины, включая витамины В, например, рибофлавин, ниацин (включая никотинамид и никотиновую кислоту), пиридоксин, пантотеновую кислоту, фолиевую кислоту, биотин и кобаламин; витамин С (аскорбиновая кислота); антиоксиданты, включая отдельные витамины, перечисленные выше, особенно витамин Е и С; также биофлавоноиды, такие как катехин, кверцетин и теафлавин; хиноны, такие как убихинон; каротиноиды, например, ликопен и ликоксантин; ресвератрол и α-липоевую кислоту; L-карнитин; D-лимонен; глюкозамин; S-аденозилметионин и хитозан. В предпочтительном осуществлении тестируемые вещества и питательные вещества можно добавлять к пище или принимать как добавки.

Вещества, идентифицированные с помощью вышеприведенных способов, также рассматриваются как часть изобретения.

Другой субъект изобретения предоставляет способ способствования развитию фенотипа RBF/IS у животного. Способ включает оральное введение животному на продолжительной регулярной основе вещества, которое воздействует на один или более параметр из поглощения пищи, насыщения, липидного метаболизма и утилизации жира. Предпочтительно, животное представляет собой собаку или кошку. Обычно вещество регулярно вводят в течение по меньшей мере двух недель, более предпочтительно, в течение по меньшей мере четырех недель или дольше. Введение вещества может продолжаться неопределенно долго, например, в течение одного, двух, трех, шести или девяти месяцев или в течение года или более, или даже в течение всей жизни животного. Вещество обычно вводят по меньшей мере раз в день, но режим дозирования будет зависеть от природы и силы вещества. Соответственно, введение может быть более частым, например, дважды или трижды в день, или менее частым, например, три раза в неделю, дважды в неделю, раз в неделю, два раза в месяц или раз в месяц.

В отдельных осуществлениях вещество представляет собой амид жирной кислоты. Конкретно, вещество представляет собой N-олеоилэтаноламид или его устойчивое к гидролизу производное, например, (Z)-(R)-9-октадеценамид, N-(2-гидроксиэтил, 1-метил). В других осуществлениях вещество представляет собой вещество, идентифицированное с помощью способа скрининга, описано выше.

В отдельных осуществлениях продолжительное регулярное оральное введение вещества вызывает изменение экспрессии одного или более гена согласно таблице 1 или таблице 2. В конкретных осуществлениях продолжительное регулярное оральное введение вещества вызывает изменение экспрессии одного или более гена, кодирующего белки, выбранные из лептина, гидролазы амида жирной кислоты (FAAH), FAT/CD36 и рецептора олеоилэтаноламида GPR119.

При применении в качестве пищевой добавки к обычному режиму питания вещество можно прямо вводить животному. Альтернативно, вещество может быть в контакте или смешано с ежедневным питанием или пищей, включая жидкости, например, питьевую воду, или предложено в качестве добавки к пище. Введение совместно с ежедневным питанием или пищей или в его составе хорошо известно простому специалисту в данной области техники. Введение можно проводить как часть ежедневного режима диеты животного. Например, режим диеты может включать обеспечение регулярного приема животным вещества в количестве, эффективном для развития фенотипа RBF/IS. В другом осуществлении вещество вводят животному совместно с одним или более лекарством, нутрицевтиком или питательным агентом для модуляции жира в организме или для развития фенотипа RBF/IS у животного.

В отдельных осуществлениях ежедневные или периодические дозы вещества, введенного по этому способу, находятся в интервале от примерно 0,001 г/кг веса тела до 10 г/кг веса тела. Более конкретно, доза превышает 0,01, 0,02, 0,03, 0,04, 0,05, 0,06, 0,07, 0,08, 0,09 или 0,1 г/кг веса тела. В других осуществлениях доза может составлять 0,2, 0,5, 1, 3, 5, 7 или 10 г/кг веса тела или больше в зависимости от вещества и частоты приема доз. Специалист в данной области техники знаком с составлением дозировок и режимов дозировки для субъектов.

Другой аспект изобретения предоставляет компьютерную систему, включающую базу данных, содержащую информацию, идентифицирующую уровни экспрессии одного или более полинуклеотида, которые дифференцированно экспрессируются у животных, которым вводят вещество, которое воздействует на один или более параметр из поглощения пищи, насыщения, липидного метаболизма и утилизации жира, где полинуклеотиды выбирают из генов, кодирующих белки, перечисленные в таблицах 1 или 2. или их фрагментов, и интерфейс пользователя, обеспечивающий пользователю доступ и работу с информацией в базе данных. Система включает базу данных, содержащую информацию, идентифицирующую уровни экспрессии одного или более полинуклеотида, выбранного из генов, кодирующих белки, перечисленные в таблицах 1 или 2, и/или полипептидов, которые специфично связываются с белками, перечисленными в таблицах 1 или 2, и интерфейса пользователя, позволяющего пользователю взаимодействовать с базой данных, конкретно, вводить, манипулировать и просматривать информацию для различных животных или категорий животных. В одном осуществлении база данных дополнительно включает информацию, идентифицирующую уровни активности одного или более полипептида из числа перечисленных в таблице 1 или 2. В другом осуществлении база данных дополнительно включает информацию о последовательностях одного или более полинуклеотида или полипептида из числа перечисленных в таблице 1 или 2, предпочтительно, из разных видов. В других осуществлениях база данных содержит дополнительную информацию, описывающую предполагаемое описание генов одного или более вида животного. Компьютерная система представляет собой любое электронное устройство, способное вмещать и манипулировать данными и взаимодействовать с пользователем, например, обычный компьютер или аналитический прибор, созданный для облегчения применения изобретения и выводящий результаты касательно статуса животного.

В другом аспекте изобретение предоставляет набор, включающий контейнер, содержащий набор из двух или более проб для детектирования дифференцированной экспрессии генов фенотипа RBF/IS, возникающего при регулярном продолжительном приеме вещества, которое воздействует на один или более параметр из поглощения пищи, насыщения, липидного метаболизма и утилизации жира. Набор включает в отдельных контейнерах в единой упаковке или в отдельных контейнерах в виртуальной упаковке, в соответствии с применением и компонентами набора, две или более пробы для детектирования дифференцированной экспрессии генов у животных с фенотипом, включающим уменьшение веса тела и уровня триглицеридов в плазме и увеличение насыщения, измеряемое по уменьшению поглощения пищи, (фенотип RBF/IS) в результате длительного регулярного приема вещества, которое воздействует на один или более параметр из поглощения пищи, насыщения, липидного метаболизма и утилизации жира, где пробы включают (а) полинуклеотиды, которые специфично гибридизуются с двумя или более генами, кодирующими белки, перечисленные в таблицах 1 или 2, или их фрагментами, или (б) агенты, связывающие полипептиды, которые специфично связываются с двумя или более полипептидами, выбранными из белков, перечисленных в таблицах 1 или 2, или их фрагментами, и дополнительно включает (1) инструкции по применению проб при анализе экспрессии генов для детектирования дифференцированной экспрессии генов у животных с фенотипом, включающим уменьшение веса тела и уровня триглицеридов в плазме и увеличение насыщения, измеряемое по уменьшению поглощения пищи, (фенотип RBF/IS) в результате длительного регулярного приема вещества, которое воздействует на один или более параметр из поглощения пищи, насыщения, липидного метаболизма и утилизации жира, (2) реагенты и оборудование для применения проб и (3) композицию, которая, как известно, индуцирует фенотип RBF/IS при регулярном продолжительном приеме. Предпочтительно, пробы прикреплены к твердой подложке в известных местах. Соответствующие стандартные вещества, известные как индукторы фенотипа RBF/IS при регулярном приеме, представляют собой N-олеоилэтаноламид или его устойчивые к гидролизу производные.

Когда набор включает виртуальную упаковку, набор ограничивается инструкциями в виртуальном пространстве в комбинации с одним или более физическим компонентом набора. В одном осуществлении набор содержит пробы и/или другие физические компоненты, а инструкции по применению проб и другие компоненты доступны в Интернете. Набор может содержать дополнительные вещи, такие как приспособление для смешивания образцов, проб и реагентов и приспособление для применения набора, например, пробирки или утварь для смешивания.

В другом аспекте изобретение предоставляет средства распространения информации относительно инструкций для одной или более композиции и способов, описанных здесь. Средства включают документы, цифровые носители, оптические носители, аудио презентации, визуальные дисплеи или т.п., содержащие информацию или инструкции. Например, средство распространения информации может быть участком в Интернете, стойкой, брошюрой, этикеткой на продукте, вкладышем в упаковку, рекламой, пресс-релизом, публичным объявлением, звукозаписью, видеозаписью, DVD, CD, чипом для считывания с помощью компьютера, картой для считывания с помощью компьютера, диском для считывания с помощью компьютера, компьютерной памятью или любой их комбинацией. Полезная информация включает один или более из (1) способов улучшения здоровья и хорошего самочувствия у животных и (2) контактной информации для хозяев животных по применению, если у них есть вопросы относительно изобретения и его применения. Полезные инструкции включают способы применения проб, инструкции по проведению анализа экспрессии генов и относительно количества и частоты введения веществ. Средства распространения полезны для оповещения о преимуществах применения изобретения.

Примеры

Далее различные аспекты изобретения будут проиллюстрированы примерами. Должно быть понятно, что эти примеры приведены только с целью иллюстрации и не ограничивают объем притязаний заявителя.

Пример 1

Исследованы физиологические и биохимические эффекты хронического орального введения ОБА. Мышей хронически кормят ОБА, предоставляя его как добавку в течение 4 недель, для исследования его воздействия на набранный вес тела и кумулятивное поглощение пищи наряду с другими параметрами.

Материалы и методы

Животные, диета и постановка эксперимента. Взрослых самцов мышей С3Н, полученных в возрасте 8 недель, помещают в индивидуальные клетки и держат ad libitum на разных диетах и воде в течение 2 недель. Животных разбивают на три группы по семь мышей путем рандомизации по весу и держат на диете с высоким содержанием жиров (липиды представляют 50% ежедневной энергии) в течение 2 недель. Состав диеты с высоким содержанием жиров на кг следующий: 284,5 г кукурузного крахмала, 89,5 г сахарозы, 250 г казеина, 50 г целлюлозы, 10 г смеси витаминов (V1001), 35 г смеси минералов (S 10026) и 281 г рапсового масла (UPAE, Jouy en Josas, France). Затем к диете добавляют ОЕА в разных количествах для получения 0, 10 или 100 мг ОЕА на кг веса тела. Мышей держат на каждой из соответствующих диет в течение 4 недель. Во время диетологического вмешательства отслеживают ежедневное потребление пищи и мышей взвешивают три раза в неделю.

Отбор образцов. Под конец экспериментального периода мышей умерщвляют путем взятия крови после анестезии с помощью изофлурана. Плазму получают путем центрифугирования (1000 g в течение 10 мин при 4°С). Брыжеечное, эпидидимальное, паховое и брюшинное жировые депо, в также печень, желудок, слизистую малого кишечника и икроножную мышцу вырезают и замораживают в жидком азоте. Плазму и образцы органов хранят при -80°С до анализа. Триглицериды, глюкозу, общий холестерин и HDL холестерин измеряют прямо в образцах плазмы, отобранных во время умерщвления, с помощью ферментативных подходов с применением Beckman Coulter Systems SYNCHRON LX 20 (Beckman Coulter, Fullerton, USA) (окислительный (оксидазный) способ, Beckman Coulter для глюкозы, GPO способ, Beckman Coulter для TG, окислительный и эстеразный способы, Beckman Coulter для холестерина). HDL выделяют путем специфичной солюбилизации с помощью набора для преципитационного выделения (Beckman Coulter, Fullerton, USA).

Статистический анализ. Результаты определяют как среднее±стандартное отклонение среднего (SEM). Статистический анализ физиологических параметров проводят с помощью одностороннего анализа ANOVA с применением программы Statview (SAS institute, Cary, USA). Статистическую значимость устанавливают на уровне Р<0,05.

Результаты

Поглощение пищи. Согласно анализу с применением линейной регрессии, кумулятивное поглощение пищи за экспериментальный период может прогнозировать до 40% общего изменения массы жировых прослоек. Поглощение пищи немного (-6,5%), но статистически значимо (Р<0,05) уменьшается у мышей, принимавших ОЕА. Ежедневное поглощение пищи значимым образом отличается для обеих доз ОЕА по сравнению с контролем в течение всего экспериментального периода (двухсторонний анализ ANOVA, Р<0,01). Однако, наблюдаемый эффект не является зависимым от дозы.

Физиологические и биохимические параметры. Введение ОЕА не индуцирует увеличения печени. ОЕА индуцирует сходное уменьшение общего веса жировых прослоек. В основном уменьшается брюшинная жировая ткань, паховые жировые прослойки, рассматриваемые как индикатор подкожных жировых депо (основное место хранения жира), также уменьшаются при приеме ОЕА (Р<0,05), тогда как брыжеечное жировое депо остается без изменений независимо от введенной дозы. Конечный вес тела мышей не изменяется.

Триглицериды плазмы значительно снижаются в обеих группах, получавших ОЕА (-72%, Р<0,05 в случае дозы 10 мг; - 59%, Р<0,05 в случае дозы 100 мг). Тенденция к уменьшению общего холестерина плазмы наблюдается при дозе 10 мг/кг и достигает статистически значимого уровня при введении 100 мг/кг веса тела.

Пример 2

Экспрессию 45 генов измеряют с помощью ПЦР в реальном времени в периферических тканях для идентификации генов, которые дифференцированно экспрессируются в ответ на введение олеоилэтаноламида (ОЕА) или негидролизуемого аналога ОЕА (KDS 5104), который воздействует на насыщение, липидный метаболизм, утилизацию жира, поглощение пищи и массу жира в организме.

Материалы и методы

Животные, диета и постановка эксперимента. Взрослых самцов мышей С3Н, полученных в возрасте 8 недель, помещают в индивидуальные клетки и держат ad libitum на разных диетах и воде в течение 2 недель. Животных случайным образом делят на три группы по семь мышей и держат на диете с высоким содержанием жиров (липиды представляют 50% ежедневной энергии) в течение 2 недель. Состав диеты с высоким содержанием жиров на кг следующий; 235 г казеина, 201 г сахарозы, 3,5 г L-цистина, 85 г крахмала, 116 г мальтодекстрина, 60 г целлюлозы, 12 г смеси витаминов (AIN-93M, UPAE, Jouy-en-Josas, France), 51,5 г смеси минералов (AIN-93Vx, UPAE, Jouy-en-Josas, France) и 236 г лярда. Затем к диете добавляют ОЕА или KDS 5104 в концентрации 100 мг/кг веса тела. Мышей держат при таком вмешательстве в течение 5 недель.

Химический синтез. ОЕА синтезируют химически из богатого олеином масла подсолнечника и этаноламина (Sigma-Aldrich, Saint-Louis, USA) согласно Roe, ET et al, 1952, J. American Oil Chemists' Society 29(1):18-22. KDS 5104 ((Z)-(R)-9-октадеценамид, N-(2-гидроксиэтил, 1-метил)) синтезируют путем стехиометрической реакции олеоилхлорида с соответствующим амином: (R)-(-)-2-аминопропанолом (Sigma-Aldrich, Saint-Louis, USA) в присутствии триэтиламина (Sigma-Aldrich, Saint-Louis, USA) по известному способу. Реакцию проводят в дихлорметане при 0-4°С при перемешивании в течение 12 час. Растворитель удаляют под вакуумом, и смесь растворяют в смеси тетрагидрофурана с этанолом (1:1) и обрабатывают водным раствором 3н КОН (2 эквивалента). Раствор держат с обратным холодильником в течение 30 мин, после чего растворитель удаляют. Остаток растворяют в этилацетате и последовательно промывают водой, гидроокисью натрия (2н), соляной кислотой (2н) и насыщенным раствором хлористого натрия. Органическую фазу сушат над сульфатом натрия, фильтруют и концентрируют при пониженном давлении (cf. Astarita et al, 2006, J. Pharmacol. Eхр. Ther. 318(2):563-70).

Отбор образцов. Под конец экспериментального периода мышей умерщвляют путем взятия крови (пункция сердца) после анестезии с помощью изофлурана. Плазму получают путем центрифугирования (1000 g в течение 10 мин при 4°С). Брыжеечное, эпидидимальное, паховое и брюшинное жировые депо, в также печень, желудок, слизистую малого кишечника, поджелудочную железу, икроножную мышцу удаляют и замораживают в жидком азоте. Плазму, мочу, фекалии и образцы органов хранят при -80°С до анализа.

Экстракция РНК и экспрессия генов. Общую РНК из печени, слизистой оболочки кишечника, жировой ткани, икроножной мышцы, поджелудочной железы и желудка экстрагируют с помощью реагента TRIzol (Invitrogen, Carlsbad, USA) согласно инструкциям производителя. Концентрацию РНК определяют в нанокаплях по поглощению при 260 нм. Ретро-транскрипционную ПЦР для синтеза кДНК проводят с применением установки Applied Biosystem Thermal Cycler 2720 и Superscript II (Invitrogen, Carlsbad, USA) no протоколу производителя. Количественный ПЦР в реальном времени (RT-qPCR) проводят с применением полученной кДНК, как описано выше, с применением системы высокой пропускной способности (Biomek 3000, Beckman & Coulter, Fullerton, USA) и Lightcycler 480 (Roche/Hitachi, Basel, Switzerland) с применением смеси SYBR Green Master mix и набора (Ewogentec, Philadelphia, USA). Праймеры для выбранных генов составляют с помощью текущей информационной поддержки от производителя Lightcycler (Roche). Для идентификации генов применяют базы данных (1) NCBl (GenBank) и (2) IHOP (Information Hyperlinked over Protein) (www.ihop-net.org/UniPub/iHOP/bng/). Значения выражают как соотношение уровней РНК по сравнению с контрольными мышами (диеты с 0 мг ОЕА/кг веса тела) с помощью ΔΔ(Ct) (Livak KJ & Schmittgen TD, 2001, Methods 25:402-8). Измеряют экспрессию следующих генов (сокращения и инвентарные номера по GenBank приведены в скобках).

Оксидаза ацил-КоА (АСО) (NM_015729)

Ко-активатор 1 альфа рецептора гамма, активируемого пролифератором пероксисом (PGC 1α) (NM_008904)

Фосфоэнодпируваткарбоксикиназа (PEP CK) (NM_028994)

Рецептор альфа, активируемый пролифератором пероксисом (PPAR α) (NM_ 011144)

Рецептор гамма, активируемый пролифератором пероксисом (PPAR γ) (NM_133249)

Карбоксилаза ацил-КоА (АСС) (NM_ 133360)

Адипоцитарный фактор, индуцируемый голоданием (Fiaf) (NM_020581)

Переносчик жирных кислот/кластер дифференциации 36 (FAT/CD 36) (NM_007643)

Липаза липопротеина (LPL) (NM_008509)

Печеночный белок 1, связывающий жирные кислоты (LFABP 1) (NM_017399)

Белок конвертазы субтилизин/кексин типа 9 (PCSK 9) (NM_153565)

Домен 17 дезинтегрина и металлопротеиназы (Adam 17) (NM_009615)

Грелин(ММ_021488)

Рецептор 119, сопряженный с G-белком (GPR 119) (NM_ 181751)

Холесцистокинин (ССК) (NM_031161)

Пептид YY (PYY) (NM_145435)

Лептин (NM_008493)

Адипонектин (NM_009605)

Вистафин (NM_021524)

Белок-с 1, связывающий регулируемый стерином элемент (SREBP 1с) (NM_011480)

Белок-С 2, связывающий регулируемый стерином элемент (SREBP2 1) (NM_033218)

Гидролаза амидов жирных кислот (FAAH) (NM_010173)

Белок, подобный N-ацилспингозингидролазе (NAAA) (NM_025972)

Олеоилэтаноламидсинтаза (ОЕА синтаза) (NM_178728)

Разобщающий белок 2 (UCP2) (NM_011671)

Переносчик глюкозы 4 (Glut 4) (NM_009204)

Рецептор дельта, активируемый пролифератором пероксисом (PPAR □) (NM_011145)

Каннабиноидный рецептор 1 (СВ 1) (NM_007726)

Субстрат рецептора инсулина 1 (IRS 1) (NM_010570)

Глюкозо-6-фосфатаза (G6P) (NM_008061)

Десатураза 1 стеароил-КоА(SСD 1) (NM_009127)

Синтаза жирных кислот (FAS 1) (NM_007988)

Статистический анализ. Результаты определяют как среднее±стандартное отклонение среднего (SEM). Статистический анализ физиологических параметров и данных об экспрессии генов проводят с помощью одностороннего анализа ANOVA с применением программы Statview (SAS institute, Cary, USA). Ежедневное поглощение пищи анализируют с помощью двустороннего анализа ANOVA с применением программы Statview. Статистическую значимость устанавливают на уровне Р<0,05, Р<0,01 и Р<0,001. Для статистического анализа данных об экспрессии генов значения рассчитывают относительно экспрессии 18S для каждой мыши и гена.

Результаты в случае введения OEА приведены в таблице 1. Результаты в случае введения KDS 5104 приведены в таблице 2. Следующие сокращения применены в таблицах: i - проксимальный кишечник, s - желудок, 1 - печень, m - мышца, р -поджелудочная железа; at - жировая ткань, at ер - эпидидимальная жировая ткань; at per - брюшинная жировая ткань.

Таблица 1
Функции	гены		Группа А	Группа В	Группа С
Все гены	0,05<Р<0,01	0,01<Р<0,001	Р<0,001
β-окисление липидов	CPT1 p	1,35
	СРТ1 1			1,74
	CPT1 i		2,00
	АСO 1	1,06
UCP2 m	1,19
Липогенез	FAS 1				1,65
	SREBP1c 1		1,24
	SREBP1c at ep	1,08
	SREBP1c at per	-1,39
	SREBP2 1	1,22
	SCD1 1			-2,13
	SCD 1 at ep	1,00
SCD 1 at per	-1,30
Транспорт липидов	FAT/CD36 1			1,45
	FAT/CD36 i			1,61
	FAT/CD36 at ep			-1,88
	FAT/CD36 at per		-1,81
	PCSK9 1			1,44
	Fiaf i	1,15
	Fiaf at ep		-1,41
Fiaf at per			-2,42
Передача сигнала инсулина	вистафин at ep				-1,55
	вистафин at per				-1,80
	адипонектин at ep	-1,14
адипонектин at per			-2,08
Контроль поглощения пищи	грелин s			1,98
	GPR119 i				1,97
	PPAR α i	1,20
	CCK i			1,57
	лептин at ep	1,22
	лептин at per		3,44
лептин s	1,41
Метаболизм и передача сигнала этаноламидов жирных кислот	CB1 i	-1,02
	CB1 at ep		-1,94
	CB1 at per			-5,27
	FAAH i			1,68
	FAAH at ep			2,22
	FAAH at per		1,62
	NAAA i			1,85
	NAAA at ep		1,36
	NAAA at per	1,03
OEA синтаза i			-1,38
Метаболизм глюкозы	Glut 4 m			3,27
	PepCK 1	1,02
G6P1		1,29

В отношении таблицы 1 многовариантный статистический анализ показывает значительный сдвиг в общей экспрессии генов при введении OEA. Гены жирового лептина и FAAH (гидролазы амида жирных кислот), кишечного FAT/CD36 и рецептора ОЕА GPR119 находятся среди генов, в основном ответственных за этот сдвиг, и также связаны с уменьшением веса жировых прослоек. Обнаружено, что жировой FAAH, в основном, связан с уменьшением поглощения пищи. Эти данные показывают, что действие ОЕА против ожирения частично основано на модуляции пути гидролиза амидов жирных кислот в жировой ткани и на модуляции недавно открытого GPR119 пути передачи сигнала ОЕА и регуляции поглощения жирных кислот в проксимальном отделе кишечника.

Таблица 2
Функции	Гены		Группа А	Группа В	Группа С
Все гены	0,05<Р<0,01	0,01<Р<0,001	Р<0,001
(3-окисление липидов	CPT1 p		1,80
	СРТ1 1	1,06
	CPT1 i				1,63
	АСO 1	1,15
UCP2 m	1,11
Липогенез	FAS 1				2,47
	SREBP1c 1			1,47
	SREBP1c at ep	1,00
	SREBP1c at per	-1,35
	SREBP2 1	1,13
	SCD1 1			-1,91
	SCD 1 at ep	1,24
SCD 1 at per	1,51
Транспорт липидов	FAT/CD36 1	0,88
	FAT/CDS 6 i			1,83
	PAT/CD36 at ep		-2,24
	FAT/CD36 at per	1,01
	PCSK9 1		1,34
	Fiaf i			0,68
	Fiaf at ep			0,46
Fiaf at per			2,79
Передача сигнала инсулина	висфатин at ep	-1,08
	висфатин at per	-1,10
	адипонектин at ep	-1,02
адипонектин at per			-1,52
Контроль поглощения пищи	грелин s	1,04
	GPR119 i				4,95
	PPARa i	1,02
	CCK i			1,62
	лептин at ep	1,35
	лептин at per	-1,32
лептин s	-1,02
Метаболизм и передача сигнала этаноламидов жирных кислот	CB1 i	-1,25
	CB1 at ep	-1,48
	CB1 at per		-3,00
	FAAH i	1,28
	FAAH at ep			9.71
	FAAH at per			3,82
	NAAA i				1,60
	NAAA at ep		1,38
	NAAA at per		1,52
OEA синтаза i		-1,36
Метаболизм глюкозы	Glut 4 m				5,70
	PepCK 1			1,55
G6P1			2,12

Применительно к таблице 2 многовариантный статистический анализ показывает значительный сдвиг общего профиля экспрессии генов при приеме KDS 5104. Гены печеночной FAS (синтазы жирных кислот), кишечной СРТ1 и рецептора олеоилэтаноламида GPR119 находятся среди генов, в основном ответственных за этот сдвиг, и также связаны с уменьшением жировых прослоек в организме. Обнаружено, что кишечная GPR119, в основном, связана с уменьшением поглощения пищи. Данные показывают, что действие KDS 5104 против ожирения частично основано на модуляции пути гидролиза амидов жирных кислот в жировой ткани и на модуляции недавно открытого GPR119 пути передачи сигнала эндоканнабиноида и на регуляции поглощения жирных кислот в проксимальном кишечнике.

В описании раскрыты и проиллюстрированы типичные предпочтительные осуществления изобретения и, хотя применены конкретные термины, они применены только в общем и наглядном смысле, а не с целью ограничения области притязаний изобретения, приведенной в формуле изобретения. В свете вышеприведенных подходов очевидно, что возможны многие модификации и варианты изобретения. Поэтому следует понимать, что в рамках области притязаний, охватываемых формулой изобретения, его можно осуществлять по-другому, нежели это конкретно описано.

1. Комбинация для диагностики состояний, связанных с фенотипом, включающим уменьшение жира в организме и триглицеридов в плазме и увеличение насыщения, включающая два или более химически синтезированных или химически модифицированных полинуклеотидов, которые специфически гибридизуются с двумя или более полинуклеотидными мишенями, которые дифференцированно экспрессируются у животных, проявляющих фенотип, включающий уменьшение жира в организме и триглицеридов в плазме и увеличение насыщения, измеряемое по уменьшению поглощения пищи - (фенотип RBF/IS), в результате продолжительного регулярного приема вещества, которое воздействует на один или более параметр из поглощения пищи, насыщения, липидного метаболизма и утилизации жира, где полинуклеотидные мишени содержат ген, выбранный из генов, кодирующих белки FAS, вистафин и GPR119.

2. Комбинация по п.1, дополнительно содержащая два или более химически синтезированных или химически модифицированных полинуклеотида, которые специфически гибридизуются с двумя или более нуклеотидными мишенями, которые выбирают из генов, кодирующих белки СРТ1, FAT/CD36, СВ1, FAAH, NAAA, G6P, SREBP1c, PSCK9, Fiaf, или лептин.

3. Комбинация по п.1, дополнительно содержащая два или более химически синтезированных или химически модифицированных полинуклеотида, которые специфически гибридизуются с двумя или более нуклеотидными мишенями, в которой полинуклеотидные мишени выбирают из генов, кодирующих белки SCD1, СРТ1, SREBPlc, FAT/CD36, PSK9, Fiaf, адипонектин, грелин, ССК, СВ1, FAAH, NAAA, ОEА синтазу, KDS 5104 синтазу или Glut 4.

4. Комбинация по п.1, дополнительно содержащая два или более химически синтезированных или химически модифицированных полинуклеотида, которые специфически гибридизуются с двумя или более нуклеотидными мишенями, в которой полинуклеотидные мишени выбирают из генов, кодирующих белки СРТ1 АСО и UCP2.

5. Комбинация по п.1, дополнительно содержащая два или более химически синтезированных или химически модифицированных полинуклеотида, которые специфически гибридизуются с двумя или более нуклеотидными мишенями, в которой полинуклеотидные мишени выбирают из генов, кодирующих белки REBP1, SREBP2 и SCD1.

6. Комбинация по п.1, дополнительно содержащая два или более химически синтезированных или химически модифицированных полинуклеотида, которые специфически гибридизуются с двумя или более нуклеотидными мишенями, в которой полинуклеотидные мишени выбирают из генов, кодирующих белки, FAT/CD36, PCSK9 и Fiaf.

7. Комбинация по п.1, дополнительно содержащая два или более химически синтезированных или химически модифицированных полинуклеотида, которые специфически гибридизуются с двумя или более нуклеотидными мишенями, в которой полинуклеотидные мишени выбирают из генов, кодирующих адипонектин.

8. Комбинация по п.1, дополнительно содержащая два или более химически синтезированных или химически модифицированных полинуклеотида, которые специфически гибридизуются с двумя или более нуклеотидными мишенями, в которой полинуклеотидные мишени выбирают из генов, кодирующих грелин, αPPAR, ССК и лептин.

9. Комбинация по п.1, дополнительно содержащая два или более химически синтезированных или химически модифицированных полинуклеотида, которые специфически гибридизуются с двумя или более нуклеотидными мишенями, в которой полинуклеотидные мишени выбирают из генов, кодирующих белки СВ1, FAAH, NAAA и ОЕА-синтазу.

10. Комбинация по п.1, дополнительно содержащая два или более химически синтезированных или химически модифицированных полинуклеотида, которые специфически гибридизуются с двумя или более нуклеотидными мишенями, в которой полинуклеотидные мишени выбирают из генов, кодирующих белки Glut4, РерСК и G6P.

11. Комбинация по п.1, в которой вещество представляет собой амид жирной кислоты.

12. Комбинация по п.1, в которой вещество представляет собой N-олеоилэтаноламид или его устойчивое к гидролизу производное.

13. Комбинация по п.1, в которой вещество представляет собой (Z)-(R)-9-октадеценамид,N-(2-гидроксиэтил, 1-метил).

14. Композиция для диагностики состояний, связанных с фенотипом, включающим уменьшение жира в организме и триглицеридов в плазме и увеличение насыщения, включающая две или более пробы (зонда) для детектирования дифференцированной экспрессии генов у животных, проявляющих фенотип, включающий уменьшение жира в организме и триглицеридов в плазме и увеличение насыщения, измеряемое по уменьшению поглощения пищи - (фенотип RBF/IS), в результате продолжительного регулярного приема вещества, которое воздействует на один или более параметр из поглощения пищи, насыщения, липидного метаболизма и утилизации жира, где пробы включают:
а) химически модифицированные полинуклеотиды, которые специфично гибридизуются с двумя или более генами, кодирующими белки FAS, вистафин или GPR119; или
б) агенты, связывающие полипептиды, которые специфично связываются с двумя или более полипептидами, выбранными из белков FAS, вистафин или GPR119.

15. Композиция по п.14, в которой агенты, связывающие полипептиды, представляют собой антитела.

16. Устройство для детектирования дифференцированной экспрессии генов у животных, проявляющих фенотип, включающий уменьшение жира в организме и триглицеридов в плазме и увеличение насыщения, содержащее твердую подложку, к которой прикреплена матрица, включающая множество проб (зондов) для детектирования дифференцированной экспрессии генов у животных, проявляющих фенотип, включающий уменьшение жира в организме и триглицеридов в плазме и увеличение насыщения, измеряемое по уменьшению поглощения пищи - (фенотип RBF/IS), в результате продолжительного регулярного приема вещества, которое воздействует на один или более параметр из поглощения пищи, насыщения, липидного метаболизма и утилизации жира, где пробы включают:
а) полинуклеотиды, которые специфично гибридизуются с двумя или более генами, кодирующими белки FAS, вистафин или GPR119; или
б) агенты, связывающие полипептиды, которые специфично связываются с двумя или более полипептидами FAS, вистафин или GPR119.

17. Устройство по п.16, в котором агенты, связывающие полипептиды, представляют собой антитела.